JP2552582B2 - 子の性の前選択の方法 - Google Patents

子の性の前選択の方法

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JP2552582B2 JP2507796A JP50779690A JP2552582B2 JP 2552582 B2 JP2552582 B2 JP 2552582B2 JP 2507796 A JP2507796 A JP 2507796A JP 50779690 A JP50779690 A JP 50779690A JP 2552582 B2 JP2552582 B2 JP 2552582B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 この発明は、精子を、DNA含有量における差異に基づ
いてＸとＹ染色体を担持する精子に分別することによ
り、子の性を前選別する方法に関する。
従来技術の記述 動物の性は家畜類の生産者にとっては重要である。酪
農家は、殆どの雄の子ウシを利用しないので、雌ウシだ
けを生産するための性別にした精子の使用は、効率の低
い生産をもっと効果的なものにするであろう。ブタの生
産者は、もし彼らが雌ブタだけを市場に出すことができ
るならば、ブタをより効果的に生産するであろう。とし
うのは、雌の方が雄より速く成長するからである。
肉牛とヒツジの種類では、雄の方が雌より早い速度で
成長するので、雄の方が肉の生産には好ましい。
これに加えて、雄または雌を特定することが可能であ
ることは、遺伝的改善の要する時間を短縮するに違いな
い。というのは、望ましい特性は、一方の親または他方
の親に頻繁に随伴するからである。ウシの子の性の計画
は、限定された基礎手順に立って既に実施されている。
この手順は、雌ウシから胎児を取り出し、それらの潜在
的性を同定し、そして望ましい性だけの胎児を再移植す
ることからなる。しかし、精子を人工受精に使用する前
に、雄を産出するそして雌を産出する群に分別すること
ができたならば、胎児移植による生産される子の全体的
価値を高めることができるであろう。
全ての生物は、対の染色体の一組をもっており、この
染色体は生命を維持しそして新しい生命を生み出すのの
にも必要な遺伝子物質の全てを担っている。
一対以外の全染色体は、常染色体と呼ばれ、皮膚、毛
髪および眼の色、成体の大きさそして身体の特徴のよう
な全身の全特徴のための遺伝子を担っている。残りの一
対を性遺伝子と呼ぶ。それらは性を特定する遺伝子物質
を担っている。一つの性染色体をＸ、他をＹと呼ぶ。
雄からの精子または雌からの卵は、常染色体の各対の
一方を持つ；これに加えて、哺乳動物では卵は常のＸ染
色体を含有し、一方精子は常にＸまたはＹ染色体のいず
れかを持つ。
精子と卵が一体になりそして精子がＹ染色体を担って
いると、子は雄（XY）である；しかし、もし精子が卵と
一体になる時にＸ染色体を担うと、その結果である子は
雌（XX）である。
今までに既知であり、そして科学的に明瞭であると証
明されている、ＸとＹ精子の間の確立されたそして測定
できる差異は、デオキシリボ核酸（DNA）含有量におけ
るそれらの差異である。Ｘ染色体はＹ染色体より、より
大きくそして僅かにより多いDNAを含有する。Ｘ担持精
子とＹ担持精子の間の全DNAの差異は、雄ブタでは3.4
％、雄ウシでは3.8％、そして雄ヒツジでは4.2％であ
る。
精子細胞におけるDNAの含有量は、殆どの正常体細胞
におけるのと同じように、安定している。従って、各々
の精子のDNA含有量は追跡できて、Ｘ担持精子とＹ担持
精子を識別するのに使用できる。
全ての哺乳動物の性遺伝子におけるDNA量における差
異は科学的にしか明瞭にされていないので、Ｘ担持精子
とＹ担持精子の間の測定可能な差異、染色体の構成［マ
ルジ,J.Reprod.Fertile.57:319（1979）］および／また
はDNA量の測定［ピンケル他（１）,Science 218:904（1
982）；ピンケル他（２）,Cytometry 3:1（1982）；ジ
ョンソンとピンケル,Cytometry 7:268（1986）；ジョン
ソン他（１）,Gam.Res.16:1（1987）；ジョンソン他
（２）,Gam.Res.17:203（1987）］だけが、精子群の性
生産の能力を決定するための繁殖以外に証明できる手段
である。文献は、性別にしたと主張している多くの物理
的、生化学的、および機能的方法が記述されている［ア
マンとセイデル、「Procpect for Sexing Mammalian Sp
erm」,Colorado Assoc.Univ.Press,Boulder（198
2）］；これらの方法の若干は、相対的なDNA含有量のた
めに試験されている［ピンケル他.,J.Anim.Sci.60:1303
（1985）ジョンソン（１）,Theriogenology 29:265（19
88）］．しかし、管理した試験では、子の性比に実際に
影響することが証明されなかった。
前の研究では、ＸおよびＹ染色体を担う精子の間のDN
A含有量における差異を繰り返し測定し、精液の試料の
精子の性比を予測できることを示している［ジョンソン
とピンケル、上記を参照；ジョンソン他（１），上記を
参照；ジョンソン他（２），上記参照；ジョンソン
（１），上記を参照；ジョンソン（２）,Cytometry,Sup
pl.2:66（Abstract）（1988）］． DNA含有量に基づいたＸとＹ精子の分別による証明で
きる分離をハタネズミ［ピンケル他（１），上記を参
照；ジョンソン，「“Beltsville Symposia in Agricul
tural Reaearch X,“P.C.Augustine,H.D.Danforth,＆,
M.R.Bakst（eds.）Martinus Nijhoff,Boston,」中,121
−134頁（1986）］およびチンチラ（chinchilla）［ジ
ョンソン他（１），上記を参照］については実施してあ
る。しかし、調製の手順がDNAの生存能力に損傷を及ぼ
す。若干数の哺乳動物（雄ウシ、雄ブタ、雄ヒツジ、ハ
タネズミ、チンチラ）種からの精子核を分別して、92な
いし99％の範囲の純度でＸおよびＹ担持染色体群に分別
することは実施された［ジョンソンおよびクラーク、Ga
m.Res.21:335（1988）］． 核の解縮合（decondensation）と生殖核の発達は、分
別したＸまたはＹを担う雄ウシ、雄ブタ、または雄ヒツ
ジの精子［ジョンソンとクラーク、上記を参照］で微注
入したハムスター卵中で示された。
発明の概要 哺乳動物の精子を、DNA含有量に基づいてＸとＹの染
色体分画に分別する方法を提供するのが本発明の目的で
ある。
分別した精子細胞の生存能力を維持しながら哺乳動物
のDNAを染色する方法を教示するのが、本発明の別の目
的である。精子の生存能力を維持しながら細胞分別装置
において使用するのに適した保護液体（sheath fluid）
を提供するのが本発明の別の目的である。
精子の生存能力を維持する能力のある採集液体を提供
するのが本発明の別の目的である。
本発明の別の目的と利点はこれに続く説明から容易に
明瞭になるであろう。
発明の詳細な説明 私は、分離法をここに示した；即ち無傷の、生存能力
のあるＸとＹ染色体を担っているウサギ、ブタの精子群
の相対的なDNA含有量に基づく流動分別；雌体中に分別
した精子の外科的種付け；そしてそれに続く、分別した
精子群の相対的DNA含有量に基づく予測と一致している
表現型−性比を持つ性別した子の分娩による方法であ
る。
流動細胞計測計は、予め蛍光染料で処理した精子がレ
ーザー線中を通過する時に放つ蛍光線の量を測定する。
この染料はDNAに結合している。蛍光線は光学レンズに
より一緒に集められる；信号は光増幅管に伝送され、増
幅され、そしてコンピューターにより解析される。
Ｘ染色体はＹ染色体より多くのDNAを含有しているの
で、雌型精子（Ｘ）は雄型（Ｙ）精子より多くの染料を
取込みそしてより多くの蛍光線を放つ。
DNAにおけるＸとＹの間の検出されるべき差異は小さ
いので、精子は単層になってレーザー光線中を通過しな
ければならず、そのレーザー光線が個々の精子のDNA含
有量を計測する。
直角流動細胞計測法では、励起源（レーザー光線）を
横切っている狭い通路中を、蛍光色素で染色した（一つ
一つの細胞を測定できるように互いに離れている）単独
の細胞のけん濁液を流させなければならない。単独の細
胞は光線中を通過し、光学的検出器が発射した光線を集
め、光線を電気信号に変換し、そして電気信号はマルチ
チャンネル分析計により分析される。データは、座標と
して細胞の数と蛍光を使用して、多重または単一パラメ
ーター−ヒストグラムとして表示される。
直角流動細胞系を使用してＸ−およびＹ−担持精子の
DNAを識別するためには、面取りされた射出先端部と前
方に位置する２番目の蛍光検出器が要求される［ジョン
ソンとピンケル、上記参照］（第１図を参照）。この報
告はここでは参考文献を包含する。
〔第１図の説明：第１図（この図は、ジョンソンとピン
ケル、Cytometry 7:268−273（1986）のFig 1であ
る。）は、面取りした試料射出管１による精子核２の方
向付けを示す線画である。レーザー光線３は平らにした
試料流４の平面中の方向付けした精子核２の平面側を横
断する。90°の検出器５と０°の検出器６は、それぞ
れ、精子核（精子頭部）２の先端側と平面側からの蛍光
線を集める。周辺を囲む保護流体と、試料射出管１とレ
ーザー光線３との間の流路先端のオリフィスは判り易く
するために省略されている。〕 この改良系では、それがレーザー光線を通過する時に
面とりされた射出先端部により平卵状の精子の頭部の方
向を制御することができる。（第１番目の蛍光検出器に
より測定されて選択される）適当に方向付けされていな
い精子を、電子ゲーティングによって除外することは精
度をあげる。典型的には、レーザー光線中を通過する時
に、精子核（尾部がない）の80％が適当に方向付けされ
る。改良したEpics V 流動細胞計測器／細胞分別器に
おいて流動力は、（第１図を参照）平卵状の哺乳動物の
精子の核がそれらが面取りされた射出先端部を通過する
時に、標本流の平面中に核を方向付けるように強制す
る。蛍光信号は、精子核の先端面から90度の光学検出器
により、そして平面から０度の光学検出器により同時に
集められる。分別のために、試料流は超音波変換器によ
り一様の微滴に分断される。適当な蛍光強度を持つ単独
の精子を含有する微滴は荷電され、静電気的に採集容器
に偏向される。次いで、採取した精子の核は卵中への微
注入に使用される。精子は尾部を持っていないので、通
常の種付けには使用できない。
精子の核が高度に凝縮され平板の形状であり、それが
化学量論的な染色を困難にしそして染色した核が高い反
射率を持つ原因になるので、流動細胞計測器と細胞分別
器を使用する、哺乳動物の精子のDNA含有量の精確な測
定は困難である。これらの要因は、蛍光の放出が精子核
の端または薄い平面から優先的に行われることに寄与す
る。殆どの流動細胞計数器兼分別器では、試料流れの方
向はレーザー光線の進行方向と蛍光検出の光学軸に対し
て直角である。その結果として、蛍光測定は、精子の蛍
光を励起しそして精子の頭部の平面に対して垂直である
軸上で測定する時に最も精確である［ピンケル他
（２），上記を参照］。試料の比較的低い流速で、流体
力は無尾精子を方向付けるのに使用され、その結果DNA
含有量はレーザー光線の正面を通過する精子の60ないし
80％の上で精確に測定できる。この研究で使用される改
善したEpics V 系は、秒当り50ないし150の精子の速度
で、殆どの種からの無尾の精子の含有量を測定できる
［ジョンソンとピンケル，上記を参照］。
無傷（尾を有する。）の精子は、生存能力があろうと
なかろうと、無尾の精子程には効果的には方向付けでき
ない［ジョンソン（２），上記を参照］。しかし、例え
ば、（第１図を参照）（精子核の先端面からの蛍光信号
を受容する）90°の検出器は、（精子核の平面からの蛍
光信号を同時に受容する）０°の検出器により測定され
るために適当に方向付けされた無傷の精子の群落を選択
するのに使用できる。即ち、90°の検出器により蛍光の
大きさを測定して精子の方向を決めて、０°の検出器に
より測定されるのに適している方向にある精子だけを選
択し、その選択された精子の０°の検出器により測定さ
れた蛍光の大きさに基づいて精子のDNA含有量を測定す
る。そして０°の検出器で測定されるのに適している方
向にある精子を測定されたDNA含有量により選択する。
流体力学的方向付けは試みられていないので、試料流
速は非常に高くなり得て、これは無傷の精子のたった15
ないし20％のみが適当な方向でレーザー光線を通過する
ことを若干は補償する。この発明では、全流量は秒当り
約2500個の無傷精子である。
無傷のＸ−とＹ−担持精子分画は、仕込んだ精子の群
から、秒当り、各々の型の80−90個の精子の速度で同時
に分別される。
分別工程の間と種付けに先立つが分別後の貯蔵の間に
おける無傷の精子の高い生存能力を維持することは勿論
非常に大切なことである。
精子の生存能力を維持することに包含される因子の中
で、保護液体（sheath fluid）を染色しそして液体を採
集する方法は特に重要であることが見出された。
無毒性のDNA染料を選択しなければならない。好まし
い染料は、ヘシスト（Hoeschst）のビスベンズイミド
（bisbenzimide）H 33342 蛍光色素（fluorochrome）
［カルバイオケム−ボーリング社（Calbiochem−Behrin
g Co.）,La Jolla,CA］である。我々の知る範囲では、
この蛍光色素は、精子に対して無毒性のただ一つのDNA
結合性の染料である。蛍光色素の濃度は毒性を避けるた
めに最少にしなければならないが、しかし精子を均一に
染色し、ＸとＹ精子のDNAにおける小さい差異を最少の
変動で検出するのに充分でなければならない。適当な濃
度は、５μg/mlであることが見出されたが、これは４な
いし６μg/mlで変動してよい。
精子は染色がおこるのに充分な温度と時間で、そして
生存能力を保持するのに充分な緩い条件で、染料と共に
保温しなければならない。35℃で１時間にわたり保温す
ることは最も効果的であろう。保温時間は温度に従って
調節されなければならず；それは30℃には1.5時間、39
℃には１時間である。
細胞を分別するのに使用する保護液体（sheath flui
d）は電導性かつ等張性でなければならない。10mM燐酸
塩緩衝食塩水は必要な電導性を付与し、そして0.1％の
ウシ血清アルブミンは、代謝のためのタンパク質支持と
精子のための粘度を与えることにより精子の生存能力を
高めるために添加される。保護液体（sheath fluid）に
は、糖分と過剰の塩分があってはならない。
分別において起こる精子の希釈は細胞の生存能力を減
少せしめる傾向がある。この問題を解決するために、精
子を、pHを調節し界面活性剤を添加することにより改質
した試験用卵黄増量剤［グラハム他、J.Dairy Sci.55:3
72（1972）］中に採集しなければならない。増量剤の詳
細は実施例１に示した界面活性剤は、卵子への受精前の
一連の変化（capaciation）を促進すると信じられてい
る。
DNA含有量を確定し、外科的に種付けしたＸまたはＹ
分別した精子分画の子の性を予測するために、分別した
精子の滴を超音波にかけて尾部を除き、染色し、そして
核はＸとＹ精子の比率を予測するためにDNA含有量を再
分析する。
下記の詳細の記述は、本発明の実施例としてウサギの
精子の分別を利用しているが、殆どの哺乳動物の精子は
これらの手順に従って効果的に分別できてもよいと期待
される。
この技術の熟練者は、僅かな改変は本発明の精神と範
囲から乖離することなしにこの手段の範囲の中でされて
よいことを理解するであろう。
ウサギの精子は採取され、希釈され、そして蛍光色素
染料で染色される。精子を改変したEpics V 流動細胞
計測計／細胞分別器中で分別する。
分別した後、精子をウサギの子宮内に外科的に種付け
する。分別した無傷の精子での雌の外科的種付けにより
得られた結果を表Ｉに提示した。種付け後40時間の卵の
回収は、染色した分別精子、並びに染色してない非分別
精子がin vitroでウサギの卵を受精（fertilizing）さ
せる能力があることを示している。
種付けは、表現型の性に対する子の予測された性の比
較値を決定するためにも行われた。表IIのデータが示し
ているように、分離した無傷の精子のDNA分析に基づく
表現型の性の予測性は非常に高かった。種付けのために
使用される分別したＹ群の再分析は、精子の81％がＹを
担っていることを示した。これらの種付けからの子の性
比は予測比と同様である。これらの値は、理論的な50:5
0の性比とは有意（Ｐ＜.003）に異なる。
種付けに使用した分別したＸ担持精子群の再分析は、
86％がＸ担持の、そして14％がＹ担持の精子であること
を示した。これらの種付け物からの子の表現型性は94％
が雌性であり、この値は理論値50:50（Ｐ＜.0003）から
異なっていた。
種付けを、種付け直前に再併合した分別ＸとＹ群（再
併合したＸとＹ群）で行った。仮定は、再併合した試料
におけるＸとＹの比率は同等（50:50）であるというも
であった。種付けから得られた表現型の性は57％が雌で
あり43％が雄であって（表II）、これは理論的な性比
（50:50）からは有意（Ｐ＝.40）に異ならなかった。
分別したＸ担持または分別したＹ担持精子で種付けし
た雌の出産した雌の表現型性比は、未処理の精子から期
待された理論的（50:50）の性比とは異なる（Ｘについ
てはＰ＜.0002そしてＹについてはＰ＜.001）。
胎児の死亡率は、分別した無傷の精子で種付けした雌
の場合には顕著である。合理的に高い受精（fertiliza
−tion）率（表Ｉ）では、80％近くの出産率とこの年代
と種の雌から一腹約６匹の大きさを期待しただろう。し
かし、３件の処理群を通じての出産率は平均28％であっ
て、一腹平均3.9匹の大きさであった。胎児死亡率が明
らかに高いことの原因は、DNAに結合した蛍光色素およ
び／またはDNAに結合した蛍光色素を励起するレーザー
光線の影響によると考えられる。
以前の研究は、ハムスター卵中に微注入した分別した
ハタネズミの精子核は、精子生殖核に発達する間に染色
体の分解を示している［リバス他,Mut.Res.182:265（19
87）］．これらの精子は超音波処理され、染色され、分
別され、そして微注入されていて、この研究で利用され
る染色と分別よりも幾分か厳しい処理なのであろう。
私は、DNAはＸ−およびＹ−担持精子の間の区分標識
として使用できるので、分別したＸ−およびＹ−担持精
子群からの子の性を精確に予測するのに使用できるこ
と；そして流動分別が、子の出産のために適当な生存能
力のあるＸ−およびＹ−担持精子群を分別するために効
果的な方法であることを示した。
下記の実施例は、本発明を更に説明することだけを意
図したものであり、請求の範囲によって定義されている
発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１ 精子は、人工膣を使用して、混合種の成熟雄ウサギか
ら採取した。精子の濃度は赤血球計測器により分析し
た。精子を、Tris緩衝液,pH6.9で希釈して、10x106/ml
になるようにした。Bisbenzimide H 33342蛍光色素を５
μg/mlの濃度で添加した。試料を35℃で１時間保温し
た。無傷の精子を、改変したEpics V 流動細胞計測計
／細胞分別器上で分別した。染色した無傷の精子は、、
2000mWで操作する５−ワット90−５イノヴァ（Innova）
アルゴン−イオンレーザーの紫外線（361および364nm）
中で励起した。データを256−ヒストグラムとして集め
た。
保護液体（sheath fluid）は、0.1％のウシ血清アル
ブミン（BSA）を含有する10mM燐酸塩緩衝食塩水（PBS）
であった。精子を試験用卵黄増量剤中に分別した。
増量剤の組成は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−
メチル−２−アミノエタンスルホン酸,2.16g;トリスヒ
ドロキシメチルアミノエタン,0.51g;デキストロース,0.
1g;ストレプトマイシン硫酸塩,0.31g;ペニシリンG,0.08
g;卵黄,12.5ml;Equex STM（Nova Chemical Sales,Scitu
ato,MA）,0.5％；および蒸留水,50mlであった。この混
合物を遠心分離し、上澄液だけを使用した。分別した精
子を１時間にわたり室温で保温することにより濃縮し
た。
その後、より薄めた部分を除き、残りを１ないし４時
間後に種付けのために使用した。
実施例２ 成熟したニュージーランド・ホワイトの雌ウサギに、
注射10時間後に排卵を誘発すると期待されるヒト・コリ
オニック・ゴナドトロピン（chorionic gonadotropin）
（HOG）の150国際単位を注射した。HOGで処理した７時
間後に、アセプロマジンを含有するケタミン塩酸塩によ
る注射により外科的に準備しそしてハロタンと酸素雰囲
気で麻酔した。子宮を中央線切開により露出し、そして
分別したまたは未分別の精子の100μｌを、21−規格（2
1−gauge）針を通して各々子宮の喇叭管の前方先端部の
内部に入れる。ウサギの面倒を見るに当たっては、標準
管理法を採用した。これらの雌ウサギを種付け40時間後
に殺した；子宮を洗浄して回収した卵を評価した。回収
した受精（fertilized）卵を桑実胚として分類した。こ
れらの実験の結果を表Ｉに示す。
実施例３ 表IIは、子宮喇叭管の先端中への種付けの結果：子を
生んだ雌ウサギの数と予測した性と比較した子の表現型
の性の数を示す。子の予測した性は、DNAの相対的含有
量を定量するために分別した無傷の精子の再分析に基づ
いた。再分析のためには、分別した精子を10秒間超音波
処理し、そして15,000gで遠心分離し、上澄液を捨て、
そしてペレットを９μＭのビスベンズイミドH33342中に
再けん濁した。子の表現型の性は出産直後に決め、そし
て10週令になった時に確認した。再併合したＸとＹは、
種付けの直前に、分別してあったＸとＹの子の精子群を
再併合したものである。
実施例４ 実施例１、２および３の方法を使用して、生存能力の
あるブタの精子を、生存能力のあるＸとＹの染色体担持
群に分別する。外科的に種付けした雄ブタ精子からの２
腹（18匹のブタ）は、Ｘ−分別した精子からは88％の
雌、そしてＹ−分別した精子からは67％の雄を産出し
た。
前出の詳細な記述は、説明の方法により主に与えら
れ、そして改変と変形は本発明の精神と範囲から乖離す
ることなしにその中でなされたものと理解される。
〔図面の簡単な説明〕
第１図は、面取りした試料射出管１による精子核２の方
向付けを示す線画である。
１……試料射出管、２……精子核（精子頭部）、３……
レーザー光線、４……試料流、５……90°の検出器、６
……０°の検出器。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＧＡＭＥＴＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｖ ｏｌ．21，Ｎｏ．４（1988−６−29）. Ｐ．335〜344

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】哺乳動物の子の性を前選択する方法であっ
    て； ａ）生存細胞中のDNAを選択的に染色する能力のある蛍
    光染料で、染色が均一に起こるのに充分に長い時間にわ
    たるが生存できる無傷の精子の生存能力を保持するのに
    充分に短い時間にわたり約30°−39℃の範囲内の温度で
    生存できる無傷の精子をその染料と共に保温することに
    より、雄の哺乳動物から集めた生存できる無傷の精子を
    染色し； ｂ）該生存できる無傷の精子を電導性かつ等張性の生存
    能力を支持する保護液体（sheath fluid）中に導入し
    て、該生存できる無傷の精子を単独で保護液体の流れ中
    で流動せしめる、該生存できる無傷の精子のけん濁液を
    形成せしめ； ｃ）該生存できる無傷の精子を含有する保護液体を、染
    色したDNAが蛍光を発する原因になる励起光源の前に通
    し； ｄ）該生存できる無傷の精子を含有する保護液体を、染
    色したDNAの蛍光を検出するための手段と細胞分別手段
    の両方を通過せしめ、前記蛍光検出のための手段は少な
    くとも２個の検出器を持ち、該２個の検出器の第１番目
    の検出器が蛍光の大きさに基づいて該生存できる無傷の
    精子の方向を決め、 そして、予め選択した方向内にあると決められたそれら
    生存できる無傷の精子の蛍光の大きさに基づいて生存で
    きる無傷の精子のDNA含有量を測定するために第２番目
    の検出器を制御するように配置されていて； ｅ）所望の性の子を出産するだろう所望の染色体に該当
    するDNA含有量を持つ生存できる無傷の精子を、該細胞
    分別手段により選択し、そして選択されていない生存で
    きる無傷の精子から選択された生存できる無傷の精子を
    分離し；そして ｆ）該選択された生存できる無傷の精子を、生存能力支
    持採取液体中に採取する ことからなる方法。
  2. 【請求項２】該哺乳動物がウサギであることを特徴とす
    る請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】該哺乳動物がブタであることを特徴とする
    請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】該哺乳動物がウシであることを特徴とする
    請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】該染料がビスベンズイミド H 33342 蛍
    光色素（bisbenzimide H 33342 fluorochrme）であるこ
    とを特徴とする請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】該保温を約39℃の温度で約１時間にわたり
    行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】該保温を約35℃の温度で約１時間にわたり
    行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】該保温を約30℃の温度で約1.5時間にわた
    り行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】該保護液体（sheath fluid）が、燐酸塩緩
    衝食塩水溶液であって、その溶液が生存できる無傷の精
    子の生存能力を高めるために0.1％ウシ血清アルブミン
    も含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】該採集液体が改変した試験用卵黄増量剤
    であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】該生存できる無傷の精子が、該光源の前
    を通されるのに先立ち、保護液体の流れの中で水力学的
    に方向付けられることを特徴とする請求項１記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】該生存できる無傷の精子が、該光源の前
    を通されるのに先立ち、面とりした射出先端部の狭い流
    れの中をその液体を通過させて出すことにより該生存で
    きる無傷の精子が保護液体の流れ中で水力学的に方向付
    けられることを特徴とする請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】哺乳動物（ヒトを除く）の子の性を前選
    択する方法であって； ａ）請求項１の方法に従って生存できる無傷の精子を分
    別し；そして ｂ）採取液体中の上記の選択された生存できる無傷の精
    子で、雄の哺乳動物と同じ種類の雌の哺乳動物に種付け
    （inseminate）すること からなる方法。
  14. 【請求項１４】哺乳動物の子の性を前選択する方法であ
    って； ａ）請求項１の方法に従って生存できる無傷の精子を分
    別し；そして ｂ）採取液体中の選択された生存できる無傷の精子で、
    雄の哺乳動物と同じ種類の雌の哺乳動物から得られた卵
    子を受精（feretilize）させること からなる方法。
  15. 【請求項１５】該細胞分別手段により分別する前に、適
    当に方向付けされていない精子を電子ゲーティングシス
    テムによって除外することを更に包含する請求項１記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】細胞分別手段を通過している精子の流れ
    が超音波変換器により調節されることを特徴とする請求
    項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】該生存できる無傷の精子が約90％の効率
    で、Ｘ−またはＹ−染色体DNA含有量に基づいて分別さ
    れることを特徴とする請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】該生存できる無傷の精子が該光源の前を
    通過するのに先立ち、該生存できる無傷の精子が保護液
    体の流れの中で水力学的に方向付けられそして適当に方
    向付けされていない生存できる無傷の精子が電子ゲーテ
    ィングシステムによって除外されることを特徴とする請
    求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】哺乳動物の子の性を前選択する方法であ
    って； ａ）生存細胞中のDNAを選択的に染色する能力のある蛍
    光染料で、染色が均一に起こるのに充分に長い時間にわ
    たるが生存できる無傷の精子の生存能力を保持するのに
    充分に短い時間にわたり約30°−39℃の範囲内の温度で
    生存できる無傷の精子を保温することにより、雄の哺乳
    動物から集めた生存できる無傷の精子を染色し； ｂ）該生存できる無傷の精子を電導性かつ等張性の生存
    能力を支持する保護液体（sheath fluid）中に導入し
    て、該生存できる無傷の精子を単独で保護液体の流れ中
    で流動せしめる、該生存できる無傷の精子のけん濁液を
    形成せしめ； ｃ）該生存できる無傷の精子を含有する保護液体を、染
    色したDNAが蛍光を発する原因になる励起光源の前に通
    し； ｄ）該生存できる無傷の精子を含有する保護液体を、染
    色したDNAの蛍光の検出のための手段と該生存できる無
    傷の精子の蛍光の大きさに基づいて生存できる無傷の精
    子のDNA含有量を測定するための細胞分別手段の両方を
    通過せしめ； ｅ）所望の性の子を出産するだろう所望の染色体を持つ
    生存できる無傷の精子を、該細胞分別手段により選択
    し、そして選択されていない生存できる無傷の精子から
    選択された生存できる無傷の精子を分離し；そして ｆ）該選択された生存できる無傷の精子を、生存能力支
    持採取液体中に採取する ことからなる方法。
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