CN105154392A - 一种提高精子运动速度的试剂及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高精子运动速度的试剂及方法。所述的试剂由以下组分组成：孕酮、N⁶-Monobutyryladenosine-3ˊ,5ˊ-cyclic？monophosphate和Calcium？Ionophore？A23187，三者浓度比依次为(10-100μg/ml):(1-10mM):(1-10mM)。所述的方法为：用精子培养液平铺在液化的精液样本上，上游0.8-1.2小时，然后抽取最上端的液体得到获能精子，再向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加所述试剂，将无菌麦管插到获能精子的上部，上游0.8-1.2小时，收集上端液体。本发明的方法能够显著提高精子运动速度，为提高体外受精率或胚胎质量提供了理论基础。

Description

一种提高精子运动速度的试剂及方法

技术领域

本发明涉及生殖医学技术领域，具体地说，涉及一种提高精子运动速度的试剂及方法。

背景技术

虽然人类的睾丸可以利用生精干细胞产生数亿条乃至无限数量的精子，每一次射精也会射出上百万的精子，可是，这些精子并不是完全相同的。精子间差异表现在精子外包被的附睾蛋白质差异、细胞核DNA的完整性、线粒体DNA(mtDNA)数量与突变、细胞膜脂类与糖基的分布、顶体结构完整性等诸多方面。在体内，能够到达受精位置(输卵管壶腹部)的精子数目只有20～200条左右，只有这一类精子才能最终使卵母细胞受精，而其他大多数精子的功能在于免疫抑制作用。受精精子具有怎样的分子组成与标记，目前还不清楚。目前辅助生殖技术中使用的精子分离方法主要是密度梯度离心和上游法。使用上游法，可以提高精子的运动速度，使精子获能，满足正常的体外受精(IVF)要求。

辅助生殖技术指采用医疗辅助手段使不育夫妇妊娠的技术，包括人工授精和体外受精-胚胎移植及其衍生技术两大类。试管婴儿就是使用该技术的体外受精-胚胎移植方法生育的婴儿。辅助生殖技术使不育夫妇实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题自然会随之得到解决，其还是遏止遗传病的传递，实现优生的重要手段。因此研发提高精子运动速度的相关试剂和方法，可改进体外受精方法，为提高试管婴儿的质量奠定基础。

此外，受精的过程和原理一直是生殖医学中备受关注的研究课题，研究受精精子的特点对于促进生殖医学的理论发展具有重要意义。

然而，目前还未见提高精子运动速度以提高精子受精能力的相关试剂和方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种提高精子运动速度的试剂。

本发明的再一的目的是，提供所述试剂的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种提高精子运动速度的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案为：

一种提高精子运动速度的试剂，所述的试剂由以下组分组成：孕酮、N⁶-Monobutyryladenosine-3',5'-cyclicmonophosphate和CalciumIonophoreA23187，三者浓度比依次为(10-100μg/ml):(1-10mM):(1-10mM)。

优选地，所述的试剂中三者浓度比依次为(50-70μg/ml):(4-6mM):(4-6mM)。

更优选地，所述的试剂中三者浓度比依次为(60μg/ml):(5mM):(5mM)。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案为：

如上任一所述的试剂在制备提高精子运动速度的试剂中的应用。

如上任一所述的试剂在制备提高体外受精率或胚胎质量的药物中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案为：

一种提高精子运动速度的方法，包括以下步骤：

a)将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游0.8-1.2小时，然后抽取最上端为所述精子培养液0.5-0.9倍体积的液体，得到获能精子；

b)向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加如上任一所述的提高精子运动速度的试剂，然后将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游0.8-1.2小时，取出无菌麦管，收集所述无菌麦管上端3/5-4/5长度的液体；

所述的精子培养液为添加10％人血清白蛋白的HTF培养液。

优选地，所述的方法包括以下步骤：

a)将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游1小时，然后抽取最上端为所述精子培养液0.8倍体积的液体，得到获能精子；

b)向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加如上任一所述的提高精子运动速度的试剂，然后将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游1小时，取出无菌麦管，收集所述无菌麦管上端4/5长度的液体。

本发明优点在于：

1、本发明提供了一种能显著提高精子运动速度的试剂，该试剂能够显著提高精子活力，使之更符合受精精子的特点。

2、本发明使用上游法获得获能精子，然后使用线粒体激活剂诱导上游法获得超激活运动状态的精子，获得的精子不仅在活动能力上超过获能精子，而且产生的ROS少，精子相对线粒体活性提高，这样的精子更符合受精精子的特点。

本发明为改进体外受精方法，提高试管婴儿的质量提供了理论基础。

附图说明

图1.JC-1染色图片。同一条精子中，同时含有高能和低能线粒体。图C、F显示未染色精子形态，图A、D显示红色高膜电位线粒体，图B、E显示绿色低膜电位线粒体。

图2.DCF染色图片。A：ROS特异性染色剂DCF显示，ROS阳性部分(绿色)分布在精子的头、颈、尾各部分。B：未染色精子。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1.对象与方法

1.1精液样本选择

根据《世界卫生组织人类精液分析实验室技术手册》第五版标准及通过病史询问、体格检查、精液的病原学检查等，选取精液参数在正常范围，并排除前列腺炎、精索静脉曲张等相关疾病的样本。选取精液样本20份，年龄范围在30.8±3.11岁。

1.2精液样本处理和实验分组

精子培养液为添加10％人血清白蛋白的HTF培养液(HTF购于Origio公司，商品号为：ART-1020)。精液液化后，直接使用精子培养液稀释后，为获能前组。上游法使用精子培养液1毫升，平铺在液化的精液样本之上，上游1小时。抽取最上端的大约0.8毫升液体，这时收集的精子为获能精子，为获能后组。使用大约5厘米高的无菌麦管，一端封闭，并注满精子培养液，在麦管顶部添加/不添加60微升精子趋化试剂线粒体激活剂，将其插到获能精子样本的上部，再上游1小时。取出麦管，去掉下端1厘米高度的精子培养液，收集上游1-4厘米高的精子，获得线粒体激活剂诱导精子，为线粒体激活剂诱导组和对照组。

其中，所用的线粒体激活剂配方为：

所述的N⁶-Monobutyryladenosine-3',5'-cyclicmonophosphate(6-MB-cAMP)Cat.No.:M003，CASNo.:[70253-67-7]；所述的CalciumIonophoreA23187CASNo.:[52665-69-7]。

1.3JC-1和DCF染色法

将精液样本用Hepes-bufferedHTF培养液洗涤2次后离心(500×g，5min)。去上清，得到的精子沉淀用1mlHepes-bufferedHTF培养液重悬，加入终浓度为50ng/ml的四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(JC-1)或二氯荧光黄(DCF)染料。室温避光孵育15min，离心去染色液，沉淀用预热的Hepes-bufferedHTF培养液清洗一次去除多余染料，最后加入一定量的1×PBS使精子浓度在1×10⁶/ml左右，流式检测JC-1和DCF染色结果。含有高膜电位(Δψm)的线粒体被染为红色；低Δψm的线粒体被染为绿色(图1)。DCF本身没有颜色，进入细胞质中以后，与活性氧基团(ROS)结合，呈现绿色荧光(图2)。

1.4流式细胞术分析方法

激发波长为488nm，应用前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)设门后，通过荧光通道FL1(绿)和FL2(红)检测荧光强度，每个样本收集10000个细胞。应用CellQuest软件获取和分析数据，JC-1组每份样本得到3组数据，分别是红色信号、绿色信号和双信号，计算红/绿细胞比率和双色信号细胞比率。DCF组每份样本得到一组绿色信号数据，计算绿色细胞比率。

1.5统计学分析

使用SPSS13.0版本统计软件，每种处理包括20份精子样本，各组间比较采用方差分析，再进行组间t检验分析，P<0.05为有显著统计学差异。

2.结果

2.1使用线粒体激活剂保护线粒体相对活性

使用JC-1染色，对上游法前后、线粒体激活剂诱导及对照组精子进行线粒体功能分析。结果表明，含有高活性线粒体精子随着获能和上游时间增加而增加，获能前精子相对线粒体活性为1.42；获能组精子相对线粒体活性上升为6.23，继续上游1小时，孕酮诱导组相对活性为12.33，而线粒体激活剂诱导组精子相对线粒体活性为10.12(显著低于孕酮诱导组)(表1)。

2.2上游精子与线粒体激活剂诱导上游精子内高/低活性线粒体组成变化

在同一条精子中，如果含有等量的高Δψm和低Δψm线粒体，称为线粒体活性均衡的精子。获能前组21.64％为线粒体活性均衡精子；获能组、孕酮诱导组和线粒体激活剂诱导组线粒体活性均衡精子比例均显著下降，分别为4.28％、8.56％和5.02％。线粒体激活剂诱导组的均衡精子比例显著低于孕酮诱导组(表1)。

2.3上游精子与线粒体激活剂诱导上游精子的ROS产量

ROS分布于精子的头、颈、尾部(图2)。ROS阳性精子比例，获能前组为2.89％，获能组显著降低到0.7％，孕酮诱导组ROS阳性细胞比例为1.90％，而线粒体激活剂诱导组ROS阳性细胞比例为1.21％，与孕酮诱导组没有差别(表1)。

表1精子获能前后线粒体活性、均衡线粒体和ROS阳性细胞比例比较分析

	获能前组	获能组	激活对照组	诱导剂组
					线粒体相对活性	1.42±0.26a	6.23±1.88b	14.36±1.63c	6.78±1.08b
均衡线粒体％	21.64±5.12a	4.28±1.09b	5.03±0.99b	5.02±1.13b
					ROS阳性％	2.89±0.95a	0.70±0.58b	4.25±1.44c	1.21±0.45c

注：N＝20。不同的脚标表示组间差异显著(P<0.01)。

2.4JC-1与DCF染料对精液参数的影响

荧光染料JC-1和DCF染色1小时，对精子活力没有影响，染色后精子获能反应正常。使用JC-1和DCF染色后1小时，精子的总活力和a+b级精子的总数不变。经过两种染色后的精子，获能后，a+b级运动精子可以达到100％(表2)。

表2.精子在染色前后总活力与a+b级精子百分比的变化

分组	获能前	JC-1染色后	DCF染色后
				总活力％	69.99±16.31	62.93±16.37	61.06±15.45
a+b级精子％	32.02±13.75	29.06±14.27	27.58±12.60

注：N＝20，P>0.05。

3.讨论

受精精子的特点可以总结为：第一，能够大幅度的提高线粒体功能和正确的mtDNA拷贝数，高度的mtDNA完整性。超激活精子的线粒体相对活性大约提高了10倍，消耗大量的ATP，才能够到达受精地点。第二，低ROS浓度。高ROS可导致精子在受精前的运动能力已经降低，并且易导致mtDNA及精子DNA出现异常。第三，持续保持低潜能线粒体的存在，提供受精(穿卵)时能量的供应。

目前体外受精过程中，为了获得较高的受精率，精子与卵子的比例一般保持在5000～10000:1的水平，远远高于体内的20～200:1的比例，受精时间在18小时左右。通过降低精子的数量，缩短精卵共同孵化的时间，有可能提高临床受孕率和降低流产率。降低精子数量，则必须提高精子的质量。

本研究表明，获能精子在本发明的线粒体激活剂的诱导下，获得的精子不仅在活动能力上超过获能精子，而且产生的ROS少，精子相对线粒体活性提高，这样的精子更符合受精精子的特点。如果选择这样的精子直接实施体外受精，则有可能降低所需精子的数量，同时降低受精所用的时间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种提高精子运动速度的试剂，其特征在于，所述的试剂由以下组分组成：孕酮、N⁶-Monobutyryladenosine-3',5'-cyclicmonophosphate和CalciumIonophoreA23187，三者浓度比依次为(10-100μg/ml):(1-10mM):(1-10mM)。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述的试剂中三者浓度比依次为(50-70μg/ml):(4-6mM):(4-6mM)。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述的试剂中三者浓度比依次为(60μg/ml):(5mM):(5mM)。

4.权利要求1-3任一所述的试剂在制备提高精子运动速度的试剂中的应用。

5.权利要求1-3任一所述的试剂在制备提高体外受精率或胚胎质量的药物中的应用。

6.一种提高精子运动速度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游0.8-1.2小时，然后抽取最上端为所述精子培养液0.5-0.9倍体积的液体，得到获能精子；

b)向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加权利要求1-3任一所述的试剂，然后将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游0.8-1.2小时，取出无菌麦管，收集所述无菌麦管上端3/5-4/5长度的液体；

所述的精子培养液为添加10％人血清白蛋白的HTF培养液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将精子培养液平铺在液化的精液样本之上，上游1小时，然后抽取最上端为所述精子培养液0.8倍体积的液体，得到获能精子；

b)向无菌麦管内注满精子培养液，并于顶部添加权利要求1-3任一所述的试剂，然后将所述无菌麦管的下端插到步骤a)得到的获能精子的上部，上游1小时，取出无菌麦管，收集所述无菌麦管上端4/5长度的液体。