CN112557473B

CN112557473B - 一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN112557473B
Application number: CN201910914389.3A
Authority: CN
Inventors: 李根喜; 孙召伟; 潘艳红; 王磊; 吴帅
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN112557473A

Abstract

本发明涉及了一种基于锆金属‑有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用恶性胶质瘤是脑内最致命的肿瘤之一，由于致癌原因的复杂性以及血脑屏障的阻碍，早期诊断在技术上仍具有挑战性。恶性胶质瘤分泌的特异性外泌体可以穿过血脑屏障并在体液中循环，具有无创性早期诊断的潜力。因此，我们提出了一种基于锆金属有机骨架(Zr‑MOF)的新型无标记电化学生物传感器。在该方法中，设计的多肽链能够特异性地捕获恶性胶质瘤外泌体中高表达的人表皮生长因子受体(EGFR)和EGFR变异株(v)III突变株(EGFRvIII)。同时，以亚甲基蓝(MB)包裹的Zr‑MOF(MB@Zr‑MOF)作为化学选择标记，通过与外泌体磷脂双分子层膜外的磷酸基团相互作用，产生敏感的电化学信号。通过监测Z‑MOF内的电活性分子，可以定量检测外泌体的浓度，表现出广阔的临床诊断应用价值。

Description

一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于化学分析领域，尤其涉及一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用。

发明背景

恶性胶质瘤是脑内最常见、最致命的恶性肿瘤之一，具有侵袭广、细胞增殖快、血管生成广泛等特点。尽管采用积极的手术切除或保守的治疗方法，恶性胶质瘤患者仍然面临生存期短，复发率高等严重问题。研究表明诊断的延误是其治疗不理想的主要原因，因此，早期诊断在改善预后，提高生存率方面起着重要的作用。磁共振成像(MRI)和计算机断层扫描(CT)是恶性胶质瘤诊断的常用技术手段。然而，由于患者的异质性和缺乏早期的可比数据，这些传统的技术难以与非肿瘤性疾病相区分。因此，开发一种新的早期诊断技术用于恶性胶质瘤患者术前、术后监测具有重要意义。

近来研究表明，肿瘤分泌的特异性外泌体在疾病的早期诊断上具有很大的潜力。外泌体是由细胞分泌的40-150nm双层膜性囊泡，大量分布于人的体液中，如血液、尿液和脑脊液等。这些膜包裹的囊泡含有丰富的生物活性分子，可以穿过血脑屏障，介导细胞间的通讯。特别是恶性胶质瘤细胞外泌体具有特异性高表达的人表皮生长因子受体(EGFR)和最常见的EGFR变异(V)III突变(EGFRvIII)。EGFR的过度表达和突变几乎发生在所有典型的恶性胶质瘤亚型中，而且EGFRvIII的表达与预后不良有着紧密关系。因此，对这些特异性的外泌体的检测为恶性胶质瘤的早期诊断提供了可能。

金属有机框架(MOFs)以其大的比表面积、高孔隙率、化学稳定性和持久的传感特性，作为一种新型的纳米材料，被广泛用作传感器研究。特别是锆金属-有机框架(Zr-MOFs)对磷酸基团具有高度的亲和力，可选择性地富集磷酸肽或其它磷酸盐生物分子。而且，外泌体是由磷脂双分子层构成的，其外表面环绕着可以跟Zr⁴⁺结合的磷酸头部。因此，我们设计了一种快速、简便的恶性胶质瘤外泌体的检测新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于Zr-MOFs与磷脂双分子层相互作用的无标记和无酶电化学生物传感器，用于恶性胶质瘤外泌体的检测，进而预测早期恶性胶质瘤患者。

为了达到解决上述问题的目的，本发明采用以下机理：在金电极上修饰可选择性结合EGFR和EGFRvIII的肽序列(P1)，特异性地捕获恶性胶质瘤外泌体。然后，用巯基己醇溶液对金电极表明进行非特异性结合位点封闭处理。之后，电极表面孵育负载亚甲基蓝(MB)的MB@Zr-MOF信号标签，由于Zr⁴⁺与恶性胶质瘤分泌的外泌体磷酸头部的相互作用，产生特异性的电化学信号。在Tris-HCl缓冲液中，通过监测MB的电化学信号，可以定量检测外泌体的浓度。该策略为恶性胶质瘤患者的早期诊断和预后监测提供了一个简单、快速、通用的平台，在临床中显示出潜在的应用。

本发明的技术方案包括如下：

一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用，其特征在于该传感器是在金电极表面修饰一条多肽链(P1)，通过特异性结合EGFR和EGFRvIII进而选择性的捕获恶性胶质瘤分泌的外泌体。负载亚甲基蓝(MB)的MB@Zr-MOF信号探针的制备以及其与恶性胶质瘤分泌的外泌体结合。

其中，所述的多肽链序列为H-Cys-acp-acp-Phe-Ala-Leu-Gly-Glu-Ala-NH2，其中acp为氨基己酸。

其中，锆金属-有机框架包括任何以锆为金属配体的任何一种MOF材料。

本发明所述的一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用由以下步骤构成：

1.外泌体的分离：(1)将人胶质瘤细胞置于细胞培养基中培养，其中培养基添加10％(V/V)的胎牛血清、1％(V/V)青霉素/链霉素，放置37℃含有5％CO₂的培养箱中培养；(2)在细胞生长到70％后，收集培养基，根据标准的超速离心法提取胶质瘤细胞外泌体，用缓冲液重悬，-80℃保存备用。。

2.负载亚甲基蓝的锆离子金属-有机框架的制备：(1)利用锆的金属前驱体、有机配体溶解在10mL DMF中并转移到Teflon衬里中，超声处理后，高温静置反应。其中锆的金属前驱体包括四氧化锆、二氯化锆、正丁醇锆、正丙醇锆中的至少一种，浓度为5-25mg/mL；其中有机配体锆的前驱体包括四氧化锆、二氯化锆、正丁醇锆、正丙醇锆中的至少一种，浓度为5-20mg/mL；其中反应温度为100-200℃；其中反应时间为10-24小时。(2)适量比例的MB与Zr-MOF混合，在室温下搅拌24小时。离心收集产生的MB@Zr-MOF沉淀，离子水洗涤三次。

3.金电极的处理：(1)金电极用水虎鱼溶液浸泡5分钟，超纯水冲洗；(2)用氧化铝浆料(1μm、0.3μm和0.05μm)进行抛光，分别在乙醇和蒸馏水中超声处理5分钟；(3)电极浸泡在硝酸(50％)中30分钟，用0.5M H₂SO₄扫描其的氧化还原电位，氮气吹干；(4)电极浸泡在含有1-20μM多肽的缓冲液中4℃孵育过夜；(5)巯基己醇溶液对金电极表面进行非特异性结合位点封闭处理，双蒸馏水冲洗，氮气吹干，得到含有多肽组装层的金电极。

4.进行外泌体的电化学检测。

本发明所述的一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用，采用三电极检测系统，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，该方法的具体步骤为：

(1)将修饰好的电极与含有不同浓度的外泌体在室温下孵育2小时，进行外泌体特异性的捕获。其中外泌体的浓度为9.5×10³-9.5×10⁷个/μL。

(2)将电极浸泡在含有5％的吐温-20溶液中30分钟，排除非特异性吸附。

(3)一定浓度的MB@MOF的信号探针与电极孵育30分钟，进行特定的信号标记。

(4)将修饰好的电极洗涤三次，浸入电化学缓冲溶液中进行电化学的测量。

本发明电化学信号变化的原理在于：

原理如图1，首先，在室温下成功地合成功能性MB@Zr-MOF。然后，将设计好的肽组装在电极表面形成传感层，特异性地识别EGFR或EGFRvIII并选择性捕获靶外泌体。含有蛋白质结合序列的肽在N端用6-氨基己酸和半胱氨酸延长，以增加柔韧性和与金电极结合力。随后，用巯基己醇溶液处理金电极防止非特异位点吸附。电极表面孵育MB@Zr-MOF信号标签，由于Zr⁴⁺与恶性胶质瘤分泌的外泌体磷酸头部的相互作用，产生特异性的电化学信号。因此，该生物传感器能够快速、简便地用于恶性胶质瘤外泌体的定量分析。

本发明所述的一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法及其应用，至少具有以下有益效果：

(1)本发明首次使用负载亚甲基蓝的锆金属有机框架应用于电化学传感器的制备。

(2)本发明首次利用锆金属有机框架和外泌体表面磷酸根的相互作用，应用于外泌体的检测中。

(3)本发明制备的电化学传感器，其制作成本低廉，工艺简单，操作容易。

(4)本发明制备的电化学传感器不仅可以用于胶质瘤外泌体的检测，也有望用于其他疾病的诊断，为临床检测提供了新的思路，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明的原理图。

图2为不同浓度的外泌体电化学信号变化图。

图3为电化学传感器特异性结果图。

具体实施方式

实施例1：基于锆金属-有机框架的恶性胶质瘤外泌体检测。

步骤一：将人胶质瘤细胞置于细胞培养基中培养，其中培养基添加10％(V/V)的胎牛血清、1％(V/V)青霉素/链霉素，放置37℃含有5％CO₂的培养箱中培养。在细胞生长到70％后，收集培养基，根据标准的超速离心法提取胶质瘤细胞外泌体，用缓冲液重悬，-80℃保存备用。

步骤二：负载亚甲基蓝的锆金属有机框架的制备：将ZrCl4(120mg)，氨基对苯二甲酸(110mg)和苯甲酸(1.9g)溶解在10mL DMF中并转移到Teflon衬里中。超声处理3分钟后，放入120℃，静置反应24小时。通过离心获得所得产物，并用新鲜DMF和甲醇(8,000rpm，5分钟)重复洗涤三次，在65℃下干燥过夜后收集锆金属有机框架纳米颗粒。适量比例的MB与Zr-MOF混合，在室温下搅拌24小时。离心收集产生的MB@Zr-MOF沉淀，用去离子水洗涤三次。

步骤三：金电极用水虎鱼溶液浸泡5分钟，超纯水冲洗。用氧化铝浆料(1μm、0.3μm和0.05μm)进行抛光，分别在乙醇和蒸馏水中超声处理5分钟，电极浸泡在硝酸(50％)中30分钟，用0.5M H₂SO₄扫描其的氧化还原电位，氮气吹干，电极浸泡在含有1-20μM多肽的缓冲液中4℃孵育过夜，巯基己醇溶液对金电极表明进行非特异性结合位点封闭处理，双蒸馏水冲洗，氮气吹干，得到含有多肽组装层的金电极。

步骤四：将修饰好的电极与含有不同浓度的外泌体在室温下孵育2小时，进行外泌体特异性的捕获。其中外泌体的浓度为9.5×10³-9.5×10⁷个/μL。电极浸泡在含有5％的吐温-20溶液中30分钟，排除非特异性吸附。稀释到一定浓度的MB@MOF的信号探针与电极孵育30分钟，进行特定的标记。将修饰好的电极洗涤三次，浸入电化学缓冲溶液中进行电化学的测量。

结果如图2所示，随着外泌体数量的增加，电化学电流逐渐增大。之间的线性关系可以建立峰值电流的对数液浓度从9.5×10³到1.9×10⁷个/μL之前，线性方程为y＝-5.32+1.63x。计算得出最小检出范围为8×10³个/μL，证明了我们方法的灵敏性。

实施例2：生物传感器的应用性检测研究。

为了验证本发明的应用性，本发明将细胞外泌体稀释到血清中，按照实例1的操作步骤进行生物传感器的应用性检测研究。结果如图3所示，在相同的实验条件下，外泌体稀释到血清与缓冲液中的电化学信号基本一致，表明血清中存在的干扰不影响该传感器，说明该传感器可以很好地用于复杂的生物样品中检测，证实了本发明的传感器具的潜在临床应用价值。

Claims

1.一种基于锆金属-有机框架的电化学传感器的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)外泌体的分离：①将人胶质瘤细胞置于细胞培养基中培养，其中培养基添加10％V/V的胎牛血清、1％V/V青霉素/链霉素，放置37℃含有5％CO₂的培养箱中培养；②在细胞生长到70％后，收集培养基，根据标准的超速离心法提取胶质瘤细胞外泌体；

(2)负载亚甲基蓝的锆离子金属-有机框架MB@Zr-MOF的制备：①利用锆的金属前驱体、有机配体溶解在10mL DMF中并转移到Teflon衬里中，超声处理后，高温静置反应；其中锆的金属前驱体包括四氯化锆、二氯氧化锆、正丁醇锆、正丙醇锆中的至少一种，浓度为5-25mg/mL；其中高温静置反应温度为100-200℃，反应时间为10-24小时；②适量比例的MB与Zr-MOF混合，在室温下搅拌24小时，离心收集产生的MB@Zr-MOF沉淀，离子水洗涤三次；

(3)金电极的处理：①金电极用水虎鱼溶液浸泡5分钟，超纯水冲洗；②用不同粒径的氧化铝浆料1μm、0.3μm和0.05μm进行抛光，分别在乙醇和蒸馏水中超声处理5分钟；③电极浸泡在50％的硝酸中30分钟，然后用0.5M H₂SO₄扫描其氧化还原电位，氮气吹干；④电极浸泡在含有1-20μM多肽的缓冲液中，放置于4℃孵育过夜，其中多肽序列为：H-Cys-acp-acp-Phe-Ala-Leu-Gly-Glu-Ala-NH₂，其中acp为氨基己酸；⑤巯基己醇溶液对金电极表面进行非特异性结合位点封闭处理，双蒸馏水冲洗，氮气吹干，得到含有多肽组装层的金电极；

(4)进行外泌体的电化学检测。

2.一种根据权利要求1所述制备方法制备的电化学传感器应用，采用三电极检测系统，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，其特征在于包括如下具体步骤：

(1)将修饰好的电极与含有不同浓度的外泌体在室温下孵育2小时，进行外泌体特异的捕获，其中外泌体的浓度为9.5×10³-9.5×10⁷个/μL；

(2)将电极浸泡在含有5％的吐温-20溶液中30分钟，排除非特异性吸附；

(3)一定浓度的MB@Zr-MOF的信号探针与电极孵育30分钟，进行特定的信号标记；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的电化学传感器可以通过MB@Zr-MOF与外泌体表面磷酸基团的相互作用用于恶性胶质瘤外泌体的分析检测。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，该传感器的信号变化包括以下步骤：

首先，在室温下成功地合成功能性MB@Zr-MOF；然后，将设计好的肽组装在电极表面形成传感层，特异性地识别EGFR或EGFRvIII并选择性捕获靶外泌体；含有蛋白质结合序列的肽在N端用6-氨基己酸和半胱氨酸延长，以增加柔韧性和与金电极结合力；随后，用巯基己醇溶液处理金电极防止非特异位点吸附；电极表面孵育MB@Zr-MOF信号标签，由于Zr基团与恶性胶质瘤分泌的外泌体磷酸头部的相互作用，产生特异性的电化学信号；因此，该电化学传感器能够快速、简便地用于恶性胶质瘤外泌体的定量分析。