CN105866218A - 金属有机骨架UiO-66应用于光电传感器检测蛋白激酶活性 - Google Patents
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Abstract
本发明提供金属有机骨架UiO‑66应用于光电传感器检测蛋白激酶活性,首次提出了以金属有机骨架代替贵金属构建光电化学传感器,包括:偶联有多肽的导电电极;在导电电极上的金属有机骨架;其中,所述金属有机骨架上负载有光响应物质;所述金属骨架可与磷酸化的多肽特异性结合;所述多肽在待测生物酶活性与三磷酸腺苷ATP存在条件下,可发生磷酸化反应。光电流在可见光下随着蛋白激酶活度的不同而大小不同,达到了超灵敏、高精确检测激酶活性的效果。该传感器具有很高的灵敏度,对酶的抑制性实验也表明,此方法达到了高效灵敏检测激酶PKA活性的目的,满足了极端恶劣条件下的使用要求。
Description
技术领域:
本发明涉及光电化学传感器领域,尤其涉及金属有机骨架UiO-66应用于光电传感器检测蛋白激酶活性。
背景技术:
激酶(PKA)调节的蛋白磷酸化在新陈代谢和细胞传导通路中起着重要的作用。蛋白激酶的过表达会引起多种疾病比如肿瘤、糖尿病、阿尔兹海默症等。在生物化学领域中,对激酶活性及其抑制剂的检测能够阐述信号传导的分子机制,在临床医学及载药领域,对早期发现激酶表达活性异常也有利于疾病的预防和治疗。
然而,现有的生物传感器中的工作电极主要为玻碳电极或金电极,其中,玻碳电极不能直接进行物理方法或者化学方法固载酶,只能通过在玻碳电极表面进行其他处理,例如化学交联或者溶胶凝胶使得玻碳电极表面固载少量酶。由于玻碳电极的固载酶量低,使得其灵敏度未能达到理想水平。而金电极通常只对含有或者修饰有特定基团比如巯基的酶进行固载,有一定的局限性。此外,玻碳电极及金电极在使用之前都要打磨抛光及活化处理,过程比较繁琐。因此,提供一种酶固载量高、分析灵敏度高且简单快速的工作电极具有重要的现实意义。
金属有机骨架MOFs是无机金属中心(金属离子或金属簇)与有机配体通过自组装相互连接,形成的一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料,具有高孔隙率、可调节孔径大小、易于功能化与修饰等优点。MOFs已被开发应用于气体选择与吸附,催化、药物传递以及生物分子检测等领域。其中,在生物分子检测领域,MOFs在荧光生物传感器、电化学传感器等方面研究较多,在光电生物传感器领域研究甚少。
中国专利(CN105021575A)公开了一种基于局域表面等离子体共振检测激酶活性的光电传感器。通过含有贵金属纳米粒子及光敏剂三联吡啶钌的DNA探针发生局域表面等离子体共振效应,使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物导带上从而产生光电流,实现了激酶活性的检测。但该设计中采用DNA探针和纳米贵金属粒子作为主要器件,导致成本较高,推广难度大;同时,其DNA链与磷酸化肯普肽仅通过金属离子连接,结合强度差,并且DNA为生物分子,对环境比较敏感,导致在极端条件下使用时,该传感器稳定性不佳。
发明内容
为克服上述问题,本发明首次提出了以金属有机骨架代替贵金属构建光电化学传感器,研究发现:部分种类金属有机骨架可与磷酸化多肽发生亲和反应,进而捕获含磷酸根的多肽,形成稳定的化合键;金属有机骨架的立体空间结构和多结合位点还保证了上述化合键的多组同时加载,提高了检测器的稳定性,满足了极端恶劣条件下使用的要求;同时,借助于金属有机骨架的空间立体结构,大幅提高了光敏剂的加载量,从而在不添加纳米贵金属粒子的情况下,实现了生物酶活性的超高灵敏检测。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种基于金属有机骨架检测生物酶活性的工作电极,包括:
偶联有多肽的导电电极;
在导电电极上的金属有机骨架;
其中,所述金属有机骨架上负载有光响应物质;
所述金属骨架可与磷酸化的多肽特异性结合;
所述多肽在待测生物酶活性与三磷酸腺苷ATP存在条件下,可发生磷酸化反应。
优选的,所述金属有机骨架结构中含有Zr6O4(OH)4簇。
更优选的,所述金属有机骨架为Zr-MOF系列;
最优选的,所述金属有机骨架为UiO-66MOFs系列。研究中对现有的金属有机骨架进行了系统分析和实验摸索,结果表明:基于金属Zr的UiO-66MOFs系列具有生物稳定性强与生物相容性的特点,特别是UiO-66结构含有Zr6O4(OH)4簇,其中由于缺陷的存在使得大量的Zr-O键被Zr-OH所代替,Zr-OH非常活跃,可以强烈的与磷酸根进行络合,形成Zr-O-P键,从而起到识别磷酸根的目的。
优选的,所述光响应物质携带有正电荷。金属有机框架的高空隙率可以负载大量的光响应物质,因此,当光响应物质携带正电荷时,可以平衡整体呈现负电荷的金属有机框架,使其可以在呈负电的磷酸化多肽修饰的电极上减少非特异性吸附,提高检测的准确度。
优选的,所述光响应物质为三联吡啶钌;
优选的,所述多肽为肯普肽;
优选的,所述生物酶为蛋白激酶。
本发明还提供了一种基于金属有机骨架检测生物酶活性的生物传感器,包括任一上述的电极。
本发明还提供了一种基于金属有机骨架检索蛋白激酶活性的生物传感器,所述生物传感 器的工作电极包括:
偶联有肯普肽的导电电极;
在修饰电极上的金属有机骨架;
其中,所述金属有机骨架上负载有三联吡啶钌;
所述金属骨架为UiO-66MOFs系列。
肯普肽在蛋白激酶及ATP与金属镁离子的存在下,由于蛋白激酶的催化,其丝氨酸上的羟基会被ATP中的磷酸基取代从而发生肯普肽磷酸化。由于UiO-66中的Zr-O簇对磷酸基团有很强的亲和作用,可以通过形成Zr-O-P键来捕获含有磷酸根的多肽。同时,由于UiO-66含有大量的空隙,可以起到负载大量染料分子的载体作用。因此,携带有大量光敏剂三联吡啶钌的UiO-66探针通过Zr-O-P键被链接到修饰到磷酸化的肯普肽的电极上。探针中含有光敏剂三联吡啶钌,在可见光的照射下,光敏剂三联吡啶钌捕获更多的光子,使得其更多的电子跃迁到半导体金属氧化物(TiO2)导带上从而产生光电流。除此之外,三联吡啶钌染料携带正电荷,可以平衡整体呈现负电荷的UiO-66,使其可以在负电的磷酸化的肯普肽修饰电极上减少非特异性吸附,提高检测的准确度。抗坏血酸在此方法中作为电子供体,其电子不断补充到染料层,从而产生连续、稳定的光电流。当蛋白激酶活性高时,肯普肽被磷酸化的程度高,而被链接上的带有染料吡啶钌的UiO-66数量也会随之增加多,从而导致光电流增大,反之则减小,因此,随着激酶活度的不同,光电流的变化也会随之变化,由此达到灵敏高效检测蛋白激酶的目的。(图1)
本发明还提供了一种基于金属有机骨架检测生物酶活性的工作电极的制备方法,包括:
在导电电极上偶联可磷酸化的多肽;
在导电电极上负载可与磷酸化多肽特异性结合的金属有机框架;
所述金属有机骨架上负载有光响应物质。
优选的,所述金属有机骨架结构中含有Zr6O4(OH)4簇。
优选的,所述金属有机骨架为Zr-MOF系列;
更优选的,所述金属有机骨架为UiO-66MOFs系列;
优选的,所述光响应物质携带有正电荷;
更优选的,所述光响应物质为三联吡啶钌;
优选的,所述多肽为肯普肽。
本发明还提供了一种较优的基于金属有机骨架检测蛋白激酶活性的工作电极的制备方 法,包括:
光电传感器的制备
1、UiO-66的合成与UiO-66负载染料吡啶钌([Ru(NH3)6]3+@UiO-66)探针的制备
UiO-66合成方法参考文献并稍微进行了改动:240mg ZrCl4,4mL CH3COOH与0.118mL的二次水加入32mL的DMF溶液中,超声10min使其均匀,然后将94.94mg对苯二甲酸加入上述混合溶液中,继续超声均匀。将超声混匀的混合溶液转移至反应釜中,在120℃下反应24h,待冷却至室温后,离心,去掉上清液,将得到的UiO-66用DMF清洗,之后放入450℃真空中活化备用。
分别称取0.02g活化后的UiO-66五份,取不同浓度的[Ru(NH3)6]3+溶液五份,将其分别加入UiO-66中,混合搅拌36h,之后分别离心,将得到的[Ru(NH3)6]3+@UiO-66置于冰箱4℃保存备用,并取适量的[Ru(NH3)6]3+@UiO-66进行紫外表征。取上清液测荧光度,并据此求得[Ru(NH3)6]3+在UiO-66中的负载量,得到[Ru(NH3)6]3+与UiO-66的比率为6.5×10-6mol/g。
2、肯普肽kemptide在电极上的磷酸化反应
氧化铟锡导电玻璃ITO电极的预处理:ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1:1v/v)溶液、水中超声清洗15min,然后将其放在90℃烘箱中12h,烘干备用。
ITO电极的烷基化:预处理之后的ITO玻璃取出之后,滴加1mg/mL的氧化钛于固定面积(0.5cm2)的ITO玻璃片之上,之后将其放入200℃环境中15h。取出将TiO2/ITO放入5wt%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min,使得氨基连接到TiO2的表面,将硅烷化的TiO2/ITO放入110℃1h之后浸入5%戊二醛,于37℃下反应1h。
TiO2/ITO传感器的组装:TiO2/ITO电极硅烷化后,将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上,二次水清洗之后氮气吹干,得到肯普肽修饰的电极;1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附,之后用二次水淋洗并用N2干燥;含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCland20mM MgCl2,pH 7.4)滴加到电极上,在37℃下反应80min后滴加50uL的[Ru(NH3)6]3+@UiO-66探针溶液;之后用大量缓冲溶液进行清洗,氮气吹干,得到制备好的光电生物传感器准备检测。
本发明的有益效果:
1、本发明是利用UiO-66中的Zr-O簇对磷酸基团有很强的亲和作用及其大空隙可以负载大量染料的特点构建光电传感器,此光电传感器首次用来检测蛋白激酶PKA的活性。
2、UiO-66具有高孔隙率特点,能够负载大量的染料分子[Ru(bpy)3]2+,[Ru(bpy)3]2+带正电荷,它存在不仅可以大大的提高可见光的吸收率,起到信号放大的作用,而且可以平衡整体呈现负电荷的UiO-66,使其可以在负电的磷酸化的肯普肽修饰电极上减少非特异性吸附,提高检测的准确度。
3、光电流在可见光下随着蛋白激酶活度的不同而大小不同,达到了超灵敏、高精确检测激酶活性的效果。
4、此光电生物传感器可以检测MCF-7细胞裂解液中蛋白激酶的活度及蛋白激酶抑制剂的筛选
5、传统的使用特异性识别磷酸根的蛋白质来识别磷酸化多肽,这种方法比较繁杂并且花费高昂,UiO-66用来识别磷酸根具有高效、简单且价格低廉的优点。
6.本发明以金属Zr为金属中心,以对苯二甲酸为有机配体合成的金属有机骨架UiO-66来构建光电化学传感器来检测蛋白激酶活性。该方法具有很高的灵敏度,对酶的抑制性实验也表明,此方法达到了高效灵敏检测激酶PKA活性的目的,满足了极端恶劣条件下的使用要求。
附图说明:
图1基于金属有机骨架检测生物酶活性的工作电极的合成示意图。
图2 UiO-66的扫描图(a)和(B)UiO-66的XRD图
图3 UiO-66和[Ru(bpy)3]2+@UiO-66的紫外吸收,其中,内插图为[Ru(bpy)3]2+紫外吸收
图4(a)ITO电极,(b)TiO2/ITO电极,(c)肯普肽/TiO2/ITO电极,(d)磷酸化的肯普肽/TiO2/ITO电极,(e)探针[Ru(bpy)3]2+@UiO-66/磷酸化的肯普肽/TiO2/ITO电极的阻抗图,实验在Fe(CN6)3-/4-溶液中进行,频率范围为0.1Hz到100KHz。
图5 A:(a)ITO电极,(b)TiO2/ITO电极,(c)肯普肽/TiO2/ITO电极,(d)磷酸化的肯普肽/TiO2/ITO电极,(e)探针[Ru(bpy)3]2+@UiO-66/磷酸化的肯普肽/TiO2/ITO电极的光电流示意图B:将[Ru(bpy)3]2+@UiO-66分别修饰到肯普肽/TiO2/ITO电极和磷酸化的肯普肽/TiO2/ITO电极上的光电流相应图。
图6 ATP的浓度优化
图7酶催化反应时间的优化
图8[Ru(bpy)3]2+/UiO-66在磷酸化的肯普肽反应时间的优化
图9不同PKA浓度对应的光电流:0.005U mL-1,0.075U mL-1,0.01U mL-1,0.015UmL-1,0.02U mL-1,0.025U mL-1,0.05U mL-1,0.0625U mL-1,0.125U mL-1,1.25U mL-1,2.5UmL-1, 5U mL-1,20U mL-1,35U mL-1,50U mL-1.内插图为PKA浓度与光电流变化值的线性曲线。光密度为190mW cm-2,电极反应面积为0.5cm2.
图10不同浓度的抑制剂ellagic acid(a)和Tyrphostin AG 1478(b)加入固定浓度的PKA与ATP反应液之后与光电流之间的关系。
图11激活剂Forskolin与抑制剂ellagic acid处理细胞后细胞裂解液中PKA的含量与光电流之间的关系
具体实施方式:
实施例1
光电传感器的制备
1、UiO-66的合成与UiO-66负载染料吡啶钌([Ru(NH3)6]3+@UiO-66)探针的制备
UiO-66合成方法参考文献并稍微进行了改动:240mg ZrCl4,4mL CH3COOH与0.118mL的二次水加入32mL的DMF溶液中,超声10min使其均匀,然后将94.94mg对苯二甲酸加入上述混合溶液中,继续超声均匀。将超声混匀的混合溶液转移至反应釜中,在120℃下反应24h,待冷却至室温后,离心,去掉上清液,将得到的UiO-66用DMF清洗,之后放入450℃真空中活化备用。
分别称取0.02g活化后的UiO-66五份,取不同浓度的[Ru(NH3)6]3+溶液五份,将其分别加入UiO-66中,混合搅拌36h,之后分别离心,将得到的[Ru(NH3)6]3+@UiO-66置于冰箱4℃保存备用,并取适量的[Ru(NH3)6]3+@UiO-66进行紫外表征。取上清液测荧光度,并据此求得[Ru(NH3)6]3+在UiO-66中的负载量,得到[Ru(NH3)6]3+与UiO-66的比率为6.5×10-6mol/g。
2、肯普肽kemptide在电极上的磷酸化反应
氧化铟锡导电玻璃ITO电极的预处理:ITO玻璃依次在丙酮、氢氧化钠(1M)的乙醇水(1:1v/v)溶液、水中超声清洗15min,然后将其放在90℃烘箱中12h,烘干备用。
ITO电极的烷基化:预处理之后的ITO玻璃取出之后,滴加1mg/mL的氧化钛于固定面积(0.5cm2)的ITO玻璃片之上,之后将其放入200℃环境中15h。取出将TiO2/ITO放入5wt%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中进行硅烷化90min,使得氨基连接到TiO2的表面,将硅烷化的TiO2/ITO放入110℃1h之后浸入5%戊二醛,于37℃下反应1h。
TiO2/ITO传感器的组装:TiO2/ITO电极硅烷化后,将50μL浓度为500μM的肯普肽溶液滴加到电极上室温黑暗处反应12h使得肯普肽连接到电极上,二次水清洗之后氮气吹干,得到肯普肽修饰的电极;1mM的6-氨基己酸封闭空白位点30min以减轻非特异性吸附,之后用二次水淋洗并用N2干燥;含有一系列浓度的PKA和ATP的缓冲溶液(50mM Tris-HCland20mM MgCl2,pH 7.4)滴加到电极上,在37℃下反应80min后滴加50uL的[Ru(NH3)6]3+@UiO-66探针溶液;之后用大量缓冲溶液进行清洗,氮气吹干,得到制备好的光电生物传感器准备检测。
3、细胞的培养与细胞裂解液的提取
MCF-7细胞分成三组,在DMEM细胞培养液中培养。在5%CO2、37℃下培养,在添加激活剂和抑制剂之前,改用无血清培养基(1mL)培养四小时,随后,细胞被分别加入蛋白激酶激活剂(毛喉素Forskolin与IBMX)和蛋白激酶抑制剂(ellagic acid)使其最终浓度分别为25uM,最后一组为对照组。经过一段时间的孵育之后,细胞分别加入2mL的细胞裂解液,五分钟之后,对三组细胞裂解液进行离心,最后将获得的上清液存在-80℃处备用。由Nanodrop测得由毛喉素刺激细胞得到的细胞裂解液中的总蛋白为28.891mg/mL,对照组细胞得到的细胞裂解液中的总蛋白为25.414mg/mL,由抑制剂鞣花酸刺激细胞得到的细胞裂解液中的总蛋白为24.072mg/mL。
实验现象的表征
UiO-66及[Ru(NH3)6]3+@UiO-66的表征
图2A为UiO-66的SEM扫描图,从图中可见,UiO-66形貌整齐,粒径单一且分散均匀。XRD(图2B)也表明UiO-66的晶体结构。
3.3.3肯普肽修饰电极的表征
交流阻抗(EIS)用来表征电极传感器的步步组装过程。在交流阻抗图中,在高频率区,半圆部分的直径部分等于阻抗,代表电极表面的电子转移动力过程。因此以频率的变化来测量电极的阻抗值是一种监控电极组装的过程的有效方法。
由图4可见,裸ITO表现出来的阻抗为可以忽略的半圆(a);随着TiO2的滴加,半圆部分半径变大,表示电极的阻抗增加(b);当肯普肽修饰上之后,阻抗进一步增加(c),这是因为肯普肽作为一种多肽不利于电子的传递;当滴加PKA之后,阻抗小幅度增加(d),表明电极表面的电子转移速率的降低,这是因为加入的PKA使得肯普肽上面的羟基置换为磷酸根,使电极表面的电负性增强,从而阻碍了电极表面的电子转移速率;最后当滴加[Ru(NH3)6]3+@UiO-66探针之后,阻抗继续增大(e),这是由于UiO-66导电性比较弱,不有利于电子的传递。传感器组装个阶段的电流强度的变化亦能反应出电极的组装情况。
光电化学传感器的光电流响应
本节讨论了本体系构建的光电化学传感器的光电流行为。图5为在可见光照射下,在含有0.1M抗坏血酸的0.1M PBS缓冲溶液中测量得到的修饰电极的光电流图。由A图中可见,裸的ITO电极和TiO2/ITO电极在可见光的照射下基本没有光响应,当TiO2/ITO电极修饰上肯普肽之后,然后被PKA磷酸化,电极仍然没有光响应,但是,最后将探针[Ru(bpy)3]2+@UiO-66通过UiO-66上面的Zr-O金属簇连接到电极上的时候,可以观察到光电流有了明显的升高,这是因为在可见光的激发下,[Ru(bpy)3]2+染料中的激发电子转移到电极上形成光电流,与此同时,UiO-66中的大孔隙极大的提高了[Ru(bpy)3]2+的负载量也明显的增强了[Ru(bpy)3]2+的光电转换效率。
蛋白激酶PKA能够磷酸化肯普肽,从而通过Zr-O-P将[Ru(bpy)3]2+/UiO-66探针修饰到电极上。B图为肯普肽连接上[Ru(bpy)3]2+/UiO-66探针的光电流(曲线a)探针和磷酸化的肯普肽由连接上[Ru(bpy)3]2+@UiO-66(曲线b)对比图。由图可见,当肯普肽没有被蛋白激酶PKA磷酸化时,修饰电极的光电流值非常小,可以忽略不见,这是因为没有被磷酸化的肯普肽不能通过Zr-O-P将[Ru(bpy)3]2+/UiO-66连接到电极上,因此没有光电响应。而肯普肽被磷酸化之后,由于Zr-O对磷酸根具有识别作用,[Ru(bpy)3]2+/UiO-66探针被连接到修饰有磷酸化的肯普肽电极上,在可见光的照射下,产生了可以用来检测PKA活性的光电流响应。
实验条件的优化
在肯普肽的磷酸化过程中,ATP作为共反应剂提供了磷酸根的供体,在磷酸化的过程中起着至关重要的作用,因此,我们对实验所用的ATP的浓度进行了优化。由图6可见,光电流的变化值随着ATP的浓度的增加而增大,当ATP的浓度达到80mM时光电流变化值得到最大,随着ATP的浓度继续增加,光电流变化值不再变化,因此本实验选取ATP的浓度为80mM时进行实验。
在酶催化实验中,反应时间也很重要。如图7所示,随着磷酸化时间的延长,光电流的变化值逐渐增大,当磷酸化时间达到80min时光电流的变化值达到最大,之后不再变化,80min为最佳磷酸化时间。
探针[Ru(bpy)3]2+/UiO-66在磷酸化的肯普肽反应的时间对于光电流的产生及产生的大小具有非常重要的作用。反应时间过短,探针[Ru(bpy)3]2+/UiO-66修饰到磷酸化的肯普肽上面的数量少,产生的光电流响应就会变弱,因此,我们对[Ru(bpy)3]2+/UiO-66在磷酸化的肯普肽反应的时间进行了优化,优化结果如图8所示。可见,当60min时候,光电流响应已经达到了一个平台,因此,我们选取60min作为[Ru(bpy)3]2+/UiO-66在磷酸化的肯普肽反应的时间。
PKA的光电化学检测
在最优条件下,利用构建的光电化学传感器对蛋白激酶PKA的活度进行了分析。图9为不同的PKA激酶所对应的光电流的变化值。由图9可见,随着PKA浓度的增加,光电流的变化值逐渐增大,当浓度达到20U/mL时候光电流变化值达到最大,之后形成平台。在PKA的浓度为0.005~0.0625U/mL范围内,蛋白激酶的浓度与光电流的变化值呈线性关系,其线性方程为I=-0.559+296×c,相关系数R=0.9975,其中,I为光电流的强度,c为蛋白激酶PKA的活度。在此光电化学传感器中,蛋白激酶检测限为0.0049UmL-1(S/N=3)
本体系对构建的检测PKA激酶活性的光电生物传感器的重复性进行了考察,利用十二根相同组装的电极对同一活度(1UmL-1)的PKA进行检测,测得其RSD=6.87%,重复性良好。另外,用一根新鲜制备的修饰电极对传感器的稳定性进行了考察,RSD=4.08%,证明其具有很高的稳定性。
PKA的抑制性实验及在细胞裂解液中活性的检测
蛋白激酶抑制剂的筛选在制药领域有非常重要的意义。为了验证在抑制剂筛选方面的潜力,我们将制备好的生物传感器用于蛋白激酶的抑制剂的分析中。其中,我们用了两种不同类型的抑制剂,其中,鞣花酸ellagic acid为蛋白激酶抑制剂,TyrphostinAG1478为络氨酸激酶抑制剂,对蛋白激酶并没有抑制作用。在固定的PKA浓度下,滴加不同浓度的ellagic acid和TyrphostinAG1478溶液。如图10所示,随着鞣花酸的浓度从0-12μM不断增加,光电流不断变小,当其浓度达到8μM时,光电流的信号不再有变化(a)。而当实验用TyrphostinAG1478时,随着TyrphostinAG1478浓度的变化,其光电流的大小并没有明显的变化(b),由此可以说明,该传感器可以用于对抑制剂的筛选。与此同时,我们可以计算出IC50(The half-maximal inhibition values)为4.21μM。
PKA在细胞活动中起着非常重要的作用,当由于细胞外部刺激导致细胞内蛋白激酶的表达发生异常的时候,能够导致多方面的细胞问题,比如细胞的增值与分化、基因转录以及肿瘤的生长等。除此之外,蛋白激酶还是一些肿瘤的标志物等,在细胞裂解液中能够检测PKA的活性对于研究细胞内PKA的活性具有重要的参考意义。因此,本体系将构建的生物传感器还应用到了MCF-7细胞裂解液中的蛋白激酶PKA的活性检测。我们将MCF-7细胞用鞣花酸和毛喉素培养后裂解细胞得到细胞裂解液,然后分别测量不同的细胞裂解液中的蛋白激酶的活性。图11为其对应的光电流相应图。可以看到,当MCF-7细胞用用鞣花酸处理后,其裂解液中的PKA活度表达最低,而空白细胞裂解液中的蛋白激酶的活度比鞣花酸处理的细胞裂 解液中蛋白激酶的活度要高。在这三者之间,用毛喉素处理的细胞裂解液测得的蛋白激酶的活度最高,与理论预期结果相符合。这对于测量细胞内的PKA含量的测定提供了理论依据。
最后应该说明的是,以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种基于金属有机骨架检测生物酶活性的工作电极,其特征在于,包括:
偶联有多肽的导电电极;
在导电电极上的金属有机骨架;
其中,所述金属有机骨架上负载有光响应物质;
所述金属骨架可与磷酸化的多肽特异性结合;
所述多肽在待测生物酶活性与三磷酸腺苷ATP存在条件下,可发生磷酸化反应。
2.如权利要求1所述的工作电极,其特征在于,所述金属有机骨架结构中含有Zr6O4(OH)4簇。
3.如权利要求2所述的工作电极,其特征在于,所述金属有机骨架为Zr-MOF系列;
优选的,所述金属有机骨架为UiO-66MOFs系列。
4.如权利要求1所述的工作电极,其特征在于,所述光响应物质携带有正电荷。
5.如权利要求1所述的工作电极,其特征在于,所述光响应物质为三联吡啶钌;
或所述多肽为肯普肽;
或所述生物酶为蛋白激酶。
6.一种基于金属有机骨架检测生物酶活性的生物传感器,其特征在于,包括权利要求1-5任一项所述的电极。
7.一种基于金属有机骨架检索蛋白激酶活性的生物传感器,其特征在于,所述生物传感器的工作电极包括:
偶联有肯普肽的导电电极;
在导电电极上的金属有机骨架;
其中,所述金属有机骨架上负载有三联吡啶钌;
所述金属骨架为UiO-66MOFs系列。
8.一种基于金属有机骨架检测生物酶活性的工作电极的制备方法,其特征在于,包括:
在导电电极上偶联可磷酸化的多肽;
在导电电极上负载可与磷酸化多肽特异性结合”的金属有机框架;
所述金属有机骨架上负载有光响应物质。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述金属有机骨架结构中含有Zr6O4(OH)4簇。
10.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述金属有机骨架为Zr-MOF系列;
或所述光响应物质携带有正电荷;
优选的,所述金属有机骨架为UiO-66MOFs系列,
或优选的,所述光响应物质为三联吡啶钌;
或优选的,所述多肽为肯普肽。
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