ES2296398T3 - Sistema de inseminacion equina artificial no quirurgica. - Google Patents

Abstract

Método de producción de un équido que comprende las etapas de: a. determinar un tiempo estimado de estro de un équido hembra, teniendo dicho équido hembra dos cuernos uterinos, teniendo cada cuerno uterino una punta y un folículo, y teniendo una vagina, un útero y un recto; b. recoger las células de esperma equino de un équido macho; c. establecer una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho; d. establecer una sonda flexible que tiene un recipiente de esperma; e. colocar dicha sonda flexible en la vagina de dicho équido hembra; f. manipular dicha sonda flexible en dicho útero de dicho équido hembra; g. guiar dicha sonda flexible en un cuerno uterino de dicho équido hembra; y h. manipular suavemente dicha sonda flexible por el recto a medida que se guía de forma profunda en dicho cuerno uterino de dicho équido hembra hasta una localización profunda en dicho cuerno uterino de dicho équido hembra próximo a la punta de dicho cuerno uterino; i. inseminar artificialmente dicho équido hembra; j. fecundar por lo menos un óvulo equino en dicho équido hembra; y k. producir un équido cría.

Description

Sistema de inseminación equina artificial no quirúrgica.

I. Sector técnico

La presente invención se refiere en general al sector de la inseminación artificial de equinos. También implica la inseminación artificial de equinos cuando ha habido una selección sexual del esperma para producir una cría equina del sexo deseado. La invención es especialmente relevante para situaciones en las que se desea la inseminación artificial no quirúrgica de equinos y también cuando la inseminación artificial de equinos a dosis bajas es de importancia práctica.

II. Antecedentes

La inseminación artificial de yeguas equinas ha tenido gran importancia durante mucho tiempo. Frecuentemente esto se ha realizado quirúrgicamente. En casos rutinarios en los que no se han requerido dosis inferiores de esperma, se ha realizado sin cirugía mediante inseminación artificial, aunque esto utiliza cantidades relativamente elevadas de esperma. Para una inseminación artificial rutinaria de la yegua, se recomienda habitualmente inseminar 250-500 x 10^{6} espermatozoides progresivamente móviles (pms) en días alternativos a una yegua en estro, para conseguir una fertilidad máxima. Desafortunadamente, cuando se inseminan yeguas con semen de semental altamente fértiles, la fertilidad disminuye a medida que la cantidad de esperma móvil se reduce. En condiciones ideales, una yegua se ha inseminado satisfactoriamente con tan poco como 100 x 10^{6} pms sin reducir la fertilidad, aunque esta cantidad aún plantea desafíos. La inseminación con bajas cantidades de esperma es necesaria cuando se utilizan semen sexuado clasificado y semen congelado descongelado en cantidad limitada.

La preselección del sexo de las crías en un animal equino es naturalmente de interés. La preselección del sexo tras la inseminación artificial (AI) con bajas cantidades de poblaciones separadas y ricas en espermatozoides portadores de cromosomas X e Y, que se han separado en base al contenido de ADN, es actualmente posible en otras especies, aunque las especies equinas han demostrado en cierta consideración más dificultades. Aunque el nacimiento de la progenie del sexo deseado tras la inseminación intrauterina de ganado vacuno y ovejas ha validado la tecnología de sexuación, hasta la presente invención, no se ha aplicado en la práctica en equinos.

Para conseguir el sexo la preselección implica la separación de los espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y seguido por su uso para la inseminación artificial (AI) o para la fecundación in vitro (IVF) y posterior transferencia de embriones. La citometría de flujo de alta velocidad actual permite a los investigadores clasificar más de 1000 espermatozoides sexuados vivos/segundo. Sin embargo, sólo esta clasificación no es suficiente. A efectos de hacer que sexuar el semen sea una técnica práctica para un programa comercial de AI equina, se requiere una menor cantidad de esperma móvil para una dosis de inseminación. En la yegua cuando se utiliza semen nuevo para AI, una dosis de inseminación habitual contendría entre 250-500 x 10^{6} espermatozoides móviles. A la velocidad de clasificación habitual de \sim 1000 espermatozoides vivos/segundo, !se tardarían casi seis días en clasificar una dosis de inseminación! Por lo tanto, se requiere una menor cantidad de espermatozoides móviles para conseguir de forma práctica una fertilidad razonable. Una vez se consigue esto, también se ve la mayor fertilidad con inseminación no quirúrgica de yeguas con semen sexuado como algo necesario en la práctica.

Tal como se ha mencionado, la preselección del sexo implica la utilización del contenido de ADN y la separación de los espermatozoides en poblaciones portadoras de los cromosomas X e Y. La utilización de citometría de flujo de alta velocidad actual permite a los investigadores clasificar hasta 1000 espermatozoides vivos/segundo del sexo deseado con un 90% de precisión, lo cual proporciona cantidades adecuadas de esperma en muchas especies diferentes a la equina en una cantidad razonable de tiempo. Por ejemplo, esta nueva tecnología para la sexuación del esperma la ha convertido en una técnica práctica para la inseminación artificial en ganado vacuno. Dado que es práctico clasificar sólo una cantidad baja de espermatozoides y mantener aún la viabilidad del esperma, un aspecto de la presente invención se dirige a ratas con un mejor embarazo tras la inseminación de 25 x 10^{6} espermatozoides progresivamente móviles (pms) no clasificados. Esto es aproximadamente una décima parte de lo que se consideró previamente como óptimo para operaciones de rutina. Otros aspectos se dirigen incluso a cantidades inferiores. Estos aspectos pueden tener consecuencias económicas significativas cuando se considera su aplicación a animales para la celebración de trofeos, tales como caballos y similares.

Tal como se ha mencionado, uno de los desafíos fundamentales a los que se enfrentan los esfuerzos por clasificar esperma equino X e Y es las grandes cantidades de esperma implicado. En la inseminación natural el esperma equino se produce en casi mil millones; en la inseminación artificial menos, aunque aún se utilizan normalmente cantidades significativamente grandes de esperma equino. Por ejemplo, las técnicas de inseminación artificial equinas utilizan de forma rutinaria de doscientos cincuenta millones a quinientos millones de espermatozoides. De esta manera, se ha supuesto que una cantidad significativa de espermatozoides es necesaria en un medio para la inseminación artificial equina.

Dado que la presente invención se refiere a la inseminación artificial con selección de sexo, se han intentado muchos métodos para conseguir la separación de espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y en otros animales. Sin embargo, ninguno de éstos ha tratado aspectos peculiares de las células de esperma equino o de clasificación específica de las mismas. Los métodos de clasificación generales han variado desde técnicas magnéticas, tal como aparecen descritas en la Patente U.S.A. No. 4276139, hasta técnicas de columna, tal como aparecen descritas en la Patente U.S.A. No. 5514537, hasta técnicas gravimétricas, tales como se describen en las Patentes U.S.A. No. 3894529, Patente No. 32350 vuelta a publicar, Patentes U.S.A. No. 4092229, 4067965 y 4155831. También se han ensayado propiedades eléctricas tal como se muestra en la Patente U.S.A. No. 4083957, así como una combinación de propiedades eléctricas y gravimétricas, tal como se describen en las Patentes U.S.A. No. 4225405, 4698142 y 4749458. También se han ensayado esfuerzos de movilidad, tal como se muestra en las Patentes U.S.A. Nos. 4009260 y 4339434. Las técnicas químicas tales como las descritas en las Patentes U.S.A. Nos. 4511661 y 4999283 (que implican anticuerpos monoclonales) y las Patentes U.S.A. Nos. 5021244, 5346990, 5439362 y 5660997 (que implican proteínas de membrana) y las Patentes U.S.A. Nos. 3687803, 4191749, 4448767 y 4680258 (que implican anticuerpos), así como la adición de componentes del suero, tal como se muestra en la Patente U.S.A. No. 4085205. Aunque cada una de estas técnicas se ha presentado como altamente eficaz, de hecho, actualmente, ninguna de estas técnicas produce el nivel deseado de preselección del sexo y ninguna ha demostrado ser satisfactoria en el nivel de inseminación artificial con esperma equino. Sin embargo, independientemente de la técnica de separación finalmente utilizada, las combinaciones competentes de las cantidades elevadas de esperma equino presentes de forma natural y el enfoque de separar los espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y ha hecho que sea deseable desarrollar una capacidad para conseguir la inseminación equina con cantidades inferiores de esperma.

La técnica cuantitativa utilizada para conseguir la separación de espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y para la inseminación artificial (de cualquier especie) ha sido aquélla que implica la técnica de citometría de flujo. Esta técnica pareció posible como resultado de avances y descubrimientos que implican la absorción diferencial de colorante de los espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y.

Esto se describió anteriormente en la Patente U.S.A. No. 4362246 y se extendió significativamente a través de las técnicas descritas por Lawrence Johnson en la Patente U.S.A. No. 5135759. La técnica de Johnson de utilizar citometría de flujo para separar espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y ha sido un avance tan importante que ha hecho factible por primera vez la separación comercial de dicho esperma. Además, la separación se ha mejorado significativamente mediante la utilización de citómetros de flujo de velocidad elevada, tales como el citómetro de flujo MoFlo® producido por Cytomation, Inc. y descrito en una serie de otro grupo de patentes que incluyen las Patentes U.S.A. Nos. 5150313, 5602039, 5602349 y 5643796, así como la publicación de patente PCT internacional WO 96/12171. Aunque la utilización de citómetros MoFlo® de Cytomation ha permitido grandes incrementos en la velocidad, y aunque estos incrementos de la velocidad son particularmente relevantes dado el elevado número de esperma equino utilizado frecuentemente, aún existen ciertos problemas. A pesar del aumento de la velocidad en casi diez veces gracias al citómetro de flujo MoFlo®, se desean por diversas razones tiempos de clasificación cada vez más cortos. En primer lugar, se ha descubierto que como cuestión práctica, los espermatozoides de equinos son células críticas con el tiempo. Pierden su eficacia cuanto más permanezcan sin utilizar. En segundo lugar, los tiempos de recogida, clasificación e inseminación han hecho que la velocidad sea un elemento de gran importancia comercial. De este modo, la naturaleza crítica del tiempo de las células de esperma equino y del proceso ha hecho que la velocidad sea un elemento esencial para conseguir una eficacia elevada e índices de éxito en la inseminación artificial.

A pesar de algunos éxitos en la clasificación y posterior inseminación artificial de animales de otras especies, el esfuerzo con equinos ha demostrado ser particularmente esquivo. Con respecto a la presente invención, las aplicaciones equinas pueden haber sido particularmente desafiantes debido al proceso de concepción equina y/o a que las propias células de esperma equino son más delicadas que las de otras especies - especialmente bovinos. Por esta razón, puede ser que los técnicos en la materia no hayan previsto técnicas o sistemas desarrollados para otras especies que sean aplicables para los equinos. En algunos casos, procedimientos casi idénticos de una especie no equina no proporcionan el mismo tipo de resultado para equinos. Esto puede haber fomentado la separación en los esfuerzos de investigación y en las técnicas y sustancias desarrolladas.

También pueden existir otros problemas tanto de tipo práctico como teórico. Por el lado práctico, se ha deseado conseguir una inseminación artificial equina de una manera en la que se puede llevar a cabo en un campo diferente de un ambiente de laboratorio. De este modo, para la producción comercial y el éxito en el campo, las mejoras que pueden representar sólo un aumento en la eficacia o practicidad pueden ser significativas. Relacionado con el aspecto práctico, está el aspecto de la delicadeza y sensibilidad del proceso global. En este sentido, se ha deseado simplificar el proceso y hacerlo lo más procesalmente robusto de manera que un error o habilidad del operario puede jugar un papel cada vez menos importante. Este objetivo también se ha combinado para realizar la inseminación con dosis inferiores aún más deseables.

Además de la delicadeza del proceso, siempre se ha sabido que los espermatozoides en general son células extremadamente delicadas. Aunque este factor a primera vista parece que podría considerarse como fácilmente entendido, de hecho, la extensión completa de las sensibilidades de las células no se ha explorado completamente aún. Además, el esperma equino parece particularmente sensible. A diferencia de los espermatozoides bovinos, son en muchos casos más delicados desde la perspectiva de la inseminación artificial satisfactoria. Surgen diferentes sensibilidades y, de este modo, ha existido hasta cierto punto una percepción de que los sistemas, técnicas y sustancias utilizadas en otros animales (tales como bovinos) no pueden ser siempre adaptables a los equinos. De hecho, se ha demostrado que esto es cierto.

En el contexto de la citometría de flujo en general, la mayoría de células o partículas clasificadas han sido frecuentemente capaces de soportar una serie de abusos. Esto no es el caso de las células de esperma equino. De hecho, tal como se describe en la presente invención, el procesado mediante las técnicas de citometría de flujo normales puede ser de hecho inaceptable para la clasificación citométrica de células de esperma equino en ciertas aplicaciones. El rango de sensibilidades a partir de los problemas de dilución y la necesidad inherente del citómetro de flujo de aislar y distinguir cada célula individualmente, así como la presión y otras tensiones que normalmente tiene la citometría de flujo (previo a la presente invención) se impusieron sobre las células equinas que se clasificaban. Esto puede representar también un único factor para las células de esperma equino, ya que parece que aun cuando las células de esperma equino puede parecer que pasan a través del citómetro de flujo y se clasifican sin efectos secundarios visiblemente discernibles, de hecho, las propias células pueden haberse estresado hasta el punto de rendir por debajo de su rendimiento óptimo en el proceso de inseminación. De este modo, parecen estar implicados una interacción de factores y han surgido problemas no habituales desde la perspectiva de la clasificación de las células de esperma equino y el uso final para la inseminación artificial equina.

Otro problema que aún existe - a pesar de los grandes avances conseguidos mediante la patente de Johnson y la tecnología relacionada - es el hecho de que previamente a la presente invención era extremadamente difícil conseguir inseminaciones con dosis inferiores con esperma equino sexuado, independientemente de la tecnología de separación utilizada. Aunque históricamente, se ha conseguido cierto logro en la inseminación con dosis bajas, parece ser de un modo más teórico o de laboratorio que en medios que probablemente son experimentales en o aplicables a una aplicación comercial. También se ha conseguido mediante técnicas quirúrgicas. En este sentido, el deseo no ha sido simplemente conseguir una inseminación a dosis bajas, sino incluso conseguir una inseminación no quirúrgica en un medio campestre. El conseguir una inseminación a dosis bajas con índices de éxito en el embarazo que son comparables con los esfuerzos de inseminación artificial no sexuada a dosis elevadas existentes es de este modo bastante significativo. Los avances conseguidos por los presentes inventores en la inseminación artificial sexuada, no sexuada y a dosis bajas representan avances significativos que pueden, por primera vez, hacer que las aplicaciones comerciales sean factibles para los équidos.

Otro problema a los que se ha enfrentado la industria - una vez más, a pesar de los grandes avances por la patente de Johnson y la tecnología relacionada - es el hecho de que el propio problema, a saber, la inseminación artificial equina con una tasa de éxito elevada, es de naturaleza estadística en la que parecen interaccionar una multitud de factores. De este modo, las soluciones propuestas pueden implicar en cierto grado una combinación de factores que, cuando se estudian estadísticamente de manera profunda, mostrarán que son necesarias aisladas o combinadas con otros factores. Dicha determinación esta agravada además por el hecho de que los propios resultados varían según las especies y puede ser difícil de establecer debido al hecho de que el ensayo y el muestreo estadístico en una base datos suficientemente grande probablemente no valgan la pena en las etapas iniciales. Por estas razones, la presente invención también puede implicar una combinación de factores que pueden, individualmente o combinados, representar las soluciones apropiadas para una aplicación determinada. Esta descripción se considera de este modo suficientemente amplia, de manera que se pueden conseguir varias combinaciones y permeaciones de las técnicas descritas. Pueden existir sinergismos con otros factores. Dichos factores pueden variar desde factores en la clasificación, o quizás, citómetro de flujo, etapas en la recogida, así como etapas en la inseminación. De este modo, aunque ha existido una gran necesidad por una velocidad elevada, aunque no satisfecha, de una inseminación equina sexuada a dosis bajas, y aunque las técnicas y elementos de aplicación hace tiempo que están disponibles, antes de la presente invención los avances o quizás las combinaciones de los avances aparentemente habían pasado por alto a los técnicos en la materia. Podría ser incluso que simplemente no se realizó la combinación más correcta de los elementos conocidos. Quizás hasta cierto punto, los técnicos del sector no han conseguido apreciar que el problema implicaba una interacción de factores, así como necesidades peculiares de las células de esperma equino implicadas en este sector. De forma interesante, tal como se muestra en la posterior lista de trabajos de la presente descripción, se han realizado intentos sustanciales, pero aparentemente no se ha conseguido entender el problema inherente en dicha área, tal como dosis baja, inseminación sexuada de equinos y quizás se asumió que dado que el acto natural implica quizás mil millones de esperma, podría haber habido limitaciones físicas para conseguir la inseminación artificial con cantidades que son tanto como tres órdenes de magnitud inferiores en número. De este modo, podría no ser sorprendente que hubiera hasta cierto punto un conocimiento real alejado de la dirección técnica en la que fueron los presentes inventores. Quizás los resultados podrían considerarse como inesperados hasta cierto punto, ya que han mostrado que la inseminación artificial equina sexuada a dosis bajas - si se realiza correctamente - se puede conseguir con unas tasas de éxito comparables con las de la inseminación artificial equina no sexuada a dosis elevadas. Incluso podría ser sorprendente para algunos que las técnicas y avances de la presente invención se combinan de hecho para conseguir los grandes resultados mostrados. Aunque cada técnica, de forma aislada, se podría ver por algunos como no destacable, de hecho, los cambios sutiles o la combinación con otras técnicas parece permitir avances significativos en el resultado final.

De este modo, en un aspecto, hasta la presente invención, el logro de una inseminación artificial equina práctica, no quirúrgica, sexuada y a dosis bajas no ha sido posible con niveles de rendimiento necesarios o procedimientos simplificados que probablemente fueran necesarios para conseguir la implementación comercial. Más allá de la inseminación sexuada a dosis bajas a nivel comercial, aunque conseguida, la presente invención también describe técnicas que permiten conseguir rendimientos mejorados y, de este modo, facilita el resultado final deseado, a saber, la inseminación artificial no quirúrgica, sexuada y no sexuada, a dosis bajas, de equinos en una base comercial.

III. Descripción de la presente invención

Por consiguiente, la presente invención da a conocer la realización de sistemas para la inseminación artificial no quirúrgica de yeguas equinas. Estas técnicas son aplicables para la utilización de dosis bajas de esperma equino y se diseñan para ser capaces de ser utilizadas en el sector a nivel comercial y práctico. Además, los sistemas se utilizan conjuntamente con - y tienen una aplicabilidad especialmente valiosa en - la inseminación artificial con esperma equino sexuado. Los sistemas también dan a conocer una capacidad mejorada de clasificar las células de esperma equino para determinar su sexo a través de las técnicas de separación de citometría de flujo. Se representan varias técnicas y sustancias pero, tal como entenderán fácilmente los técnicos en la materia, se pueden utilizar varias combinaciones y permutaciones de la manera en que puedan ser optimizadas para el rendimiento en base a las necesidades, técnicas de separación, objetivos y otros parámetros implicados en una aplicación específica de procesado equino.

En lo que se refiere a la aplicación equina sexuada, los objetivos de la presente invención eran 1) comparar las tasas de embarazo en yeguas inseminadas en una única ocasión, próxima a la ovulación, con 500, 25 ó 5 x 10^{6} espermatozoides progresivamente móviles (pms), 2) conseguir unas tasas de embarazo razonables tras la inseminación con 25 x 10^{6} de espermatozoides sexuados, clasificados en vivo, y 3) desarrollar técnicas para la clasificación del semen.

En uno de los experimentos iniciales, se asignaron aleatoriamente a sesenta y una yeguas de 1 a 3 tratamientos: El grupo 1 (n = 20) se inseminó en el cuerpo uterino con 500 x 10^{6} espermatozoides (controles). El grupo 2 (n = 21) y el grupo 3 (n = 20) se inseminaron en la punta del cuerno uterino ipsilateral al folículo preovulatorio con 25, y 5 x 10^{6} espermatozoides. A las yeguas se les administró cloprostenol (250 \mug i.m.) para inducir la luteólisis y se monitorizaron mediante ultrasonografía en días alternos hasta que se detectó un folículo mayor o igual a 30 mm y, a continuación, diariamente hasta que se detectó la ovulación. Se administró GnRH (deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge) cuando el folículo dominante era igual o superior a 35 mm. Las yeguas se inseminaron 34 (n = 29) o 40 horas (n = 32) después de GnRH. Los datos de los ciclos de 22 yeguas se excluyeron debido a que ovularon antes de la inseminación planeada (n = 11), no ovularon (n = 3) u ovularon más de 4 días después de la administración de GnRH. (n = 8). El semen se recogió y se diluyó inmediatamente con un extensor de leche desnatada (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) hasta 25 x 10^{6} ó 5 x 10^{6} esperma móvil/ml. Las yeguas que recibieron 1 ml se inseminaron con una pipeta plástica flexible de inseminación artificial (IMV, Francia), mientras que las yeguas que recibieron 0,2 ml se inseminaron utilizando una pistola para implantes desechable (Veterinary Concepts, Green Valley, WI) que contenía una "paja" de 0,5 ml. Se utilizaron diferentes pipetas de inseminación para optimizar la liberación de los dos volúmenes diferentes. La localización de pipetas en el interior del útero se confirmó mediante ultrasonografía transrectal antes de la deposición del semen.

El embarazo se determinó mediante ultrasonografía a los 16 días después de la ovulación. Las tasas de embarazo no fueron diferentes entre sementales (P > 0,05), de manera que se combinaron los resultados de los dos sementales. Existía una diferencia en las tasas de embarazo para yeguas fecundadas con 500 x 10^{6} tratamientos (18/20 = 90%) frente a 25 x 10^{6} tratamientos (12/21 = 57%) (P < 0,05). No existía diferencia entre yeguas fecundadas con 25 x 10^{6} tratamientos frente a 5 x 10^{6} tratamientos (7/20 =35%) (P > 0,05). No existía diferencia en las tasas de embarazo entre yeguas fecundadas 34 horas frente a 40 horas después de la administración de GnRH 19/29 (65%) y 18/32 (56%), respectivamente (P > 0,1). Tampoco había diferencia en las tasas de embarazo entre yeguas fecundadas con 5 x 10^{6} espermatozoides en un volumen de 1 ml, 3/10 (30%) o un volumen de 0,2 ml, 4/10 (40%) (P > 0,05). En resumen, las tasas de embarazo disminuyeron a medida que el número de espermatozoides móviles inseminados crecía en este esfuerzo inicial. Sin embargo, un índice de embarazo en el día 16 del 57% se consiguió con una única inseminación, próxima a la ovulación, con 25 x 10^{6} pms cuando se depositó en la punta del cuerno uterino.

En otro experimento, se asignaron aleatoriamente a diecisiete yeguas a 1 de 2 grupos: Las yeguas del grupo A (n = 11) se inseminaron con aproximadamente 25 x 10^{6} espermatozoides clasificados vivos en un volumen de 1 ml. Los espermatozoides se clasificaron en un extensor de semen con leche desnatada comercial (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA). Una yegua no consiguió ovular y se excluyó del estudio. Las yeguas del grupo B (n = 10) se inseminaron con aproximadamente 25 x 10^{6} espermatozoides clasificados vivos en un volumen de 1 ml. El esperma se clasificó en EZ-Mixin + 4% de yema de huevo (EY). Dos yeguas (una de cada grupo) se inseminaron con 20 x 10^{6} espermatozoides debido a las restricciones de tiempo con los citómetros de flujo. En ambos grupos, las inseminaciones se realizaron 34 horas después de la administración de GnRH y el esperma se depositó en la punta del cuerno uterino, ipsilateral al folículo preovulatorio utilizando una pipeta de plástico flexible para AI. La localización de las pipetas en el interior del útero se confirmó mediante ultrasonografía transrectal antes de la deposición del semen. A las yeguas se les administró cloprostenol (250 \mug i.m.) para inducir la luteólisis y se monitorizaron mediante ultrasonografía en días alternos hasta que se detectó un folículo mayor o igual a 30 mm y, a continuación, diariamente hasta que se detectó la ovulación. Se administró GnRH (deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge) cuando el folículo dominante era igual o superior a 35 mm. Se utilizaron dos sementales en este experimento, uno de los cuales (Semental A) se utilizó en el Experimento 1. El semen recién recogido se extendió 1:1 en HBGM-3 y se centrifugó durante 10 minutos a 400 x g a 22ºC. El sobrenadante se aspiró y el esperma se incubó en 25 \mul de Hoechst 33342 a 400 x 10^{6} espermatozoides/ml en HBGM-3 durante 1 hora a 35ºC y, a continuación, se diluyó hasta 100 x 10^{6} espermatozoides/ml para la clasificación. El esperma se clasificó según los cromosomas del sexo en base a la diferencia del contenido del ADN. Se utilizaron para la clasificación dos clasificadores de células con citómetro de flujo MoFlo® equipados con un láser argón que emitía a una potencia de 150 mW a 352 y 364 nm, operando a 50 psi con HBGM-3 como fluido envolvente. Se reanalizaron para ADN partes alícuotas de poblaciones clasificadas como X e Y y se obtuvieron purezas del 90 y el 84% para X e Y, respectivamente. El esperma se recogió a aproximadamente 900 espermatozoides/segundo en tubos de 14 ml que contenían 4 ml de EZ-Mixin (Grupo A) o 4 ml de EZ-Mixin + 4% de yema de huevo (Grupo B). El esperma recogido se centrifugó y se resuspendió hasta 25 x 10^{6} espermatozoides/ml y se inseminaron inmediatamente. El embarazo se determinó mediante ultrasonografía a los 12, 14, 16 y 30 días después de la ovulación, y los fetos se sexuaron 60-70 días después de la ovulación sin conocimiento del sexo del esperma clasificado inseminado. Los índices de embarazo no fueron diferentes entre los sementales (Semental A = 3/10, 30%; Semental B = 5/10, 50%) (P > 0,1), de manera que se combinaron los grupos de datos. Aunque no había diferencia en los índices de embarazo entre los tratamientos del esperma (EZ-Mixin = 3/10, 30% frente a 4% yema de huevo + EZ-Mixin = 5/10, 50%) (P > 0,1), esto no puede probar en última instancia que sea cierto. En el día 60, las yeguas 5/20 (25%) estaban preñadas; los fetos se sexuaron y la proporción de sexo fenotípico se predijo perfectamente, cinco de cinco.

Esta prueba ha demostrado por primera vez que se puede conseguir el embarazo en la yegua y se pueden obtener potros de sexo predeterminado, siguiendo la inseminación no quirúrgica con semen sexuado. Esto se explica en la siguiente descripción.

De este modo, un objetivo de la presente invención es conseguir de esta manera la inseminación artificial de equinos en un medio campestre sin necesidad de recurrir a procedimientos quirúrgicos. Además, un objetivo es dar a conocer la capacidad de utilizar dosis inferiores de manera que se trabaja en circunstancias comerciales reales y se obtienen probabilidades de éxito en el embarazo que son comparables con las tasas de éxito en la dosificación equina tradicional. Un objetivo es también conseguir una mejor clasificación para células de esperma equino. Un objetivo paralelo es proporcionar sustancias y técnicas que son especialmente adecuadas para células de esperma equino cuando se separan en componentes portadores de los cromosomas X e Y. De este modo, un objetivo es conseguir un resultado clasificado que concuerda con las expectativas de la dosificación elevada no clasificada.

Otro objetivo es también presentar un sistema global para la inseminación artificial equina que puede conseguir sus objetivos de una manera comercialmente práctica. La clasificación de una manera que se permite una clasificación equina a una velocidad elevada y con baja tensión, y que está especialmente adaptada para la clasificación celular del esperma equino en un contexto de dosis bajas es también un objetivo importante.

Naturalmente, en otras secciones de la memoria y las reivindicaciones se describen objetivos adicionales de la invención.

IV. Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de un sistema clasificador según una técnica de separación con citómetro de flujo para la presente invención.

La figura 2 es un diagrama de las células arrastradas en la boquilla justo antes del área de caída libre de un citómetro de flujo típico.

V. Modo óptimo de llevar a cabo la presente invención

Tal como se observará, los conceptos básicos de la presente invención se pueden combinar y realizar de varias maneras. La presente invención implica una inseminación artificial equina sexuada a dosis bajas comercialmente práctica y los resultados. Para las técnicas de separación de citometría de flujo, la presente invención también implica sistemas de citómetros de flujo mejorados, así como sistemas para la creación de muestras de esperma equino de sexo específico que se pueden utilizar en la inseminación artificial equina y los équidos producidos mediante dichas técnicas. Se describen procesos globales a través de los cuales son posibles tasas de éxito elevadas incluso en ambientes equinos comerciales. Además, las técnicas se describen de manera general, de manera que se pueden aplicar a sistemas específicos y aplicaciones una vez se han entendido los principios generales. Aunque se describen mejoras de los aparatos, debe entenderse que estas mejoras no sólo se realizan para ciertos métodos, sino que también se pueden variar y combinar de varias maneras. En gran medida, como en todo lo anterior, cada una de estas facetas debería entenderse que está comprendida por esta descripción.

Cuando se considera el aspecto de selección del sexo de la presente invención, el objetivo básico es el de separar los espermatozoides portadores de X del esperma equino portador de Y de una manera en la que, a continuación, se puede utilizar para inseminar artificialmente la yegua con tasas de éxito elevadas. Preferiblemente, esta inseminación no requeriría cirugía. La fase de separación se realiza preferiblemente de una manera que aísla los dos tipos de esperma equino, de manera que cada uno se puede envasar por separado y ser tratado. Actualmente, el aislamiento se realiza preferiblemente mediante la utilización de citometría de flujo. La citometría de flujo es una técnica que es bien conocida. Por ejemplo, los aspectos básicos de la misma se muestran y se describen en una serie de patentes de Cytomation, Inc., tales como las Patentes de Estados Unidos y otras publicaciones indicadas anteriormente.

En general, debería entenderse que durante la meiosis en los testículos, los cromosomas del sexo se segregan en espermátides individuales y los espermatozoides haploides transportan el cromosoma X o Y. Existe una proporción 50:50 de espermatozoides portadores de X con respecto a Y en el semen, y la fecundación de un ovocito haploide portador de X por esperma portador de X o Y determina el sexo del embrión. Una proporción 50:50 existe porque los espermatozoides portadores de X e Y se fabrican en igual número y son fenotípicamente idénticos. El deseo de alterar esta proporción 50:50 y predeterminar el sexo de la cría de mamífero ha sido de gran interés para el público durante muchos años. Existen numerosas ventajas para la preselección del sexo en animales equinos. La preselección del sexo también se ha utilizado para producir hembras cuando las enfermedades hereditarias unidas a X son clave. A diferencia de los humanos y la mayoría de animales de granja, la ventaja de la preselección del sexo en el caballo puede ser la preferencia del criador/dueño y ha habido un considerable interés expresado por miembros de ciertos registros de crianza.

Durante años, se han realizado numerosos intentos para separar los espermatozoides portadores del cromosoma X de los del cromosoma Y en base a las propiedades físicas y químicas del esperma. Johnson (citado en referencias anteriores) ensayó estos métodos y observó que el único método que demostró ser eficaz se basaba en la diferencia del contenido de ADN de los espermatozoides. Ningún otro método basado en una diferencia física en los espermatozoides o en propiedades superficiales ha demostrado ser eficaz en la separación de los espermatozoides portadores de X de los portadores de Y. En los equinos, el contenido de ADN de esperma de mamífero portador de los cromosomas X e Y difiere en un 4,1%. Esta diferencia en el contenido de ADN se puede utilizar para separar los espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y después de la tinción del esperma con un colorante fluorescente de unión a ADN seguido de citometría de flujo.

La tecnología moderna de citometría de flujo/clasificación celular fue desarrollada por primera vez por Fulwyler en 1965. La citometría de flujo se ha utilizado principalmente en la investigación médica y el diagnóstico con respecto a células sanguíneas y tumorales, pero también se puede utilizar para evaluar muchos tipos de suspensiones celulares, incluyendo las células de esperma. Esencialmente, la citometría de flujo tal como se aplica en la presente invención implica la clasificación de las células de esperma equino, las cuales se disponen en el instrumento del citómetro de flujo a través de algún tipo de fuente de células. En la figura 1 se muestra un instrumento conceptual. El instrumento de citómetro de flujo incluye una entrada de muestra, en este caso una fuente de células de esperma equino (1) que actúa para establecer o suministrar células de esperma equino o algún otro tipo de elemento a analizar por el citómetro de flujo. Las células se depositan en una boquilla (2) de manera que las células están rodeadas por un fluido envolvente (3). El fluido envolvente (3) se suministra habitualmente mediante alguna fuente de fluido envolvente (4), de manera que a medida que la fuente de células de esperma equino (1) suministra sus células, se alimenta al mismo tiempo el fluido envolvente (3) a través de la boquilla (2). De esta manera, se puede entender fácilmente cómo el fluido envolvente (3) forma un medio de fluido envolvente para las células de esperma equino. Dado que se disponen varios fluidos en el citómetro de flujo a cierta presión, fluyen desde la boquilla (2) y salen en el orificio (5) de la boquilla. Mediante la disposición de algún tipo de oscilador (6) que puede estar controlado de manera muy precisa a través de un control del oscilador, las ondas de presión se pueden estabilizar en el interior de la boquilla (2) y transmitirse a los fluidos que salen de la boquilla (2) en el orificio (5) de la misma. De este modo, dado que el oscilador (6) actúa sobre el fluido envolvente (3), la corriente (7) saliente del orificio de la boquilla (5) finalmente y de manera regular forma gotas (8). Dado que las células están rodeadas por un medio de fluido envolvente, las gotas (8) pueden contener en su interior células individualmente aisladas u otros elementos.

Dado que las gotas (8) contienen generalmente células de esperma equino aisladas, el citómetro de flujo puede distinguir y separar gotitas en base a si la célula o células apropiadas están o no contenidas en la gota. Esto se realiza mediante un sistema de detección de células (9). El sistema de detección de células implica por lo menos algún tipo de detector (10) (que puede incluir dos detectores a 90 grados el uno del otro) que responde a las células contenidas en cada gota (8), tal como se describe extensamente en el trabajo seminal (sin doble sentido) de Larry Johnson, a saber, Patente de Estados unidos No. 5135759. Tal como explica la patente de Johnson para las células de esperma, el sistema de detección de células (9) puede provocar una acción dependiendo de la presencia relativa o la ausencia relativa de un colorante particular que puede excitarse mediante algún estimulante, tal como el excitador láser (11). Aunque cada tipo de célula de esperma esta teñida por el colorante, la longitud diferente del cromosoma X y el cromosoma Y provoca diferentes niveles de tinción. De este modo, mediante la detección del grado de colorante presente en las células de esperma es posible discriminar entre esperma portador de X y esperma portador de Y mediante sus diferentes niveles de emisión.

A efectos de conseguir la máxima separación y aislamiento de las células apropiadas en una técnica de separación con citómetro de flujo, las señales recibidas por el detector (10) se alimentan a algún tipo de sistema de discriminación clasificador (12) que muy rápidamente toma la decisión y puede cargar de forma diferencial cada gota (8) en base a si ha decidido que la célula de esperma equino existe o no en la gota (8). De esta manera, el sistema de discriminación clasificador (12) actúa para permitir que las placas de deflección electrostática (13) deflecten gotas (8) en base a si contienen o no la célula apropiada u otro elemento. Como resultado, el citómetro de flujo actúa para clasificar las células provocando que se depositen en uno o más colectores (14). De este modo, mediante la detección de alguna propiedad de las células u otros elementos, el citómetro de flujo puede discriminar entre células de esperma equino en base a una característica particular y colocarlas en el colector apropiado (14). En el sistema utilizado en la presente invención para clasificar esperma equino, las gotas de esperma portador de X están cargadas positivamente y, de este modo, deflectan en una dirección, las gotas de esperma portador de Y están cargadas negativamente y, de este modo, deflectan en la otra dirección, y la corriente desechada (es decir, las células no clasificables) no está cargada y, de este modo, se recoge en una corriente no deflectada en un tubo de succión o similar.

En referencia a la figura 2, el proceso se puede entender incluso mejor. Tal como se muestra en la figura, la boquilla (2) emite una corriente (7) que, debido al oscilador (6) (no mostrado en la figura 2), forma gotas (8) (no mostradas en la figura 2). Dado que la fuente de células de esperma equino (1) (no mostrado en la figura 2) puede suministrar células de esperma equino (15) que han sido teñidas según la técnica de Johnson, la estimulación de luz por el excitador láser (11) y el estado diferencialmente determinado según se ha detectado por el detector (10) se pueden utilizar para crear la existencia o no existencia de una carga en cada gota (8) a medida que se separa de la corriente (7). Esto está todo controlado por el citómetro de flujo. Este control da lugar a gotas (8) cargadas positivamente, cargadas negativamente y no cargadas en base a su contenido. Tal como se muestra en la figura 1, ciertas gotas se muestran como gotas deflectadas (16). Estas gotas deflectadas (16) son aquellas que contienen células de esperma (15) de uno u otro sexo. A continuación, se depositan en el colector apropiado (14) para el uso posterior.

Tal como se muestra en la figura 2, las células de esperma equino (15) se pueden inyectar en el fluido envolvente (3) mediante una aguja o un tubo de inyección (18). Tal como entienden los técnicos de la citometría de flujo, este tubo de inyección (18) puede estar conformado para conseguir una focalización y orientación hidrodinámica, de manera que la parte de la cola y/o la parte más plana de las células de esperma equino (15) están correctamente orientadas. Tal como se muestra, se puede producir incluso una corriente central con una muestra en forma de lazo. Esto puede ser importante, ya que la intensidad de fluorescencia a los noventa grados puede observarse que es proporcional a la orientación de la cabeza del espermatozoide y la intensidad de fluorescencia a los cero grados puede observarse que es proporcional al contenido de ADN del esperma.

El análisis del ADN de esperma equino por citometría de flujo de alta resolución es difícil en comparación con otras células, ya que la cromatina altamente compactada en la cabeza del espermatozoide morfológicamente plana y en forma de pala provoca un alto índice de refracción. La diferencia en el índice de refracción entre la cabeza del espermatozoide y el medio circundante, en combinación con la forma plana de la cabeza del espermatozoide, da lugar a una mayor emisión de fluorescencia a través del plano de la célula (desde el borde de la cabeza del espermatozoide) que en un ángulo de 90º con respecto al plano. La orientación correcta de la cabeza es crítica para una clasificación de alta resolución. Otros investigadores han investigado métodos de control de la orientación de las cabezas de los espermatozoides que fluyen en una corriente y han observado que un tubo inyectado biselado (18) era eficaz en el sometimiento de las células a fuerzas planas hidrofóbicas a medida que las células salían del extremo de la aguja. La corriente de muestra puede ser empujada a una corriente en forma de lazo que puede orientar la cabeza plana del espermatozoide de la misma manera. Frecuentemente también se aplican otros principios físicos más complejos para orientar los espermatozoides.

Tal como se ha mencionado, los espermatozoides que experimentan el proceso de clasificación se tiñen con el colorante fluorocromo Hoechst 33342, conocido químicamente como bisbenzimida. El colorante se añade a la muestra en aproximadamente 9 \muM en un volumen de 1 ml que contiene 400 x 10^{6} espermatozoides, y se puede incubar a 32-35ºC. Hoechst 33342 no es tóxico para el esperma, y no altera significativamente la movilidad del esperma. Hoechst 33342 se une a las regiones A-T de la hélice de ADN. Dado que el proceso de clasificación es más productivo si no se recogen los espermatozoides muertos, a la muestra teñida se puede añadir una molécula que detiene la fluorescencia del Hoechst 33342 y marca los espermatozoides muertos. Los colorantes alimenticios son un ejemplo de una molécula no tóxica que se ha utilizado. A continuación, en el proceso los espermatozoides teñidos fluorescentemente se introducen bajo presión (por ejemplo, 50 psi) en una suspensión líquida al citómetro de flujo. Los espermatozoides entran en el tubo de inserción de muestra y se orientan de una manera u otra, quizás a medida que salen del extremo biselado del tubo en el fluido envolvente. La corriente que contiene el esperma se cruza con un haz de láser de iones argón, en longitudes de onda del ultravioleta (351 y 364 nm) a una potencia de hasta 200 mW. Aproximadamente, un 7% de las gotas contienen una célula de espermatozoides cuando la muestra es de 100 x 10^{6} espermatozoides/ml. Los núcleos teñidos fluorescentemente se excitan mediante el haz de láser, produciendo señales fluorescentes proporcionales a la cantidad de ADN unido al colorante.

Se utilizó un sistema de clasificación de flujo comercial modificado para analizar y clasificar los espermatozoides en base a las diferencias de ADN. Tal como se ha mencionado, la señal fluorescente del borde del espermatozoide (ángulo de 90º desde la emisión láser) es más brillante que la emitida desde la parta plana (detector directo a 0º). La emisión en el borde se utiliza para caracterizar la orientación de las cabezas de los espermatozoides a medida que atraviesan el haz de láser. La luz de emisión se recoge por el detector a 90º y se reconocen los espermatozoides orientados correctamente. Los espermatozoides de los análisis que no están orientados correctamente desprenden menos luz y están electrónicamente espaciados, frecuentemente, debido a la falta de orientación correcta, la mayoría de espermatozoides no se separan en poblaciones ricas en X o Y. Además, muchas células de esperma que están correctamente orientadas no se clasifican debido a las distribuciones de solapamiento de la fluorescencia. Se pueden utilizar un detector óptico y un tubo fotomultiplicador (PMT) para la detección a 0º de la fluorescencia, que es proporcional al contenido de ADN de los espermatozoides correctamente orientados. Los PMT recogen la fluorescencia emitida por los espermatozoides y convierten la señal óptica en una señal electrónica proporcional, que es amplificada por el PMT para el procesado de una señal posterior y la exhibición de un gráfico. El espaciado electrónico permite la selección de señales del detector directo a 0º sólo para espermatozoides orientados correctamente; esto da lugar a la capacidad de diferenciar entre el ADN de espermatozoides X e Y. Mediante el establecimiento de ventanas de clasificación electrónicas alrededor de las poblaciones clasificadas, los espermatozoides portadores de X e Y se separan en dos tubos. Dos detectores ópticos recogen la luz desprendida y se activan circuitos que añaden un pulso de carga (+ o -) a las gotas que contienen los respectivos espermatozoides portadores de X e Y. A medida que caen las gotitas de espermatozoides individuales, éstas atraviesan un campo electrostático que atrae las gotitas cargadas que contienen los espermatozoides en tubos separados que contienen un extensor "captador de fluido" ("catch fluid") como medio de sostenimiento temporal hasta que los espermatozoides se procesan posteriormente.

Las muestras de espermatozoides que se han separado en muestras enriquecidas con los cromosomas X e Y se pueden reevaluar para su pureza utilizando un análisis citométrico de flujo para el contenido de ADN de los espermatozoides individuales. En el pasado, el único método válido disponible para la verificación de la separación era determinar la proporción de sexos de las crías, el cual es prematuro y caro. Los reanálisis que utilizan citometría de flujo reducen no sólo el tiempo y el coste, sino que aumentan la precisión.

Con los avances, se anticipa que el porcentaje de espermatozoides que están orientados correctamente a medida que las gotas atraviesan el láser puede aumentar, dando lugar a mayores índices de clasificación desde 100 espermatozoides vivos/s de cada sexo hasta índices entre 1000 y 1500 espermatozoides vivos/s de cada sexo a \sim90%. Este aumento en el índice de clasificación de los espermatozoides sería útil para hacer más práctico la utilización de semen sexuado en un programa de inseminación artificial equina.

Otros investigadores han descrito la utilización de la cantidad de ADN en los espermatozoides como marcador para la preselección del sexo y el posterior nacimiento en conejos del sexo previsto después de la inseminación quirúrgica. Los espermatozoides se separaron en poblaciones que portaban cromosomas X e Y con un clasificador de células con citómetro de flujo. Los espermatozoides clasificados se inseminaron quirúrgicamente en el útero. De los inseminados con fracciones enriquecidas en espermatozoides que portan Y, el 81% de las crías nacidas eran machos; las fracciones enriquecidas en espermatozoides portadores de X dieron lugar a un 94% de hembras. De este modo, la proporción de sexos se alteró significativamente respecto a 50:50. Esta proporción fenotípica (y genotípica) se predijo con precisión en base a los reanálisis de ADN de las poblaciones clasificadas, que mostraron purezas del 81% para espermatozoides portadores de Y y del 86% para espermatozoides portadores de X. A continuación, se publicaron los experimentos en cerdos y ganado vacuno. La fecundación in vitro se ha utilizado para obtener embarazos en ganado vacuno utilizando semen sexuado. Por ejemplo, un investigador transfirió embriones gemelos en cada una de las 9 vaquillas. Cuatro vaquillas quedaron preñadas y nacieron 6 terneros, todos del sexo previsto. Estos resultados muestran que los espermatozoides viables se pueden separar en poblaciones portadoras de los cromosomas X e Y y retener la capacidad de fecundación y producción de progenie normal. También se han obtenido embarazos después de una fecundación in vitro (IVF) con espermatozoides portadores de X e Y en cerdos y conejos. Recientemente, se han producido embriones bovinos mediante IVF con espermatozoides clasificados mediante citometría de flujo de alta velocidad, pero no se han realizado transferencias de embriones.

Utilizando espermatozoides equinos sexuados clasificados en un ambiente de laboratorio, un investigador realizó dos experimentos para determinar los índices de embarazo con una inyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI) en ovocitos equinos o inseminación oviductal. Trece ovocitos inyectados se desarrollaron hasta la etapa de 2 a 3 células, 8 hasta la etapa de 4 a 6 células y 2 ovocitos se desarrollaron hasta la etapa de 7 a 8 células. Se transfirió un embrión a la etapa de 7 a 8 células, pero no se obtuvo embarazo. En el experimento de inseminación oviductal, se inseminaron dos yeguas mediante la canulación del extremo fimbriado del oviducto con 50 \mul que contenían 1,5 x 10^{5} espermatozoides portadores de X clasificados. Se detectó un embarazo y la yegua produjo un potro hembra.

Uno de los aspectos de la citometría de flujo que es particularmente importante para su aplicación para el esperma equino es la operación a velocidad elevada de un citómetro de flujo. Se han realizado avances particularmente mediante los citómetros de flujo disponibles en Cytomation, Inc. bajo la marca comercial MoFlo®. Estos citómetros de flujo han aumentado las velocidades de clasificación de manera extraordinaria y, de este modo, han hecho de la citometría de flujo una técnica que es probable que haga factible la aplicación comercial de la clasificación del esperma equino (entre otras aplicaciones comerciales). Trabajan para conseguir una clasificación de alta velocidad, es decir a una velocidad que es notablemente superior a la utilizada en otros casos. Específicamente, los citómetros de flujo MoFlo® de Cytomation funcionan con frecuencias de oscilador superiores a cinco kilohercios y más específicamente pueden operar en los intervalos de 10 a 30 o incluso 50 kilohercios. De este modo, las gotitas se forman a frecuencias muy elevadas y las células contenidas en el medio de fluido envolvente se pueden emitir muy rápidamente desde la boquilla (2). Como resultado, cada uno de los componentes, tales como la boquilla (2), el oscilador (6) y similares que forman y son parte de un sistema de citómetro de flujo se puede configurar o seleccionar para dar lugar a un clasificador de células de alta velocidad. En la aplicación de un clasificador de células de alta velocidad para clasificar células de espermatozoides, se consigue una clasificación a velocidades superiores a aproximadamente 900 clasificaciones por segundo. En gran medida, debería entenderse que el término "alta velocidad" es un término relativo, de manera que se consiguen otros avances en la citometría de flujo y aplicaciones específicas, el aspecto que se considera "alto" puede variar o puede permanecer absoluto. En cualquiera de las definiciones, el principio general es que la clasificación puede tener lugar a velocidades en las que los parámetros y las características físicas del citómetro de flujo son significativas para las propias células cuando se clasifican células concretas, tales como células de esperma equino.

Un aspecto de la clasificación de alta velocidad que parece que entra en juego cuando se clasifican células de esperma equino mediante una técnica de separación de citómetro de flujo son las presiones y otras tensiones a las que se someten las células de esperma equino en el citómetro de flujo. Por ejemplo, cuando se trabaja a altas velocidades (y una definición alternativa de "alta velocidad"), los citómetros de flujo pueden trabajar a una presión de 50 libras por pulgada cuadrada e incluso superior. Estas presiones se pueden considerar altas, ya que pueden dar lugar a efectos sobre las células de esperma equino que se clasifican. La clave, tal como se ha descrito en la presente invención para esta faceta, es el hecho de que los umbrales de tensión de las células concretas son el factor determinante. Adicionalmente, a medida que se obtiene un mayor conocimiento, se puede observar que los umbrales de tensión son una función de efectos combinados, tales como las especies particulares o la manipulación particular anterior o posterior de las células de esperma equino. La clave en este aspecto es que la tensión impuesta sobre las células de esperma equino pueden de hecho alterar su viabilidad y su capacidad de conseguir el resultado deseado. Esto puede ser inusualmente cierto para especies equinas. En el caso de la presión, puede ser que simplemente sometiendo las células de esperma a una presión más elevada como resultado de la operación del citómetro de flujo a esa presión pueda dar lugar a un descenso del rendimiento de las células de esperma equino. En un aspecto, la presente invención funciona para minimizar estas tensiones y, de este modo, da lugar a mayores eficacias, así como dosis inferiores tal como se describirá a continuación.

Al considerar el aspecto de las tensiones de las células equinas, la presente invención actúa de manera que minimiza las tensiones. Estas tensiones se pueden minimizar en cualquier punto en el ciclo o proceso global de recolección, clasificación o incluso inseminación del animal. En gran medida, la tensión provocada por la manipulación de las células en el citómetro de flujo parece significativa para la especie equina. En una realización de la presente invención, el fluido envolvente se selecciona específicamente, de manera que puede servir de forma coordinada con el medio de fluido de células preclasificadas y/o el medio de fluido de células después de la clasificación. De este modo, la presente invención funciona para minimizar los cambios mediante el tipo de operación o la selección de sustancias que pueden actuar como medios para minimizar los cambios que experimentan las células del esperma equino. Para el fluido envolvente, se selecciona una sustancia según una realización de la presente invención, de manera que se puede coordinar químicamente a cambios mínimos presentes. De este modo, mediante la selección del fluido envolvente adecuado no sólo en el contexto de los parámetros de la citometría de flujo, sino también en el contexto de los propios parámetros de las células de esperma equino y la inseminación artificial equina, se pueden mejorar los cambios experimentados por las células y el resultado global de la clasificación. De manera interesante, para células de esperma equino, se ha descubierto que un medio tamponado con hepes, tal como un medio de gametos bovinos con hepes - particularmente HBGM3 según fue creado anteriormente por J.J. Parrish para aplicación bovina - funciona bien. Este medio se describe en el artículo "Capacitation of Bovine Sperm by Heparin", 38 Biology of Reproduction 1171 (1988). No sólo esto sorprendente porque no es el mismo tipo de utilización para el esperma bovino, pero el tampón presente, se desarrolló originalmente para una aplicación bovina. De este modo, en la aplicación equina el fluido envolvente se selecciona de manera que contiene el tampón con hepes.

Un aspecto separado del procesado con el citómetro de flujo que también puede ser importante es el hecho de tratar correctamente las células tanto química como físicamente después de clasificarlas. Tal como se muestra en la figura 2, las células en el interior de las gotas (8) se depositan en el colector (14). El fluido del colector (17) también puede servir para minimizar las tensiones de las células. En un aspecto, dado que puede ser importante administrar un nutriente a las células tanto antes como después de la clasificación, el fluido del colector (17) se puede seleccionar de manera que se dispone también una recepción más sencilla. Para las células de esperma equino, las células se pueden recoger en un extensor de leche desnatada comercial, tal como la de EZ-Mixin, Animal Reproduction Systems, Chino, CA. Aunque está destinado para un objetivo diferente, este extensor se puede utilizar como fluido de recogida de células de esperma equino. Además, este fluido de recogida puede incluir también un 4% de yema de huevo.

Otro aspecto que puede interaccionar en varios factores de la presente invención es la utilización de cantidades de dosis bajas de esperma para la inseminación artificial o similares. Los antecedentes adicionales en el aspecto de la inseminación artificial sexuada se pueden encontrar en "Prospects for Sorting Mammalian Sperm" por Rupert P. Amman y George E. Seidel, Jr. Colorado Associated University Press (1982) y en la publicación de PCT a la que se ha hecho referencia anteriormente. Tal como se ha mencionado anteriormente, la inseminación natural en equinos implica cantidades de espermatozoides del orden de mil millones de espermatozoides. La inseminación artificial rutinaria se realiza actualmente con doscientos cincuenta millones o más espermatozoides para la especie equina. Mediante el término "dosis baja" se entiende que la dosificación de espermatozoides utilizados en el acto de la inseminación es inferior a un cuarto o preferiblemente incluso inferior a aproximadamente un 10% o un 5% de la cantidad habitual de espermatozoides dispuestos en un acto habitual de inseminación artificial equina. De este modo, el término "dosis baja" debe verse en el contexto de la dosificación de la inseminación artificial habitual o también como un valor absoluto. Naturalmente, los valores absolutos pueden depender de la especie. Para la especie equina, solamente menos de aproximadamente veinticinco, diez, cinco o incluso un millón de espermatozoides se pueden considerar como un proceso de dosis bajas.

Aún otro aspecto que puede ser importante es el hecho de que el esperma sexuado mediante las técnicas de la presente invención (o de otro modo) se utiliza en un sistema de inseminación artificial equina. De este modo, cuando, para una técnica de citómetro de flujo se utiliza el colector (14) para disponer el esperma para la inseminación artificial, las técnicas de la presente invención pueden ser particularmente relevantes. Además, es posible que la combinación de la utilización tanto de la inseminación artificial equina como en un medio de dosis bajas pueden crear juntos sinergias que hacen que las diversas técnicas de la presente invención sean apropiadas. Naturalmente, el esperma sexuado se puede utilizar no sólo en un modo para la inseminación artificial, sino en otras técnicas, tales como la fecundación in vitro y similares.

El proceso de recogida, clasificación y finalmente inseminación de un animal mediante la utilización de la clasificación con citometría de flujo, u otra técnica de separación, implica una serie de etapas. En el contexto de la inseminación equina, en primer lugar el semen se recoge del semental. El semen se puede recoger de sementales de fertilidad elevada conocida inmediatamente antes de la inseminación planeada. Esto puede tener lugar con un modelo Colorado de vagina artificial (Animal Reproductions Systems, Chino, CA) equipado con un filtro de gel en línea. A continuación, se pueden evaluar en los eyaculados el volumen libre de gel, la movilidad y la concentración de espermatozoides. A continuación, el semen se puede extender con un extensor de glucosa y leche desnatada comercial (EZ-Mixin, OF, Animal Reproductions Systems, Chino, CA) hasta 25 x 10^{6} pms/ml (n = 51) o 5 x 10^{6} pms/ml (n = 10). El semen se puede mantener a temperatura ambiente hasta que se realizan las inseminaciones, poco después de la recogida. La tinción se puede llevar a cabo según un protocolo de tinción múltiple o individual, el último, la materia de la Patente de Johnson y la tecnología relacionada.

Después de añadir el colorante, se puede realizar la dilución o extensión hasta la concentración de clasificación deseada. A continuación, se puede llevar a cabo la clasificación según diversas técnicas descritas anteriormente, a partir de la cual se pueden recuperar las células de esperma en la fase de recogida.

Está bien establecida una cantidad óptima de espermatozoides móviles por dosis de inseminación para maximizar la fecundación con técnicas anteriores en especies, tales como cerdos, ovejas y terneras. Con la presente invención, la cantidad mínima de espermatozoides móviles parece ser mucho menor que los 250 a 500 x 10^{6} espermatozoides progresivamente móviles (pms) habitualmente recomendados. En condiciones ideales, las yeguas se habían inseminado incluso con solamente 100 x 10^{6} pms sin reducir la fertilidad. (Los investigadores no hallaron diferencias entre yeguas inseminadas durante tres ciclos con 100 ó 500 x 10^{6} pms y se consiguieron índices de embarazo del 63,9% y el 75%, respectivamente.). La presente invención muestra que ahora son posibles cantidades incluso inferiores - y que las cantidades inferiores se pueden conseguir en un medio campestre.

Aunque la diferencia no era significativa, en un experimento los índices de embarazo para los tratamientos con 100 y 500 x 10^{6} durante los ciclos 1, 2 y 3 fueron de un 25 frente a un 39, de un 33 frente a un 45 y de un 28 frente a un 25%, respectivamente. De manera destacada, otros investigadores han descrito un aumento en el índice de nacimiento de potros cuando la cantidad de espermatozoides móviles por inseminación se aumentó desde un 40 a un 80 x 10^{6}, pero no se observó una mejora adicional cuando la cantidad de espermatozoides aumentó hasta 160 x 10^{6}. En un experimento utilizando dos grupos de 14 yeguas subfértiles, un investigador no encontró diferencias entre los tratamientos utilizando 100 ó 500 x 10^{6} espermatozoides móviles por inseminación (35,7 frente a un 42,9%, respectivamente). Posteriormente, el mismo investigador describió índices de embarazo después de la reproducción durante tres ciclos de yeguas inseminadas con 50, 100 y 500 x 10^{6} pms de 41,7, 65,6 y 81,3%, respectivamente, a partir de los datos promedios de diversos experimentos. Otro investigador de la técnica describió que yeguas inseminadas (durante tres ciclos) con 50 y 500 x 10^{6} pms mostraron una diferencia significativa entre los índices de embarazo del 37,5 y el 75%, respectivamente. En un estudio más reciente, uno de los inventores superovuló yeguas con extracto de pituitaria equina (EPE) e inseminó las yeguas una vez con 50 x 10^{6} pms. Los índices de embarazo no eran diferentes entre las yeguas tratadas con EPE y los controles salinos (65 y 55%, respectiva-
mente).

En la inseminación artificial equina de rutina existente, aunque parece haber poca diferencia en la fecundidad entre 100 y 500 x 10^{6} espermatozoides por dosis de inseminación, se recomienda generalmente 500 x 10^{6} pms para disponer del máximo de fertilidad. Sin embargo, cuando se utilizaron técnicas de inseminación artificial correctas, se creyó también que 100 x 10^{6} pms de un semental altamente fértil era el mínimo adecuado con las técnicas anteriores. En el caso más aceptado, cuando se realiza una inseminación artificial de rutina (AI) con sementales y yeguas fértiles, 500 x 10^{6} pms inseminados en días alternativos a la vez que las yeguas están en estro da lugar a una fertilidad máxima. Tal como se ha mencionado anteriormente, el problema con esto es simple, la inseminación de yeguas con una cantidad baja de espermatozoides puede ser necesaria cuando el semen está limitado o cuando se utiliza semen sexuado clasificado.

Tal como se ha mencionado anteriormente, actualmente, es posible obtener aproximadamente 1000 espermatozoides vivos equinos/segundo (3,6 x 10^{6}/h) de cada composición cromosómica sexual cuando se clasifican los espermatozoides para los cromosomas sexuales mediante citometría de flujo con una precisión del 90%. De este modo, no sería práctico obtener 500 x 10^{6} espermatozoides que se clasificaron según los cromosomas sexuales para una inseminación de 3,6 x 10^{6} espermatozoides/hora. Por lo tanto, el objetivo era conseguir una menor cantidad de espermatozoides por dosis de inseminación a la vez que se obtiene una fertilidad razonable. El objetivo era conseguir índices de embarazo en yeguas inseminadas en una única ocasión, próxima a la ovulación, con tan pocos como 25 ó 5 x 10^{6} o menos espermatozoides progresivamente móviles (pms).

El eyaculado de un semental normal contiene un volumen promedio de 50 ml. El semental deposita este volumen de semen elevado directamente en el útero de la hembra. En otra especie (verraco) que eyacula varios cientos de ml de semen, sólo 0,5-0,1 ml entran en cada trompa de falopio al inicio del estro para permitir la fecundación. Este gran volumen seminal llena la región de la unión útero-tubal hasta que se establece una reserva de espermatozoides en el istmo. Por lo tanto, se establece un volumen específico de semen en el istmo y el contenido restante se elimina rápidamente.

Para la inseminación artificial, el número de espermatozoides en una dosis de inseminación puede ser crítico. Los extensores seminales se utilizan frecuentemente para diluir el semen en bruto para disponer de volúmenes de inseminación mayores y manipulados más fácilmente. En la técnica anterior, se recomienda generalmente un volumen que varía entre 10 y 25 ml de semen aunque, ahora, quizás dependiendo de la concentración de espermatozoides, pequeños volúmenes de inseminación pueden demostrar ser tan eficaces como volúmenes mayores. Aunque no se especificó la concentración, los volúmenes de inseminación que variaban entre 0,6 y 26,8 ml de semen no afectaban de manera adversa a la fecundación cuando se estudiaron los efectos de la inseminación de volúmenes de 10 ó 50 ml de semen extendido en los índices de recuperación de embriones en yeguas. No obstante, en base a este experimento, hubo una reducción en los índices de recuperación de embriones de yeguas inseminadas con un volumen de 50 ml de semen extendido en comparación con un volumen de 10 ml cuando ambos contenían la misma cantidad de pms. La menor fertilidad podría ser debido al mayor volumen de inseminado o podría ser debido a la menor concentración de espermatozoides, ya que era un quinto de la del volumen de 10 ml (5 frente a 25 x 10^{6}).

Se realizaron experimentos adicionales para determinar: 1) el índice de recuperación de embriones cuando las yeguas se inseminaron con 100 x 10^{6} pms extendidos en 10, 100 ó 200 ml de extensor de leche desnatada seca y 2) el índice de recuperación de embriones cuando las yeguas se inseminaron con 250 x 10^{6} pms extendidos en 10 ó 100 ml del mismo extensor que el experimento 1. Los resultados del experimento 1 mostraron una diferencia en los embriones recuperados sólo entre yeguas inseminadas con 10 (40%) y 200 ml (0%). En uno de estos experimentos, había una diferencia significativa entre las yeguas inseminadas con 10 ml (70,6%) en comparación con 100 ml (13%). De este modo, los volúmenes de inseminación de 100 ó 200 ml se asociaron con índices de recuperación de embriones inferiores que a un volumen de 10 ml, probablemente debido a la menor concentración de espermatozoides o a la pérdida retrógrada de espermatozoides en la vagina.

Se realizó un estudio para ensayar si el volumen solo afecta a la fertilidad cuando están presentes concentraciones y cantidades suficientes de espermatozoides. Se concluyó que no existían diferencias entre las yeguas inseminadas con 30 ó 120 ml de semen enfriado a una concentración de 50 x 10^{6} pms/ml. Sin embargo, este enfoque no es seguido por la presente invención hasta cierto punto.

El ritmo y la frecuencia de inseminación pueden jugar un papel muy importante en la mayoría de operaciones de reproducción, especialmente cuando está implicado semen congelado o enfriado durante el transporte. La cantidad y el ritmo de las inseminaciones pueden afectar en la fertilidad. La yegua promedio ovula cada 21 días durante la época de reproducción fisiológica y la duración promedio del estro durante este tiempo es de 5-7 días. Durante el estro, las yeguas orinarán pasivamente, levantarán su cola y presentarán sus cuartos traseros al semental. En condiciones naturales, cuando se introdujo un semental en una manada de 20 yeguas, el número de reproducciones por hora de observación fue de 2,4 \pm 0,2. Los sementales frecuentemente fecundan la misma yegua múltiples veces por día (en condiciones naturales). En un estudio, se sincronizaron 20 yeguas y se colocaron en un pasto con un semental y se observaron durante 9 días. El semental se apareó 9,12 veces por día y fecundó 17 de 18 yeguas.

Los investigadores también han recopilado datos sobre las épocas de reproducción múltiple comparando el efecto del número de inseminaciones en los índices de embarazo. Quedaron preñadas más yeguas cuando se inseminaron cinco veces (68%) más que las yeguas que se inseminaron tres veces (35,9%) durante el ciclo 1. No se observaron otras diferencias con respecto al número de inseminaciones en los índices de embarazo durante el ciclo 1. No había diferencias en los índices de embarazo durante los ciclos 2 y 3 cuando las yeguas se inseminaron de una a siete veces. Quedaron preñadas más yeguas cuando se inseminaron 5 veces (60%) que las yeguas inseminadas 1 (23,5%), 2 (35%) ó 3 veces (35,5%) durante 3 ciclos. Cuando se consideraron los 3 ciclos, las yeguas que quedaron preñadas se inseminaron un promedio de 3,3 veces, que era más que el promedio de 2,8 veces para yeguas que no quedaron preñadas.

También se ha determinado que las inseminaciones múltiples por ciclo no eran perjudiciales para la fertilidad. En un estudio, se recogieron datos de 257 yeguas durante un periodo de 10 años para establecer la relación entre el número de inseminaciones por ciclo, duración del estro y los índices de embarazo. Las yeguas se inseminaron con 100 x 10^{6} espermatozoides. Se consiguieron índices de embarazo en el primer ciclo de 22,0, 23,0, 38,6, 52,5, 58,3 y 52,2% cuando las yeguas se inseminaron 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o más veces por ciclo, respectivamente. Quedaron preñadas menos yeguas después de tres ciclos cuando se inseminaron de 1 a 4 veces por ciclo que las yeguas inseminadas 12 o más veces por ciclo. Otro estudio inseminó 62 yeguas durante tres ciclos cada 48 horas durante el estro con 200 x 10^{6} pms para un máximo de tres inseminaciones. Las inseminaciones se iniciaron cuando se detectó un folículo igual o mayor a 30 mm y se continuaron hasta la ovulación. La fertilidad por ciclo fue del 45% y no era diferente si se realizaban dos o más inseminaciones por ciclo en comparación con una inseminación por ciclo. También determinaron que los mayores índices de embarazo se consiguieron con inseminaciones realizadas entre 48 y 72 (8/23) ó 72 y 96 horas (8/23) antes de la ovulación y que la última inseminación no era la fecundativa como mínimo el 51% del tiempo. En conjunto, cuando se realiza una AI de rutina con sementales y yeguas fértiles, 500 x 10^{6} pms/dosis inseminados en días alternativos a la vez que las yeguas están en estro da lugar a una fertilidad máxima. Con la presente invención, ahora son posibles menores cantidades.

La inducción de la ovulación en un tiempo específico en la yegua puede ser ventajoso por las siguientes razones: asegurar que la ovulación tendrá lugar durante las 36-48 horas desde el apareamiento eliminando la necesidad de una nueva reproducción, (b) con la utilización de semen enfriado, congelado o sexuado cuando el ritmo es crítico a efectos de maximizar la fecundación, (c) asegurar que sólo una inseminación única próxima a la ovulación es necesaria cuando se utilizan sementales o yeguas subfértiles, (d) minimizar el transporte de yeguas o sementales, y (e) escalonar las ovulaciones cuando múltiples yeguas presentan el estro a la vez.

La gonadotropina coriónica humana (hCG) está producida por el citotrofoblasto del vello coriónico de la placenta humana. Es una hormona de glicoproteína compuesta de dos subunidades (a y \beta) que están unidas de forma no covalente. Tiene una vida media de 8-12 horas en la sangre.

La utilización de hCG para la inducción de la ovulación durante el ciclo estral de la yegua se describió por primera vez en 1937 por Mirskaja y Petropavloski. Encontraron que la ovulación tenía lugar durante las 24 y 48 horas después de la inyección de extracto crudo de orina de embarazada humana (Prolan®) inyectado en el primer día del estro. Estudios adicionales han demostrado que cuando se inyecta hCG (1500-3300 IU) en una yegua durante el estro temprano, mimetiza la actividad de la hormona luteinizante (LH) e induce la ovulación, generalmente durante 24-48 horas. La utilización de hCG en una dosis de 2000-3000 IU no ha disminuido la fertilidad. Sin embargo, algunos investigadores hallaron que dosis más elevadas (4500-6000 IU) daban lugar a trastornos reproductivos y a un menor índice de embarazo. Aunque la utilización de hCG puede ser muy eficaz en la inducción de la ovulación, varios investigadores han demostrado que la administración de hCG durante varios ciclos de estro consecutivos puede dar lugar a la formación de anticuerpos, con una duración promedio de estro y ovulación igual que en las yeguas de control o 2 días más que los controles.

La hormona de liberación de gonadotropina nativa (GnRH) es un decapéptido sintetizado en el hipotálamo y almacenado en gránulos secretores de la eminencia mediana. Tras la liberación, la GnRH entra en el sistema portal y es transportada a la pituitaria anterior y se une a receptores en las células gonadótropas donde se estimulan la síntesis y la secreción de la hormona luteinizante (LH) y la hormona de estimulación de folículos (FSH). La investigación también se ha realizado sobre la utilización de análogos de GnRH y GnRH nativo en los que se han modificado 1 ó 2 aminoácidos en la inducción de ovulación durante el estro en la yegua.

La administración pulsátil o continua de GnRH nativa provoca una ovulación predecible. En un estudio, se inyectaron 11 yeguas cíclicas con solución salina o 20 \mug de GnRH en un patrón pulsátil (un pulso de 5 s/h, 2 h ó 4 h) empezando en el día 16 del ciclo del estro. El número de días desde el inicio del tratamiento hasta la ovulación fue inferior en yeguas inyectadas con 20 \mug de GnRH/h en comparación con las yeguas de control con solución salina o 20 \mug de GnRH por 4 horas. Se concluyó que la inyección pulsátil de GnRH es eficaz en el avance de la ovulación, pero la frecuencia del pulso es una variable crítica. La GnRH nativa se ha utilizado también para inducir el desarrollo folicular y la ovulación en yeguas temporalmente anestras. Un implante a corto plazo que libera 1,5 ó 2,2 mg del análogo de GnRH deslorelina provoca la ovulación en 36-48 horas cuando se administra a yeguas en estro con un folículo con más de 30 mm de diámetro.

Uno de los inventores ha comparado el efecto de varias dosis de un implante de análogo de GnRH (acetato de deslorelina) en la inducción de la ovulación en yeguas cíclicas y ha hallado que la ovulación se indujo en la mayoría de yeguas dentro de 48 horas después de la inyección y que no existen ventajas en las dosis superiores a 2,2 mg/yegua. Otros han comparado la utilización de hCG, buserelina (un análogo de GnRH) y luprostiol (un análogo de PGF_{2}\alpha) en la inducción de la ovulación en yeguas cíclicas. Tanto la buserelina como la hCG acortaron el intervalo de tratamiento hasta la ovulación, mientras que el luprostiol no consiguió acelerar la ovulación.

El extracto pituitario equino (EPE) deriva de las glándulas de la pituitaria anterior equina. La preparación de EPE para la experimentación como gonadotropina cruda ha sido descrita por Braselton y McShan (1970), y más recientemente por Guillou y Combarnous (1983). EPE se ha utilizado en la yegua principalmente para inducir el crecimiento de folículos múltiples en yeguas cíclicas o anestras y para la superovulación en la oveja.

La utilización de extracto de pituitaria equina como agente ovulador en la yegua es conocida. En algunos estudios, se ha separado la hormona luteinizante equina (eLH) y la hormona de estimulación de folículos (eFSH) mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y se han realizado los experimentos. En un experimento, la actividad de LH en gonadotropina equina cruda (CEG) se comparó con la actividad de LH en la fracción de HIC en su capacidad para inducir la ovulación. De las 25 yeguas de control, 7 ovularon en 48 horas en comparación con 24/25 yeguas tratadas con CEG y 19/26 yeguas tratadas con LH. Se diseñó otro experimento para ensayar la capacidad de la fracción rica en eFSH de extracto de pituitaria para inducir el crecimiento de múltiples folículos en comparación con CEG. El número de folículos que alcanzaron los 30 mm era el mismo en grupos tratados con CEG frente a FSH y ambos grupos eran diferentes cuando se compararon con el grupo de control. Los índices de ovulación no eran diferentes entre los dos grupos de tratamiento, pero eran diferentes del grupo de control.

Históricamente, el método utilizado más habitualmente en la inducción de la ovulación es una inyección única de hCG. Aún sigue siendo el método más habitual. Sin embargo, dado que no existen diferencias en los índices de embarazo o el ritmo de la ovulación cuando se administra GnRh o hCG a yeguas cíclicas, cualquier tratamiento es un método aceptable para la inducción de la ovulación. Sin embargo, el EPE no está disponible comercialmente para los médicos y, por lo tanto, no es una técnica práctica para la inducción de la ovulación.

En condiciones de apareamiento naturales, el eyaculado equino se deposita directamente en el útero de la yegua. Spallanzani fue el primero en describir la inseminación artificial (AI) en perros y, a continuación, en caballos a finales de 1700. La utilización de la AI está documentada en ganado vacuno, ovejas, cerdas y caballos. Los caballos, el ganado vacuno y las cerdas se inseminan artificialmente en el cuerpo uterino; las ovejas, las cabras y las perras en el cérvix; y las gatas en la vagina anterior. En cuanto a los equinos, otros investigadores han descrito procedimientos de recogida seminal y de manipulación rutinarias en el caballo. Para los procedimientos de AI de rutina, el semen se deposita en el cuerpo uterino utilizando una pipeta y jeringa de inseminación estériles. Sin embargo, existen diversas razones para la utilización de sitios y técnicas alternativos para la inseminación artificial: a) inseminación de semen congelado descongelado de calidad baja o cantidad limitada, b) inseminación de semen de un padre subfértil o c) inseminación de semen sexuado, que es de cantidad limitada. Algunas técnicas de AI alternativas incluyen: inseminación intrauterina (mediante laparoscopia o técnicas no quirúrgicas) en aquellas especies en las que se llevan a cabo de forma rutinaria inseminaciones cervicales o vaginales, inseminación oviductal (mediante laparoscopia o laparotomía del flanco) o inseminación intrauterina profunda no quirúrgica.

La inseminación intrauterina laparoscópica ha evolucionado como la técnica menos invasiva para la deposición de semen directamente en el útero de las ovejas y las cabras desde principios de los años 70 cuando se desarrolló el equipo adecuado. La inseminación laparoscópica se realiza de forma rutinaria en la oveja y cabra con una fertilidad elevada en comparación con la AI tradicional. La inseminación intrauterina laparoscópica está descrita de manera satisfactoria en el hurón, gato doméstico, tigre, guepardo y leopardo, y más recientemente zarigüeya y wallaby. Algunas ventajas de la inseminación laparoscópica incluyen: la mejora genética utilizando semen congelado, el aumento de la cantidad de inseminaciones por recogida utilizando menores cantidades de esperma, y una fertilidad más elevada. La principal desventaja de la inseminación laparoscópica es el coste más elevado del equipo y el procedimiento (trabajo cualificado, fármacos, procesado del semen). Este procedimiento también es relativamente invasivo para el paciente.

La inseminación intrauterina no quirúrgica con ovejas se utiliza en un intento por aumentar los índices de fertilidad en especies que se inseminan habitualmente en el cérvix. Un investigador obtuvo un 75% de índice de paridero tras una inseminación intrauterina, en comparación con un 17% después de una inseminación cervical profunda, y un 30% después de una inseminación caudocervical doble. En otro estudio, un investigador depositó esperma de carnero congelado-descongelado en tres regiones del tracto genital de las ovejas. En el grupo 1, se realizó una inseminación intrauterina única, mientras que en el grupo 2 las ovejas se inseminaron una vez de forma profunda en el cérvix y en el grupo 3 las ovejas se inseminaron dos veces, 12 horas de diferencia, en la región caudocervical; los índices de concepción fueron 89, 45 y 57% respectivamente. Otros investigadores describieron resultados similares con la inseminación intrauterina. La inseminación endoscópica no quirúrgica también se ha realizado en perras dando lugar a índices de embarazo elevadas.

Con la inseminación oviductal (OI), se insemina quirúrgicamente un pequeño volumen de semen (habitualmente 0,05-0,5 ml) en el lumen oviductal. En un estudio se inseminaron nueve cerdas utilizando inseminación laparoscópica. Dos de las nueve cerdas (22%) quedaron preñadas a partir de una única inseminación. Un estudio más reciente en la oveja determinó los efectos de la cantidad de espermatozoides, el ritmo y el sitio de inseminación sobre la fertilidad. En el experimento 1, las ovejas se inseminaron con 10^{4}, 10^{5}, 10^{6} o 10^{7} espermatozoides. Los óvulos recuperados 48 horas después se clasificaron como fecundados si se habían dividido. Los resultados mostraron que había más ovejas fértiles después de la inseminación oviductal que después de la inseminación intrauterina (61 frente a 39%) y con dosis elevadas (10^{6} y 10^{7}) en lugar de dosis bajas (10^{4} y 10^{5}) de espermatozoides para inseminaciones intrauterinas, pero no para oviductal. Los investigadores en nuestras instalaciones han conseguido por primera vez la utilización de OI para obtener embarazos en la yegua. Se inseminaron catorce yeguas mediante OI con 50 x 10^{3} pms y 15 se inseminaron mediante AI intrauterina con 500 x 10^{6} pms. Los índices de embarazo no eran diferentes entre los grupos 3/14 (21,4%) y 6/15 (40%), respectivamente. La inseminación oviductal se ha utilizado de forma satisfactoria para obtener embarazos en mujeres y conejos.

En vacas, el sitio de deposición seminal durante la inseminación artificial durante las últimas cuatro décadas ha sido el cuerpo uterino. Ésta es una técnica aceptable cuando hay disponible para la inseminación grandes cantidades de espermatozoides fértiles, pero para equinos - especialmente cuando están disponibles cantidades limitadas de espermatozoides - se ha desarrollado un enfoque alternativo. La inseminación intrauterina profunda es una técnica que se ha utilizado para obtener embarazos en el ganado vacuno. Un estudio comparó los índices de embarazo para AI cuando el semen se depositó en el cuerpo uterino o en ambos cuernos uterinos (inseminación córnea). El índice de embarazo cuando el semen de depositó en el cuerpo uterino fue del 44,7% en comparación con el 64,6% con la inseminación córnea. Sin embargo, no todos los estudios muestran una ventaja con esta técnica de inseminación.

Tal como muestra la presente invención, puede haber una congruencia de métodos de sexuación de esperma en base al contenido de ADN, clasificadores de células/citometría de flujo de alta velocidad y procedimientos para la inseminación de equinos con menos de veinticinco millones de espermatozoides totales sin comprometer la fertilidad que pueden dar lugar a la posibilidad de una industria viable de semen no quirúrgico e incluso sexuado en equinos. De forma interesante, en lugar de la inseminación en el interior del cuerpo uterino en el que la inseminación tiene lugar habitualmente, mediante la inseminación profunda en el interior del cuerno uterino de la yegua se pueden conseguir mejores resultados. Por profundo, debería entenderse que la inserción tiene lugar bien adentro del cuerno uterino. Se puede realizar, aunque no es necesario, utilizando un equipo de transferencia de embriones.

Como resultado de la inseminación, se desea naturalmente que se produzca un animal del sexo deseado. Este animal se puede producir según los sistemas descritos anteriormente mediante la utilización de la especie de esperma sexuado. También debería entenderse que las técnicas de la presente invención pueden encontrar aplicación en otras técnicas, tales como la inseminación laparoscópica, la inseminación oviductal, o similares. Como ejemplos, se han realizado los siguientes experimentos. Aunque no todos utilizan cada aspecto de las invenciones descritas en el presente documento, y no muestran todas las mejoras en el rendimiento de la presente invención, muestran algunas mejoras posibles a través de los diferentes aspectos de la presente invención.

Yeguas.- Se utilizaron sesenta y una yeguas cíclicas reproductivamente normales de razas de caballo claro, con una variación de edad entre 3 y 15. A las yeguas se les administró cloprostenol (250 \mul i.m.) para inducir la luteólisis y se examinaron por palpación y ultrasonografía del tracto reproductivo por el recto, en días alternativos hasta que se detectó un folículo mayor a 30 mm y, a continuación, diariamente hasta la ovulación. Una vez la yegua ha desarrollado un folículo igual o mayor de 35 mm, se le administró subcutáneamente un implante de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) (acetato de deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge, IA), y se le asignó a uno de los tres grupos de tratamiento.

Grupo de tratamiento 1 - Las yeguas se inseminaron en una única ocasión con 500 x 10^{6} pms en un volumen de 20 ml (25 x 10^{6} pms/ml), 40 horas (n = 9) ó 34 horas (n = 1) después de la administración de GnRH. El semen se depositó en el cuerpo uterino utilizando una pipeta de plástico flexible para la inseminación artificial (AI) (IMV, Francia).

Grupo de tratamiento 2 - Las yeguas se inseminaron en una única ocasión con 25 x 10^{6} pms en un volumen de 1 ml (25 x 10^{6} pms/ml), 40 horas (n = 13) ó 34 horas (n = 8) después de la administración de GnRH. El semen se depositó en la punta del cuerno uterino, ipsilateral al folículo preovulatorio, utilizando una pipeta de plástico flexible para AI. La localización de la pipeta en el útero se confirmó mediante ultrasonografía transrectal antes de la deposición del semen.

Grupo de tratamiento 3 - Las yeguas se inseminaron en una única ocasión con 5 x 10^{6} pms en un volumen de 1 ml (5 x 10^{6} pms/ml), 40 horas (n = 10) ó 0,2 ml (25 x 10^{6} pms/ml), 34 horas (n = 10) después de la administración de GnRH. Las yeguas que recibieron 1 ml se inseminaron con una pipeta de plástico flexible para AI, mientras que las yeguas que recibieron 0,2 ml se inseminaron utilizando una pistola para implantes desechable (Veterinary Concepts, Green Valley, WI) que contenía una paja de plástico de 0,5 ml. Se utilizaron diferentes pipetas de inseminación para optimizar la liberación de los dos volúmenes diferentes. El semen se depositó en la punta del cuerno uterino, ipsilateral al folículo preovulatorio. La localización de pipetas en el interior del útero se confirmó mediante ultrasonografía transrectal antes de la deposición del semen.

Después de la inseminación, se examinaron las yeguas diariamente para determinar el día de ovulación. Los exámenes de embarazo se realizaron mediante ultrasonografía en los días 12, 14 y 16 posteriores a la ovulación.

Los índices de embarazo no eran diferentes entre dos sementales de raza arábiga (Semental A = 22/31, 71%; Semental B = 15/30, 50%) (P > 0,1) o entre yeguas fecundadas 34 frente a 40 horas después de la inseminación de GnRH (19/29, 65% y 18/32, 56%, respectivamente) (P > 0,1), de manera que se combinaron los grupos de datos. Tal como se muestra en la Tabla 1, las yeguas fecundadas con 500 x 10^{6} pms en un volumen de 20 ml tenían un índice de embarazo significativamente superior (P < 0,05) que las yeguas fecundadas con 25 ó 5 x 10^{6} pms (Tabla 1). No había diferencias significativas (P > 0,05) en los índices de embarazo entre yeguas fecundadas con 25 x 10^{6} pms y yeguas fecundadas con 5 x 10^{6} pms en un volumen de 1 ó 0,2 ml. Aunque la fertilidad era significativamente superior con 500 x 10^{6} pms cuando se comparaba con el Grupo 2 (25 x 10^{6} pms), se consiguió un índice inicial del 57% con una única inseminación. Éste no era diferente de los índices de embarazo conseguidos con el Grupo 3 (5 x 10^{6} pms), 7/20 (35%).

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TABLA 1 Índices de embarazo a partir de una única inseminación

1

El ritmo de la inseminación en relación con la administración de GnRH cambió de 40 a 34 horas después de GnRH durante el experimento, ya que muchas yeguas ovulaban antes de la inseminación planeada y, por lo tanto, no se inseminaron. Se excluyeron los datos de los ciclos de 22 yeguas (26,5%), ya que ovulaban antes de la inseminación planeada (n = 11), no ovularon (n = 3) u ovularon más de 4 días después de la administración de GnRH (n = 8).

La cantidad óptima de espermatozoides generalmente recomendada por dosis de inseminación es de 500 x 10^{6} pms en días alternativos mientras que la yegua está en estro. Sin embargo, tal como se ha mencionado anteriormente, se han realizado estudios que han mostrado que no hay un descenso en la fertilidad cuando se inseminan con 100 x 10^{6} espermatozoides móviles en comparación con 500 x 10^{6} espermatozoides móviles. Los estudios con 50 x 10^{6} espermatozoides móviles han mostrado un descenso en la fertilidad en comparación con 100 y 500 x 10^{6}. Otros estudios han mostrado que a medida que aumenta el número de inseminaciones, aumenta la fertilidad. Desafortunadamente, los resultados de estos estudios han sido algo inconsistentes. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a conseguir la menor cantidad de espermatozoides necesarios para disponer de un índice de embarazo razonable cuando se administra en una única ocasión, próxima a la ovulación.

En el Grupo 3, se inseminaron 20 yeguas con 5 x 10^{6} pms en un volumen de 1 ml (5 x 10^{6} pms/ml) (n = 10) o un volumen de 0,2 ml (25 x 10^{6} pms/ml) (n = 10). Se compararon los índices de embarazo entre los dos subgrupos, ya que se ha descrito que los índices de embarazo disminuyen cuando se diluye el semen hasta una concentración de esperma inferior a 25 x 10^{6}/ml. Sin embargo, en este experimento, no existían diferencias en la fertilidad entre las dos concentraciones de esperma.

Si una yegua ya hubiera ovulado en base a la palpación rectal y el examen de ultrasonidos la mañana del día de la inseminación planeada, no se inseminaría. En cambio, se administraría cloprostenol (250 \mug) 5 días después de la ovulación para inducir a la luteólisis, de manera que se pudiera volver a utilizar. Los embarazos terminaron en el día 16 mediante la localización por ultrasonografía transrectal y la rotura de la vesícula embrionaria. A continuación, se administró cloprostenol (250 \mug i.m.) para inducir la luteólisis, de manera que se pudieran volver a utilizar.

El semen se depositó en la punta del cuerno uterino para las dos dosis inferiores en este experimento. La deposición seminal profunda en el cuerno uterino es particularmente útil cuando se utilizan cantidades bajas de esperma en un volumen bajo. La pipeta flexible de inseminación se colocó en el útero por la vagina y, a continuación, se guió lentamente hasta la punta del cuerno uterino deseado mediante manipulación suave por el recto. La localización de la pipeta se confirmó mediante palpación transrectal y examen por ultrasonidos.

Se realizó un pequeño estudio adicional al final de la época de reproducción utilizando cinco yeguas y uno de los mismos dos sementales. El objetivo del estudio fue determinar los índices de embarazo con 25 x 10^{6} pms depositados en el cuerpo uterino. Tres de las cinco yeguas (60%) inseminadas en una única ocasión con 25 x 10^{6} pms 40 horas después de la administración de GnRH estaban embarazadas el día 16.

En resumen, los resultados de estos experimentos mostraron que un índice de embarazo en el día 16 del 57% se conseguía con una inseminación única, próxima a la ovulación, con 25 x 10^{6} pms cuando se deposita de forma profunda en el cuerno uterino.

Los objetivos de los experimentos siguientes eran 1) determinar los índices de embarazo tras la inseminación con 25 x 10^{6} espermatozoides sexuados vivos clasificados depositados en la punta del cuerno uterino ipsilateral al folículo preovulatorio y 2) comparar los índices de embarazo para el semen clasificado en un extensor de leche desnatada con o sin yema de huevo.

Yeguas - Se utilizaron diecisiete yeguas cíclicas reproductivamente normales de razas de caballo claro, con una variación de edad entre 5 y 12 años. A las yeguas se les administró cloprostenol (250 \mul i.m.) para inducir la luteólisis y se examinaron por palpación y ultrasonografía del tracto reproductivo por el recto, en días alternativos hasta que se detectó un folículo mayor a 30 mm y, a continuación, diariamente hasta la ovulación. Una vez la yegua desarrolló un folículo igual o mayor de 35 mm, se le administró subcutáneamente un implante de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) (acetato de deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge, IA), y se le asignó aleatoriamente uno de los dos grupos de tratamiento.

Grupo A de tratamiento - Las yeguas (n = 11) se inseminaron en una única ocasión con \sim25 x 10^{6} espermatozoides clasificados vivos en un volumen de 1 ml (25 millones/ml), 34 horas después de la administración de GnRH. Los espermatozoides se clasificaron en un extensor de semen de leche desnatada comercial (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) y el mismo extensor se añadió después de centrifugación como tampón posterior a la centrifugación para ajustar la concentración del esperma a 25 x 10^{6} ml. El esperma se depositó en la punta del cuerno uterino, ipsilateral al folículo preovulatorio, utilizando una pipeta de plástico flexible para AI (IMV, Francia). La localización de la pipeta en el útero se confirmó mediante ultrasonografía transrectal antes de la deposición del semen. Una yegua se inseminó con 20 x 10^{6} espermatozoides clasificados vivos debido a las restricciones de tiempo con el citómetro de flujo. Una yegua no consiguió ovular y se excluyó del estudio.

Grupo B de tratamiento - Las yeguas (n = 10) se inseminaron en una única ocasión con \sim25 x 10^{6} espermatozoides clasificados vivos en un volumen de 1 ml (25 millones/ml), 34 horas después de la administración de GnRH. Una yegua se inseminó con 20 x 10^{6} espermatozoides clasificados vivos debido a las restricciones de tiempo con el citómetro de flujo. Los espermatozoides se clasificaron en el mismo extensor de semen comercial más un 4% de yema de huevo, y el mismo extensor se añadió después de centrifugación como tampón posterior a la centrifugación para ajustar la concentración del esperma. El esperma se depositó en la punta del cuerno uterino, ipsilateral al folículo preovulatorio, utilizando una pipeta de plástico flexible para AI. La localización de la pipeta en el útero se confirmó mediante ultrasonografía transrectal antes de la deposición del semen.

Después de la inseminación, las yeguas se examinaron en una base diaria para determinar el día de la ovulación. Los exámenes de embarazo se realizaron mediante ultrasonografía en los días 12, 14, 16 y 30 y posteriormente a la ovulación y los fetos se sexuaron el día 60.

Recogida y preparación de semen - En este experimento se utilizaron dos sementales de raza árabe y fertilidad elevada conocida, uno de los cuales (Semental A) se utilizó en el Experimento 1. El semen se recogió la mañana de la inseminación planeada con una vagina artificial modelo "Colorado" (Animal Reproductions Systems, Chino, CA) equipado con un filtro de gel en línea. En los eyaculados se evaluaron el volumen libre de gel, la movilidad y la concentración de espermatozoides. El semen se extendió 1:1 en HBGM-3 con BSA y en unos minutos, se transportó a temperatura ambiente al laboratorio para el posterior procesado. El semen se centrifugó durante 10 minutos a 400 x g a 22ºC para concentrar el esperma de forma elevada. Después de la centrifugación, se aspiró el sobrenadante, dejando un gránulo de esperma blando. La concentración de espermatozoides se determinó utilizando un densímetro (Animal Reproduction Systems, Chino, CA) y los espermatozoides se diluyeron posteriormente hasta 400 x 10^{6}/ml en HBGM-3 en un volumen total de 1 ml, y se tiñeron con 25 \mul de Hoechst 33342 (5 mg/ml de agua). Se prepararon un total de 8 muestras y se incubaron a 34ºC durante 1 hora. A continuación, las muestras teñidas se diluyeron hasta 100 x 10^{6}/ml con 3 ml de HBGM-3. Se añadió colorante alimenticio (2 \mul/ml de FD&C#40 al 1% en HBGM-3) a cada uno de los ocho tubos de muestra dando lugar a un volumen total de 4 ml. A continuación, las muestras se filtraron a través de un aparato de 1 ml con un filtro de 40 micras en tubos de 6 ml de polipropileno y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que se clasificaron por su ADN aproximadamente 25 x 10^{6} espermatozoides vivos mediante citometría de flujo. Se utilizó un láser de argón, que emite a 150 mW a 351 y 364 nm, en cada uno de los dos clasificadores de células/citómetro de flujo MoFlo® modificados para la clasificación de esperma, trabajando a 50 psi con HBGM-3 sin BSA como fluido envolvente. Los espermatozoides se recogieron a aproximadamente 900 espermatozoides/segundo en un total de 6 tubos de polipropileno (14 ml en cada uno) que contenían 4 ml de captador de fluido antes del inicio de la clasificación de EZ-Mixin® o un 4% de yema de huevo en EZ-Mixin®. Cuando había dos yeguas disponibles para la inseminación en el mismo día, se recogió el esperma enriquecido en los cromosomas X e Y. El contenido de los tubos se mezcló cada 30 minutos durante la clasificación. Después de la clasificación, el esperma de los dos citómetros de flujo se agrupó, se colocó en tubos de centrífuga de 50 ml y se centrifugaron durante 20 minutos a 1200 x g a 22ºC. A continuación, el sobrenadante se aspiró hasta obtener un gránulo de esperma de 200 \mul, y se añadieron 100 \mul de tampón posterior a la centrífuga o EZ-Mixin® CST (Animal Reproduction Systems, Chino, CA) o 4% de leche desnatada-yema de huevo al gránulo y se transfirió a un tubo Falcon de 50 ml pesado previamente. Se realizó un recuento con hemacitómetro para determinar la concentración final de espermatozoides/ml. El volumen de espermatozoides en el tubo Falcon x concentración de espermatozoides/ml era igual a la cantidad total de espermatozoides recuperados. A continuación, se diluyeron las muestras hasta un total de 25 x 10^{6} espermatozoides clasificados vivos en un volumen de 1 ml que se utilizó para la inseminación.

Reanálisis del contenido de ADN del esperma - El contenido de ADN relativo del esperma intacto clasificado utilizado para la inseminación se determinó mediante un análisis citométrico de flujo de los núcleos de esperma de una muestra que contenía menos de 0,5 ml de cada uno de los respectivos lotes recogidos al final del día. Los núcleos del esperma se prepararon a partir de una parte alícuota de esperma clasificado intacto mediante sonicación durante 3 segundos con un Ultrasonic Dismembrator 60 (Fisher Scientific) ajustado en el ajuste # 2 (aproximadamente 1 vatio). La proporción de esperma portador de X e Y se determinó mediante el ajuste de un par de distribuciones Gausianas a los histogramas del detector a 0º (Johnson y otros, 1987b). El reanálisis del ADN indicó una pureza de clasificación promedio del 90% para el esperma portador de X y del 84% para el esperma portador de Y para las 17 clasificaciones.

Determinación del sexo fetal - Se sexuaron fetos de yeguas preñadas 60-70 días después de la ovulación mediante ultrasonografía transrectal sin el conocimiento del sexo del esperma inseminado clasificado. Para la determinación del sexo se utilizó un escáner de ultrasonidos de tiempo real (Aloka 500®) equipado con un transductor de 5 MHz de selección lineal. El género del feto se puede determinar con precisión (hasta un 99%) en caballos y ganado vacuno mediante la identificación y la localización del tubérculo genital (Curran, 1998).

Análisis Estadístico - Los datos se analizaron utilizando el Test Exacto de Fishers.

En la Tabla 2 se muestran los índices de embarazo en el día 16. Los índices de embarazo no eran diferentes entre sementales (Semental A = 3/10, 30%; Semental B = 5/10, 50%) (P > 0,1), de modo que se combinaron los grupos de datos. No había diferencia estadística en los índices de embarazo entre los tratamientos del esperma (EZ-Mixin = 3/10, 30% frente a 4% yema de huevo + EZ-Mixin = 5/10, 50%) (P > 0,1) aunque este resultado puede no ser siempre cierto. Se predijo la proporción de sexo fenotípico con perfecta exactitud, cinco de cinco.

Tres yeguas perdieron sus crías en algún momento entre los días 16-60 después de la ovulación, de manera que el sexo del feto no pudo determinarse. Una yegua inseminada con espermatozoides portadores de X fue sacrificada en el día 66 de gestación debido a un problema gastrointestinal. Se detectó un feto hembra fenotípicamente normal (el sexo correcto) en la necropsia.

TABLA 2 Índices de embarazo tras la inseminación con 25 x 10^{4} espermatozoides sexuados

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Resultados: Se han realizado muchos intentos durante los últimos 80 años para separar el esperma portador de los cromosomas X e Y. La citometría de flujo/clasificación celular es el único método no destructivo que tiene un registro probado de su precisión en la identificación del esperma portador de los cromosomas X e Y, haciendo posible de este modo alterar la proporción del sexo según se desee. Se ha separado el esperma mediante la citometría de flujo/clasificación celular para obtener el embarazo después de la inseminación quirúrgica en las siguientes especies: conejos, cerdos y caballos. En estos experimentos se escogió la inseminación quirúrgica debido a la necesidad de minimizar las cantidades de esperma debido a la lenta velocidad de clasificación de flujo (\sim100 espermatozoides/s.) del esperma portador de X e Y y a la aparente necesidad de grandes cantidades de esperma para establecer el embarazo. La producción de esperma portador de X e Y por unidad de tiempo mediante medios de clasificación de alta velocidad y una boquilla de orientación desarrollada recientemente han incrementado las velocidades de clasificación hasta 10-12 veces más que las velocidades anteriores. Esta tecnología ha incrementado el número de espermatozoides clasificados por unidad de tiempo y ha permitido a los investigadores obtener embarazos resultantes de inseminación intrauterina no quirúrgica en ovejas y ganado vacuno.

El presente estudio fue el primero en obtener embarazos viables en el caballo siguiendo la inseminación intrauterina no quirúrgica con semen sexuado. El índice de embarazo en el día 16 después de la inseminación de 25 x 10^{6} espermatozoides sexuados (40%), no fue estadísticamente diferente (P > 0,1) del de las yeguas en el Experimento 1 inseminadas con 25 x 10^{6} espermatozoides progresivamente móviles no clasificados (57%). La técnica de inseminación fue la misma en ambos experimentos. Se utilizaron las mismas yeguas y técnicos en ambos experimentos. Además, ambos experimentos se llevaron a cabo durante la misma época de reproducción, en el mismo momento del año.

Los índices de embarazo experimentales iniciales fueron ligeramente menores con el semen sexuado probablemente debido a la cantidad de tiempo que requiere clasificar 25 x 10^{6} espermatozoides y el posible daño al esperma durante el proceso. En los experimentos, el tiempo promedio desde la recogida del semen hasta la inseminación fue de 7 horas. En el primer experimento, se inseminaron las yeguas casi inmediatamente después de la recogida del semen. El promedio total y la movilidad progresiva de los espermatozoides sexuados fueron del 69 y el 38% respectivamente, y se recogieron para la inseminación un total de solamente 25 x 10^{6} células de espermatozoides clasificados vivos. El proceso de clasificación es un proceso muy estresante para el esperma. Los espermatozoides se bombean a través de un tubo fino a alta presión que los hace salir a \sim100 km/h, y se guardan a temperatura ambiente durante horas hasta que se recogen las cantidades adecuadas de espermatozoides. Los espermatozoides se incuban durante una hora a 35ºC con Hoechst 33342, que tiene una gran afinidad por las regiones ricas en AT del ADN y, a continuación, se exponen a luz láser ultravioleta a 351 y 364 nm. A diferencia de muchos colorantes específicos del ADN, Hoescht 33342 no se intercala en la hélice del ADN. A pesar de que ninguno de estos procesos es propicio para la salud de los espermatozoides, no se tiene constancia de un aumento de las incidencias de anormalidades genéticas en los cientos de crías que se han obtenido utilizando esta tecnología.

De interés complementario es el hecho de que otros investigadores han propuesto otra posible explicación de los índices de embarazo más bajos con semen sexuado. Hallaron que el primer ciclo celular se retrasó en embriones de conejo fecundados por espermatozoides tratados con Hoechst 33342. Desafortunadamente, el mecanismo no es conocido, pero podría ser debido a la interferencia de las moléculas de colorante a medida que se replica o se transcribe el ADN. También se ha descrito la menor supervivencia de embriones en el esperma clasificado por flujo.

Tres de las ocho yeguas (38%) inseminadas con semen sexuado perdieron sus crías entre los días 16 y 60. Dos de estas yeguas desarrollaron vesículas embrionarias que parecían normales hasta el día 16. A continuación, las vesículas disminuyeron de tamaño hasta que no estar más presentes. Una de las tres yeguas desarrolló un embarazo viable con un feto visible mediante el latido del corazón. Se observó que el feto estaba vivo en el día 35, pero se perdió por el día 50. Con semen nuevo, no clasificado, se ha observado que la pérdida embrionaria temprana era del 9% en el día 14 y hasta el 16% de promedio entre los días 20 y 50. Se utilizó un procedimientos de tinción y clasificación del esperma en los presentes experimentos. Es posible que el esperma equino sea más sensible a los procedimientos de tinción y clasificación que el esperma bovino.

En resumen, la presente invención ha demostrado por primera vez que se puede conseguir el embarazo en la yegua y se pueden obtener potros de sexo predeterminado mediante la deposición de una cantidad baja de espermatozoides en la punta del cuerno uterino de la yegua. El sexuado del esperma de mamífero se aleja de una técnica de investigación y puede estar ahora disponible para programas de AI equina comercial. Además, tal como se ha mencionado y tal como se puede observar a partir de varios experimentos, el campo tiene base estadística y, de este modo, se pueden realizar una serie de experimentos adicionales para poner de manifiesto adicionalmente la combinación apropiada y las estrategias de limitación.

Finalmente, mediante este documento - especialmente las reivindicaciones - a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprenden" o "que comprenden" se entenderán que implican la inclusión de un elemento indicado o grupo de elementos, pero sin la exclusión de cualquier otro elemento o grupo de elementos.

Claims (13)

1. Método de producción de un équido que comprende las etapas de:

a. determinar un tiempo estimado de estro de un équido hembra, teniendo dicho équido hembra dos cuernos uterinos, teniendo cada cuerno uterino una punta y un folículo, y teniendo una vagina, un útero y un recto;

b. recoger las células de esperma equino de un équido macho;

c. establecer una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho;

d. establecer una sonda flexible que tiene un recipiente de esperma;

e. colocar dicha sonda flexible en la vagina de dicho équido hembra;

f. manipular dicha sonda flexible en dicho útero de dicho équido hembra;

g. guiar dicha sonda flexible en un cuerno uterino de dicho équido hembra; y

h. manipular suavemente dicha sonda flexible por el recto a medida que se guía de forma profunda en dicho cuerno uterino de dicho équido hembra hasta una localización profunda en dicho cuerno uterino de dicho équido hembra próximo a la punta de dicho cuerno uterino;

i. inseminar artificialmente dicho équido hembra;

j. fecundar por lo menos un óvulo equino en dicho équido hembra; y

k. producir un équido cría.

2. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicha especie macho de dicho équido comprende las etapas de:

a. determinar la característica sexual de un conjunto de dichas células de esperma equino; y

b. clasificar dichas células de esperma equino según la determinación de su característica sexual,

y en el que dicha etapa de producción de una cría de equino mamífero comprende la etapa de producir una cría de équido del sexo deseado.

3. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 2, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho, comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho y que tiene una cantidad baja de dichas células de esperma equino en relación con la dosis de inseminación artificial habitual.

4. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 3, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho y que tiene una cantidad baja de dichas células de esperma equino en relación con la dosis de inseminación artificial habitual, comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho y que tiene una cantidad baja de dichas células de esperma equino en relación con la dosis de inseminación artificial habitual seleccionada del grupo que consiste en: una muestra de inseminación equina de no más de aproximadamente cinco millones de células de esperma, y una muestra de inseminación equina de no más de aproximadamente veinticinco millones de células de esperma.

5. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 4, en el que dicha etapa de fecundación de, como mínimo, un óvulo equino en dicho équido hembra comprende la etapa de fecundar, como mínimo, un óvulo equino en dicho équido hembra en niveles de éxito estadísticamente comparables con la dosis de inseminación artificial habitual.

6. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 5, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho y que tiene una cantidad baja de dichas células de esperma equino en relación con la dosis de inseminación artificial habitual, comprende las etapas de:

a. teñir dichas células de esperma equino;

b. clasificar según dicho sexo de dichas células de esperma equino mediante la utilización de citometría de flujo de alta velocidad; y

c. concentrar dichas células de esperma equino clasificadas.

7. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 6, en el que dicha etapa de clasificación según dicho sexo de dichas células de esperma equino mediante la utilización de citometría de flujo de alta velocidad, comprende la etapa de recoger los espermatozoides vivos del sexo deseado a la velocidad de, como mínimo, novecientos espermatozoides vivos por segundo.

8. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 6, en el que dicha etapa de clasificación según dicho sexo de dichas células de esperma equino mediante la utilización de citometría de flujo de alta velocidad, comprende la etapa de operar con un clasificador de células de alta velocidad a una presión de, como mínimo, cincuenta libras por pulgada cuadrada.

9. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 1, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho, comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho y que tiene una cantidad baja de dichas células de esperma equino en relación con la dosis de inseminación artificial habitual.

10. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 9, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho y que tiene una cantidad baja de dichas células de esperma equino en relación con la dosis de inseminación artificial habitual, comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho y que tiene una cantidad baja de dichas células de esperma equino en relación con la dosis de inseminación artificial habitual seleccionada del grupo que consiste en: una muestra de inseminación equina de no más de aproximadamente cinco millones de células de esperma, y una muestra de inseminación equina de no más de aproximadamente veinticinco millones de células de esperma.

11. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 4, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que tiene un volumen seleccionado del grupo: 0,2 ml ó 1 ml.

12. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 7, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que tiene un volumen seleccionado del grupo: 0,2 ml ó 1 ml.

13. Método de producción de un équido, según se describe en la reivindicación 10, en el que dicha etapa de establecimiento de una muestra de inseminación equina que contiene, como mínimo, algunas de dichas células de esperma equino de dicho équido macho comprende la etapa de establecer una muestra de inseminación equina que tiene un volumen seleccionado del grupo: 0,2 ml ó 1 ml.