JP5746328B2 - ヒト睾丸および副睾丸で発現される305種類の生殖関連精子局在タンパク質の検出方法 - Google Patents
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Description
a)検出される対象からの精漿サンプルを男性生殖関連タンパク質に対する捕捉試薬を含むチップと接触させる工程、
b)サンプルから男性生殖関連タンパク質を捕捉し、第1の信号を形成させる工程、
c)第1の信号を(陽性対照と陰性対照を含む)標準品の信号と比較し、定性または定量で前記男性生殖関連タンパク質の発現量を確定する工程、及び
d)発現量から男性不妊を引き起こすタンパク質の候補を確定する工程
を有する方法を提供する。
ここで用いられるように、用語の「男性生殖関連タンパク質」とは、男性の哺乳動物(特に人間)の睾丸および/または副睾丸で発現される、男性生殖に関連するタンパク質を指す。通常、前述の男性生殖関連タンパク質は、精子を保護するタンパク質、精子の運動能力に関するタンパク質、精子の卵細胞への進入に関するタンパク質を含む。
また、本発明において、本発明の男性生殖関連タンパク質を検出する方法を提供する。前述の方法は、ヒト精子局在タンパク質の定性または定量の検出、およびたんぱく質チップの検出を含むが、これらに限定されない。
通常、特異的抗体を検出標本(精子)とともにインキュベートした後、標識発色で精子局在タンパク質の定性または定量を行い、発色基質は、通常の酵素発色剤、化学発光剤または放射性同位体などでもよい。また、第2の抗体で信号を増幅し、且つ感度の高い発色手段を使用することによって、感度を大幅に向上させることができる。
また、本発明は、男性生殖関連タンパク質の検出に用いられるタンパク質チップを提供する。このようなチップは、定性または定量的に測定サンプルにおける男性生殖関連タンパク質の検出結果を提供することができる。これらの検出結果は、補助的に例えば男性不妊の原因の判断に用いることができる。用語の「タンパク質アレイ」または「タンパク質チップ」は、いずれも捕捉試薬がタンパク質標識物と結合できるアレイを指し、入れ替えて使うことができる。典型的に、捕捉試薬は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体で、特異的なタンパク質と結合することができる。言い換えれば、タンパク質と特異的に結合できるタンパク質、ポリペプチド、核酸または他の分子もしくは表面は、いずれもタンパク質アレイに応用することができる。これらのアレイは、通常、数百または数千のアドレス指定可能な区域にある、異なる捕捉試薬を含む。標識物が検出可能な分子で標識されると、タンパク質アレイにある捕捉試薬と標識物との結合は、通常、定量される。
本発明に基づき、男性生殖関連タンパク質の検出方法および検出手段は、不妊症患者の精漿における生殖関連タンパク質の含有量の検出に有用である。
(a)迅速に、有効的に個体における男性生殖に関連する複種のタンパク質を定性または定量的に検出した結果をスクリーニングすることができる。
(b)科学研究、特に生殖関連分野の研究に有用である。
副睾丸および睾丸の標本は、事故死の青年男性(27から30歳)から採取され、生前に子持ちで、生殖系疾患の記録がなく、その家族と医学研究ための献体の契約を締結し、同時に煙台毓▲黄▼頂病院倫理委員会によって承認された。手術で標本を得た後、すぐ副睾丸の管腔液および睾丸組織のタンパク質サンプルの抽出およびタンパク質の定量を行い、3個体以上の標本を等量で混合して2次元ゲル電気泳動で分離し、3回重複した電気泳動で共有するタンパク質の点を取って質量分析で同定した。中では、精子における分布がわかったタンパク質は319種あった。
正常精液を37℃で恒温液化を30分行い、1.0mlの精液を吸い取って37℃、5%CO2および飽和湿度の条件で12時間安定化したEarle液に入れ、試験管を45°程度傾けて60分インキュベートし、比較的に元気な精子を充分に泳がせ、600gで10分間遠心した。上清液を捨て、洗浄を2回繰り返し、使用に備えた。正常精液は、提供者の同意を得てから、煙台毓▲黄▼頂病院生殖センターによって提供された。
上述した319種類の遺伝子のタンパク質製品は以下のような方法で得られた。遺伝子配列によって、成熟コーディング領域を増幅するための一対の特異的プライマーを合成した。通常の方法で調製されたヒト副睾丸cDNAライブラリーを鋳型とし、PCRで目的の遺伝子を直接増幅し、さらに市販のベクターのpGM−Tvector(上海貝博生物公司から購入)にクローンして配列決定で正確と確認した。配列決定で確認した遺伝子を制限酵素切断部位で発現ベクターのpET32b(+)(上海貝博生物公司から購入)にクローンし、融合タグの読み枠と一致させた。組換え発現ベクターを通常のE. coli BL21(DE3)の感受性細胞に導入し、操作菌を得た。1mM IPTGによって32℃で発現が誘導され、ベクターにおけるHis−Tagタグによって、「二段階ネッケル親和性クロマトグラフィー」で組換えタンパク質を分離して精製した。(図1)精製された組換えタンパク質はBradford(Bradford 1976)法で定量した後、凍結乾燥して保存した。
上述した319種類のタンパク質のモノクローナル抗体は以下のような方法で得られた。実施例1で調製された組換えタンパク質でBALB/Cマウスを免疫させた。簡単に言うと、各マウスは1日目に50μgの組換えタンパク質と等量の完全フロイントアジュバント(CFA)を注射した。その後、15、30および45日目に25μgの組換えタンパク質と等量の不完全フロイントアジュバント(IFA)を注射して免疫を強化した。最後の免疫から3〜4日後、脾臓細胞を分離してSp2骨髄腫細胞株と混合し、さらにPEGを入れて細胞を互いに融合させ、融合した細胞を適当に希釈し、培養プレートに置いて培養し、通常は0.8個細胞/穴まで希釈し、穴の底の20%を覆うように細胞を培養した時点で、培養の上清液を吸い取ってELISAで抗体の含有量を測定した。陽性細胞株を選んでマウスの腹腔に接種し、腹水を収集し、ブドウ球菌のプロテインAで親和性クロマトグラフィーのカラムを調製し、抗体を結合させた後、溶離し、モノクローナル抗体を回収した。
精子を収集してPBSで洗浄した後、1%ゼラチンで覆われたスライドガラスに塗布し、自然に乾燥させ、さらにメタノールで10分間固定した。精子を含むスライドガラスを3%BSAで室温で1時間ブロックした後、各種のタンパク質のモノクローナル抗体(1:200)を添加し、4℃で一晩置いた。PBST(0.1%のTween−20を含むPBS)で3回洗浄し、相応のFITC−標識ヒツジ抗マウスIgGである第2抗体(1:200)を入れた。スライドガラスをPBSTで3回洗浄した後、80%グリセリンで封じた。オリンパスBX−52顕微鏡で結果を観察した。
3つの0.5mL滅菌した遠心管を取り、それぞれ100μLの濃度を調整した精子懸濁液(2.0×107個/mL)を入れ、且つ、空白対照群、実験群および陽性対照群と標記した。その後、傾けて37℃、5%CO2および飽和湿度のインキュベーターで3時間インキュベートして受精能を獲得させた。受精能獲得が終わった後、空白対照群では2μLの精子受精能獲得培養液(BWW)のみを、実験群では2μLのHEL−S−65pタンパク抗体(1:200)を、陽性対照群では2μLのHEL−75抗体を入れ、均一に混合し、インキュベーターでさらに1時間インキュベートして精子をブロックした。
組換えベクターpET−32b(+)−HEL−S−154wまたは空白ベクターpET−32b(+)を導入した細菌(大腸菌BL21)を一晩培養した後、LB培地で1:40で接種し、この時サンプリングしてOD600を測定し、その後1時間おきにサンプリングした。増殖対数期になった時点で、細菌を均等に2つの部分にわけた。その一方に最終濃度が0.1mMになるようにIPTGを入れ、もう一方は入れずに対照とし、その後1時間おきにOD600を測定し、毎回は平行に測定を3回繰り返し、陰性対照群として、空白のホスト菌BL21をIPTGの毒性検出に用いた(図4に示す)。
一晩培養した大腸菌XL−1 blueが対数期(OD600=0.4〜0.5)になった後、10mMのPBS(pH7.4)で希釈した。約2×106CFU/mLの細菌を12.5〜100μg/mLのrRNASE9と混合し、37℃で培養し、培養開始後15、30、60および120分の時点でサンプリングした。サンプルを10mMのPBSで勾配希釈し、各濃度で100μL取ってプレートに塗布し、37℃で一晩培養して単集落が形成し、集落数を統計し、抗菌活性は細菌の生存百分率で表示し、式は%生存=(タンパク質処理後の生存クローン数/タンパク質処理なしの生存クローン数)×100である。
3つの0.5mL滅菌した遠心管を取り、それぞれ100μLの上述の濃度を調整した精子懸濁液を入れ、且つ、空白対照群、実験群および陽性対照群と標記した。空白対照群では2μLのBWW液のみを、実験群では2μLのHEL−S−65p抗体(1:200)を、陽性対照群では2μLのHEL−75を入れ、均一に混合し、傾けて、37℃、5%CO2および飽和湿度のインキュベーターで3時間インキュベートしてブロックおよび受精能獲得を行った。精子懸濁液を取り、600gで10分間遠心した。添加した過剰のタンパク質の第一抗体を除去するように上清液を捨て、精子密度が3.5×106個/mLになるようにBWW液で調整した。精子懸濁液を3組90μLずつ取り、それぞれ最終濃度が10μL/Lになるように10μLの100μmol/Lのプロゲステロンを入れ、受精能獲得後の精子のアクロソーム反応を誘導した。35mmの無菌プラスチックシャーレを取り、アクロソーム反応を誘導した精子懸濁液をそれぞれ100μLの受精液滴とし、各受精液滴に15〜20個の卵母細胞を入れた。上にパラフィンオイルを被覆した後、37℃、6%CO2および飽和湿度の二酸化炭素インキュベーターで3時間インキュベートして受精させた。受精終了後、卵母細胞を取り出してBWWで卵母細胞の表面にある精子を洗浄し、そしてカバーガラスをつけて位相差顕微鏡で受精卵を観察し、膨大の精子の頭部およびその尾部の存在または雄性前核を精子が卵に進入した指標とした。精子が卵へ進入した百分率を統計した。実験結果は表5に示す。
以下の方法でタンパク質チップNo.1−4を製造した。
(a)スライドガラスのチップ
(1)高速スポッターで複数穴の板における各タンパク質サンプル(抗本発明のタンパク質の抗体)を直接高密度で化学処理した、表面に活性アルデヒド基があるスライドガラスにスポットし、各アレイに16(4×4)個のサンプル点があり、各サンプル点は直径0.4mmであった。
(2)室温で一晩または37℃で1時間インキュベートし、タンパク質のアミノ基をスライドガラスにおけるアルデヒド基と縮合反応させ、サンプルを固定化した。
(3)スライドガラスにおけるタンパク質と結合しなかった活性アルデヒド基を還元させ、されに充分に洗浄して室温で乾燥した。
(4)最後に、遮光材料で密封して包装し、4℃の環境で保存した。
(1)高速スポッターで複数穴の板における各タンパク質サンプル(抗本発明のタンパク質の抗体)をPDVF膜にスポットし、各アレイに16(4×4)個のサンプル点があり、各サンプル点は直径0.4mmであった。
(2)緩衝液で膜を2〜3回、毎回3〜6分間洗浄した。
(3)5%のウシ胎児血清または脱脂粉乳で室温で1〜2時間ブロックした。
(4)さらに緩衝液で膜を2〜3回、毎回3〜6分間洗浄した。
(5)乾燥後、遮光材料で密封して包装し、4℃の環境で保存した。
実施例10で製造されたチップNo.4で21例の男性不妊症の患者の精漿における各男性生殖関連タンパク質の含有量を検出した。検出結果から、5例の精子無力症である男性不妊症の患者の精漿にHEL−S−162ePタンパクが欠けていることがわかった。
現在、臨床ではすでにいくつかの精漿タンパクが補助的に不妊症の診断および治療に用いられ、複数のマーカーを合わせて検出すると、スクリーニングができ、診断の陽性率が向上する。通常の免疫学的な検出方法は、放射免疫測定(RIA)、酵素結合免疫測定(ELISA)、化学発光免疫測定(CLIA)などを含み、それぞれ利点があるが、これらの技術は共通の制限があり、即ち、毎回1種の不妊症タンパクマーカーしか検出できない。これは臨床上の同時に複数の不妊症マーカーの検出の要求に応えられず、タンパク質チップは同一の標本における複数の異なる目的のタンパク質を同時に分析することができ、また同時に複数の標本を検出することもできるため、効率が大幅に向上し、感度と精度が高く、信号雑音比が良く、微量の標本で済み、操作が簡単で、再現性が優れる。
Claims (9)
- 男性個体の男性生殖関連タンパク質の発現状況を検出するチップまたはキットの製造のために用いられる捕捉試薬であって、
前記男性生殖関連タンパク質は、表2に示されているが表1に示されていないタンパク質、且つ、表2における番号7のHEL−S−7a、番号13のHEL−S−13a、番号29のHEL−S−29a、番号93のHEL−S−49e、番号116のHEL−S−74p、番号250のHEL−S−168mPおよび番号312のHTL−S−49mPに該当するタンパク質以外のタンパク質であり、
前記男性生殖関連タンパク質は、少なくとも、表2に示されているタンパク質のうちの5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200または250種類を含み、
前記5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200または250種類のタンパク質は、少なくともHEL−S−65p、HEL−S−6aおよびHEL−S−162ePに該当するタンパク質を含む
ことを特徴とするヒト精子成熟/男性生殖関連タンパク質の捕捉試薬。 - 抗体であって、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項1に記載の捕捉試薬。
- 前記補足試薬はタンパク質チップの形態をなしていることを特徴とする請求項1に記載の捕捉試薬。
- 前記検出は定性または定量の検出であることを特徴とする請求項1に記載の捕捉試薬。
- 前記検出は、男性個体の精漿サンプルにおける精子局在タンパク質を定性または定量的に検出することを特徴とする請求項1に記載の捕捉試薬。
- 前記検出は、男性個体の精子における局在タンパク質を定性または定量的に検出することを特徴とする請求項1に記載の捕捉試薬。
- 前記男性個体は、人間で、男性不妊または結婚後1年で未出産女性の配偶者であることを特徴とする請求項1に記載の捕捉試薬。
- 前記男性生殖関連タンパク質は、表2における番号5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、88、89、94、95、96、97、98、99、100、101、107、109、111、112、113、114、115、129、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、227、228、229、231、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、251、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、313、314、315、316、317及び319に該当するタンパク質であることを特徴とする請求項1から7のうちのいずれか1項に記載の捕捉試薬。
- 固相担体および該固相担体に存在する、表2に示されているが表1に示されていないタンパク質、且つ、表2における番号7のHEL−S−7a、番号13のHEL−S−13a、番号29のHEL−S−29a、番号93のHEL−S−49e、番号116のHEL−S−74p、番号250のHEL−S−168mPおよび番号312のHTL−S−49mPに該当するタンパク質以外のタンパク質であり、少なくとも、表2に示されているタンパク質のうちの5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200または250種類を含み、前記5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200または250種類のタンパク質は、少なくともHEL−S−65p、HEL−S−6aおよびHEL−S−162ePに該当するタンパク質を含む男性生殖関連タンパク質を検出するためのサンプル添加点である検出点を含むチップであって、ヒト睾丸および副睾丸で発現される精子結合タンパク質の検出に用いられることを特徴とするチップ。
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