CN110873706A - 一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法。通过以健康生育男性作为正常对照，以不明原因不育男性患者作为研究对象，观察并高通量筛选不同人精子样本之间孕酮对其头部细胞内游离Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_i)的作用，在避免加药时间差的同时高效快速筛选孕酮响应缺陷的人精子不育样本，进一步探究孕酮对人精子功能的影响及其分子机制，同时以期阐明精子膜孕酮受体功能缺陷在评价男性不育病因中的临床意义。

Description

一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法

技术领域

本发明属于医学技术领域，具体涉及一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法。

背景技术

精子在进入雌性生殖道后，能够快速响应外界理化环境的变化，并经历获能、超活化和顶体反应等一系列生理过程和功能变化，最终才能与卵细胞结合完成授精。孕酮是调节哺乳动物成熟精子功能最重要的生理激素，它由卵丘细胞分泌，在雌性生殖道内呈现浓度梯度分布，在一定浓度范围内，孕酮作为一种重要的趋化因子对精子的生理功能起诱导特性，引导精子成功游向卵细胞，且避免精子过早发生超活化和顶体反应导致能量和水解酶系统的散失，从而保证了正常授精。但孕酮调控精子功能的胞内信号机制尚未得到清楚的阐述。

近年来精子细胞膜上孕酮结合蛋白和精子中孕酮激活的信号通路也相继被发现，精子表面孕酮的正常表达对于受精过程至关重要。孕酮通过与其受体结合，激活相关信号通路，进而调节精子的产生并促进精子受精。如果孕酮受体存在表达或功能缺陷，必将影响精子的功能及受精能力，很有可能是某些男性不育症的病因之一。因此，临床中监测孕酮响应缺陷不育人精子样本至关重要。

目前，已有研究通过检测细胞内钙信号的变化来判断孕酮是否响应的人精子样本，进而预期其运动及受精能力。现有测定孕酮响应筛选的方法有流式细胞仪测定人精子内钙浓度，单细胞钙成像技术等。但这些方法步骤繁琐，耗时较长，未能高效筛选孕酮响应缺陷的不育样本。

发明内容

本发明针对现有方法步骤繁琐、耗时较长，未能高效筛选孕酮响应缺陷的不育样本，提出一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法，为进一步深入探讨精子中孕酮膜受体和孕酮对精子的具体作用机制及在评价男性不育病因中的临床意义，同时为寻找治疗不育症的有效途径提供新思路。

一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法，包括以下步骤：

步骤1，精子样本的处理，将精液样本液化，经初筛选取得到前向运动好且形态正常的完全液化精子样本；

步骤2，精子样本的分离纯化，通过上游法分离纯化精子，将步骤1得到的完全液化精子样本加至HTF溶液中，孵育，取上清液离心，去除上清，加入HS溶液重悬，得到待测精子样本；

步骤3，精子染色，将步骤2得到的待测精子样本用含钙荧光探针Fluo-4 AM 和Pluronic F-127 的溶液进行染色，离心，去除上清，加入 HS溶液重悬，得到染色后的精子溶液；

步骤4，高通量测定精子胞内钙信号，取步骤3得到的染色后精子样本置于96孔板中，设置多功能酶标仪的激发光波长为 503 nm、发散波长为 525 nm，每 1 s 收集一次荧光信号，测定得到染色后精子样本的120 s内胞内钙离子信号的荧光基底值F₀，向样品盘96 孔板中加入孕酮溶液，使其终浓度为1 μM，酶标仪监测5 min 内精子样本的胞内钙离子信号变化情况，根据加入孕酮后精子样本的荧光变化情况计算得到内钙变化百分数，从而得知精子样本对孕酮的相应情况。

进一步地，步骤1中液化条件为37℃恒温水浴中液化 60 min。

进一步地，步骤2中孵育条件为37℃、5% CO₂孵育1 h。

进一步地，步骤2中待测精子样本中精子浓度为1×10⁷个/mL。

进一步地，步骤3中用含5 μM 钙荧光探针Fluo-4 AM 和0.05% Pluronic F-127的溶液进行染色。

进一步地，步骤3中染色条件为37℃、5% CO₂避光染色30 min。

进一步地，步骤4中内钙变化百分数的计算公式为：内钙变化百分数（%）= ΔF/F₀×100 %，其中：F₀为加入孕酮前精子样本的平均荧光，ΔF为每个测量点的荧光值减去F₀。

本发明有效利用了酶标仪自动加药避免时间差、快速、结果稳定，可重复等有点和钙荧光探针稳定性高、不易光漂白、灵敏度高等优点，高效筛选孕酮响应缺陷的人精子不育样本。

附图说明

图1为实施例1中样本1的孕酮对成熟精子胞内钙信号的测量结果。

图2为实施例1中样本2的孕酮对成熟精子胞内钙信号的测量结果。

具体实施方式

精子在进入雌性生殖道后，能够快速响应外界理化环境的变化，并经历获能、超活化和顶体反应等一系列生理过程和功能变化，最终才能与卵细胞结合完成授精。

当精子进入雌性生殖道以后，孕酮能激活精子质膜上的钙离子通道CatSper，由其介导的精子胞内 Ca²⁺ 迅速内流，进而激活胞内相关钙信号途径调节精子顶体反应。同时孕酮还可增加精子胞内 cAMP 的含量，促进精子酪氨酸磷酸化和激活 MAPK 等信号通路，有效调节精子获能、超活化、趋化性等生理功能，使得精子顺利穿过透明带和卵细胞膜最终完成受精作用。但孕酮调控精子功能的胞内信号机制尚未得到清楚的阐述。

迄今国内外对不育男性精子膜孕酮受体缺陷的研究主要集中于少、弱精子症以及畸形精子症患者。少精、弱精、畸形精子症和不明原因不育男性精子对孕酮的响应能力降低导致受精能力下降，可能与孕酮受体的表达缺陷或其他与之相关的膜转导系统发生功能异常密切相关。不明原因不育男性患者其精子经孕酮刺激后不能启动导致顶体反应级联即细胞内游离 Ca²⁺ 浓度升高，必然影响精子的生理功能，从而导致不育。

上述研究表明，孕酮刺激能使正常的细胞内游离钙离子浓度升高应答，目前，研究人员通过检测细胞内钙信号的变化来判断孕酮是否响应的人精子样本，进而预期其运动及受精能力。现有测定孕酮响应筛选的方法有流式细胞仪测定人精子内钙浓度，单细胞钙成像技术等。这些方法步骤繁琐，耗时较长，未能高效筛选孕酮响应缺陷的不育样本。本发明公开了一种高通量筛选孕酮响应缺陷不育人精子样本的方法，以健康生育男性作为正常对照，以不明原因不育男性患者作为研究对象，观察孕酮对精子头部细胞内游离Ca²⁺浓度 ([Ca^{2 +} ] _i) 的作用，高效快速筛选孕酮是否响应的人精子样本，为进一步深入探讨精子中孕酮膜受体和孕酮对精子的具体作用机制及在评价男性不育病因中的临床意义，同时为寻找治疗不育症的有效途径提供新思路。

基于孕酮有效增强人精子功能的特征和精子细胞膜上孕酮结合蛋白受体的功能，因此本发明以健康生育男性作为正常对照，以不明原因不育男性患者作为研究对象，观察并高通量筛选不同人精子样本之间孕酮对其头部细胞内游离 Ca^{2 +}浓度 ([ Ca^{2 +} ] _i) 的作用，在避免加药时间差的同时高效快速筛选孕酮响应缺陷的人精子不育样本，进一步探究孕酮对人精子功能的影响及其分子机制，同时以期阐明精子膜孕酮受体功能缺陷在评价男性不育病因中的临床意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中所使用的HTF溶液和HS溶液参照下列组成配置。

HTF溶液配方：

Component	Weight for 1000 mL (mg)
		NaCl	5481.7
MgSO<sub>4</sub> .7H<sub>2</sub>O	49.296
		KCl	349.639
KH<sub>2</sub>YO<sub>4</sub>	50.3533
		CaCl<sub>2</sub> . 2H<sub>2</sub>O	299.88
Lacti acid	1927.7
		Glucose	500.956
HEPES	5004.3
		NaHCO<sub>3</sub>	336.04
PH 7.4 with NaOH

HS溶液配方：

Component	Weight for 1000 mL (mg)
		NaCl	7889.4
KCl	372.75
		MgSO<sub>4</sub> .7H<sub>2</sub>O	246.48
CaCl<sub>2</sub> . 2H<sub>2</sub>O	294
		HEPES	4766
Glucose	901
		Lacti acid	900.8
Na pyruvate	110
		PH 7.4 with NaOH

实施例1

步骤1，精子样本的处理

将收集到的当日精液样本放于37℃恒温水浴中液化 60 min。液化后的精液样本于人精液分析板中进行分析，取10 µL液化后的精液，置于洁净的 20 µm载玻片上，盖上盖玻片，形成一约 20 µm 深池，将精液分析板放于计算机辅助精液分析仪（CASA）中检测人精子的各项参数，显微镜下初筛精子样本，尽量选取前向运动好且形态正常的完全液化精子样本。

步骤2，上游法纯化分离人精子

人精液通过上游法进行分离纯化。取50 mL离心管，加入5 mL配制的HTF溶液，置37℃预热30 min备用。取出预热好的HTF，用移液枪吸取1mL精子样本，枪头插至管底缓慢且匀速加入液化好的精液样本，形成明显的分界面。将该离心管呈45度角放置于37℃、5% CO₂孵育1 h，运动好的精子自然上游。随后将离心管保持斜角轻轻取出，吸取斜面3 mL- 4 mL上清液，2000 rpm离心5 min。弃去上清，将含有精子的溶液吸出置于2 mL EP管中，加入适量温育后的HS溶液重悬，混匀后，2000 rpm离心5 min，弃去上清，加入适量温育后的HS溶液重悬并调整精子浓度为1×10⁷个/mL。取10 µL置于精液分析板中，于计算机辅助精液分析仪（CASA）中检测精子样本的各项参数。纯化后的精子背景干净，精子个体分明。

步骤3，精子染色

经离心纯化后的精子用含5 μM 钙荧光探针Fluo-4 AM 和0.05% Pluronic F-127 的溶液重悬，置于37℃、5 % CO₂培养箱中避光染色30 min，2000 rpm 离心 6 min，吸去上清液以去除精子细胞外残留的染料，加入 HS溶液重悬精子沉淀，2000 rpm 离心 6 min，去除上清，重复一次，避光备用既得染色后的精子溶液。

步骤4，高通量测定精子胞内钙信号

多功能酶标仪（Flexstation 3，Molecular Devices）提前预热 30 min，取 80 μL 染色后的精子样本置于黑色底板透明的96孔板中，设置仪器的激发光波长为 503 nm、发散波长为 525 nm，每 1 s 收集一次荧光信号，设定温度为37℃，测定染色后精子样本的120 s内胞内钙离子信号的荧光基底值F0。设置自动吸取加样体积为20 μL，将一定浓度的孕酮加至样品盘96 孔板中，自动吸取并加入孕酮，使其终浓度为1 μM，酶标仪监测5 min 内精子样本胞内钙离子信号变化情况，确定孕酮对人精子胞内钙信号的影响，进一步筛选孕酮响应缺陷不育人精子样本。

根据以下公式计算不同精子样本对孕酮的相应情况。公式如下：内钙变化百分数（%）=ΔF/F₀×100 %（F₀, 加药前平均荧光；ΔF，每个测量点荧光值减去F₀）。

以健康生育男性作为正常对照，以不明原因不育男性患者作为研究对象，选取2个不同样本按上述步骤进行。从图1和图2中可知，样本1受到孕酮刺激后，胞内钙浓度增加约95%，而样本2加入孕酮后其内钙浓度只增加约至20%，显著低于样本1。因此可以结合CASA测试精子参数（表1）初步判断样本1为正常精子样本，样本2为孕酮响应缺失的不育精子样本，提示样本2患者精子膜上负责 Ca^{2 +}内流的非基因型孕激素受体可能存在功能障碍。

表1 计算机辅助精液分析仪（CASA）分析精子样本各项功能参数

	精子浓度	总活力	前向运动
				标准	≥ 15*10<sup>6</sup>/mL	≥ 40%	≥ 32%
样本1	110.71*10<sup>6</sup>/mL	71.03%	57.16%
				样本2	50.63*10<sup>6</sup>/mL	31.37%	20.83%

本发明有效利用了酶标仪自动加药避免时间差、快速、结果稳定，可重复等有点和钙荧光探针稳定性高、不易光漂白、灵敏度高等优点，高效筛选孕酮响应缺陷的人精子不育样本。相对于单细胞钙成像方法而言，这种高通量筛选方法简便，快捷，节省了大量的时间；相对于利用流式细胞仪检测而言，该法提高了检测的灵敏度，能够高效快速监测人精子样本响应孕酮的情况。

Claims (7)

1.一种孕酮响应缺陷不育人精子样本的高通量筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，精子样本的处理，将精液样本液化，经初筛选取得到前向运动好且形态正常的完全液化精子样本；

步骤2，精子样本的分离纯化，通过上游法分离纯化精子，将步骤1得到的完全液化精子样本加至HTF溶液中，孵育，取上清液离心，去除上清，加入HS溶液重悬，得到待测精子样本；

步骤3，精子染色，将步骤2得到的待测精子样本用含钙荧光探针Fluo-4 AM 和Pluronic F-127 的溶液进行染色，离心，去除上清，加入 HS溶液重悬，得到染色后的精子溶液；

步骤4，高通量测定精子胞内钙信号，取步骤3得到的染色后精子样本置于96孔板中，设置多功能酶标仪的激发光波长为 503 nm、发散波长为 525 nm，每 1 s 收集一次荧光信号，测定得到染色后精子样本的120 s内胞内钙离子信号的荧光基底值F₀，向样品盘96 孔板中加入孕酮溶液，使其终浓度为1 μM，酶标仪监测5 min 内精子样本的胞内钙离子信号变化情况，根据加入孕酮后精子样本的荧光变化情况计算得到内钙变化百分数，从而得知精子样本对孕酮的相应情况。

2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤1中液化条件为37℃恒温水浴中液化 60 min。

3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤2中孵育条件为37℃、5%CO₂ 孵育1 h。

4.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤2中待测精子样本中精子浓度为1×10⁷个/mL。

5.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤3中用含5 μM 钙荧光探针Fluo-4 AM 和0.05% Pluronic F-127 的溶液进行染色。

6.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤3中染色条件为37℃、5%CO₂ 避光染色30 min。

7.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于：步骤4中内钙变化百分数的计算公式为：内钙变化百分数（%）= ΔF/F₀×100 %，其中：F₀为加入孕酮前精子样本的平均荧光，ΔF为每个测量点的荧光值减去F₀。

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