CN102262159B - 用于检测生育相关人睾丸和附睾表达305种精子定位蛋白的方法 - Google Patents

用于检测生育相关人睾丸和附睾表达305种精子定位蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测人生育相关的人睾丸和附睾表达305种精子定位蛋白方法。更具体地，本发明提供了人精子成熟能够引起不育相关的重要蛋白质群，还提供了检测人精子定位蛋白在精子上和精浆中的定性与定量方法，为男性不育原因的明确诊断提供新途径。

Description

用于检测生育相关人睾丸和附睾表达305种精子定位蛋白的方法
技术领域
本发明涉及检测领域，更具体地涉及检测生育相关的、人睾丸和附睾表达的305种精子定位蛋白的方法，包括用荧光、酶标、银标、生物素、同位素、芯片等标记技术定性和定量地检测精子定位蛋白的方法。本发明还涉及用于检测所述精子定位蛋白的蛋白质芯片及其应用
背景技术
男性不育是引起不孕症的重要因素之一。据2000年世界卫生组织(WHO)报道全球不育症约占15％，男方因素约占一半；在欧州一些国家不育症高达30％。导致男子不育的原因非常复杂广泛，涉及生殖系统解剖结构和功能、激素调节、遗传物质、感染免疫等诸多因素的异常和障碍。
现阶段对这些因素的研究大多停留在单基因水平和基因组水平。然而，机体真正生理机能的执行者是蛋白质，所以上述分子遗传学研究并不能反映基因转录后的调控、蛋白质表达水平的变化以及蛋白质的翻译后修饰等信息，并且细胞内mRNA水平和蛋白质的表达丰度并不完全一致，因此从蛋白质水平对男性不育机制进行研究显得特别重要。
研究表明，男性不育症不是一种独立的疾病，而是多种疾病或多因素综合作用的结果。虽然导致男子不育的原因非常复杂广泛，然而目前常规精液检测手段却非常局限，导致人们无法从整体上系统地分析精浆中的蛋白质表达水平。
综上所述，迄今为止，人们对人类精子成熟引起的男性不育相关蛋白的了解尚不深入，更缺乏此类蛋白检测方法，因此迫切需要开发出检测男性生育相关蛋白的有效方法和产品。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效检测男性生育相关蛋白的方法以及产品。
在本发明的第一方面，提供了一组与人精子成熟、男性生育相关蛋白的捕获试剂的用途，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，其中，所述的捕获试剂用于制备检测男性个体的男性生育相关蛋白表达情况的芯片或试剂盒。
在另一优选例中，所述的男性生育相关蛋白包括至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300种列于表2中蛋白。
在另一优选例中，所述是试剂是蛋白质芯片。
在另一优选例中，所述的检测是定性或定量检测。
在另一优选例中，所述的检测是对男性个体的精浆样品进行检测。
在另一优选例中，所述的检测是对男性个体的精子样品进行检测。
在另一优选例中，所述的捕获试剂是抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体抗体。
在另一优选例中，所述的抗体具有一种或多种可检测的标记物。
在另一优选例中，所述的标记物主要为免疫荧光、酶标、银标、生物素、同位素等。
在另一优选例中，所述的男性个体是人，尤其是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。
在本发明的第二方面，提供了一种可用于检测睾丸或附睾表达的精子结合蛋白的芯片，所述的芯片包括：
固相载体以及位于所述固相载体上的男性生育相关蛋白的检测点，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白。
在另一优选例中，所述的检测点固定有所述的男性生育相关蛋白的捕获试剂(如抗体)。
在另一优选例中，男性生育相关蛋白包括至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300种列于表2中蛋白。
在另一优选例中，所述的固相载体选自下组：玻璃片、塑料片、硝酸纤维膜、聚偏氟乙烯膜、微球等载体。
在本发明的第三方面，提供了一种使用上述芯片鉴别男性不育相关蛋白的方法，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，所述鉴别包括以下步骤：
a)将来自待检测对象的精浆样品与包含针对男性不育相关蛋白的捕获试剂的芯片接触；
b)从样品中捕获男性不育相关蛋白并产生第一个信号；
c)将第一序号与标准品(包括阳性对照和阴性对照)的信号进行比较，获得定性或定量地确定所述男性不育相关蛋白的表达量；
d)根据表达量确定导致男性不育的候选蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.附睾和睾丸蛋白的二维凝胶电泳分离(2D)和质谱鉴定。其中A.附睾组织蛋白的2D参考图谱；B.附睾管腔液蛋白的2D参考图谱；C.HEL-S-128m质谱鉴定结果。
图2.显示了用pET32b(+)载体构建的重组表达载体模式图。
图3.显示了HEL-S-154w，HEL-S-65p，HEL-S-6a蛋白精子免疫荧光定位分别定位在精子全身，尾部和顶体。
图4.显示了HEL-S-154w蛋白具有明显的抑菌活性。
图5.显示了HEL-S-154w蛋白的抗菌活性。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了在人附睾、睾丸中表达、与男性生育相关的多种特异性蛋白，从而确立与不育发生相关的重要蛋白质群。在此基础上开发了检测男性生育相关蛋白的方法和芯片的检测工具，从而完成了本发明。利用本发明所揭示的男性不育发生相关的蛋白质群，有助于人们揭示关键蛋白的分子作用机制和相互作用关系，从而提供了寻找男性不育原因的创新途径。
男性生育相关蛋白
如本文所用，术语“男性生育相关蛋白”指在男性哺乳动物(尤其人)的睾丸和/或附睾中表达的，与男性生育相关的蛋白。一般所述的男性生育相关蛋白包括：保护精子的蛋白、与精子运动能力有关的蛋白、与精子穿卵有关的蛋白。
如本文所用，“哺乳动物”指胎生并籍由乳腺哺育后代的动物种类，属于脊椎动物的一种代表性的哺乳动物包括(但并不限于)，例如：人、猴、羊、牛、兔、马、小鼠、大鼠等，特别地优选人。
一类特别适用于本发明的男性生育相关蛋白是睾丸和/或附睾的分泌蛋白，这些分泌蛋白有些存在于精浆中，有些定位在精子上。本发明的研究提示，这些男性生育相关蛋白与精子的成熟等过程密切有关，对于精子的获得正常的功能是至关重要的。
如本文所用，术语“本发明蛋白”、“本发明的生育相关蛋白”、或“本发明的男性生育相关蛋白”可互换使用，都指本发明首次揭示其与男性生育相关性的睾丸和/或附睾中表达的在精子上有定位的蛋白。代表性的本发明蛋白如表2所示。
表1已知的在精子上有明确定位的男性生育相关蛋白
  序号   蛋白编号   蛋白名称   参考序列登陆号  精子定位   蛋白功能
  K1   HEL-S-135P   ADAM7/GP83   GQ891358  顶体+赤道   精子运动
  K2   HEL-S-171mP   CD52/HE5   FJ460513  附睾精子表面   精子运动
  K3   HEL-S-194m   Eppin   GQ891395  顶体尾部   精子运动
  K4   HEL-S-170mP   HE3   GQ891376  尾部(中段+主段)   精子运动
  K5   HEL-S-195E   NAG   GQ891410  尾部末端   精子运动
  K6   HEL-S-193e   CRES   GQ891394  赤道   精卵融合
  K7   HEL-S-75p   GPX5   FJ460514  顶体后区   精卵融合
  K8   HEL-S-89n   grp78/hsp70   EU794617  颈部   精卵融合
  K9   HEL-S-3a   LCN6   GQ891284  顶体   精卵融合
  K10   HEL-S-4a   P34H   GQ891285  顶体   精卵融合
  K11   HEL-S-96n   SPAM1(PH-20)   EU794686  颈部   精卵融合
  K12   HEL-S-192a   Clusterin   GQ891391  顶体   精卵融合
  K13   HEL-S-49e   HE12   GQ891321  赤道   精卵融合
  K14   HEL-S-154w   ESC42/DEFB118   EF426755  颈部   抗菌功能
表2本发明首次揭示的精子上有定位的男性生育相关蛋白
  序号   基因编号   对应蛋白名称   参考序列登陆号   本发明登录号   精子定位   蛋白功能
  1   HEL-S-1a   PDXK   NM_003681.4   EU794642   顶体   穿透明带
  2   HEL-S-2a   PRDX2   NM_005809.4   EU668325   顶体   穿透明带
Figure GSA00000134566500051
Figure GSA00000134566500061
Figure GSA00000134566500071
Figure GSA00000134566500081
Figure GSA00000134566500091
Figure GSA00000134566500111
Figure GSA00000134566500121
Figure GSA00000134566500131
Figure GSA00000134566500141
Figure GSA00000134566500151
*运动指精子运动
检测方法
在本发明中，还提供了检测本发明男性生育相关蛋白的方法，其中包括(但并不限于)：人精子定位蛋白定性或定量检测，以及蛋白质芯片检测。
人精子上的定位蛋白定性或定量检测
通常地，将特异性抗体与检测标本(精子)共同孵育后，通过标记显色来确定精子定位蛋白的定性或定量，显色底物可以是普通酶显色剂，化学发光剂或放射性同位素等。也可以由于利用了第二种抗体进行了信号放大，并且可以利用高灵敏的显色方式，灵敏度也得到了很大的提高。
特异性抗体可以溶解在溶液中，与精子表面结合，通过流式细胞仪等检测手段定性或定量地测定流动的精子表面蛋白含量；也可以将抗体固定在支持物(例如聚乙烯板，免疫微球，玻璃片、硝酸纤维(NC)膜、PVDF膜等)上，用普通扫描仪定性或定量地测定阳性精子百分含量。
蛋白质芯片及其在人精浆检测中的应用
本发明还提供了可用于检测男性生育相关蛋白的蛋白质芯片。这种芯片可以定性地或定量地提供测试样品中的男性生育相关蛋白检测结果。这些检测结果可以辅助性地用于判断例如男性不育的原因。术语“蛋白质阵列”或“蛋白芯片”可互换使用，都指捕获试剂能结合蛋白质标志物的阵列。典型地，捕获试剂为多克隆或单克隆抗体，可以与特异的蛋白质结合。换句话说，可以特异性结合蛋白的任何蛋白、多肽、核酸或其他分子或表面都可以被应用于蛋白阵列中。这些阵列通常包括数百或数千个位于可寻址区域的不同捕获试剂。当标志物被可检测分子标记后，蛋白质阵列上的捕获试剂与标志物的结合通常被定量。
本发明蛋白质芯片的特点在于，在所述的芯片上设置有男性生育相关蛋白的检测点，这些检测点可以随机分布，也可以分布于芯片的不同检测区，或相对集中地分布于芯片的某一个或多个特定的检测区。
如本文所用，术语“检测点”指位于蛋白芯片上，用于检测某一蛋白质所对应的点样点，例如用于检测HEL-75蛋白的检测点，通常是将抗HEL-75蛋白的单克隆抗体点样于芯片基片所形成的。
在优选例中，蛋白质芯片包括对应于精子成熟各阶段或不同性能评价的区域，例如包括选自下组的一个或多个检测区：精子获能检测区、与精子运动有关蛋白检测区、与精子穿卵有关的蛋白检测区，以便能够更方便地检测不同功能或类型的男性生育相关蛋白。应理解，所述的检测区可以是物理上相对集中的区域，例如将芯片分为不同的检测区A，B，C，其中检测区A可以是精子获能检测区，检测区B可以是精子运动蛋白检测区，检测区C可以是精子穿卵蛋白检测区。或者，所述的检测区可以是在物理上并不集中，但是在数据分析或处理时被归类处理，从而构成例如精子获能检测区等特定检测区。例如如果将一个芯片上随机排列的多个检测点在数据分析或处理时被作为精子获能检测区进行归类处理，那么可以认为在蛋白质芯片上存在所述的精子获能检测区。对于某一男性生育相关蛋白A可能涉及多种功能时，这种方式有助于避免在芯片上该蛋白A的重复点样，即仅需要设置一个蛋白A的检测点，而不必设置多个检测区并在每个检测区设有蛋白A的检测点。
适用于本发明的蛋白质芯片没有特别限制，可以采用本领域中各种已知结构的空白蛋白质芯片。通常，这些蛋白质芯片载体包括：免疫微球、玻璃片、塑料片、硝酸纤维(NC)膜、PVDF膜等，其中特别优选的是免疫微球和各种基片。采用原位合成、机械点样或共价结合的方法将多肽、蛋白、或抗体有序地固定于各种载体上成为检测用的芯片，将标记荧光的抗体或其他成分与芯片相互作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光等扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片或其它载体上各点的荧光强度，以及标记物度强度来分析每种蛋白质的含量，由此达到测定各种蛋白质的目的。
本发明的蛋白质芯片可以含有一种或多种，较佳地含有≥5种，更佳地≥10种，最佳地≥20种本发明首次揭示的男性生育相关蛋白的检测点。例如，含有至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300种，直至全部(305种或更多)本发明蛋白的检测点。
如上所述，本发明的蛋白质芯片优选含有相对独立的检测区。当含有一个或多个这些的检测区时，每个检测区宜含有至少2种，较佳地至少5种本发明蛋白的检测点。
表3
  检测区   本发明蛋白  已知的蛋白   检测点数量
  穿透明带区   表2中蛋白序号：1，2，5-39，41-85，313-319  无   ≥2、≥5、≥10个检测点
  精卵融合有关   表2中蛋白序号：89-92，94-116，118-130，132-137，139-163，165-218，313-319  表1中的蛋白序号：K6-K13   ≥2、≥5、≥10个检测点
  精子运动有关   表2中蛋白序号：219-231，233-251，254-265，268-312，313-319  表1中的蛋白序号：K1-K5   ≥2、≥5、≥10个检测点
  保护精子有关   表2中蛋白序号：86，88  表1中的蛋白序号：K14   ≥1、≥2、或≥3个检测点
应理解，本发明的蛋白质芯片可以是全面性的，即检测全部或绝大部分男性生育相关蛋白，也可以仅针对某类特定功能的男性生育相关蛋白，例如仅含有检测精子获能的检测点，或者仅针对致病最相关(即导致大多数不育病例)的本发明蛋白。
在一优选例中，本发明提供了一种用于免疫学分析的蛋白质芯片及其制法。可以利用高速全自动点样机器人把蛋白质样品(本发明的蛋白的抗体)点阵于经化学处理过的载玻片上，蛋白质通过化学键连接于载玻片上而被固定(例如通过载玻片其表面的醛基基团与氨基并形成共价键)；所述蛋白质样品的点样阵列设计成方阵阵列，每个阵列布有蛋白质样品点阵，将分析过程集成于芯片表面，利用荧光标记物对蛋白质样品分子进行标记，最后利用芯片荧光扫描分析系统对蛋白质样品进行检测分析。
产业应用
基于本发明，男性生育相关蛋白的检测方法和检测工具可用于检测不育症患者精浆中与生育相关蛋白的含量。
本发明的主要优点在于：
(a)可快速有效地筛查个体中与男性生育相关的多种蛋白定性或定量的结果。
(b)用于科研，特别是与生殖相关领域的研究。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
附睾和睾丸标本取自意外死亡的青年男性(27-30岁)，生前有生育史，没有生殖系统疾病记载，与其家属签有将尸体捐赠给医学研究用协议，同时经过烟台毓璜顶医院伦理委员会通过。通过手术取得标本后，立刻进行附睾管腔液和睾丸组织蛋白样品提取和蛋白定量，等量混合三个个体以上标本进行二维凝胶电泳分离，取三次重复电泳共有蛋白点进行质谱鉴定，其中，新发现在精子上有明确定位的蛋白有305个。
实施例2精子准备
正常精液于37℃恒温液化30min，吸取1.0ml的精液于37℃、5％CO2和饱和湿度条件下平衡12h的Earle，s液，将试管倾斜45°左右孵育60min，使活力较好的精子充分上游，600g离心10min。弃上清，重复洗涤两次，备用。正常精液经提供人同意后，由烟台毓璜顶医院生殖中心提供。
实施例3表达载体构建及蛋白纯化
上述305种基因的蛋白产品通过如下方法获得。根据基因序列，合成一对扩增成熟编码区的特异引物。以用常规方法制备的人附睾cDNA文库为模板，通过PCR直接扩增目的基因，然后克隆至市售的载体pGM-T vector(购自上海贝博生物公司)进行测序鉴定正确。将经过测序鉴定后的基因通过酶切位点克隆至表达载体pET32b(+)(购自上海贝博生物公司)中，使其与融合标签的阅读框一致。将重组表达载体转入常规的E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得工程菌。经1mM IPTG在32℃诱导表达，根据载体中的His-Tag标签，运用“两步镍亲和层析法”对重组蛋白进行分离纯化。(图1)纯化后的重组蛋白用Bradford(Bradford 1976)法进行定量，然后冷冻干燥进行保存。
实施例4单抗制备和活性测试
上述305种蛋白的单抗是通过如下方法获得。用实施例1制备的重组蛋白免疫BALB/C小鼠。简单地说，每只老鼠于第1天注射50μg重组蛋白与等量的完全福氏佐剂(CFA)。然后在第15，30和45天注射25μg重组蛋白和等量的不完全福氏佐剂(IFA)加强免疫。末次免疫后3～4天，分离脾细胞与Sp2骨髓瘤细胞株混合后加入PEG使细胞彼此融合，将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养，一般稀释至0.8个细胞/孔，细胞培养至覆盖20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。筛选出的阳性细胞株小鼠腹腔接种，收集腹水，用葡萄球菌A蛋白制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收单克隆抗体。
实施例5 HEL-S-65p，HEL-S-154w，HEL-S-6a三个代表性的蛋白免疫荧光定位
收集精子用PBS洗涤后涂布于1％明胶包被的载玻片上，自然晾干，然后用甲醇固定10分钟。含有精子的载玻片用3％BSA在室温下封闭1小时，然后添加每种蛋白单抗(1∶200)，4℃过夜。用PBST(PBS containing 0.1％Tween-20)洗涤三次，加入对应的FITC-标记羊抗鼠IgG二抗(1∶200)。载玻片用PBST洗涤三次，然后用80％甘油封片。用Olympus BX-52显微镜观察结果。
结果如图3所示，显示HEL-S-65p，HEL-S-154w，HEL-S-6a蛋白分别结合在成熟精子尾部、全身和顶体。
实施例6 HEL-S-65p蛋白对精子运动的影响
取3个0.5ml灭菌离心管，分别加入100μl调整好浓度的精子悬液(2.0×107个/ml)，并标为空白对照组，实验组和阳性对照组。然后倾斜置于37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱内孵育3h进行获能。获能完成后，空白对照组内只加入2μl精子获能培养液(BWW)，实验组中加入2μl HEL-S-65p蛋白抗体(1∶200)，阳性对照组中加入2μl的HEL-75抗体，混匀，在培养箱内再孵育1h进行精子封闭。
将上述处理完毕的精子进行运动检测，检测仪器为汉密尔顿精子运动分析仪，样本检测小室深度为20μm。实验结果见表A。
表A HEL-S-65p蛋白的免疫荧光定位及对精子运动的影响。精子免疫荧光定位显示HEL-S-65p蛋白定位在精子尾部主段，抗体封闭精子后精子的各项运动参数受到明显抑制。
表A获能前封闭精子运动数据
Figure GSA00000134566500201
实施例7HEL-S-154w蛋白抑菌活性
将转入重组载体pET-32b(+)-HEL-S-154w或者空载体pET-32b(+)的细菌(大肠杆菌BL21)过夜培养后，用LB培养基按照1∶40接种，此时取样测OD600，以后每隔1h取样一次。当达到生长指数期时，将细菌平均分成2份。其中一份加入IPTG至终浓度为0.1mM，另一份不加作为对照，以后每隔1h测OD600，每次平行重复测量三次，作为阴性对照组，空白宿主菌BL21用于检测IPTG的毒性。(见图4)。
实施例8 HEL-S-154w蛋白抗菌活性
将过夜培养的大肠杆菌XL-1 blue生长到对数期(OD600＝0.4～0.5)后用10mM PBS(PH7.4)稀释。大约2×106CFU/ml细菌与12.5～100ug/ml的rRNASE9混合，37℃培养，在开始培养后的15，30，60和120分钟取样。将样品用10mMPBS作系列稀释，每个稀释度取100ul涂板，37℃过夜培养形成单菌落，统计菌落个数，抗菌活性用细菌存活的百分数表示，公式为：％存活＝(蛋白处理后存活克隆数/未经蛋白处理后存活的克隆数)*100。
结果图5所示，表明HEL-S-154w蛋白具有抗菌活性。
实施例9 HEL-S-6a蛋白穿卵实验
取3个0.5ml灭菌离心管，分别加入100μl上述调整好浓度的精子悬液，并标为空白对照组，实验组和阳性对照组。空白对照组内只加入2μl获能培养液(BWW)液，实验组中加入2μl HEL-S-6a抗体(1∶200加入)，阳性对照管中加入2μl的HEL-75，混匀，然后倾斜置于37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱内孵育3h进行封闭和获能。取出精子悬液，600g，离心10min。弃上清，以除去添加的多余蛋白一抗，然后用BWW液调节精子密度为3.5×106个/ml左右。取3组精子悬液各90μl，分别加入10μl100μmol/L孕酮，使孕酮终浓度为10μl/L以诱导获能后的精子发生顶体反应。取35mm的无菌塑料培养皿，将已经诱导顶体反应后的精子悬液分别做成100μl的受精滴，并于每个受精滴内加入15-20个卵母细胞。上面覆盖石蜡油，然后放入37℃、6％CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱内孵育3h，使之受精。受精结束后，取出卵母细胞用BWW洗去卵母细胞表面松散的精子，然后压片在相差显微镜下观察受精卵，以膨大精子头及其尾部之存在或雄原核作为卵子被精子穿透的指标。统计精子穿入卵子的百分率。实验结果见表B。
表B显示了HEL-S-6a蛋白的免疫荧光定位及穿卵活性。精子免疫荧光定位显示HEL-S-6a蛋白定位在精子顶体，其抗体能明显抑制获能前及获能后精子的穿卵能力。
表B穿卵实验
实施例10蛋白质芯片的制备
用以下方法制备蛋白质芯片No.1-4：
(a)载玻片芯片
(1)用高速点样仪将多孔板中的各蛋白质样品(抗本发明蛋白的抗体)，直接高密度地点印于经化学处理过的、表面具有活性醛基的载玻片上，每阵列16(4×4)个样点，每个样点直径0.4mm；
(2)于室温过夜或于37℃温育1小时，使蛋白质的氨基与载玻片上的醛基发生缩合反应，以固定样品；
(3)还原载玻片上未被蛋白质占据的活性醛基，然后充分洗涤并室温干燥；
(4)最后用避光材料密封包装并保存于4℃环境中。
(b)PDVF膜芯片
(1)用高速点样仪将多孔板中的各蛋白质样品(抗本发明蛋白的抗体)点到PDVF膜上，每阵列16(4×4)个样点，每个样点直径0.4mm；
(2)用缓冲液漂洗膜2-3次，每次3-6分钟，
(3)用5％的小牛血清或脱酯奶粉室温下封闭1-2小时，
(4)再用缓冲液漂洗膜2-3次，每次3-6分钟；
(5)干燥后，用避光材料密封包装并保存于4℃环境中。
其中，各芯片包括的检测点如下表C所示：
表C
  芯片编号   基片类型  检测区   检测点
  1   载玻片  3个检测区：   与精子穿卵有关的蛋白检测区设214个检测点，为表2中序号为：
  1，2，5-39，41-85，89-92，94-116，118-130，132-137，139-163，165-218，313-319的蛋白的抗体。与精子运动有关蛋白检测区设96个检测点，表2中序号为；219-231，233-251，254-265，268-312，313-319的蛋白的抗体与保护精子有关的检测区设2个检测点，为表2中序号为86，88的蛋白的抗体；
  2   PDVF膜   3个检测区：   同上
  3   PDVF膜   1个检测区   仅包括芯片1中的精子运动有关蛋白检测区
  4   PVDF膜   1个检测区   包括了表2中且不列于表1中的全部305种蛋白
实施例11
蛋白质芯片的应用
用实施例10中制备的芯片No.4，检测了21例男性不育病人的精浆中各男性生育相关蛋白的含量。检测表明结果，有5例弱精男性不育病人的精浆中缺乏HEL-S-162eP蛋白。
然后，对于HEL-S-162eP蛋白缺乏的这5例弱精男性不育病人的精子进行精子运动能力的测定，结果表明：5例男性不育病人的精子运动力均很弱(小于正常的精子对照的30％)。而且精子免疫荧光实验表明精子表面减弱或缺乏HEL-S-162eP蛋白的定位。
对于HEL-S-162eP蛋白的精子定位试验已表明，HEL-S-162eP蛋白定位于赤道+尾主段(见表2)，提示与精子的运动能力相关。
综合上述检测结果，提示缺乏HEL-S-162eP蛋白是导致这些男性不育的主要原因。
讨论
目前，临床上已有少数精浆蛋白用于不育症的辅助诊断和治疗，多项标志物联合检测可筛选和提高诊断的阳性率。常用的免疫学检测方法包括放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)等虽各具优点，但是这些技术都存在一个共同的局限性，即每次仅能检测一种不育症蛋白标志物。这显然不能满足临床上需要联合检测多种不育症标志物的需要，蛋白质芯片可对同一样本中的多种不同目的蛋白分子同时进行分析，又可以同时对多份样本进行检测，大大提高了工作效率；灵敏度和准确度高，信噪比好，只需要微量样本即可；操作简便；重复性好。
本发明选取305种人类精子定位蛋白，是精子成熟重要的蛋白，可作为标志物开发试剂盒，用于男性不育症研究和临床常规检查诊断试剂。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一组与人精子成熟、男性生育相关蛋白的捕获试剂的用途，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白；
且所述的男性生育相关蛋白包括至少5种列于表2中蛋白；
并且所述的男性生育相关蛋白中包括以下蛋白所构成的组合：HEL-S-65p、HEL-S-6a和HEL-S-162ep；
其特征在于，所述的捕获试剂用于制备检测男性个体的男性生育相关蛋白表达情况的芯片或试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性生育相关蛋白包括至少20种列于表2中蛋白。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性生育相关蛋白包括至少50种列于表2中蛋白。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性生育相关蛋白包括至少100种列于表2中蛋白。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性生育相关蛋白包括至少300种列于表2中蛋白。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的捕获试剂是抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂是蛋白质芯片。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是定性或定量检测。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是对男性个体的精浆样品中精子定位蛋白进行定性或定量检测。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是对男性个体的精子上的定位蛋白进行定性或定量检测。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的男性个体是男性不育或婚后1年未育女性的配偶。
12.一种可用于检测睾丸或附睾表达的精子定位蛋白的芯片，其特征在于，所述的芯片包括：
固相载体以及位于所述固相载体上的男性生育相关蛋白的检测点，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白；
并且所述的男性生育相关蛋白中包括以下蛋白所构成的组合：HEL-S-65p、HEL-S-6a和HEL-S-162ep；
且所述的男性生育相关蛋白包括至少5种列于表2中蛋白。
13.一种使用权利要求12所述的芯片鉴别男性不育相关蛋白的方法，其中所述男性生育相关蛋白是列于表2且不列于表1中的蛋白，并且所述的男性生育相关蛋白中包括以下蛋白所构成的组合：HEL-S-65p、HEL-S-6a和HEL-S-162ep；
所述鉴别包括以下步骤：
a)将来自待检测对象的精浆样品与包含针对男性不育相关蛋白的捕获试剂的芯片接触；
b)从样品中捕获男性不育相关蛋白并产生第一个信号；
c)将第一信号与标准品的信号进行比较，获得定性或定量地确定所述男性不育相关蛋白的表达量，其中所述标准品包括阳性对照和阴性对照；
d)根据表达量确定导致男性不育的候选蛋白。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018576B (zh) * 2014-04-18 2020-02-14 烟台聚杰生物工程有限公司 15种男性生育相关蛋白或其组合的应用
US10155008B2 (en) 2014-04-18 2018-12-18 Yantai Jujie Bioengineering Limited Company Use of 15 male fertility related proteins or combination thereof
CN109970843A (zh) * 2019-03-22 2019-07-05 丽水学院 一种人源抗炎症多肽及其应用
CN110873706A (zh) * 2019-11-11 2020-03-10 南通大学 一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1840544A (zh) * 2005-03-30 2006-10-04 李建远 Esc42蛋白及其制备方法和用途
JP2008237204A (ja) * 2007-02-28 2008-10-09 Osaka Univ 疾患モデル動物、細胞、組織、精巣、交配用動物、生殖細胞生産方法、生殖細胞、培養細胞、スクリーニング方法、医薬組成物、妊孕性診断キット、検出方法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体
CN101629953A (zh) * 2009-08-07 2010-01-20 中国海洋大学 一种现场检测免疫芯片及其制备方法与应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6013455A (en) * 1998-10-15 2000-01-11 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Protein kinase homologs
JP2001095578A (ja) * 1999-09-28 2001-04-10 Tanabe Seiyaku Co Ltd 精巣特異的遺伝子
CN1643148B (zh) * 2002-02-14 2011-04-20 独立行政法人科学技术振兴机构 小鼠精子形成基因、人男性不育关连基因、以及利用该基因的诊断系统
EP1794589A4 (en) * 2004-09-15 2010-03-17 Protometrix Inc PROTEIN ARRAYS AND METHOD OF USE THEREOF
ATE429419T1 (de) * 2004-09-24 2009-05-15 Bayer Schering Pharma Ag Indol derivative als inhibitoren der löslichen adenylatzyklase
CN1869700A (zh) * 2005-05-24 2006-11-29 汪宁梅 不孕不育六项指标集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒
US20080108091A1 (en) * 2006-08-07 2008-05-08 Hennessy Bryan T Proteomic Patterns of Cancer Prognostic and Predictive Signatures
EP1891965A1 (de) * 2006-08-16 2008-02-27 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Hip-Kinase für Fertilitätskontrolle
EP2036906A1 (de) * 2007-09-05 2009-03-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Azaindole als Inhibitoren der löslichen Adenylatzyklase
CN101525616A (zh) * 2008-03-03 2009-09-09 李建远 人类附睾特异表达的精子结合蛋白hel-127的制备与应用
WO2010025548A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 UNIVERSITé LAVAL Sperm fertility biomarkers and uses thereof
EP2356449A1 (en) * 2008-10-16 2011-08-17 Rigshospitalet Detection of carcinoma in situ in semen specimens
CN101519448B (zh) * 2009-02-18 2011-10-12 南京医科大学 一种附睾蛋白酶抑制蛋白单克隆抗体及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1840544A (zh) * 2005-03-30 2006-10-04 李建远 Esc42蛋白及其制备方法和用途
JP2008237204A (ja) * 2007-02-28 2008-10-09 Osaka Univ 疾患モデル動物、細胞、組織、精巣、交配用動物、生殖細胞生産方法、生殖細胞、培養細胞、スクリーニング方法、医薬組成物、妊孕性診断キット、検出方法、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び抗体
CN101629953A (zh) * 2009-08-07 2010-01-20 中国海洋大学 一种现场检测免疫芯片及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.N.Tomes, et al..α-SNAP and NSF are required in a priming step during the human sperm acrosome reaction.《Molecular Human Reproduction》.2004,第11卷(第1期),43-51.
Calcium-triggered acrosomal exocytosis in human spermatozoa requires the coordinated activation of Rab3A and N-ethylmaleimide-sensitive factor;M.Michaut, et al.;《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》;20000822;第97卷(第18期);9996-10001 *
KexiongZhang et al..Molecular Cloning and Characterization of Three Novel Lysozyme-Like Genes
M.Michaut, et al..Calcium-triggered acrosomal exocytosis in human spermatozoa requires the coordinated activation of Rab3A and N-ethylmaleimide-sensitive factor.《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》.2000,第97卷(第18期),9996-10001.
Molecular Cloning and Characterization of Three Novel Lysozyme-Like Genes, Predominantly Expressed in the Male Reproductive system of Humans, Belonging to the C-Type Lysozyme/Alpha-Lactalbumin Family;Kexiong Zhang, et al.;《Biology of Reproduction》;20050713;第73卷(第5期);1064-1071 *
α-SNAP and NSF are required in a priming step during the human sperm acrosome reaction;C.N.Tomes, et al.;《Molecular Human Reproduction》;20041112;第11卷(第1期);43-51 *
免疫芯片;康熙雄;《齐鲁医学检验》;20051230;第16卷(第6期);1-3 *
康熙雄.免疫芯片.《齐鲁医学检验》.2005,第16卷(第6期),1-3.
韩伟东,等..蛋白质组学技术在精子蛋白研究中的应用.《中国生物工程杂志》.2009,第29卷(第6期),120-124. *
韩伟东，等。.蛋白质组学技术在精子蛋白研究中的应用.《中国生物工程杂志》.2009,第29卷(第6期),120-124.

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