RU2697395C1 - Способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано для прогноза идиопатического бесплодия мужчин. Для этого методом латексагглютинации определяют концентрации термостабильной карбоксилэстеразы в семенной плазме в начале исследования и через 4-6 недель и по сумме концентраций двух определений выше 16,0 нг/мл прогнозируют идиопатическое бесплодие мужчин. Изобретение направлено на повышение точности прогноза идиопатического бесплодия мужчин. 1 ил., 1 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано, в частности, для прогноза идиопатического бесплодия мужчин.

Мужское бесплодие играет важную роль в 50% бесплодных браков. По данным ВОЗ [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. / - 5th ed. - World Health Organization. 2010. 272 р.] тщательное и полное диагностическое обследование позволяет распознавать наиболее важные причины мужского бесплодия. Известно [Епанчинцева Е.А Селятицкая, Е.М. Артюхова М.А., Лебедева Е.А., Е.Ю. Галустян, А.А. Кирс Частота нарушений сперматогенеза у мужчин из бесплодных пар. // Репродуктивные технологии сегодня и завтра, материалы XXVI международной конференции российской ассоциации репродукции человека (7-10 сентября 2016), М.: 2016, с. 39-43],что более чем в 30% случаев, механизм развития остается нераспознанным, и попадают в категорию мужского идиопатического бесплодия.

Об идиопатическом (необъяснимом, без явно установленной причины) мужском бесплодии говорят в тех случаях, когда с помощью всех существующих современных методов исследования причину бесплодия врачу-специалисту установить не удается. Идиопатическое бесплодие у мужчин (бесплодие без выявленных причин) характеризуется необъяснимым снижением качества спермы (эякулята) и/или клиническим бесплодием без снижения качества спермы. [Епанчинцева Е.А Частота нарушений сперматогенеза у мужчин из бесплодных пар. / Е.А. Епанчинцева, В.Г. Селятицкая, Е.М. Артюхова,, Е.А Лебедева. Е.Ю. Галустян, А.А. Кирс // Репродуктивные технологии сегодня и завтра, материалы XXVI международной конференции российской ассоциации репродукции человека (7-10 сентября 2016), М.: 2016, с. 39-43]

Считается, что на развитие нарушений, которые приводят к ухудшению качества спермы, без изменения спермограммы влияет комбинация внутренних и внешних факторов (образ жизни мужчины, характер питания, факторы окружающей среды) - все эти факторы могут быть ответственны за мужской фактор бесплодия.

Термин «идиопатический» используется, только если проведено комплексное обследование мужчины и при этом не установлены никакие явные причинные факторы снижения качества спермы.

При постановке идиопатического бесплодия или, другими словами, необъяснимого бесплодия врачи руководствуются наличием хороших анализов и отсутствием детей при незащищенном половом акте в течение года и больше.

Лечение идиопатического бесплодия представляет собой трудную задачу, поскольку оно не может быть специфичным вследствие неопределенности этиологии и неоднородности групп пациентов, что предопределяет его эмпирический характер с непредсказуемым результатом. Своевременная постановка идиопатического бесплодия может сохранить время и деньги пациентов потраченные на безуспешные попытки получения потомства и обратить их взгляды на современные вспомогательные репродуктивные технологии.

В практике для оценки качества и фертильности спермы в настоящее время выполняется спермограмма [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. - 5th ed. - WHO (Geneva), 2010. - Vol. 270; Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макаровой под научн. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. - М.: Изд-во "Капитал принт", 2012]. Данное исследование включает в себя определение целого ряда параметров, из которых, однако, на практике преимущественно используется только ограниченное число (определение концентрации, жизнеспособности, подвижности и морфологии сперматозоидов).

К недостаткам данного способа относится то, что он:

- основан на визуальном исследовании функционально-морфологических критериев и не позволяет выявить биохимические нарушения в половых клетках;

- носит субъективный характер, отчего результат оценки качества половой клетки зависит от проводящего данный анализ;

- не позволяет в 40% случаев, а иногда и более, дать приемлемую интерпретацию причин бесплодия неясного генеза, так как показатели спермограмм мужчин с идиопатическим бесплодием находятся в пределах нормы, согласно критериям ВОЗ, и соответствуют критериям фертильных мужчин, поскольку нет достаточного количества данных о биохимических механизмах лежащих в основе формирования фертильности.

Поэтому клинически традиционных показателей спермограммы не всегда достаточно в оценке фертильности сперматозоидов. Необходим поиск новых критериев мужской фертильности и биохимических маркеров для расширения доказательной базы некоторых параметров спермы и определения качества половых клеток.

Предложено много лабораторных, инструментальных анамнестических, генетических тестов для прогноза идиопатического мужского бесплодия при показателях спермограммы близких к норме. [Hofherr SE, Wiktor АЕ, Kipp BR, Dawson DB, Van Dyke DL. Clinical diagnostic testing for the cytogenetic and molecular causes of male infertility. J Assist Reprod Genet. 2011; 28:1091-1098.].

Так, известен способ определения одного из таких маркеров - фрагментации ДНК сперматозоидов - с использованием различных методов документации этого явления: TUNEL-тест (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling); электрофорез ДНК индивидуальных, заключенных в агарозу клеток - Comet assay (single cell gel electrophoresis); тест на структуру хроматина - метод SCSA (sperm chromatin structure assay), который позволяет определить степень повреждения нитей ДНК в сперматозоидах, коррелирующую с мужской фертильностью как в естественных условиях, так и во вспомогательной репродукции. Для количественного определения клеток с нарушенной ДНК используют проточную цитометрию или флуоресцентную микроскопию [Жабин С.Г. и др. Сравнительная оценка уровня ДНК-фрагментации и других показателей фертильности эякулята // Пробл. репрод. - 2015. - Т. 21. - №4. - С. 121-124; Evenson D.P., et al. Sperm chromatin structure assay: Its clinical use for detecting sperm DNA fragmentation in male infertility and comparison with other technique // J. Androl. - 2002. - Vol. 23. - P. 25-43; Muratori M., et al. Nuclear staining identifies two populations of human sperm with different DNA fragmentation extent and relationship with semen parameters // Hum. Reprod. - 2008. - Vol. 23. - №5. - P. 1035-1043; Tomsu M., et al. Embryo quality and IVF treatment outcomes may correlate with different sperm comet assay parameters // Hum. Reprod. - 2002. - Vol. 17. - №7. - P. 1856-1862].

Однако недостатками способов определения фрагментации ДНК являются:

- трудоемость и технические сложности;

- необходимость использования дорогостоящих реактивов и оборудования (например, проточного цитофотометра);

- недостаточная стандартизированность методологии и общепринятого протокола исследования;

- отсутствие понимания биологических механизмов, лежащих в основе анализируемого параметра, так как источником повреждения ДНК в сперме могут быть либо повреждения, возникающие в ходе сперматогенеза, либо инициация процесса апоптоза, либо оксидативный стресс.

- фрагментация ДНК является поздним маркером апоптоза, поэтому способ не позволяет выявить ранние биохимические нарушения начавшиеся в клетке и ассоциированные с ее гибелью, т.е. когда клетка находится на ранних этапах апоптоза.

Существует способ, позволяющий выявлять ранние признаки апоптоза, а именно изменения проницаемости плазматической мембраны и хроматина, предшествующие межнуклеосомной фрагментации ДНК [Ricci G., Perticarari S., Fragonas E. et al. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes // Hum. Reprod. - 2002. - Vol. 17. - №10. - P. 2665-2672].

В живых клетках существует фосфолипидная асимметрия плазматической мембраны, т.е. фосфатидилсерин находится исключительно во внутреннем слое мембраны. Инициация апоптоза приводит к экстернализации фосфатидилсерина в наружный слой мембраны, определить которую можно Аннексином V.

Наиболее близким к предлагаемому является способ исследования иммунохимического параметра в спермальной жидкости, отличающийся тем, что в сперме определяют термостабильный альфа-1-гликопротеин, сравнивают с нормой и при повышении его концентрации выше 16 мкг/мл определяют сниженную фертильность спермы [Посисеева Л.А., Татаринов Ю.С., Городков В.Н. и соавт. Авторское свидетельство №1389758]. Недостатками прототипа является то, что результаты:

- носят полуколичественный характер и зависят от качества разведения спермальной жидкости;

- авторы не указывают на удаление сперматозоидов, а, как известно, количество сперматозоидов влияет на объем эякулята и, соответственно, меняется концентрация белков семенной плазмы [Луцкий Д.Л., Николаев А.А., Ложкина Л.В. / Белковый спектр эякулятов различной фертильности. // Урология. 1998. №2, с. 48-52.];

- анализ продолжается не менее 24 часов.

- субъективность оценки учета последнего подгиба линии преципитации.

Изобретение направлено на повышение точности прогноза идиопатического бесплодия мужчин.

Указанный технический результат достигается тем, что методом латексагглютинации определяют концентрации термостабильной карбоксилэстеразы в семенной плазме в начале исследования и через 4-6 недель и по сумме концентраций двух определений, выше 16,0 нг/мл прогнозируют идиопатическое бесплодие у мужчин.

Антитела выделяли на аффинном сорбенте, полученном на основе цианбромированной сефарозы CL-4B и чистого препарата термостабильной КЭ (ТКЭ) полученной по методу [Николаев Биохимическое и иммунохимическое изучение белков семенной плазмы человека ДОКТОРСКАЯ диссертация. Астрахань, 1994]. При постановке метода в качестве твердой фазы использовали полимерные микросферы (ПМС), предварительно активированные 2% глютаровым альдегидом. 10,0 мкг антител к ТКЭ растворяли в 2,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,8, который содержал 12,5 г/л глутаральдегида. Сенсибилизированные ПМС центрифугировали и сохраняли при 4°С. Далее взвесь полимерных сфер промывали и к 1 г осевшей взвеси добавляли 1 мл 2 М раствора 1,6-диаминогексана и перемешивали смесь в течение 2 ч при температуре 50°С. Концентрация адсорбированного на полимерной поверхности иммуноглобулина составляла 25,5-32,8 мкг/см. Активированные частицы ПМС промывали, путем трехкратного центрифугирования, используя забуференный физиологический раствор рН=7,2, содержащий 0,5% Твин-20.

Предел чувствительности латексагглютинационного анализа на термостабильную КЭ в данном варианте метода составил 0,80 нг/мл. В отличие от ИФА предлагаемый способ втрое дешевле, не требует дополнительного оборудования и по затратам времени в 8-10 раз выполняется быстрее ИФА.

Проведено динамическое исследование семенной плазмы 442 мужчин пациентов центра планирования семьи г. Астрахань, лаборатории «Диамед-экспресс» ООО МФВФ «Техномед» и определяли методом ЛА уровни ТКЭ в их семенной плазме дважды с интервалом в 4-6 недель. Все пациенты наблюдались в течение года и регистрировались диагноз и причина бесплодия. Из 442 мужчин идиопатическое бесплодие в конечном итоге диагностировано у 224. Ретроспективный анализ лабораторных данных позволил нам предложить формулу вероятности идиопатического бесплодия. В нашем случае прогноз основан на сумме концентраций термостабильной КЭ, определенной двукратно с интервалом не менее 4 недель. При таком расчете суммарная концентрация выше 16,0 нг/мл позволяет судить об идиопатическом бесплодии. Сущность предлагаемого способа поясняется фиг. 1, где А. Положительный результат - агглютинация образца семенной плазмы, пациента с идиопатическим бесплодием. Б. отрицательный результат - образец семенной плазмы фертильного мужчины.

Диагноз идиопатического бесплодия устанавливался на основании клинических и лабораторных данных. Проведенные исследования позволили произвести комплексную оценку факторов риска с учетом информативной значимости каждого фактора.

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Истинноположительным результатом на термостабильную КЭ считалась сумма концентраций двух определений более 16 нг/мл. при подтвержденном диагнозе Идиопатическое бесплодие.

Истинноотрицательным результатом на термостабильную КЭ считалась сумма концентраций двух определений менее 16 нг/мл. при неподтвержденном диагнозе Идиопатическое бесплодие.

Ложноотрицательным результатом на термостабильную КЭ считалась сумма концентраций двух определений менее 16 нг/мл. при подтвержденном диагнозе Идиопатическое бесплодие.

Ложноположительным результатом на термостабильную КЭ считалась сумма концентраций двух определений более 16 нг/мл. при неподтвержденном диагнозе Идиопатическое бесплодие.

Чувствительность метода: =55,3%. Специфичность: =88,5%.

Таким образом, это означает: у 55,3%. мужчин с суммарным уровнем ТКЭ выше 16,0 нг\мл прогноз идиопатического бесплодия оказывается верным. Специфичность равна 88,5%. следовательно, у 88,5% пациентов, с заведомо отрицательным прогнозом, результаты теста отрицательны. Отрицательная разница в 33,5% между достоверно положительным прогнозом и достоверно отрицательным прогнозом является фактором неопределенности, обусловленным многофакторностью причин идиопатического бесплодия и в данном случае открывает возможности для введения новых прогностических признаков для повышения чувствительности.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1

Донор спермы №1, возраст 32 лет, длительность бесплодного брака 2,5 года. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 14 минут. Объем эякулята 4,1 мл. Концентрация сперматозоидов - 16,8 млн/мл, подвижных сперматозоидов 44,0%, нежизнеспособных 25,4%, атипичных форм 42,3%.

После проведения анализа спермограммы образец спермы центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 20 минут, надосадочная жидкость (семенная плазма) собиралась, маркировалась и хранилась для дальнейшего исследования при -24°С.

В ряд лунок микропланшета вносят по 2 капли соответствующих разведении исследуемого образца и добавляют по 1 капле суспензии частиц латекса, сенсибилизированных антителами к термостабильной КЭ. В положительном контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разведениями стандартного раствора термостабильной КЭ.

В отрицательном контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разводящим раствором (Боратный буфер с рН 8,3, азид натрия 0,95 г/л) микропланшет встряхивают и выдерживают при 26°С 15 мин. При наличии визуальной агглютинации реакция считается положительной. Количественная оценка проводится по разведениям исследуемой пробы. Минимальная концентрация термостабильной КЭ по данным разведений стандартного препарата 0,80 нг\мл.

1 определение ТКЭ равно 8,0 нг/мл, 2 определение, проведенное через 4 недели равно 12,0 нг/мл Сумма 20,0 нг/мл.

Прогноз Идиопатическое бесплодие в дальнейшем подтвердился клинико-лабораторным исследованием

Пример №2

Донор спермы №21, возраст 34 года, длительность бесплодного брака 5 лет. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 15 минут.Объем эякулята 4,2 мл. Концентрация сперматозоидов - 12 млн/мл, подвижных сперматозоидов 41,0%, нежизнеспособных 22,4%, атипичных форм 38,6%). Определение термостабильной карбоксилэстеразы проводят как в примере №1.

1 определение ТКЭ равно 8,0 нг/мл, 2 определение проведенное через 6 недель равно 4,0 нг/мл Сумма 12,0 нг/мл.

Прогноз бесплодие не носит идиопатический характер. В дальнейшем подтвердился клинико-лабораторным исследованием диагноз секреторное бесплодие. Пример №3.

Донор спермы №68, возраст 31 год, длительность бесплодного брака 2 года. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 20 минут. Объем эякулята 3,0 мл. Концентрация сперматозоидов - 15 млн/мл, активно подвижных сперматозоидов 42,0%, нежизнеспособных 28%, атипичных форм 39%. Определение термостабильной карбоксилэстеразы проводят как в примере №1.

1 определение ТКЭ равно 4,0нг/мл, 2 определение, проведенное через 4 недели равно 2,0 нг/мл Сумма 6,0 нг/мл.

Прогноз бесплодие не носит идиопатический характер. В дальнейшем при тщательном клинико-лабораторным исследовании пациент признан фертильным.

Пример №4

Донор спермы №81, возраст 36 лет, длительность бесплодного брака 5 лет. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 14 минут. Объем эякулята 6,4 мл. Концентрация сперматозоидов - 14,5 млн/мл, подвижных сперматозоидов 40,0%, нежизнеспособных 26,5%, атипичных форм 44,8%.

Определение термостабильной карбоксилэстеразы проводят как в примере №1.

1 определение ТКЭ равно 2,0 нг/мл, 2 определение, проведенное через 6 недель равно 16,0 нг/мл Сумма 18,0 нг/мл.

Прогноз Идиопатическое бесплодие в дальнейшем подтвердился клинико-лабораторным исследованием.

Пример №5

Донор спермы №117, возраст 34 года, длительность бесплодного брака 4 года. Показатели спермограммы соответствуют критериям, предъявляемым экспертной группой ВОЗ к фертильной сперме. Время разжижения 15 минут.Объем эякулята 3,8 мл. Концентрация сперматозоидов - 14,2 млн/мл, подвижных сперматозоидов 44,9%, нежизнеспособных 25,4%, атипичных форм 39,6%.

Определение термостабильной карбоксилэстеразы проводят как в примере №1.

1 определение ТКЭ равно 8,0 нг/мл, 2 определение проведенное через 6 недель равно 4,0 нг/мл Сумма 12,0 нг/мл.

Прогноз бесплодие не носит идиопатический характер. В дальнейшем подтвердился клинико-лабораторным исследованием диагноз секреторное бесплодие.

Предлагаемым способом достигается повышение точности прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин, а именно

- повышается точность т.к используется семенная плазма, а не цельная сперма, концентрация белков в которой колеблется в связи с численностью сперматозоидов;

- существенно сокращается время исследования с минимум 24 часов до максимум 1 часа;

- снижается субъективность оценки;

- повышается чувствительность способа от 1000-5000 нг\мл в прототипе (средняя чувствительность реакции преципитации в агаре), до 0,8 нг\мл.

Claims (1)

1. Способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин путем исследования иммунохимического параметра в сперме, отличающийся тем, что методом латексагглютинации определяют концентрации термостабильной карбоксилэстеразы в семенной плазме в начале исследования и через 4-6 недель и по сумме концентраций двух определений выше 16,0 нг/мл прогнозируют идиопатическое бесплодие.

Images