JP5857385B2 - Ape1/ref−1を含有する膀胱癌診断用組成物、及びこれを利用した膀胱癌診断キット - Google Patents
Ape1/ref−1を含有する膀胱癌診断用組成物、及びこれを利用した膀胱癌診断キット Download PDFInfo
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Description
膀胱癌患者と正常者の血清内APE1/Ref−1の量を測定するために、抗凝固剤が入っている全血採取チューブを利用して正常者と膀胱癌患者の血液を採取した。膀胱癌患者51人と健康検診のために来院した正常者6人からそれぞれ10ml程度の血液を採取した。上記採取した血液を室温で揺らしながら放置した後、2500rpmで10分間遠心分離して上澄み液(すなわち、プラズマ)を分離した。分離した上澄み液を4℃の低温で保管した後、サンドイッチELSIAの遂行時に試料当り100μlずつ使用した。
APE1/Ref−1を認知する捕獲抗体として抗−APE1/Ref−1ポリクロナール抗体(Abcam、ab64865)を使用した。捕獲抗体に結合したAPE1/Ref−1を認知する検出抗体としては、抗−APE1/Ref−1モノクロナール抗体(Abcam、ab194)を使用した。APE1/Ref−1の標識物質としては、大膓菌から分離、精製した組み換えヒトAPE1/Ref−1−Hisを5倍ずつ連続的に希薄して(0−25ng)使用した。
コーティング緩衝液(0.5M炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH9.6)で捕獲抗体は200ng/mlの濃度に希薄してELISA用96−ウェルマイクロリットルプレート(BD Falcon 3072、Franklin、NJ)にコーティングした。プレートを4℃で一晩中コーティングした。結合していないAPE1/Ref−1ポリクロナール抗体を除去するために、プレートを洗滌溶液(PBS、0.05% Tween20)で3回洗滌した。洗滌した後に、プレートを遮断溶液(PBS、5% Bovine Serum Albumin、BSA)250μlで常温で1時間の間遮断した。膀胱癌患者と正常者の血漿試料を96−ウェルプレートにそれぞれ100μlずつ添加し、37℃で90分間反応させた。プレートを洗滌溶液で5回洗滌した。捕獲抗体に結合したAPE1/Ref−1の程度を調べるために、検出抗体の抗−APE1/Ref−1モノクロナール抗体を200ng/mlの濃度に希薄して室温で2時間の間反応させた。プレートを洗滌溶液で7回洗滌した。検出抗体を認知するHRP−接合した抗−マウスIgG二次抗体を、1:5000に希薄してプレートに添加した。プレートを30分間の間室温で反応させ、洗滌溶液で5回洗滌した。プレートにテトラメチルベンジデン(tetramethyl benzidine、TMB)ペルオキシターゼ基質及びペルオキシターゼ溶液(BD555214、Franklin、NJ)を添加した。プレートを室温で色が現われ出しながら4分間反応させて規則的に揺らした。反応停止液として2.5M H2SO4を添加して450nmで吸光度を測定した。
精製分離した組み換えヒトAPE1/Ref−Hisを0−25ngの範囲内で連続希薄して直線性を提示する標準曲線を得て、表1及び図1に示した。
Claims (4)
- 膀胱癌を診断するために、血液中のAPE1/Ref−1の濃度を測定する方法であって、
血液中のAPE1/Ref−1に捕獲抗体を結合することと、
検出抗体を用いて前記捕獲抗体に結合したAPE1/Ref−1を検出することと、
検出されたAPE1/Ref−1を用いて前記血液中のAPE1/Ref−1の濃度を測定することと
を含むことを特徴とする方法。 - 前記血液が全血であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記捕獲抗体が、抗−APE1/Ref−1ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記検出抗体が、抗−APE1/Ref−1モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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