CN110716045A - 一种抗合成酶综合征oj自身抗体的检测方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法与应用，具体涉及生物技术领域，具体包括有以下步骤：步骤一：取人体肺内活细胞作为细胞悬液，采用催化抗体作为抗体催化剂，将抗体催化剂添加至细胞悬液内部。本发明通过采用催化抗体作为抗体催化剂，有效的提高了OJ自身抗体的活跃性，使其更加易于检测，并由荧光染色的抗体结合微粒与OJ自身抗体相互结合，并利用抗体结合微粒吸附膜与抗体结合微粒之间的吸附作用，使得OJ自身抗体更加有效的被检测出来，提高了OJ自身抗体检测的准确性和高效率性，改变了以往的单一的荧光标记以及放射性法检测，避免了发生检测失误的状况，利于肌炎症患者的早期诊断，具备较高的诊断性能。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法与应用。
背景技术
抗合成酶综合征，是一种因自身的肌炎特异性抗体功能紊乱，而产生的临床疾病。自从1980年Nishikai首次发现抗Jo-1抗体、并证实该抗体与肌炎密切相关后，人们又陆续发现抗PL-7、PL-12、OJ及EJ等抗氨酰-tRNA合成酶抗体。它们与抗SRP、Mi-2及抗Mas抗体等同属于“肌炎特异性自身抗体”。它们在DM和PM患者血清中的阳性率约为25％～40％。这些抗体阳性的患者，不论抗体的种类，基本临床表现是一致的，即都具有所谓的“抗合成酶综合征”(抗Jo-1抗体综合征)。
至今发现的以上5种抗合成酶抗体中，抗Jo-1抗体在肌炎中是最常见的，阳性率为15％～30％，在特发性多肌炎中的阳性率为25％～45％，而在皮肌炎中的阳性率一般小于10％，其他4种抗合成酶抗体在肌炎中的阳性率均不超过5％，但在皮肌炎的阳性率高于多肌炎。
在同一患者中一般不同时存在这5种抗体，但可与其他自身抗体如抗ds-DNA、Sm、SSA或SSB抗体等同时存在，不过Gelpi等发现1例体内同时存在抗Jo-1抗体与抗OJ抗体的患者，抗合成酶抗体的DM和PM患者病情重、预后差，且突出表现为肺间质病变，阳性率高达40％～75％，远高于抗合成酶阴性者的10％～20％，如Oddis等研究了匹兹堡大学医院自1975年以来的PM/DM患者，发现18例抗Jo-1抗体阳性的患者，其中12例有肺间质病变，占67％，而79例抗Jo-1抗体阴性的患者中仅有15例肺间质病变(占15％)。许多患者在就诊前被诊断被“肺部感染”，长期大量应用抗生素，症状得不到有效控制。部分患者甚至出现呼吸衰竭。
抗合成酶抗体的DM和PM患者的关节炎及雷诺现象发生率分别高达57％～100％和60％。国内仅通过检测抗Jo-1抗体，认为关节炎多是温和的，但国外的报道认为关节炎的症状及导致畸形的程度十分严重，如Maargnerie报道的一组29例抗合成酶抗体阳性的患者，1/3有多关节炎，4例出现关节侵蚀。Oddis等人报道了21例抗Jo-1阳性患者，12例出现多关节炎，4例有手或腕的畸形，1例有MCP和尺骨的侵蚀。另外，与抗合成酶抗体相关的症状还有“机械工人手”(mechanic'shand)、发热、白细胞增多、浆膜炎、干燥性皮肤病及血清中RF阳性等，“机械工人手”表现为患者手指桡侧及掌面的皮肤高度角化、开裂并伴有色素沉着。
专利申请公布号CN 106680503A的发明专利公开了一种在ECH1自身抗体的筛选和鉴定方法及其应用，包括以下步骤：通过肺癌细胞系H1299全蛋白提取物进行双向电泳，与5例肺癌患者血清和5例正常人血清进行蛋白印迹法，筛选有意义的肿瘤自身抗原，经过比对分析，仅出现在患者血清的蛋白点被进行进一步分析；SDS-PAGE胶上的兴趣蛋白点经切割、消化后，采用LC-MS/MS质谱分析方法对上述蛋白点进行分析，经检测鉴定为ECH1；进一步验证ECH1自身抗体能否作为肺癌诊断标志物。该发明研究发现应用ELISA方法进行血清ECH1自身抗体的检测，可以较准确地将肺癌患者和正常人，以及慢性肺病患者鉴别开来，并可以用于肺癌的早期诊断。
但是上述技术方案在实际运用时，仍旧存在较多缺点，被研究的OJ自身抗体由于离体之后，本身的活性会降低，从而导致OJ自身抗体难以被有效的检测出来，降低了其检测效率和准确性。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法与应用，通过采用催化抗体作为抗体催化剂，有效的提高了OJ自身抗体的活跃性，使其更加易于检测，并由荧光染色的抗体结合微粒与OJ自身抗体相互结合，并利用抗体结合微粒吸附膜与抗体结合微粒之间的吸附作用，使得OJ自身抗体更加有效的被检测出来，提高了OJ自身抗体检测的准确性和高效率性，改变了以往的单一的荧光标记以及放射性法检测，避免了发生检测失误的状况，利于肌炎症患者的早期诊断，具备较高的诊断性能。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，具体包括有以下步骤：
步骤一：取人体肺内活细胞作为细胞悬液，采用催化抗体作为抗体催化剂，将抗体催化剂添加至细胞悬液内部，轻微晃动细胞悬液，在适宜温度环境下静置半小时；
步骤二：制作抗体结合微粒，并将抗体结合微粒置于荧光抗体悬浮液内部并进行搅拌，将染色后的抗体结合微粒置于适宜温度下保存半个小时，并将染色后的抗体结合微粒倒入到细胞悬液内部，采用气流法进行搅拌，使得抗体结合微粒与细胞悬液内的OJ自身抗体相互结合在一起；
步骤三：制作抗体结合微粒吸附膜，采用具有与抗体结合微粒相互结合的抗原做原材料，该抗体结合微粒吸附膜内为100ul/孔；
步骤四：将上述步骤过程中的细胞悬液缓慢倒置在抗体结合微粒吸附膜上，细胞悬液依次穿过多层抗体结合微粒吸附膜，在倾倒的时候，需要手动晃动多层抗体结合微粒吸附膜，使得细胞悬液能够全面吸附在抗体结合微粒吸附膜上；
步骤五：将多层抗体结合微粒吸附膜缓慢翻转，将上面附着的抗体结合微粒倾倒下来，在显微镜下进行操作并观察，由荧光标记的抗体结合微粒来确定OJ自身抗体。
在一个优选地实施方式中，所述步骤一中细胞悬液用碳酸盐缓冲溶液将抗原稀释至适宜的浓度100ug/ml，静置十分钟之后，弃去上清液，取下方沉积液。
在一个优选地实施方式中，所述步骤二中搅拌的过程中需要采用磁力搅拌器，其中磁力搅拌器以1000r/min离心5分钟时间，随后将搅拌后的液体进行静置。
在一个优选地实施方式中，所述步骤三中的抗体结合微粒吸附膜共设置有三层，每层抗体结合微粒吸附膜均是呈漏斗状布置，倒置细胞悬液的时候，需要缓慢的将细胞悬液沿漏斗状分布的抗体结合微粒吸附膜四周旋转着进行倾倒。
在一个优选地实施方式中，所述步骤四中抗体结合微粒穿过抗体结合微粒吸附膜上的孔目时，会与其相互吸附。
在一个优选地实施方式中，所述步骤五中将筛选出来后的OJ自身抗体与抗体结合微粒放置在载玻片上。
在一个优选地实施方式中，还包括有抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测的应用：用于检测患者身体内的抗OJ自身抗体的状况，用于检测患者身体内的抗OJ自身抗体的状况。
本发明的技术效果和优点：
本发明通过采用催化抗体作为抗体催化剂，有效的提高了OJ自身抗体的活跃性，使其更加易于检测，并由荧光染色的抗体结合微粒与OJ自身抗体相互结合，并利用抗体结合微粒吸附膜与抗体结合微粒之间的吸附作用，使得OJ自身抗体更加有效的被检测出来，提高了OJ自身抗体检测的准确性和高效率性，改变了以往的单一的荧光标记以及放射性法检测，避免了发生检测失误的状况，利于肌炎症患者的早期诊断，具备较高的诊断性能，能够较为广泛的应用于其他疾病的抗体检测，提高了本发明的实用性和适用性，具有较高的推广价值。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供了一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，具体包括有以下步骤：
步骤一：取人体肺内活细胞作为细胞悬液，采用催化抗体作为抗体催化剂，将抗体催化剂添加至细胞悬液内部，轻微晃动细胞悬液，在适宜温度环境下静置半小时；
步骤二：制作抗体结合微粒，并将抗体结合微粒置于荧光抗体悬浮液内部并进行搅拌，将染色后的抗体结合微粒置于适宜温度下保存半个小时，并将染色后的抗体结合微粒倒入到细胞悬液内部，采用气流法进行搅拌，使得抗体结合微粒与细胞悬液内的OJ自身抗体相互结合在一起；
步骤三：制作抗体结合微粒吸附膜，采用具有与抗体结合微粒相互结合的抗原做原材料，该抗体结合微粒吸附膜内为100ul/孔；
步骤四：将上述步骤过程中的细胞悬液缓慢倒置在抗体结合微粒吸附膜上，细胞悬液依次穿过多层抗体结合微粒吸附膜，在倾倒的时候，需要手动晃动多层抗体结合微粒吸附膜，使得细胞悬液能够全面吸附在抗体结合微粒吸附膜上；
步骤五：将多层抗体结合微粒吸附膜缓慢翻转，将上面附着的抗体结合微粒倾倒下来，在显微镜下进行操作并观察，由荧光标记的抗体结合微粒来确定OJ自身抗体；
进一步的，所述步骤一中细胞悬液用碳酸盐缓冲溶液将抗原稀释至适宜的浓度100ug/ml，静置十分钟之后，弃去上清液，取下方沉积液；
进一步的，所述步骤二中搅拌的过程中需要采用磁力搅拌器，其中磁力搅拌器以1000r/min离心5分钟时间，随后将搅拌后的液体进行静置；
进一步的，所述步骤三中的抗体结合微粒吸附膜共设置有三层，每层抗体结合微粒吸附膜均是呈漏斗状布置，倒置细胞悬液的时候，需要缓慢的将细胞悬液沿漏斗状分布的抗体结合微粒吸附膜四周旋转着进行倾倒；
进一步的，所述步骤四中抗体结合微粒穿过抗体结合微粒吸附膜上的孔目时，会与其相互吸附；
进一步的，所述步骤五中将筛选出来后的OJ自身抗体与抗体结合微粒放置在载玻片上；
进一步的，还包括有抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测的应用：用于检测患者身体内的抗OJ自身抗体的状况。
实施例2：
本发明提供了一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，具体包括有以下步骤：
步骤一：取人体肺内活细胞作为细胞悬液，不采用催化抗体作为抗体催化剂，轻微晃动细胞悬液，在适宜温度环境下静置半小时；
步骤二：制作抗体结合微粒，并将抗体结合微粒置于荧光抗体悬浮液内部并进行搅拌，将染色后的抗体结合微粒置于适宜温度下保存半个小时，并将染色后的抗体结合微粒倒入到细胞悬液内部，采用气流法进行搅拌，使得抗体结合微粒与细胞悬液内的OJ自身抗体相互结合在一起；
步骤三：制作抗体结合微粒吸附膜，采用具有与抗体结合微粒相互结合的抗原做原材料，该抗体结合微粒吸附膜内为100ul/孔；
步骤四：将上述步骤过程中的细胞悬液缓慢倒置在抗体结合微粒吸附膜上，细胞悬液依次穿过多层抗体结合微粒吸附膜，在倾倒的时候，需要手动晃动多层抗体结合微粒吸附膜，使得细胞悬液能够全面吸附在抗体结合微粒吸附膜上；
步骤五：将多层抗体结合微粒吸附膜缓慢翻转，将上面附着的抗体结合微粒倾倒下来，在显微镜下进行操作并观察，由荧光标记的抗体结合微粒来确定OJ自身抗体；
进一步的，所述步骤一中细胞悬液用碳酸盐缓冲溶液将抗原稀释至适宜的浓度100ug/ml，静置十分钟之后，弃去上清液，取下方沉积液；
进一步的，所述步骤二中搅拌的过程中需要采用磁力搅拌器，其中磁力搅拌器以1000r/min离心5分钟时间，随后将搅拌后的液体进行静置；
进一步的，所述步骤三中的抗体结合微粒吸附膜共设置有三层，每层抗体结合微粒吸附膜均是呈漏斗状布置，倒置细胞悬液的时候，需要缓慢的将细胞悬液沿漏斗状分布的抗体结合微粒吸附膜四周旋转着进行倾倒；
进一步的，所述步骤四中抗体结合微粒穿过抗体结合微粒吸附膜上的孔目时，会与其相互吸附；
进一步的，所述步骤五中将筛选出来后的OJ自身抗体与抗体结合微粒放置在载玻片上；
进一步的，还包括有抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测的应用：用于检测患者身体内的抗OJ自身抗体的状况。
分别取上述实施例1-2中的细胞原液进行试验，每个实施例中各取十组原液，实施例1中添加了催化抗体作为催化剂，实施例2中未添加催化抗体，分别进行试验，使用一段时间之后，得到以下数据：
由上表可知，实施例1中通过采用催化抗体作为抗体催化剂，导致OJ自身抗体本身较为活跃，并由荧光染色的抗体结合微粒与OJ自身抗体相互结合的数量增多，检测出来的抗体数量较多且较活跃，改变了以往的单一的荧光标记以及放射性法检测，避免了发生检测失误的状况，利于肌炎症患者的早期诊断，具备较高的诊断性能。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，其特征在于，具体包括有以下步骤：
步骤一：取人体肺内活细胞作为细胞悬液，采用催化抗体作为抗体催化剂，将抗体催化剂添加至细胞悬液内部，轻微晃动细胞悬液，在适宜温度环境下静置半小时；
步骤二：制作抗体结合微粒，并将抗体结合微粒置于荧光抗体悬浮液内部并进行搅拌，将染色后的抗体结合微粒置于适宜温度下保存半个小时，并将染色后的抗体结合微粒倒入到细胞悬液内部，采用气流法进行搅拌，使得抗体结合微粒与细胞悬液内的OJ自身抗体相互结合在一起；
步骤三：制作抗体结合微粒吸附膜，采用具有与抗体结合微粒相互结合的抗原做原材料，该抗体结合微粒吸附膜内为100ul/孔；
步骤四：将上述步骤过程中的细胞悬液缓慢倒置在抗体结合微粒吸附膜上，细胞悬液依次穿过多层抗体结合微粒吸附膜，在倾倒的时候，需要手动晃动多层抗体结合微粒吸附膜，使得细胞悬液能够全面吸附在抗体结合微粒吸附膜上；
步骤五：将多层抗体结合微粒吸附膜缓慢翻转，将上面附着的抗体结合微粒倾倒下来，在显微镜下进行操作并观察，由荧光标记的抗体结合微粒来确定OJ自身抗体。
2.根据权利要求1所述的一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，其特征在于：所述步骤一中细胞悬液用碳酸盐缓冲溶液将抗原稀释至适宜的浓度100ug/ml，静置十分钟之后，弃去上清液，取下方沉积液。
3.根据权利要求1所述的一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，其特征在于：所述步骤二中搅拌的过程中需要采用磁力搅拌器，其中磁力搅拌器以1000r/min离心5分钟时间，随后将搅拌后的液体进行静置。
4.根据权利要求1所述的一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，其特征在于：所述步骤三中的抗体结合微粒吸附膜共设置有三层，每层抗体结合微粒吸附膜均是呈漏斗状布置，倒置细胞悬液的时候，需要缓慢的将细胞悬液沿漏斗状分布的抗体结合微粒吸附膜四周旋转着进行倾倒。
5.根据权利要求1所述的一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，其特征在于：所述步骤四中抗体结合微粒穿过抗体结合微粒吸附膜上的孔目时，会与其相互吸附。
6.根据权利要求1所述的一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法，其特征在于：所述步骤五中将筛选出来后的OJ自身抗体与抗体结合微粒放置在载玻片上。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种抗合成酶综合征OJ自身抗体的检测方法的应用，其特征在于，用于检测患者身体内的抗OJ自身抗体的状况。
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