CN114660135B - 一种pd-l1外泌体电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PD‑L1外泌体电化学传感器及其制备方法和应用，其传感器电极由蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC进行功能化修饰。

Description

一种PD-L1外泌体电化学传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及电化学传感器，尤其涉及PD-L1外泌体电化学传感器。

背景技术

免疫系统对机体的免疫反应和功能起着重要的作用，可维持机体内部环境的平衡和稳定。免疫逃逸机制被认为是诱发癌症的关键因素之一。

程序性死亡配体1(PD-L1)是调节T细胞免疫应答的主要分子之一。PD-1和PD-L1都是属于CD28/B7/CTLA-4蛋白家族的I型跨膜蛋白。PD-L1由一个含有IgC样和IgV样结构域的细胞外结构、一个疏水性跨膜结构域和一个短胞内结构域组成。其组成性低表达位于抗原呈递细胞、血管内皮细胞和免疫特权组织(如胎盘、睾丸、眼睛)或其他部位。PD-L1也可能因致癌过程中的驱动致癌事件而过度表达，PD-L1生物学功能的实现主要取决于对PD-1的特异性识别。PD-1主要表达于成熟淋巴细胞和骨髓细胞的细胞膜表面，由疏水跨膜结构域、胞外IgV样结构域和胞内结构域组成，其中存在两个酪氨酸残基，为N端酪氨酸抑制基序(ITIM)和C端酪氨酸转换基序(ITSM)。PD-L1在许多恶性肿瘤中呈高水平表达，如黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌等，提示PD-L1参与肿瘤的发生发展，在减弱抗肿瘤免疫反应中起重要作用。目前，现有的文献指出PD-L1外泌体在疾病诊断过程与疾病进程相关。因此，PD-L1外泌体的检测成为多种肿瘤免疫治疗的重要指标。对于PD-L1外泌体的临床检测对肿瘤的早期诊断、诊疗方案的确定、治疗剂量的优化以及药物疗效的评价具有重要意义。

虽然最常用的肿瘤检测免疫组化(IHC)可以直观地评估病变组织的生理和病理状况，但这种侵入性诊断方法依赖于医生的主观判断来评估患者是否患有癌症，这可能会导致假阳性诊断结果。此外，组织切片厚度、抗体孵育时间、染色程度等IHC的前期操作都会影响诊断结果。因此在诊断过程中需要更客观的辅助方式来综合评估患者的病情，如PD-L1外泌体浓度的精确数字。有多种新兴的PD-L1检测方法。如可测量原发灶和转移灶中PD-L1表达的放射性核素标记核医学影像、具有快速检测和多样本分析优势的流式细胞术等，均可作为IHC的辅助手段诊断癌症。实验室常规的聚合酶链反应(PCR)技术可直接在核酸水平特异性检测sPD-L1基因。蛋白质是生物功能的执行者，而基因表达水平与蛋白质表达水平之间没有绝对对应关系，所以通过基因检测很难准确反映病理状态，并且由于其成本较高，一直受到很大的限制。而且现有方法依旧不能将PD-L1外泌体低表达的患者与健康人区分开，也不能预测部分患者(约15％的患者)的临床结果，灵敏度还有待提高。并且PD-L1外泌体在人血清和各种体液中的低表达程度影响了PD-L1外泌体检测的准确性，PD-L1外泌体的定量需要更高的灵敏度、更快的响应速度和更准确的诊断结果。鉴于这种现状，迫切需要开发一种有效的PD-L1外泌体检测方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供超灵敏的免疫电化学传感器。用以实现对PD-L1外泌体的检测。本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法。

为达到上述目的，本方法的本发明采用如下机理：电化学分析具有灵敏度高、无需标记、实时监测和技术廉价等优点，为外泌体疾病标志物的医学诊断提供了巨大的潜力。肽在分析检测中作为识别分子具有优势，但它们的亲和力和选择性比抗体弱。因此，上述识别探针限制了开发测定的灵敏度。同时，用修饰电极直接检测临床样品中的目标分子，会引发蛋白质非特异性吸附引起的生物污染，降低生物测定的灵敏度和准确性。多价相互作用是克服探针弱结合亲和力的主要策略，本发明提出具有多个分支序列的肽可以提高肽探针对靶标结合亲和力，同时提高防污性能。

本发明设计了一种简便且灵敏的电化学传感器来定量PD-L1外泌体的水平。模拟蟹爪防污肽电极界面，用于血清中高灵敏度和简便的PD-L1外泌体检测。由于多种原因，蟹爪多价防污肽对PD-L1外泌体的结合亲和力高于直链肽。识别探针的增强提高了界面与靶点的相互作用的可能性。最重要的是，单肽上的多识别分子和多个受体之间的互作显着改善了结合亲和力。同时，基于EKEKEK的多状防污结构，进一步提高了传感器的防污能力，减少了BSA等防污蛋白加入的步骤。Zr⁴⁺和AgNCs的先后加入，实现高选择性和稳定结合，不受蛋白变性的干扰，并且进一步提高了PD-L1外泌体的检测灵敏度和高特异性。通过这种模式，一种高效的“互作识别”策略被构建出来。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种PD-L1外泌体电化学传感器，其传感器电极由蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC进行功能化修饰。

进一步地，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应后，用缓冲液洗涤金电极表面。

本发明还提供了一种PD-L1外泌体电化学传感器的制备方法，用蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC对传感器电极进行功能化修饰，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应，然后用缓冲液洗涤金电极表面。

进一步地，反应时间约1小时。

本发明最后提供了一种PD-L1外泌体电化学传感器的应用，包括步骤：

(1)用蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC对传感器电极进行功能化修饰；

(2)靶标溶液中加入电极界面进行孵育；

(3)在电极界面加入Zr⁴⁺和AgNCs孵育；

(4)将电极安装到电化学工作站仪器上，通过电化学DPV检测PD-L1外泌体。

进一步地，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应，然后用缓冲液洗涤金电极表面。

进一步地，反应时间约1小时。

进一步地，AgNCs的合成步骤为：在AgNO₃溶液中加入柠檬酸三钠溶液在室温下搅拌，然后加入NaBH₄并在黑暗中反应以获得AgNCs。

进一步地，靶标溶液的孵育时间为1小时，Zr⁴⁺和AgNCs孵育时间为0.5小时。

进一步地，提供了一种孵育盒，孵育盒包括可扣合的第一盒体和第二盒体，在第一盒体内放置电极，在第二盒体内滴入修饰物或靶标物溶液，然后将第一盒体和第二盒体扣合，使得电极的金电极表面浸在修饰物或靶标物溶液中，通过旋转夹爪从两端夹持孵育盒，并绕其轴线旋转进行离心式孵育，使得修饰物或靶标物溶液中修饰物或靶标物沉积固定在电极的金电极表面。

本发明设计了一种基于蟹爪多价防污肽的免疫电化学传感器模型，可以优异的捕捉有活性的PD-L1外泌体。本发明设计的传感器利用仿生蟹爪多价序列，实现囊泡形靶标结合亲和力提高及防污性能提升。该方法是高效蟹爪多价防污肽的开发及其后续的衍生应用。测试结果表明该方法具有高的灵敏度和宽的线性范围。这种传感模式为开发更直接有效的生物传感器提供了实际的临床应用价值。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例中的蟹爪多价防污肽的功能验证结果图；

图2是本发明的一个较佳实施例中的为不同浓度的PD-L1外泌体引起的电化学信号变化图；

图3是本发明的一个较佳实施例中的孵育盒的工作状态示意图；

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本实施例中蟹爪多价防污肽({[(NYSKPTDRQYHFKE)₄]KE}₂KEPPPPC)修饰的金片特异性结合PD-L1外泌体的电化学测定方法和步骤如下：

(1)AgNCs是通过经典的还原方法合成的。首先，在圆底烧瓶中加入100mL 0.25mMAgNO₃溶液和100mL 0.25mM柠檬酸三钠溶液并在室温下搅拌30分钟。加入6mL 5mM NaBH₄并在黑暗中反应12小时以获得AgNCs。将最终溶液放置并储存在4℃的冰箱中以备将来使用。

(2)电化学方法测定P-tau：

所用电极为市场所买，首先，蟹爪多价防污肽的功能化修饰步骤如下：将约100μL蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP打断自形成的二硫键，加入至电极界面，反应时间约为1小时，用缓冲液洗涤金电极表面以洗脱未连接的蟹爪多价防污肽。然后，100μL的靶标溶液中加入电极界面，孵育1小时，随后洗涤金电极表面去除未结合靶标。随后在电极界面加入Zr⁴⁺和AgNCs，实现配位结合，孵育0.5小时，随后冲洗电极界面。之后，将附着有蟹爪多价防污肽的电极安装到电化学工作站仪器上。并通过电化学DPV检测不同浓度PD-L1外泌体引起电化学信号变化。

采用PD-L1外泌体浓度分别为：78particle/ml，782particle/ml，7820particle/ml，78200particle/ml，782000particle/ml，7820000particle/ml，78200000particle/ml。

测试条件：使用电化学工作站(AutolabPGSTAT128Nsystem)，以30min作为孵育时间，在室温条件下进行不同浓度PD-L1作用下的电化学DPV测定。

参见附图，图2为不同浓度的PD-L1外泌体引起的电化学信号变化图。

由图可见：随着PD-L1外泌体浓度的增大，导致的电化学信号也越大。因此可以对其进行灵敏的定量分析。

参见附图，图1为蟹爪多价防污肽的功能验证，具体为：(A)直链肽对于PD-L1外泌体的多价结合能力。(B)蟹爪多价防污肽对于PD-L1外泌体的多价结合能力。(C)蟹爪多价防污肽与直链肽的结合亲和力对比。(D)蟹爪多价防污肽/直链肽/裸金片的BSA变化量。(E)蟹爪多价防污肽/直链肽/裸金片的血清变化量(n＝3)。由图可知，蟹爪多价防污肽相对于直链肽对于相同浓度PD-L1外泌体的捕获能力更强，并且所需浓度更低。SPR的亲和力对比实验中，蟹爪多价防污肽相对于直链肽与PD-L1外泌体有更强的结合亲和力，从253nM降至57nM。上述的结果证明蟹爪多价防污肽基于多价相互作用，对于PD-L1外泌体有更强的结合力；不同浓度的BSA和血清电化学防污实验，验证了蟹爪多价防污肽有效的降低了血清污染，并相对于直链肽防污性能有进一步的提高。

图2为不同PD-L1外泌体浓度与DPV变化间的线性相关关系。由图可见：随着PD-L1外泌体浓度的增大，造成的DPV变化也越大，并且PD-L1外泌体浓度与DPV变化间呈现出较好的线性相关关系。线性方程为：y＝8.38943-11.325×lgCPD-L1外泌体，线性相关系数为0.966，检测限为75particle/mL，符合检测要求。

如图3所示，为使修饰物或靶标物更快更紧密地固定在电极4的金电极表面3表面，加快孵育时间，提供了一种孵育盒，孵育盒包括可扣合的第一盒体1和第二盒体2。再第一盒体1内放置电极4，在第二盒体2内滴入修饰物或靶标物溶液5。然后将第一盒体1和第二盒体2扣合，使得电极4的金电极表面3浸在修饰物或靶标物溶液中，通过旋转夹爪6从两端夹持孵育盒，并绕其轴线旋转进行离心式孵育，使得修饰物或靶标物溶液中修饰物或靶标物更快更紧密地沉积固定在电极4的金电极表面3表面。

本发明利用蟹爪多价防污肽的多价相互作用，实现了传感器对于PD-L1外泌体结合力的提高，并进一步提升了界面防污能力，并且通过Zr⁴⁺-AgNCs复合物对DPV进行信号放大。该方法不仅拥有高的特异性和选择性，而且具有高的灵敏度，能检测极微量的PD-L1外泌体。我们构建的高特异性和双重选择的简便的电化学免疫传感器为血液中的总PD-L1外泌体的检测提供了一种更方便快捷和准确的方法。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种PD-L1外泌体电化学传感器的应用，其特征在于，包括步骤：

(1)用蟹爪多价防污肽{[(NYSKPTDRQYHFKE)4]KE}2KEPPPPC对传感器电极进行功能化修饰；

(2)靶标溶液中加入电极界面进行孵育；

(3)在电极界面加入Zr⁴⁺和AgNCs孵育；

(4)将电极安装到电化学工作站仪器上，通过电化学DPV检测PD-L1外泌体。

2.如权利要求1所述的PD-L1外泌体电化学传感器的应用，其中，修饰步骤为：将蟹爪多价防污肽溶液加入TCEP后，加入至电极界面进行反应，然后用缓冲液洗涤金电极表面。

3.如权利要求2所述的PD-L1外泌体电化学传感器的应用，其中，反应时间1小时。

4.如权利要求1所述的PD-L1外泌体电化学传感器的应用，其中，AgNCs的合成步骤为：在AgNO₃溶液中加入柠檬酸三钠溶液在室温下搅拌，然后加入NaBH₄并在黑暗中反应以获得AgNCs。

5.如权利要求1所述的PD-L1外泌体电化学传感器的应用，其中，靶标溶液的孵育时间为1小时，Zr⁴⁺和AgNCs孵育时间为0.5小时。

6.如权利要求1所述的PD-L1外泌体电化学传感器的应用，其中，提供了一种孵育盒，孵育盒包括可扣合的第一盒体和第二盒体，在第一盒体内放置电极，在第二盒体内滴入修饰物或靶标物溶液，然后将第一盒体和第二盒体扣合，使得电极的金电极表面浸在修饰物或靶标物溶液中，通过旋转夹爪从两端夹持孵育盒，并绕其轴线旋转进行离心式孵育，使得修饰物或靶标物溶液中修饰物或靶标物沉积固定在电极的金电极表面。