CN108931641A - 特发性炎性肌病检测的生物标志物及其用途 - Google Patents

特发性炎性肌病检测的生物标志物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了甘氨酸N‑甲基转移酶，即GNMT，或其片段在制备用于诊断特发性炎性肌病的试剂中的用途。本发明采用高密度蛋白芯片技术进行PM/DM相关自身抗体靶抗原的筛查，确定91个PM/DM相关自身抗体。采用91个PM/DM相关自身抗体对应靶抗原构建制备PM/DM相关自身抗体靶抗原芯片，进行临床扩大样本验证。研究结果显示抗GNMT(甘氨酸N‑甲基转移酶)抗体在PM组的阳性率为25.00％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝1.24×10‑13)，结果差异具有显著性；在DM组的阳性率为6.11％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝0.07×10‑2)，结果差异具有显著性；在PM/DM组的阳性率为11.33％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝9.64×10‑9)，结果差异具有显著性。表明抗GNMT抗体可用作特发性炎性肌病的诊断和检测标志物。

Description

特发性炎性肌病检测的生物标志物及其用途
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及多发性肌炎和/或皮肌炎检测的生物标志物及其用途。
背景技术
特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies，IIMs)是以近端对称性肌无力和多器官受累为特征的异质性疾病，主要包括多发性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)、免疫介导坏死性肌病(immune-mediated necrotizingmyopathy，IMNM)、散发性包涵体肌炎(sporadic inclusion body myositis，sIBM)和幼年特发性肌炎(juvenile idiopathic myositis，JIM)等临床亚型。PM/DM是一种横纹肌非化脓性炎性肌病的自身免疫性疾病。其临床特点是血清肌酶升高，肌电图呈肌源性改变，以肢带肌、颈肌及咽肌等肌组织出现炎症、变性改变，导致对称性肌无力和一定程度的肌萎缩，最终累及多个系统和器官导致患者死亡。PM/DM在我国并不少见，女性多见，男女比例约为1：2。本病可发生在任何年龄，呈双峰型，在儿童5–14岁和成人45–60岁各出现一个高峰，容易出现肺间质病变(interstitial lung disease，ILD)，该并发症是影响PM/DM预后的重要影响因素。
自身抗体是指针对自身组织、器官、细胞及细胞成分的抗体，是人体体液免疫系统对外防御病原菌入侵和对内保持自身机体生长平衡的重要武器。血清自身抗体标志物在自身免疫病的发病过程中产生，而且往往会在疾病具有典型临床表现和任何实验室或影像学检测异常前数年甚至10余年前出现。有证据表明PM/DM的发病是与自身免疫有关：(1)病理组织学检查显示患者的肌肉组织出现T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和浆细胞；(2)血清检测发现PM/DM患者存在针对细胞核细胞浆成分的自身抗体。根据自身抗体对疾病的诊断价值，把与肌炎有关的自身抗体分为两类：肌炎特异性抗体(myositis-specificautoantibodies，MSAs)及肌炎相关性抗体(myositis-associated autoantibodies，MAAs)。目前已报道MSAs有抗ARS抗体(抗Jo-1、PL-7、PL-12、EJ、OJ、KS、YRS、Zo抗体)、抗Mi-2抗体、抗MDA5抗体、抗TIF1抗体、抗NXP2抗体、抗SAE抗体、抗SRP抗体、抗HMGCR抗体、抗cN1A抗体；MAAs有抗PM-Scl抗体、抗Ku抗体、抗SSA抗体、抗Ro50抗体、抗U1-RNP抗体、抗SSB抗体、AECA。MSAs可与特定的临床亚型相关，有助于预测并发症，辅助肌炎的诊断、预后判断和提示临床选择正确的治疗策略。
抗ARS抗体阳性的肌炎患者通常诊断为抗合成酶抗体综合征(anti-synthetasesyndrorme，ASS)。此类患者具有一组特殊的症候群：ILD、雷诺现象、技工手、非侵蚀性关节炎、发热或可伴有皮疹。最常见的是抗Jo-1抗体，它可出现在9％-24％IIMs患者中。抗Mi-2抗体是一种DM特异性抗体，其靶抗原是核小体重塑和脱乙酰化酶(NuRD)复合体，该抗体在成年型DM中的阳性率为11％-59％，在幼年型皮肌炎(juvenile dermatomyositis，JDM)中的阳性率为4-10％，抗Mi-2抗体阳性的肌炎患者病情相对较轻，会出现关节痛、关节炎、雷诺现象和ILD等临床表现，治疗反应和预后相对较好。抗MDA5抗体是DM特异性抗体，其靶抗原是黑色素瘤分化相关蛋白5，最常见于临床无肌病性皮肌炎(Clinically amyopathicdermatomyositis，CADM)患者中，与临床表现密切关联：抗MDA5抗体与皮肤溃烂、可触痛的手掌丘疹等皮肤表型特征显著相关，可增加口腔疼痛/溃疡、手肿、关节炎/关节痛和弥漫性脱发的风险，对肌炎相关的快速进展型间质性肺病(rapidly progressive interstitiallung disease，RPILD)具有较高诊断价值。抗TIF1抗体是DM特异性抗体，其靶抗原为转录中介因子1家族蛋白，包括抗TIF1α、抗TIF1β、抗TIF1γ抗体三种亚型。抗TIF1抗体在成年和儿童患者中均可出现，成年型PM/DM出现频率为13-31％，JDM出现频率为22-29％。因TIF1蛋白在肿瘤发生中起着关键作用，故这些抗体可能是由于体内出现异常抗肿瘤免疫而产生，抗TIF1抗体最常见于肿瘤相关性肌炎(cancer-associated myositis，CAM)。抗NXP2抗体主要出现在幼年型肌炎患者的血清中，其靶抗原为核基质蛋白2，该抗体阳性率为23％-25％，在成人肌炎患者中的阳性率为1％-17％，抗NXP2抗体阳性的JDM患者以肌肉挛缩及萎缩和肌肉功能显著损害为特征，该抗体与钙质沉着相关。抗SAE抗体靶抗原是小泛素样修饰物-1(SUMO-1)激活酶异二聚体：SAE1和SAE2，是主要与DM相关的自身抗体，大部分阳性患者首先会出现皮肤病变，随后可发展严重吞咽困难。抗SRP抗体其靶抗原是信号肽识别粒子，出现在5％的白种成年型PM/DM，8％-13％亚非成年型PM/DM和2％JDM患者中，主要见于IMNM。抗HMGCR抗体靶抗原是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，该抗体的产生与他汀类药物的使用相关，可以作为诊断标志物，还可作为疾病预后标志物。抗HMGCR抗体阳性患者的主要临床特征是肌无力和吞咽困难。抗cN1A抗体是目前所发现的第一种对sIBM特异的抗体，靶抗原是胞质5'核苷酸酶，该抗体与临床特征、治疗反应和预后判断的关系有待进一步研究。
约50％的成人PM/DM患者血清中可检测到上述自身抗体的存在，但是仍有相当一部分的患者血清中没有检测到自身抗体。在临床诊疗实践中，自身抗体阴性PM/DM患者得不到正确的诊断和及时的治疗。由于PM/DM的发病机理、病因尚不明确，且缺乏诊断的特异性实验室指标，目前主要依据肌肉活检、肌电图检查及临床表现综合判断，诊断难度较大。不同类型的特发性炎症性肌病可累及皮肤、肺和肌肉等不同靶器官，因此临床表现比较复杂，难以做到早期诊断、早期治疗，且已有研究报道免疫性坏死性肌病与肌营养不良患者具有相似的病理改变，因此部分患者容易被误诊。PM/DM的早期病变一般属于临床治疗可逆转期或部分可逆转期，治疗效果较好；而后期或终末期属于临床治疗不可逆转期，愈后不佳，死亡率高，后果严重。因此，PM/DM疾病的早期诊断、早期治疗尤为重要。自身抗体可以在自身免疫病临床症状出现前10年，甚至更早出现在患者体内，因此，要彻底做到实际意义上的早期诊断以及早期有效治疗，进一步全面系统研究PM/DM的血清抗体全貌，找到用于PM/DM疾病诊断相关的标志物，是PM/DM疾病研究的重点及临床急待解决的问题。
发明内容
PM/DM是一组具有临床异质性的罕见的自身免疫病。自身抗体对PM/DM的诊断特异性高，随着检测方法的进步，越来越多与PM/DM相关的自身抗体为疾病的早期发现、诊断、治疗和预后提供重要的参考意义。然而，目前已报道的与PM/DM相关的自身抗体敏感性均较低，找到新的标志物仍是PM/DM的研究重点和临床亟待解决的问题。
为了解决上述问题，本发明提供甘氨酸N-甲基转移酶，即GNMT，或其片段在制备用于诊断特发性炎性肌病的试剂中的用途。
在本发明优选的实施方案中，所述的特发性炎性肌病包括但不限于多发性肌炎、皮肌炎或或多发性肌炎/皮肌炎。
其中，所述诊断包括：测定获自呈现特发性炎性肌病的患者的生物样品中对GNMT或其片段的反应性的抗体的水平；任选地，
与对照数据比较所述生物样品中抗体的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中对GNMT为反应性的抗体的可检测地提高表明患特发性炎性肌病的可能性。
其中，所述生物样品为血清样品。
其中，GNMT抗体的水平通过以下步骤来测量，包括：
a.使来自患者的生物样品与GNMT或其片段接触；
b.在生物样品中存在的抗体与GNMT或其片段之间形成抗体-蛋白质复合物；
c.洗涤来除去任何未结合的抗体；
d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和
f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述患者中存在抗GNMT抗体。
其中，所述的GNMT或其片段沉积或固定在固相支持物上。
其中，所述支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。
其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
本发明还提供一种用于检测和/或定量生物样品中抗GNMT抗体的诊断试剂盒，包括：一种固相支持物，其中，所述的GNMT或其片段沉积或固定在固相支持物上，所述的抗GNMT抗体作为诊断特发性炎性肌病的生物标志物。
其中，所述诊断试剂盒还包括被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体。
其中，所述支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。
本发明采用高密度蛋白芯片技术对40例PM/DM患者、30例自身免疫病对照患者和20例健康对照进行PM/DM相关自身抗体靶抗原的筛查，对筛查结果进行统计分析，确定91个PM/DM相关自身抗体。为了确认这些PM/DM相关自身抗体的敏感性和特异性及临床应用价值，随后采用91个PM/DM相关自身抗体对应靶抗原构建制备PM/DM相关自身抗体靶抗原芯片，对397例PM/DM患者，200例疾病对照患者(包括40例RA，40例SLE，40例SS，40例SSc，40例慢性疾病)和100例健康对照的血清进行临床扩大样本验证。研究结果显示抗GNMT(甘氨酸N-甲基转移酶)抗体在PM组的阳性率为25.00％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝1.24×10-13)，结果差异具有显著性；在DM组的阳性率为6.11％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝0.07×10-2)，结果差异具有显著性；在PM/DM组的阳性率为11.33％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝9.64×10-9)，结果差异具有显著性。结果表明，抗GNMT抗体可用作特发性炎性肌病的诊断和检测标志物。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明纳入的437例PM/DM患者来源于北京协和医院以及行业基金课题支撑的医院。其中男性患者131例，女性患者306例，年龄范围2-79岁，平均年龄(44.07±16.57)岁。所有PM/DM患者均符合1975年Bohan/Peter的诊断标准，并除外其他自身免疫病，如类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥综合征( syndrome，SS)、系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)等。疾病对照组220例，包括46例RA，入组标准：1987年ACR分类诊断标准；47例SLE，入组标准：1997年ACR分类诊断标准；47例SS，入组标准：AECG分类诊断标准；50例SSc，入组标准：2013年SSc分类诊断标准；40例其他慢性疾病对照。健康对照组120例，来源于北京协和医院体检中心。严格按蛋白质组学研究要求留取样本，采集外周静脉血，2小时内分离血清后分装，-80℃冻存备用。
实施例1高密度蛋白芯片筛选PM/DM相关自身抗体
高密度蛋白芯片上所有的蛋白质抗原N端均带有用于蛋白纯化的GST标签。首先使用兔抗GST单克隆抗体与芯片蛋白杂交验证芯片质量。接着选取40例PM/DM患者血清、30例自身免疫病患者对照血清和20例健康对照血清与90张高密度蛋白芯片杂交，通过信号采集及数据分析鉴定候选PM/DM相关自身抗原。
1.1高密度蛋白芯片扫描数据的提取
采用GenePix 4000B芯片扫描仪进行高密度蛋白芯片扫描，获得TIFF格式灰度图像后，根据GenePix Pro 6.0软件的操作手册，按照高密度蛋白芯片上样点矩阵参数，由分析软件自动完成每个蛋白点信号像素分割提取，同时人工逐一检查芯片上所有蛋白点的信号强度，手工调整避开杂质、划痕等人为因素造成的蛋白信号点位置及大小的偏移，最后完成每张高密度蛋白芯片上所有蛋白抗原点信号强度的提取，并生成数据文档，后续进一步分析使用。
1.2高密度蛋白芯片检测质量评估
使用抗GST抗体杂交高密度蛋白芯片后的灰度图像，完成芯片每个蛋白点信号强度采集后，当芯片上探针的两平行点的信噪比(Signal to Noise Ratio，SNR)同时大于2时才认为芯片上该蛋白点可被检测。然后计算芯片上可被检测的蛋白质点的比例及每个蛋白两个平行点之间信号强度的相关性。
1.3高密度蛋白芯片检测血清自身抗体
用于高密度蛋白芯片检测的血清标本包括PM/DM患者40例，自身免疫病对照患者30例，正常对照20例。具体操作步骤如下：
(1)将-80℃保存的高密度蛋白芯片取出后，隔离空气平衡至室温，浸入5ml含3％BSA PBST的蛋白芯片封闭液中，室温封闭1小时(h)；
(2)取lμl血清标本按照1：1000的比例稀释于lml 3％BSA PBST中，震荡混匀，10000rpm*l0min离心，上清即为稀释好的血清。将蛋白芯片从封闭液中取出后，如果蛋白芯片表面有气泡，则用lml加样枪吸取孵育盒中封闭液体从顶端冲洗，用吸水纸将多余的封闭液从一侧尽量吸干，置于湿盒中。然后吸取150ul稀释好的血清加到蛋白芯片上，枪头不要碰到芯片以免破坏芯片上的蛋白抗原，缓慢加盖玻片封闭，避免产生气泡，室温孵育1h；
(3)将孵育好的蛋白芯片置于10ml PBST洗液中，小心取下盖玻片，芯片放入洗盒中用室温的PBST 40rpm漂洗3次，每次10min；
(4)取Alexa 647标记的山羊抗人IgG抗体，按照1：1000的比例稀释于3％BSA PBST中，震荡混匀，10000rpm*10min离心，上清即为稀释好的二抗。从洗盒中取出蛋白芯片，如果芯片表面有气泡，则用1ml加样枪吸取孵育盒中液体从顶端冲洗，用吸水纸从一侧吸干多余的洗液，置于湿盒中。将150μl稀释好的荧光二抗加到芯片上，缓慢加盖玻片封闭，避免产生气泡，室温避光孵育二抗1h；
(5)将孵育好的蛋白芯片置于PBST洗液中，小心取下盖玻片，芯片放入洗盒中用PBST 40rpm避光漂洗3次，每次10min；
(6)然后在室温用双蒸水(double distilled water，ddH20)40rpm避光漂洗蛋白芯片3次，每次10min；
(7)取出蛋白芯片，置于50ml离心管中，芯片上点有抗原蛋白的一面朝外，1000rpm离心2min，甩干芯片上残余的ddH20；
(8)GenePix 4000B芯片扫描仪扫描蛋白芯片，每次杂交完成后都设置相同的扫描参数扫描芯片。
1.4PM/DM相关自身抗体靶抗原的确定
将GenePix Pro 6.0软件采集到的每张高密度蛋白芯片上所有蛋白点的信号强度信息导入Excel表格中。用每个蛋白点的前景信号强度(F635median)除以该蛋白点周围背景信号强度(B635median)作为该蛋白点的信号值。即Iij＝F635median/B635median(Iij代表block j中的蛋白质i点的信号值)。蛋白质抗原蛋白点的信号值越趋近于1，说明血清中相应的自身抗体浓度越低，该抗体越不容易被检测到。信号值越高说明血清标本中该自身抗体的结合靶抗原蛋白质的能力越强。将同一个蛋白不同两个点信号强度的平均值作为该蛋白点在该芯片上的信号强度。当该平均值≥2时，认为该蛋白点为阳性。然后统计每份血清与高密度蛋白芯片上各蛋白质抗原免疫反应阳性率的信息。采用高通量芯片生物信息分析技术中常用的基因芯片显著性分析(SAM)方法对PM/DM患者组、自身免疫病对照组及正常对照组进行数据分析。
1.5结果
经分析确定的PM/DM相关靶抗原共计91个，这些靶抗原将纳入到PM/DM相关自身抗体靶抗原小芯片制备，详见表1。
表1制备PM/DM相关自身抗体靶抗原蛋白芯片的蛋白
实施例2 PM/DM相关自身抗体靶抗原蛋白质芯片的构建与血清筛选验证
自身免疫病患者由于遗传背景的不同以及环境影响因素的差异，同种自身免疫病不同患者个体之间所产生的自身抗体种类差异较大。为了确认采用高密度蛋白芯片进行小样本筛选出的PM/DM相关自身抗体是否具有临床意义和应用价值，以及这些自身抗体对PM/DM患者诊断的敏感性和特异性，本研究将实施例1高密度蛋白芯片筛选出的PM/DM相关自身抗体靶抗原制备成PM/DM相关自身抗体靶抗原蛋白质芯片进行临床扩大样本验证。用于PM/DM相关自身抗体靶抗原蛋白芯片进行临床大样本验证检测的血清标本包括PM/DM患者397例，疾病对照患者200例，健康对照100例。具体步骤如下：
(1)取出-80℃保存的PM/DM相关自身抗体靶抗原蛋白芯片后静置30min(避免冷凝水)，隔离空气恢复室温后，剪开包装，小心取出蛋白芯片，对着日光灯，按照芯片上每个Block的位置在芯片的正面放置围栏并用力压实贴好，然后正面向上放置到芯片杂交湿盒中；
(2)加入含有3％BSA的PBST(0.1％Tween20，v/v)缓冲液50微升于每个围栏的小方阵中，于37℃下封闭1小时；
(3)将蛋白芯片放置于50ml离心管中，芯片上有蛋白质抗原的一面朝外，1000rpm离心2min以去除每个小方阵中的液体；
(4)取1u1血清按照1：1000的比例稀释于lml 3％BSA PBST中，震荡混匀，10000rpm*10min离心，上清即为稀释好的血清；
(5)在PM/DM相关自身抗体靶抗原蛋白芯片每个小方阵中分别加入50ul稀释好的血清，避免产生气泡，室温孵育1h；
(6)将蛋白芯片浸泡于10毫升PBST洗液中置于脱色摇床上缓慢摇动漂洗3次，40转/分钟，每次10min；
(7)从洗盒中取出蛋白芯片，将芯片放置于50ml离心管中，芯片上有蛋白质抗原的一面朝外，1000rpm离心2min，离心去除每个小方阵中的液体；
(8)取Alexa 647标记的山羊抗人IgG抗体，按照1：1000的比例稀释于3％BSA PBST中，震荡混匀，10000rpm*10min离心，上清即为稀释好的二抗；
(9)在蛋白芯片每个小方阵中加入50微升1:1000稀释的A1exa647标记山羊抗人IgG抗体，37℃避光孵育1小时；
(10)小心将粘贴在蛋白芯片上的14孔围栏撕下后，将芯片浸泡于10毫升PBST洗液中，置于脱色摇床上缓慢摇动，避光漂洗3次，40转/分钟，每次10min；
(11)然后用10ml ddH20避光漂洗蛋白芯片3次，每次10min。将蛋白芯片放置于50ml离心管中，芯片上有蛋白质探针的一面朝外，1000rpm离心2min以去除芯片上残留的液体；
(12)用芯片扫描仪进行蛋白芯片扫描。参数的设置如下：激发光波长为635nm，光电倍增管检测器(PMT)设置为650，电源(Power)设置为90，扫描像素设置为5um。
将GenePix Pro 6.0软件采集到的每张蛋白芯片上所有蛋白点的信号强度信息导入Excel表格中。用每个蛋白点的前景信号强度(F635median)除以该蛋白点周围背景信号强度(B635median)作为该蛋白点的信号值。即Iij＝F635median-B635median(Iij代表block j中的蛋白质i点的信号值)。蛋白质抗原蛋白点的信号值Iij越趋近于0，说明血清中相应的自身抗体含量越低，该抗体越不容易被芯片检测到。Iij信号值越高说明血清标本中该自身抗体的结合靶抗原蛋白质的能力越强。同一个蛋白不同两个点信号强度的平均值作为该蛋白点在该芯片上的信号强度。分别计算本研究中纳入的100例健康对照组每个蛋白点靶抗原的平均信号强度Iij(Averagenormal)和Std，将Iij(Averagenormal)+3Std作为该蛋白点的阳性反应Cutoff值。然后统计各研究组血清与PM/DM相关自身抗体靶抗原蛋白芯片上各蛋白质抗原免疫反应的阳性率信息。采用卡方检验进行不同组间自身抗体标志物阳性率的比较，当P<0.01时，认为差异具有显著性。
PM/DM相关自身抗体靶抗原芯片上91种靶抗原的检测结果详见表2。
表2 PM/DM相关自身抗体靶抗原芯片上检测结果
研究结果显示抗GNMT(甘氨酸N-甲基转移酶)抗体在PM组的阳性率为25.00％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝1.24×10-13)，结果差异具有显著性；在DM组的阳性率为6.11％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝0.07×10-2)，结果差异具有显著性；在PM/DM组的阳性率为11.33％，高于所有对照组阳性率1.00％(P＝9.64×10-9)，结果差异具有显著性。结果表明，抗GNMT抗体可用作特发性炎性肌病的诊断和检测标志物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.甘氨酸N-甲基转移酶，即GNMT，或其片段在制备用于诊断特发性炎性肌病的试剂中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的特发性炎性肌病包括但不限于多发性肌炎、皮肌炎或或多发性肌炎/皮肌炎。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断包括：测定获自呈现特发性炎性肌病的患者的生物样品中对GNMT或其片段的反应性的抗体的水平；任选地，
与对照数据比较所述生物样品中抗体的水平，其中，相对于所述对照数据，所述样品中对GNMT为反应性的抗体的可检测地提高表明患特发性炎性肌病的可能性。
4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述生物样品为血清样品。
5.如权利要求1-3任一项所述的用途，其中，GNMT抗体的水平通过以下步骤来测量，包括：
a.使来自患者的生物样品与GNMT或其片段接触；
b.在生物样品中存在的抗体与GNMT或其片段之间形成抗体-蛋白质复合物；
c.洗涤来除去任何未结合的抗体；
d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体；
e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体；和
f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号；其中可检测信号的存在表明所述患者中存在抗GNMT抗体。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述的GNMT或其片段沉积或固定在固相支持物上，其中，优选的支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。
7.如权利要求5所述的用途，其中，所述检测抗体通过共价连接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标记。
8.一种用于检测和/或定量生物样品中抗GNMT抗体的诊断试剂盒，包括：一种固相支持物，其中，所述的GNMT或其片段沉积或固定在固相支持物上，所述的抗GNMT抗体作为诊断特发性炎性肌病可能性的生物标志物。
9.如权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，还包括被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体。
10.如权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述支持物是乳胶珠子、多孔平板或膜条的形式。
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