RU2814377C1 - Способ определения необходимости выполнения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с донацией сперматозоидов при идиопатическом мужском бесплодии с необструктивной азооспермией - Google Patents
Способ определения необходимости выполнения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с донацией сперматозоидов при идиопатическом мужском бесплодии с необструктивной азооспермией Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814377C1 RU2814377C1 RU2023117159A RU2023117159A RU2814377C1 RU 2814377 C1 RU2814377 C1 RU 2814377C1 RU 2023117159 A RU2023117159 A RU 2023117159A RU 2023117159 A RU2023117159 A RU 2023117159A RU 2814377 C1 RU2814377 C1 RU 2814377C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- testicular
- spermatogenesis
- infertility
- sperm
- assisted reproductive
- Prior art date
Links
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 230000002381 testicular Effects 0.000 claims abstract description 39
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 claims abstract description 37
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims abstract description 19
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims abstract description 19
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 210000002863 seminiferous tubule Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 3
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 6
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 6
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 206010067162 Asthenospermia Diseases 0.000 description 4
- 208000007799 Asthenozoospermia Diseases 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 3
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 101001041080 Homo sapiens Beta-defensin 126 Proteins 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 3
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102100021099 Beta-defensin 126 Human genes 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001400 Tryptase Human genes 0.000 description 2
- 108060005989 Tryptase Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 2
- 239000000598 endocrine disruptor Substances 0.000 description 2
- 231100000049 endocrine disruptor Toxicity 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102100021337 Gap junction alpha-1 protein Human genes 0.000 description 1
- 229920002306 Glycocalyx Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 231100000182 Sperm DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N Triclosan Chemical compound OC1=CC(Cl)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000006470 autoimmune attack Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000003927 comet assay Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000003583 cytomorphological effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035557 fibrillogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013277 forecasting method Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004517 glycocalyx Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005184 men's health Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009933 reproductive health Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229960003500 triclosan Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, репродуктологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения необходимости выполнения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с донацией сперматозоидов при идиопатическом мужском бесплодии с необструктивной азооспермией. У мужчин с бесплодием неустановленого генеза получают биопсийный материал яичка, в котором на гистологическом срезе поперечных сечений извитых семенных канальцев исследуют методом световой микроскопии состояние сперматогенеза по десятибалльной шкале. Далее исследуют строму яичка и наличие в ней триптазаактивных тучных клеток в 1 мм2, которые контрастируют с помощью иммунногистохимического окрашивания. При выявлении триптазаактивных тучных клеток 39 и более в 1 мм2 в интерстиции яичка на фоне нарушения сперматогенеза 6 баллов и ниже прогнозируют необходимость выполнения протокола вспомогательных репродуктивных технологий с донацией сперматозоидов. Изобретение позволяет получить информацию о тяжести нарушения сперматогенеза из-за изменения клеточного микроокружения в интерстиции яичка, а также обеспечивает повышение точности диагностики идиопатического бесплодия мужчин и оценки перспективы сохранности развития мужских половых клеток. 3 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к урологии, репродуктологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования мужского бесплодия неустановленного генеза и оценки репродуктивного здоровья мужчин.
В настоящее время бесплодие приобрело статус глобальной социально-демографической проблемы, с которой сталкивается 15% пар во всем мире при планировании семьи (Agarwal A, Mulgund A, Hamada A, Chyatte MR. А unique view on male infertility around the globe; 2 Reprod Biol Endocrinol 2015; 13(1):37. doi:10.1186/s12958-015-0032-1.). Показатель встречаемости «мужского» фактора, то есть, количественных и качественных нарушений в сперме, при обследовании пары на бесплодие приближается к 50%, что требует пристального внимания к мужскому здоровью (Лебедев Г.С., Голубев Н.А., Шадеркин И.А., Шадеркина В.А., Аполихин О.И., Сивков А.В., Комарова В.А. Мужское бесплодие в Российской Федерации: статистические данные за 2000-2018 годы. Экспериментальная и клиническая урология 2019; (4): 4-12).
Таким образом, доля мужчин с нарушениями в эякуляте ежегодно увеличивается, что является одной из причин снижения рождаемости, и становится как медицинской, так и социальной проблемой. Современные методы диагностики позволяют распознавать многие факторы мужского бесплодия: генетические, эндокринные, инфекционные, экстрагенитальные и т.д. Однако, несмотря на все современные медико-биологические достижения, остается 1/3 пациентов с нераспознанной причиной (идиопатической) мужского бесплодия. При этом нельзя забывать, что часть пациентов из этой категории для реализации отцовства не хотят прибегать к вспомогательным репродуктивным технологиям, и стремятся достичь беременности естественным путем. Поэтому поиск причин мужского бесплодия остается актуальным вопросом современной урологии.
Разработка принципиально новой стратегии и тактики скрининга мужской инфертильности на основе молекулярных инструментов представляет собой насущную потребность. На сегодняшний день в практике врача уролога практически отсутствуют надежные, соответствующие времени методики для точной диагностики мужского бесплодия, основанные на использовании достижений молекулярной биологии и генетики.
В данной ситуации следует отметить, что репродукция - сложный процесс, в основе которого лежит взаимодействие эндокринной и иммунной систем и микробиоты. В то же время существующий гемато-тестикулярный барьер, который позволяет избежать аутоиммунные атаки против белков, экспрессируемых сперматозоидами, при повреждении которого возникает секреторный тип мужского бесплодия. (Santacroce L, Imbimbo С, Ballini А, Crocetto F, Scacco S, Cantore S, Di Zazzo E, Colella M, Jirillo E. Testicular Immunity and Its Connection with the Microbiota. Physiological and Clinical Implications in the Light of Personalized Medicine. J Pers Med. 2022 Aug 20;12(8):1335. doi: 10.3390/jpm12081335. PMID: 36013286; PMCID: PMC9409709).
Поэтому клинически традиционных показателей спермограммы не всегда достаточно в оценке фертильности сперматозоидов. Более того, морфологический анализ биоптатов яичка, окрашенных стандартными красителями, может демонстрировать информацию о текущем состоянии сперматогенеза, но не позволяет прогнозировать сохранность сперматогенного эпителия в перспективе. Необходим поиск новых критериев мужской фертильности, биохимических и морфологических маркеров для расширения доказательной базы некоторых параметров спермы и определения качества половых клеток.
В практике для оценки качества и фертильности спермы в настоящее время выполняется спермограмма [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. - 5th ed. - WHO (Geneva), 2010. - Vol.270; Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макаровой под научн. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. - М.: Изд-во "Капитал принт", 2012]. Данное исследование включает в себя определение целого ряда параметров эякулята, из которых, однако, на практике преимущественно используется только ограниченное число критериев (определение концентрации, жизнеспособности, подвижности и морфологии сперматозоидов).
К недостаткам морфологической оценки эякулята (WHO (Geneva), 2010) относятся:
- основана на визуальном исследовании функционально-морфологических критериев и не позволяет выявить биохимические причины мужского бесплодия;
- носит субъективный характер, отчего результат оценки качества половой клетки зависит от проводящего данный анализ;
- не позволяет в 40% случаев, а иногда и более, дать приемлемую интерпретацию причин бесплодия неясного генеза, так как показатели спермограмм мужчин с идиопатическим бесплодием находятся в пределах нормы, согласно критериям ВОЗ, и соответствуют критериям фертильных мужчин, поскольку нет достаточного количества данных о биохимических механизмах, лежащих в основе формирования фертильности.
Из существующего уровня техники известен способ определения одного из таких маркеров инфертильности - фрагментации ДНК сперматозоидов - с использованием различных методов документации этого явления: TUNEL-тест (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling); электрофорез ДНК индивидуальных, заключенных в агарозу клеток - Comet assay (single cell gel electrophoresis); тест на структуру хроматина - метод SCSA (sperm chromatin structure assay), который позволяет определить степень повреждения нитей ДНК в сперматозоидах, коррелирующую с мужской фертильностью как в естественных условиях, так и во вспомогательной репродукции. Для количественного определения клеток с нарушенной ДНК используют проточную цитометрию или флуоресцентную микроскопию [Жабин С.Г. и др. Сравнительная оценка уровня ДНК-фрагментации и других показателей фертильности эякулята // Пробл. репрод. - 2015. - Т. 21. - №4. -С.121-124].
Однако недостатками способов определения фрагментации ДНК являются:
- трудоемкость и технические сложности;
- необходимость использования дорогостоящих реактивов и оборудования (например, проточного цитофотометра);
- недостаточная стандартизация методологии и общепринятого протокола исследования;
- отсутствие понимания биологических механизмов, лежащих в основе анализируемого параметра, так как источником повреждения ДНК в сперме могут быть либо повреждения, возникающие в ходе сперматогенеза, либо инициация процесса апоптоза, либо оксидативный стресс.
- фрагментация ДНК является поздним маркером апоптоза, поэтому способ не позволяет выявить ранние биохимические нарушения, начавшиеся в клетке и ассоциированные с ее гибелью, т.е. когда клетка находится на ранних этапах апоптоза.
Известен Способ диагностики мужского бесплодия, включающий исследование эякулята на содержание эндокринных дизрапторов (EDs), отличающийся тем, что при обнаружении наличия триклозана ≥0,15 нг/мл методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием устанавливают токсическую форму бесплодия, (патент РФ№2675856, опубл.25.12.2018).
Недостатками данного технического решения являются:
- данный способ позволяет определить лишь токсическую форму патозооспермии;
- данный способ не позволяет выявить конкретные воспалительные причины мужского бесплодия;
- трудоемкость и технические сложности.
Известен способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин путем исследования иммунохимического параметра в сперме, отличающийся тем, что методом латексагглютинации определяют концентрации термостабильной карбоксилэстеразы в семенной плазме в начале исследования и через 4-6 недель и по сумме концентраций двух определений выше 16,0 нг/мл прогнозируют идиопатическое бесплодие (патент РФ №2697395. Опуб. 14.08.2019).
Однако недостатками этого способа определения являются:
- не высокая чувствительность метода (55,3%),
- метод определяет биохимические изменения в семенной плазме и не демонстрирует корреляцию с морфологическими изменениями в извитых семенных канальцах;
- трудоемкость и технические сложности, необходимость специальной аппаратуры.
Известен способ определения качества эякулята у мужчин по активности креатинфосфокиназы в спермальной плазме, включающий сбор образца эякулята, полученный путем мастурбации и семяизвержения в чистый контейнер из пластика, доставку в лабораторию в течение 30 минут при температуре от 20 до 37°С, помещение в термостат при 37°С для разжижения, центрифугирование в течение 10 мин при 1000 g, перенесение в чистую пробирку и определение активности креатинфосфокиназы на автоматическом биохимическом анализаторе кинетическим методом, отличающийся тем, что интерпретацию результатов проводят следующим образом: активность креатинфосфокиназы более 362,3 Е/л соответствует нормозооспермии; от 167,0 до 362,3 Е/л включительно соответствует олигозооспермии; от 109,4 до 167,0 Е/л включительно соответствует криптозооспермии; активность КФК ниже 109,4 Е/л включительно соответствует азооспермии по данным спермограммы.(патент РФ№2732968, опубл. 25.08.2020).
Однако недостатками иммунофлуоресцентного анализа гидроксиметилированной ДНК являются:
- необходимость использования дорогостоящих реактивов (антител, флуорохромов) и оборудования (например, люминесцентного микроскопа);
- трудоемкость и технические сложности;
- недостаточная стандартизация методологии и общепринятого протокола исследования;
- отсутствие определения патогенеза биологических механизмов ДНК-фрагментации, лежащих в основе анализируемого параметра, так как причиной повреждения ДНК сперматозоидов могут быть либо повреждения, возникающие в ходе сперматогенеза, либо инициация процесса апоптоза, либо активные формы кислорода.
Известен способ оценки репродуктивной функции мужчин с идиопатическим бесплодием и астенозооспермией, отличающийся тем, что с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в клетках подвижной фракции эякулята определяют уровень экспрессии и мутантный аллель гена противомикробного пептида DEFB126 и при снижении уровня экспрессии по меньшей мере в 3,4 раза в сравнении с экспрессией группы здоровых доноров и выявлении мутантного генотипа del/del DEFB126 диагностируют астенозооспермию, обусловленную нарушением белковой структуры гликокаликса сперматозоидов (патент РФ№2759147, опубл. 09.11.2021).
Недостатками данного технического решения являются:
- трудоемкость и технические сложности;
- метод позволяет выявить факт наличия мутантного генотипа del/del DEFB126, который провоцирует развитие астенозооспермии, причину нарушения подвижности сперматозоида данный способ не позволяет выявить;
- с помощью данного способа невозможно определить в какой период сперматогенеза произошла мутация, которая стала причиной нарушения подвижности сперматозоида.
В настоящее время существует небольшое количество работ, посвященных морфометрическому анализу сперматогенеза.
Известен способ диагностики гипосперматогенеза и атрофии сперматогеннго эпителия в паренхиме яичка путем проведения морфометрического анализа биоптата и определения индекса сперматогенеза с помощью вычисления отношения числа всех сперматогенных клеток к числу сустентоцитов (клеток Сертоли) в 30 поперечных срезов извитых семенных канальцев [А.Ф. Астраханцев, Соловьев А.А., 2001]. Оценка результата производится по таким признакам как: снижение индекса сперматогенеза до 10-90%, снижение индекса сперматогенеза более 90%, при этом в 1 случае диагностируется гипосперматогенез, во 2 случае диагностируют атрофию сперматогенных клеток яичка.
Недостатки данного метода: метод неточен, т.к. не дает информации о количественном соотношении сперматогенных клеток различной степени дифференцировки в процессе различных фаз сперматогенеза: размножения, роста, созревания и формирования.
Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ диагностики нарушений сперматогенеза у человека путем определения его цитологического профиля, отличающийся тем, что на гистологическом срезе поперечных сечений извитых семенных канальцев мужской половой железы проводят определение каждой из VI клеточных ассоциаций, составляющих цикл сперматогенеза, затем производят дифференцированный подсчет количества сперматогенных клеток, входящих в каждую ассоциацию, по отношению к количеству сустентоцитов данного сегмента канальца, сравнивают результаты подсчета с цитологическим профилем сперматогенеза в половых железах здоровых мужчин и оценивают результат, констатируя нарушение на стадии формирования при снижении количества ранних и поздних сперматид во всех VI клеточных ассоциациях более 5%; на стадии созревания при уменьшении количества сперматогенных клеток, входящих в VI клеточную ассоциацию; на стадии роста при снижении числа первичных сперматоцитов на стадиях I-V; на стадии размножения при уменьшении количества сперматогоний на всех VI стадиях.(патент РФ№2665162, опубл. 28.08.2018).
Недостатками данного технического решения являются:
- трудоемкость и необходимость в высококвалифицированном персонале;
- нет корреляции изменений в паренхиме и строме яичка;
- данный метод демонстрирует конкретные морфологические изменения в яичке, но не поясняет патогенез данных нарушений.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является усовершенствование методики прогнозирования нарушений сперматогенеза неустановленного генеза.
Данная задача решается за счет того, что заявленный пособ прогнозирования идиопатического мужского бесплодия в условиях программ вспомогательных репродуктивных технологий, включающий проведение гистологического анализа биоптатов яичка, отличается тем, что у мужчин с бесплодием неустановленного генеза получают биопсийный материал яичка, в котором методом световой микроскопии оценивают состояние сперматогенеза в извитых семенных канальцах по десятибалльной шкале, далее оценивают интерстиций яичка и наличие в ней триптазаактивных тучных клеток (ТК) в 1 мм2, которые контрастируются с помощью иммунногистохимического окрашивания. В случае выявления интенсивной инфильтрации интерстиция яичка триптазаактивными тучными клетками более 39 в 1 мм2 на фоне нарушения сперматогенеза 6 баллов и ниже, прогнозируют необходимость выполнения протокола вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с донацией сперматозоидов.
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является повышение точности и достоверности прогнозирования, путем введения дополнительных процедур цитоморфологического анализа паренхимы и стромы яичка и введения дополнительных критериев оценки результатов.
Известно, что тучные клетки (ТК) формируются из гемопоэтических клеток-предшественников, но при этом зрелые ТК обычно не циркулируют в крови. Они мигрируют в периферические ткани, где приобретают свой зрелый фенотип [Komi D.E.A., Khomtchouk К., Santa Maria P.L. A review of the contribution of mast cells in wound healing: involved molecular and cellular mechanisms. Clin Rev Allergy Immunol. 2020;58(3):298-312. DOI: 10.1007/s12016-019-08729-w.]. Этому процессу, а также локальному созреванию и активации ТК способствует фактор стволовых клеток (SCF), продуцируемый различными клетками, включая фибробласты и эндотелиальные клетки. Сами ТК экспрессируют широкий спектр рецепторов, таких как FcsRI, Fey, рецепторы комплемента, цитокинов, хемокинов, гормонов и толл-подобные рецепторы. Это позволяет ТК синтезировать разнообразный и широкий спектр биологически активных продуктов [Gri G., Frossi В., DTnca F. et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Front Immunol. 2012;3:120. DOI: 10.3389/fimmu.2012.00120.].
Однако роль ТК в формировании мужского бесплодия остается до конца не ясной. Получены данные о повышенном содержании ТК как в эякуляте, так и непосредственно в тканях репродуктивных органов у бесплодных мужчин, особенно при идиопатической азооспермии. Так, анализ образцов семенной жидкости бесплодных мужчин с астенозооспермией показал, что количество ТК у этих пациентов было больше, чем у здоровых мужчин [El-Karaksy A., Mostafa Т., Shaeer O.K. et al. Seminal mast cells in infertile asthenozoospermic males. Andrologia. 2007;39(6):244-247. DOI: 10.1111/j.1439-0272.2007.00795.x.].
Цель нашего исследования - провести количественный подсчет тучных клеток в интерстиции яичка и их корреляцию с нарушением сперматогенеза у мужчин с идиопатическим мужским бесплодием для решения вопроса о необходимости выполнения протокола вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с донацией сперматозоидов.
У мужчин с идиопатической азооспермией получают биоптат яичка, методом световой микроскопии оценивают состояние сперматогенеза в извитых семенных канальцах в баллах. Так же в условиях световой микроскопии оценивается интерстиций яичка и наличие в нем триптазаактивных тучных клеток (ТК). Отдельно производился морфометрический подсчет ТК в 1 мм2 и определение соотношение их количества с нарушением сперматогенеза. Высокое содержание ТК в 1 мм2 интерстиция яичка свидетельствует о выраженном хроническом воспалении гонады, о малой перспективе восстановления сперматогенного эпителия, низкой эффективности получения собственных сперматозоидов и прогнозирования необходимости выполнения протокола вспомогательных репродуктивных технологий с донацией сперматозоидов.
С целью разработки референсных значений для количества тучных клеток в интерстиции яичка нами был проведен ROC- анализ клинической базы пациентов (n=32), обратившихся в клинику по лечению бесплодия, в ходе которого была определена точка разделения (cut-off) для количества тучных клеток в 1 мм2 интерстиция яичка у мужчин с патозооспермией и нормозооспермией.
При статистической обработке полученных данных (ROC - анализ) была определена площадь под ROC - кривой, которая соответствует взаимосвязи прогноза патозооспермии и количества триптазаактивных тучных клеток в 1 мм2 интерстиция яичка у мужчин и составила 0.994±0,01 с 95% ДИ: 0.979-1,0.
Пороговое значение количества триптазаактивных тучных клеток в точке cut-off составило 39,0 / мм2. При выявлении количества тучных клеток в интерстиции яичка в равном или превышающем данное значение прогнозировалась тяжелая степень бесплодия (патозооспермии) с низкой эффективностью ЭКО/ИКСИ с применением собственных сперматозоидов и высокий прогноз приверженности ИКСИ с использованием донорской спермы. Чувствительность и специфичность метода составила 95% и 100% соответственно.
Наши исследования показали, что, высвобождая провоспалительные медиаторы, хемотаксические факторы и иммунорегуляторные цитокины, которые способствуют прогрессии фибриллогенеза, ТК, расположенные в интерстиции ткани яичка, могут приводить к снижению тестикулярной функции и нарушению сперматогенеза. Данный факт нашел подтверждение в клинических наблюдениях пациентов с необструктивной азооспермией и без явных объективных причин мужского фактора бесплодия, у которых в интерстициальном пространстве яичка были обнаружены ТК.
Мы установили, что, тучные клетки являются триггером в формировании патоспермии за счет высокой способности к миграции в соединительной ткани, которая усиливается во время воспаления, и выработки множества медиаторов, начиная от предварительно сформированных протеаз и гистамина, заканчивая синтезированными de novo цитокинами, хемокинами и липидными медиаторами.
Одним из важных аспектов наших исследований, посвященных изучению причин идиопатического бесплодия, стала визуализация и подсчет ТК с помощью иммунногистохимического анализа. Таким образом, повышенное количество тучных клеток может служить маркером в тактике преодоления мужского фактора бесплодия. Это позволило получить информацию о тяжести нарушения сперматогенеза из-за изменения клеточного микроокружения в интерстиции яичка, а также обеспечивает повышение точности диагностики идиопатического бесплодия мужчин и оценки перспективы сохранности развития мужских половых клеток.
В случае, когда перспективы консервативного и хирургического лечения мужского бесплодия у пациента отсутствуют, следует рекомендовать супружеской паре выполнение протокола вспомогательных репродуктивных технологий с донацией сперматозоидов.
Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения
Предлагаемый способ прогнозирования осуществляется следующим образом. Биопсия яичка производится открытым способом по стандартным показаниям по методике Micro-TESE (Franco G, Scarselli F, Casciani V, De Nunzio C, Dente D, Leonardo C, Greco PF, Greco A, Minasi MG, Greco E. A novel stepwise micro-TESE approach in non obstructive azoospermia. BMC Urol. 2016 May 12;16(1):20. doi: 10.1186/s12894-016-0138-6).
После стандартной фиксации в забуференном 4% формальдегиде биопсийный материал заливали в парафин. Иммуногистохимическую детекцию триптазы ТК проводили с помощью антител Anti-Mast Cell Tryptase antibody (клон AA1, #ab2378, разведение 1:2000; Abeam, Великобритания). В качестве вторичных использовались козьи антитела #AS-M1-HRP, хромогенная детекция которых проводилась реагентом ImmPACTTM DAB Peroxidase Substrat Kit (#SK-4105) согласно инструкции производителя. После стандартной процедуры обезвоживания срезы заключали в постоянную монтажную среду (Vector Laboratories, Burlingame, СА, USA, #Н1000).
Микроскопическое исследование осуществляется с помощью микроскопа «01ympus СХ43» при общем увеличении оптической системы х 400. Тучные клетки оценивались в 1 мм2 интерстиция яичка. Качество сперматогенеза оценивалось на поперечных срезах извитых семенных канальцах в баллах, где 10 баллов - сперматогенез полностью сохранен; 9 -незначительные нарушения сперматогенеза - дезорганизация сперматогенного эпителия, много поздних сперматид; 8 - меньше чем пять сперматозоидов в канальце, немного поздних сперматид; 7 - отсутствие сперматозоидов и поздних сперматид, много ранних сперматид; 6 -отсутствие сперматозоидов и поздних сперматид, мало ранних сперматид; 5 -отсутствие сперматозоидов и сперматид, много сперматоцитов; 4 -отсутствие сперматозоидов и сперматид, мало сперматоцитов; 3 - только сперматогонии; 2 - отсутствие половых клеток, только клетки Сертоли; 1 -отсутствие элементов сперматогенного эпителия (тубулярная атрофия) [Aafjes J.H., van der Vijver J.C., Schenck P.E. Value of a testicular biopsy rating for prognosis in oligozoospermia. Br Med J. 1:289 -290., 1978.]
В случае выявления у пациента интенсивной инфильтрации интерстиция яичка триптазаактивными тучными клетками более 39 в 1 мм2 на фоне нарушения сперматогенеза 6 баллов и ниже, прогнозируют необходимость выполнения протокола вспомогательных репродуктивных технологий с донацией сперматозоидов.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:
Пример 1. Пациент А-ов., 37 лет. Мужское бесплодие 5 лет. По данным спермограммы и клинического обследования - идиопатическая необструктивная азооспермия. Оценка сперматогенеза - 2-3 балла. Количество триптазаактивных тучных клеток - 114 мм2 в интерстиции яичка. Морфологически зрелые сперматозоиды при биопсии яичка не были получены. Прогноз восстановления сперматогенеза - отрицательный.
Пример 2. Пациент К-ев., 27 лет. Мужское бесплодие 3 года. По данным спермограммы и клинического обследования - идиопатическая необструктивная азооспермия. Оценка сперматогенеза - 6 баллов. Количество триптазаактивных тучных клеток - 39 мм2 в интерстиции яичка. Морфологически зрелые сперматозоиды при биопсии яичка не были получены. Прогноз восстановления сперматогенеза - отрицательный. Пациенту рекомендовано ВРТ / ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) с использованием донорской спермы.
Пример 3. Пациент М-ян., 30 лет. Мужское бесплодие 3 года. По данным спермограммы и клинического обследования - идиопатическая необструктивная азооспермия. Оценка сперматогенеза - 7-8 баллов. Количество триптазаактивных тучных клеток - 35 мм2 в интерстиции яичка. При биопсии яичка были получены единичные морфологически зрелые сперматозоиды, поэтому у этого мужчины была взята ткань яичка для криоконсервации для последующего выполнения ИКСИ после плановой подготовки партнерши к трансферу эмбриона.
Во всех приведенных клинических случаях мужского бесплодия данные лабораторного и инструментального исследования не выявили явных отклонений. Однако прослеживается четкая тенденция ухудшения сперматогенеза при увеличении количества тучных клеток в 1 мм2 ткани яичка. Т.е. чем меньше тучных клеток в интерстиции яичка, тем лучше прогноз в плане сохранности сперматогенеза в извитом семенном канальце яичка и успеха программы ВРТ.
Преимущества метода:
Заявленный способ позволяет повысить точность и достоверность прогнозирования успешности программ вспомогательных репродуктивных технологий, тем самым принять своевременные меры к осуществлению повторного протокола вспомогательных репродуктивных технологий с использованием аутоспермиев или донацией половых клеток. Тем самым сокращается время протокола программы ВРТ и снижается субъективность морфологической оценки сперматогенеза.
Способ апробирован на достаточно большом материале и может быть рекомендован к использованию в центрах планирования семьи и репродукции.
Claims (1)
- Способ определения необходимости выполнения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с донацией сперматозоидов при идиопатическом мужском бесплодии с необструктивной азооспермией, включающий проведение гистологического анализа биоптата яичка, отличающийся тем, что у мужчин с бесплодием неустановленого генеза получают биопсийный материал яичка, в котором на гистологическом срезе поперечных сечений извитых семенных канальцев исследуют методом световой микроскопии состояние сперматогенеза по десятибалльной шкале, далее исследуют строму яичка и наличие в ней триптазаактивных тучных клеток в 1 мм2, которые контрастируют с помощью иммунногистохимического окрашивания; при выявлении триптазаактивных тучных клеток 39 и более в 1 мм2 в интерстиции яичка на фоне нарушения сперматогенеза 6 баллов и ниже прогнозируют необходимость выполнения протокола вспомогательных репродуктивных технологий с донацией сперматозоидов.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2814377C1 true RU2814377C1 (ru) | 2024-02-28 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA53719C2 (ru) * | 1999-12-29 | 2003-02-17 | Інститут Розведення І Генетики Тварин Уаан | Способ оценки оплодотворяющей способности спермы |
| RU2314530C1 (ru) * | 2006-04-26 | 2008-01-10 | Федеральное государственное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ прогнозирования нарушения фертильности у мужчин |
| WO2011144595A1 (de) * | 2010-05-18 | 2011-11-24 | Justus-Liebig-Universität Giessen | Verfahren und schnelltest zur bestimmung der fertilität von spermien |
| RU2665162C1 (ru) * | 2017-07-03 | 2018-08-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики нарушений сперматогенеза путем определения его цитологического профиля |
| RU2697395C1 (ru) * | 2019-03-12 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) | Способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин |
| RU2785487C1 (ru) * | 2022-09-26 | 2022-12-08 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин |
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA53719C2 (ru) * | 1999-12-29 | 2003-02-17 | Інститут Розведення І Генетики Тварин Уаан | Способ оценки оплодотворяющей способности спермы |
| RU2314530C1 (ru) * | 2006-04-26 | 2008-01-10 | Федеральное государственное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Способ прогнозирования нарушения фертильности у мужчин |
| WO2011144595A1 (de) * | 2010-05-18 | 2011-11-24 | Justus-Liebig-Universität Giessen | Verfahren und schnelltest zur bestimmung der fertilität von spermien |
| RU2665162C1 (ru) * | 2017-07-03 | 2018-08-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ диагностики нарушений сперматогенеза путем определения его цитологического профиля |
| RU2697395C1 (ru) * | 2019-03-12 | 2019-08-14 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Астраханский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России) | Способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин |
| RU2785487C1 (ru) * | 2022-09-26 | 2022-12-08 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования инфертильности эякулята у мужчин |
| RU2797507C1 (ru) * | 2023-01-23 | 2023-06-06 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования эффективности вспомогательных репродуктивных технологий |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Кульченко Н.Г. Популяция тучных клеток в яичке при патоспермии. РМЖ. Медицинское обозрение. 2022; 6(4): 195-199. Abdel-Hamid A.A.M., Atef H., Zalata K.R., Abdel-Latif A. Correlation between testicular mast cell count and spermatogenic epithelium in non-obstructive azoospermia. Int J Exp Pathol. 2018; 99(1): 22-28. El-Karaksy A., Mostafa T., Shaeer O.K. et al. Seminal mast cells in infertile asthenozoospermic males. Andrologia. 2007; 39(6): 244-247. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feijó et al. | Diagnostic accuracy of sperm chromatin dispersion test to evaluate sperm deoxyribonucleic acid damage in men with unexplained infertility | |
| Kazerooni et al. | Evaluation of sperm’s chromatin quality with acridine orange test, chromomycin A3 and aniline blue staining in couples with unexplained recurrent abortion | |
| Vasan | Semen analysis and sperm function tests: How much to test? | |
| Sellami et al. | Assessment of chromatin maturity in human spermatozoa: useful aniline blue assay for routine diagnosis of male infertility | |
| Giwercman et al. | Correlation between sperm motility and sperm chromatin structure assay parameters | |
| Esterhuizen et al. | Sperm chromatin packaging as an indicator of in-vitro fertilization rates | |
| CN108398407B (zh) | 一种人类精子活率及其dna损伤双参数检测及分析的试剂盒 | |
| Santillán et al. | Where and when should natural killer cells be tested in women with repeated implantation failure? | |
| Manochantr et al. | Relationship between chromatin condensation, DNA integrity and quality of ejaculated spermatozoa from infertile men | |
| Martini et al. | Genetics: Constitution of semen samples from XYY and XXY males as analysed by in-situ hybridization | |
| Boushaba et al. | Sperm DNA fragmentation and standard semen parameters in algerian infertile male partners | |
| Monqaut et al. | Use of high-magnification microscopy for the assessment of sperm recovered after two different sperm processing methods | |
| Khalili et al. | Sperm Nuclear DNA in Ejaculates of Fertile and Infertile Men Correlation with Semen Parameters | |
| Hwang et al. | Use of diagnostic testing to detect infertility | |
| WO2008099385A2 (en) | Methods and kits for qualifying sperm cells | |
| Liffner et al. | Diagnostics of DNA fragmentation in human spermatozoa: Are sperm chromatin structure analysis and sperm chromatin dispersion tests (SCD‐HaloSpermG2®) comparable? | |
| RU2814377C1 (ru) | Способ определения необходимости выполнения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) с донацией сперматозоидов при идиопатическом мужском бесплодии с необструктивной азооспермией | |
| EP2191021B1 (en) | Male reproductive health panel and uses thereof | |
| RU2697395C1 (ru) | Способ прогнозирования идиопатического бесплодия мужчин | |
| TAVALAEI et al. | Flow cytometry: a new approach for indirect assessment of sperm protamine deficiency | |
| Macleod et al. | Assessment of the conventional criteria of semen quality by computer-assisted image analysis: evaluation of the Hamilton–Thorn motility analyser in the context of a service andrology laboratory | |
| RU2804207C1 (ru) | Способ прогнозирования мужского бесплодия на основе анализа фрагментации днк сперматозоидов | |
| WO2017156844A1 (zh) | 一种体外获能后精子质量评估的试剂盒及其使用方法 | |
| Diallo et al. | Increased DNA fragmentation in patients with infertility in Dakar (Senegal) | |
| RU2795567C1 (ru) | Способ лабораторной диагностики мужской репродуктивной функции на базе оценки дисперсии днк-фрагментов сперматозоидов |