CN102812123A - 减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统 - Google Patents

减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统 Download PDF

Info

Publication number
CN102812123A
CN102812123A CN201080065616.7A CN201080065616A CN102812123A CN 102812123 A CN102812123 A CN 102812123A CN 201080065616 A CN201080065616 A CN 201080065616A CN 102812123 A CN102812123 A CN 102812123A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
sample
substratum
sorting
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201080065616.7A
Other languages
English (en)
Inventor
J·莫雷诺
M·埃文斯
M·杰兰德
J·格萨维兹
C·冈萨雷斯·马丁
C·洛佩兹·费尔南德斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Technology LLC
Inguran LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2010/054549 external-priority patent/WO2011053727A2/en
Application filed by Monsanto Technology LLC filed Critical Monsanto Technology LLC
Publication of CN102812123A publication Critical patent/CN102812123A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及与常规的分选和处理方法相比以降低的DNA断裂的水平和发生率来处理生殖细胞样品并分选精子的方法和系统,所述方法和系统使用具有低水平的DNA断裂的生殖细胞和精子细胞样品来改善授精样品生殖力的活力和辅助生殖过程的成功率,所述辅助生殖过程包括人工授精、体外受精、胞质内注射、以及其它相关的技术。

Description

减少经处理的精子样品中的DNA断裂的方法和系统
该国际PCT(专利合作条约)申请是以下各申请的部分延续申请,并要求其优先权:2010年4月1日递交的美国临时专利申请61/320,183、2010年4月14日递交的美国临时专利申请61/324,192和国际PCT申请PCT/US10/54549号申请,以上各申请以引用的方式由此引入。
技术领域
本发明实施方式总体涉及用于减少各种经处理的细胞和精子细胞的群体中的DNA断裂事件的数量的方法和系统,更具体而言,涉及用于改变细胞处理和精子分选过程以减少各种细胞和精子悬浮液中的DNA断裂事件、用于减少各种细胞和精子样品中的DNA的断裂发生率以及用于改善辅助生殖技术和操作的整体成功率的方法和系统。
背景技术
精子和性别分选的精子(基于携带X或者Y染色体分选的精子)对辅助生殖技术,特别是畜牧繁殖业具有重大意义的生物材料。但是,损伤的和/或死亡的精子缺乏通过人工授精(AI)、体外受精(IVF)、胞质内精子注射(ICSI)、胚胎移植(ET)或者其它辅助生殖技术产生后代的活力。损伤的细胞可以包括膜改变的细胞、经历细胞凋亡的细胞、以及具有DNA断裂的细胞。损伤的精子,当其存在于辅助生殖技术中使用的有活力的精子群体中时,可能能够使卵子受精,但是可能无法产生有活力的胚胎或者产生的胚胎具有基因异常(其不会正常发育或稍后死亡)。以这种方式,具有DNA断裂的精子和有活力的精子竞争,减少了成功妊娠的总体可能性,增加了产生畸变后代的可能性。Simon等(Human Reproduction,Vol.25No.7pp.1594-1608(2010))证明了:精子DNA断裂比率的增大对采用例如IVF和ICSI等辅助生殖技术的妊娠率和胚胎发育具有不利影响。因此,需要这样的涉及精子和其他生殖细胞处理的方法和系统,其能减少经处理的生殖细胞或分选的精子亚群体,特别是用于辅助生殖过程中的分选的亚群体中的DNA断裂水平或DNA的断裂率。更具体而言,对于处理常规的精子和性别分选精子存在该需求。
性别分选的精子是性别富集的精子亚群体,其以携带X染色体或Y染色体为特征并基于此进行分选。利用所述性别分选的精子,可以以高度确定性产生具有所期望的性别的后代,因而特别有利于乳制品和牛肉工业。绝大多数的精子分选方法采用流式细胞分析和过程,其通常结合非毒性DNA结合荧光染料,该染料在适宜的条件下透过细胞膜,以化学计量方式和细胞的DNA相关联。与各精子关联的染料的量与包含在每个细胞中的DNA的量密切相关,其根据激光激发可使得带有Y染色体的精子和带有X染色体的精子产生可区分的荧光模式。美国专利5,135,759、6,357,307、7,371,517和7,758,811(其中每个都通过引用的方式并入本文)提供了基于X染色体和Y染色体差异的适于精子分选的系统和方法。
虽然所有动物的新鲜精液本身含有一定基准数量的具有DNA断裂的精子,来自各个捐助者的精液中的DNA断裂的总体水平却可随着以下因素的不同而变化,如氧化应激、细胞凋亡、组蛋白-鱼精蛋白的无法替代、和其他与精液产生相关的环境因素等。在随后的精子处理过程中,这些DNA损伤因子的一部分可以被复合。除此之外,鉴于精子通常是易损的细胞,那么体外射精后得到的精子样品在大多数精子处理过程(同时准备授精样品)中可能会遭受到额外的医源性的损伤。特别是,精子性别分选的方法学包括几个步骤,对细胞制造应力刺激,其不仅是损伤,还可以有助于和加强潜在的医源性损伤。由于所述分选过程某些步骤中所制造的损伤可以整个分选过程中耐受的化学和物理应力而复合,因此特别需要最大限度地减少在精子群体被处理、分选和存储时该群体中DNA断裂事件的发生。因而,需要通过减少分选的精子群体中的DNA断裂的发生来改善经处理的精子样品的活力的方法和系统,该方法和系统用于改善使用性别分选的精子的人工生殖授精技术和后代健康发育的成功率。
发明内容
本发明的实施方式通常涉及使用流式细胞仪和微流体装置的细胞分选方法,所述方法用于分选精子和其他生殖细胞,并且与初始的细胞或者使用常规的分选方法产生的经分选的精子样品相比,所述方法产生的精子群体显示出减少的DNA断裂量或减少的DNA断裂率。这些具有减少的DNA断裂量或减少的DNA断裂率的精子群体有利于改善使用辅助授精和/或受精技术(如AI、ICSI、IVF、ET及其他相关技术)的成功的出生率。
因此,本文中所公开的实施方式提供了用于减少经处理的细胞和分选的精子样品中的DAN断裂的总体水平的方法和系统。
在一个方面中,本文中所公开的实施方式提供了通过减少初始细胞、精液或经处理的细胞样品中的细菌污染(在本公开中也称为细菌感染(BI))来减少细胞或精子群体中的DNA断裂的方法和系统。
在另一个方面中,本文中所公开的实施方式涉及通过以逐步的方式控制样品的酸度来减少经处理的细胞样品,如精子样品或性别分选的精子样品中的DNA断裂率的方法和系统。
在又一个方面中,本文中所公开的实施方式提供了用于性别分选精子的方法和系统,相比于此前的分选和处理方法,所述方法和系统具有减少了DNA断裂的水平的改进步骤。
在再一个方面中,本文中所公开的实施方式涉及改进的精子染色步骤,其通过添加具有较高pH的淬灭染料从而减少DNA的断裂并保存精子活力。
在另一个方面中,本文中所公开的实施方式涉及采用新淬灭染料改进染色过程。令人惊讶的是,已经发现,黄色食品染料,更具体而言黄色6(yellow 6)在分离精子时提供了有关分辨率的益处,并且需要较少的Hoechst染色剂。由于需要较少的染色剂,在分选过程结束时改善了精子的健康。
附图说明
图1A示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光v.s.侧向角荧光的代表性绘图。
图1B示出了染色质扩散实验中含有精子的一侧,其中所述精子收集自特殊分选区域。
图1C示出了染色质扩散实验中含有精子的一侧,其中所述精子收集自特殊分选区域。
图2A示出了流式细胞仪中精子的前向角荧光v.s.侧向角荧光的代表性绘图。
图2B示出了流式细胞仪中精子的选通部分(gated portion),其绘制为前向荧光v.s.积分的前向荧光的图。
图3A示出了常规的精子样品中随时间推移的DNA断裂的示意图。
图3B示出了性别分选的精子样品中随时间推移的DNA断裂的示意图。
图3C示出了在常规样品和性别分选的精子样品中随时间推移的平均DNA断裂的示意图。
图4示出了根据本文提出的某些实施方式的流式细胞仪。
图5A示出了描绘未表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的线箱图。
图5B示出了描绘未表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的示意图。
图5C示出了描绘表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的线箱图。
图5D示出了描绘表现出细菌感染的样品中在不同时间的精子样品中的DNA断裂的百分率的示意图。
图6示出了几种不同的Red TALP处理的DNA断裂随时间推移的图示。
图7A和B示出了样品精液的前向荧光v.s.侧向荧光的绘图。
图8A和B分别示出了选通样品7A和7B的R1区域产生的流式细胞仪中峰值前向荧光的直方图。
具体实施方式
在详述所述方法和系统之前,应当理解的是,所述方法并不限于本文中所公开的特定的实施方式,而是可以以多种方式实施。此外,被描述的方法和系统是以通常的方式公开,因此本领域技术人员一旦理解了这种一般性的规律,这些方法就能运用于具体的系统中。
一些实施方式涉及产生不连续的亚群体的细胞分选方法,其中一些亚群体富含特定的特征,并且相比于通过此前的方法分选的精子,所分选的亚群体包含较少的细胞DNA断裂。通常,精子样品直接或间接地获自哺乳动物,包括但不限于Wilson,D.E.和Reeder,D.M.,Mammal Species of the World,Smithsonian Institute Press(1993)中列出的那些,该文献的文本整体以引用的方式特此并入本文中。这些哺乳动物包括但不限于牛、马、猪、犬、猫、海豚、山羊、绵羊和乌鸦。在一个实施方式中,纯精液(新鲜采集的精液)可通过现有技术中已知的增量剂(extender)或缓冲溶液进行稀释或离心分离来处理,从而保存增容的精子样品中精子的活动力和生殖力。在另一个实施方式中,精子样品也可以通过解冻此前冻存的和/或此前处理的精子(来自精子储存管)来建立。在又一个实施方式中,精子样品可包含分别去除其精子尾部的精子头部。
在一个实施方式中,诸如喹诺酮等抗菌剂可以与细胞或精子样品结合以最大限度地减少精浆中和精子表面上的细菌及其他微生物的生长。喹诺酮是一组萘啶酸和/或氯喹衍生物,其包括但不限于环丙沙星、吡哌酸、噁喹酸和西诺沙星。抑制精子样品中的细菌生长已经与精子样品中DNA分裂的水平相关联。在一些实施方式中,喹诺酮可以是来自氟喹诺酮组的环丙沙星,并且作为主要的抗菌化合物添加。在其他的实施方式中,包含一种或多种抗生素的具有至少一种喹诺酮的喹诺酮混合物可以直接添加至精子或精液样品中,缓冲溶液中,增容的精子样品中,染色介质中,或者在处理精子时使用的另外介质中。
通过孵育、混合或通过其他的方法可以平衡并均匀地分散包含抗生素或抗微生物剂的精子悬浮液。选择的喹诺酮在目标细胞或精子悬浮液中可以以约0.05μg/ml~约20μg/ml、约0.2μg/ml~约5μg/ml和/或约0.1μg/ml~约2μg/ml存在。两种以上的喹诺酮可以各自以指定的浓度添加。经处理的或分选的精子可以被直接收集到包含喹诺酮或喹诺酮混合物的介质中。作为选择,喹诺酮或喹诺酮混合物也可以随后添加,包括:在分选前,在分选后,乃至在分选、冷冻和解冻之后。
缓冲溶液可包括一种或多种的缓冲体系,可以选自非穷尽性的目录,包括:TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP、MOPS、HEPES类的缓冲剂、磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、氟化物、包含BSA的缓冲液及其组合。
所述方法或系统可进一步包括基于所给定的精子样品的具体组成来调节或优化喹诺酮的组合的机制,从而调节喹诺酮的水平以最大限度地抑制特定的精子样品中的细菌的生长。该调节或优化的一个实例可涉及到监测并调节特定的精子样品的酸度以减少精子悬浮液中的DNA断裂的水平。
所得到的精子样品于是可以预先冻存和/或预先性别分选。在该实施方式中,喹诺酮或喹诺酮的混合物可以在解冻后步骤中添加,或者在分选处理后步骤中添加。在一个实施方式中,可以将冻存的精子解冻并将喹诺酮添加至解冻的精子样品中。这可以与分选(如性别分选)相结合,并在分选(如性别分选)之前或之后进行。在另一个实施方式中,在加入喹诺酮之后可以冻存精子样品。在每一种情况中,经处理的精子可用于建立授精样品,无论其是常规的还是性别分选的。
在另一个实施方式中,喹诺酮或喹诺酮混合物可应用于IVF过程或培养基以减少胚胎悬浮液中的细菌污染。
在一些实施方式中,添加喹诺酮以实现显示出DNA断裂的细胞数的减少,其可以减少细胞悬浮液中的DNA断裂的整体水平。所述细胞悬浮液可以是任何类型的精液样品,如新鲜的、冷冻的、常规的、分选的,也可以是卵母细胞或卵母细胞衍生物的悬浮液,包括但不限于卵母细胞、去核细胞及其经注射的衍生物、经胞内注射的卵母细胞,冷冻胚胎以及其他相关的生殖细胞悬浮液。
本文中的一些方面涉及增容的精子样品,该样品可包含精子、喹诺酮和/或缓冲溶液。在一个实施方式中,喹诺酮可包括氟喹诺酮,例如环丙沙星,不过也可以使用其他的喹诺酮。所述喹诺酮可以以约0.05μg/ml~约20μg/ml、约0.2μg/ml~约5μg/ml和/或约0.1μg/ml~约2μg/ml的范围存在于新鲜的或增容的精子样品中。所述缓冲溶液可以是前述的任何一种,以及它们的任意组合。
增容精子样品中的精子可包括以生殖力特征(例如X染色体或Y染色体的存在)而分选的精子。
在另一个方面中,某些实施方式涉及消除或减少受到污染的细胞样品或细胞培养基中的细菌及其他微生物的水平的方法。该方法可包括下述步骤:获得包含生殖细胞的细胞样品,并将一种或多种喹诺酮施用至细胞样品或细胞培养基以恢复具有最少可检测水平的细菌污染或不具有可检测水平的细菌污染的细胞系。所述生殖细胞可包括精子、卵母细胞、卵子、具有或不具有注入的DNA的去核配子、胚胎、可通过添加一种或多种喹诺酮来进行处理并孵育以实现喹诺酮的抗微生物效果的培养的胚胎。
在另一个方面中,某些实施方式涉及用于产生胚胎的方法,该方法可以包括以下步骤:获得精子样品、使精子样品与喹诺酮结合、抑制精子样品中的细菌生长和用精子使卵子受精。所述精子可以利用各种染色和分选方法来进行性别分选,所述方法包括但不限于如前所述的本领域中的那些标准方法。
在另一个方面中,所述方法可涉及用改进的染色过程来处理精子样品的方法。该方法的第一步为获得精子,所述精子可以是前述的任一种精子悬浮液,包括此前被冷冻的精子样品。所述精子悬浮液然后用第一培养基中的DNA选择性染料染色,随后通过添加可含有第二染料的第二培养基来染色。可调整第二染料的pH配合第一染料的pH,或第二染料的pH配合第一染料的pH与精子样品的pH的组合,以维持或调整pH至所需范围。
调整第二染料的pH进行配合应当理解为例如包括以下操作:使第二培养基的pH与第一培养基的pH相配;用适宜的缓冲系统改变第一培养基的pH以实现染色效果,然后再次调整pH至更合适的pH,从而将细胞损伤减至最少;或通过添加精子样品改变第一培养基的pH以达到所需的最终pH。通过减少对待染色的精子的潜在的pH的变化和冲击,或通过达到或接近最终的目标pH,可以完成调整第二培养基的pH进行配合的步骤。第二培养基或缓冲系统可包含第二淬灭染料以便于分选。
调整第二培养基的步骤可包括调整第二培养基的pH至5.5以上,在约5.5~约7.4之间,至约6.4~约7.4之间,约6.4和约7.4。第二培养基的pH可被调整为在第一培养基的2pH单位之内,第一培养基的1pH单位之内,或者基本上具有与第一培养基相同的pH。类似地,第二培养基也可以被调整为达到最终的精子样品的pH,即约6.6~约7.2。
此前,没有认识到应用包含第二染料的pH 5.5的培养基将杀死悬浮液内的精子。在pH 5.5TALP接触部分溶液并开始混合时,但在悬浮液达到平衡之前,局部的浓度更偏酸性,具有较低pH的混合物实际上接触了很少的局部的精子亚群体,并损伤或杀死这些局部的精子,从而减少了精子样品的整体的精子活动性和活力。这样,添加pH 5.5的培养基的处理步骤会对精子产生意想不到的负面效果。令人惊讶的是,该效果可能比施用更高pH的淬灭染料更具破坏性。传统上认为在较高的pH下施用淬灭染料将导致最终的悬浮液的pH对于精子的健康而言过高。对于本公开的目的,本领域的技术人员将认识到指定pH(例如5.5pH)意味着与pH 5.5相同。
第一培养基可包括TALP类缓冲液,或另外的缓冲液,与DNA选择性染料(如发荧光的DNA选择性染料、Hoechst 33342或诸如本文中所描述的那些的其他染料)的组合。
第二培养基可包含红色TALP,其可包括TALP类的缓冲液和红色食品染料。第二培养基可包含淬灭染料。所述淬灭染料可以是红色食品染料、黄色食品染料、percoll(经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液)、碘化丙啶、台盼蓝或已知渗透受损的细胞膜用于淬灭发荧光的染料的其他染料。
如前所述,处理过的精子随后进行性别分选,并在选自以下缓冲液的缓冲液中进行增容:TRIS、柠檬酸钠、卵黄、牛奶、TALP、MOPS、HEPES、磷酸盐、KMT、硼酸盐、碳酸氢盐、包含BSA的缓冲液和/或氟化物、以上物质的组合或其他用于精子处理或存储的已知的缓冲液。
在一个实施方式中,以第一培养基和第二培养基染色的步骤可在单独的pH调整事件中完成。在另一个实施方式中,染色的精子可以被性别分选,然后冻存。
在一些可能希望对精子样品进行性别分选的实施方式中,精子样品可以用荧光染料等标记来染色。所述标记可以是DNA选择性染料,如Hoechst 33342、Hoechst 33258、BBC、SYBR-14、SYBR Green I、双苯酰亚胺染料,或其组合。为了使精子均匀地且在合理的时间内吸收DNA选择性染料(如Hoechst 33342),染色过程需要升高精子的温度和pH。温度可以升至34℃~39℃,pH升至约7.2~7.4。通过第一染色步骤可以对精子施加这些条件,在第一染色步骤中引入的第一培养基具有所需的pH、克分子渗透压浓度和DNA选择性染料的浓度。仅举一个实例来说,该第一培养基可以是补充有BSA(牛血清清蛋白)、卵黄、抗生素和其他添加剂的TALP类的或HEPES类的溶液。
在一些实施方式中,所述精子可以用淬灭染料来染色,红色食品染料、碘化丙啶或具有淬灭性质的另外的染料等。习惯上,制备第二培养基使其具有与第一培养基类似的组成,区别在于其中添加了淬灭染料并处于较低的pH以使总体样品的pH恢复至对精子的损害较低的水平。本发明的一个实施方式涉及以与第一培养基相同或相近的较高的pH提供第二培养基中的第二染料的方法。
一个方面涉及用改进的淬灭染料来染色精子。该方法的起始步骤为获得精子。精子获自新鲜的精液、纯精液乃至解冻的此前冷冻的精液。精子随后在受控的染色条件下用荧色物染料孵育。受控的染色条件可包括在30℃~39℃的温度、在7.0~7.4的pH孵育20分钟~1小时的时间。所述荧色物染料可以是诸如Hoechst 33342等荧光染料。淬灭染料可以在孵育步骤之后或在孵育期间加入到精子中。所述淬灭染料可以是黄色食品染料、橙色食品染料、绿色食品染料乃至蓝色饰品染料。更具体而言,所述淬灭染料可以是6号黄色食品染料。无论选择哪一种淬灭染料都应选择其展示改进的分选应用(如微流体分选或流式细胞仪)的分辨率。
在一个实施方式中,使染色的精子随后流经诸如流式细胞仪或微流体装置等分选器,然后曝露于辐射能量。使用诸如Hoechst 33342等荧光染料时,辐射能量源可以是在UV波长操作的激光器。该激光激发可基于由染色精子所发出的荧光能来区分带X染色体和Y染色体的精子。
在许多实施方式中,使用流式细胞仪或基于荧光或可见光发射的另外的分析技术,可对各染色精子进行评估。在流式细胞术中,精子被夹带在液体流中,然后该液体流被分裂成液滴,每个液滴理想地含有单个精子,其在检查区用激光等能量源单独地照射。激光是能量源的一个实例,不过弧光灯和其它辐射能源可以用来辐射被染色的精子。所述DNA选择性染料将吸收来自激光的能量并响应于激发而发出不同波长的光。这种发射光的量可以定量,以测定与样品中的其他精子相比的DNA选择性染料的相对量。DNA选择性染料的量随后可用于确定精子的特性,更具体地可用于确定是否单个精子含有X染色体或Y染色体。
用于分选精子的系统可包括定位以用于检测在检查区内的辐射能量与和各精子相关联的DNA选择性染料的相互作用的传感器。该传感器可以是光电倍增管,其可基于这些发射的水平产生信号,并能够与用于处理信号且对各事件进行分选确定的分析器联通。评估该信号,以评估样品中的各精子的DNA特性。DNA特性可包括在各精子核中X染色体或Y染色体的存在。一旦通过所述分析器进行确定,信号可以传送至分离器以将样品分离为不同群体。
例如,在一些使用流式细胞术的精子分选系统中,基于所述分析器产生的信号,通过对夹带精子的流体进行充电可以分离精子。构成液体流并与液体流分离的带电的液滴然后保持该电荷,并通过偏转平板而发生电磁偏转,从而引导所述液滴进入几个容器中的一个。分离的精子然后根据其DNA特性被分选到多个收集元件中。
在经分选的精子中的DNA断裂
本文中提供的四个实验例示了将死亡的和DNA损伤的精子与有活力的精子样品分离的分选技术。死亡的和将死的精子群体中的精子有较高的DNA断裂频率,而分入有活力的亚群体中的精子则存在较低水平的精子DNA断裂。通过组合多种分选技术(如使用流式细胞术的性别分选),可以检测具有高水平的精子损伤,由此将该精子分选到死亡的亚群体中,而其余部分可包含活的亚群体,例如携带活的X染色体和/或活的Y染色体的亚群体。死亡的亚群体与活的亚群体均可包括受损伤的或者经历DNA断裂的细胞,但是其在活的亚群体细胞中的比率分布是最小的。
证明DNA的损伤减少的实验
在接下来的实验中,在3岁至9岁之间的年龄选择5只Jersey公牛和15只Holstein公牛,制备精子样品。每种性别分选的样品使用MoFlo SX TM(Beckman Coulter,Miami,Florida)进行分选。基于使用Hoechst 33342(Molecular Probes,Eugene,Oregon)和红色食品染料(FD&C#40,Molecular Probes Eugene,Oregon)而产生的荧光信号的差异来分选精子。具有较高DNA含量的细胞,即X-染色体携带群体的荧光信号比具有较低DNA含量的细胞,即Y-染色体携带群体的荧光信号更强。红色食品染料通常被排除在具有健康完整的胞膜的那些精子之外,但其保留在具有受损的胞膜(其淬灭了那些细胞中的相当大量的荧光信号)的精子内。
在每个实验中,基于荧光信号的差异选择携带X-和携带Y-染色体的分选的精子,其使用16.2mM Hoechst 33342(Molecular Probes,Eugene,Oregon,USA),该染料在由20%卵黄-TRIS扩增剂构成的捕捉液中稀释。使用与常规精液制备相同的标准,以及被选择用于要处理的精液的标准精液特征的截止值。在所有的实验中,用于常规的或性别分选的精子储存管精液的公牛精液只有满足以下标准时才能被使用:1)55%的最小活动力;2)900x 106个精子/mL的最小浓度,使用SP1-Cassette,Reagent S100和
Figure BDA00002165931400101
SP-100TM系统(ChemoMetec A/S,Gydevang 43,DK-3450
Figure BDA00002165931400102
Denmark)测定,不过也可以使用其他相当的系统;和3)15%的初级形态,15%的次级形态,以及总形态计数不超过25%。此外,用于解冻后分析的样品必须满足以下的标准质量控制条件:1)前向运动活动力在0h时至少45%,在3h时为至少30%;和2)在3h时包括至少50%的完整的顶体。对于解冻3小时后的活动力以及顶体的测定,所有的样品在加湿室中于37℃孵育3h。对于所有精液的质量评估,使用75x25mm玻璃显微载玻片(Andwin,Addison,Illinois,美国)和22x22mm#1.5盖玻片(ThomasScientific,Swedesboro,New Jersey,USA)。使用明视野显微术进行所有的活动力评估,使用微分干涉对比(DIC)显微术(放大倍数为x400)进行后期的完整顶体和形态评估。
实验中所用的全部扩增剂均具有相同的配方,其具有6.8的pH,和在300mOsm时与TRIS扩增剂平衡的克分子渗透压浓度。对于冻存,使用甘油通过两步增容对分选的和常规的精子样品进行处理。实验中所用的所有冷冻-解冻的性别分选样品包含2.1x 106个精子/精子储存管(0.25cc),而常规的样品则具有25x 106至30x 106个精子/精子储存管(0.5cc)的范围。
来自每只单独公牛的纯精液被分成两等分试样。一个等分试样被性别分选,之后使用诸如IMV
Figure BDA00002165931400111
(IMV,Cedex,France)等自动冷冻装置将精子在低温稳定化后冷冻,并保存在液氮中。第二个等分试样被直接冻存,以用于解冻后的DNA断裂水平的后续分析。在进行了X染色体和Y染色体的性别选择后对不同的亚群体进行精子DNA断裂分析,同时比较每只公牛的两份等分试样。
在各实验中,使用Sperm-Halomax试剂盒(Halotech DNA,Madrid,Spain)测定DNA断裂。每个精子样品被裂解,然后制备在载玻片上的琼脂糖中。所述载玻片然后用SYBR I(Invitrogen,Molecular Probes,Eugene,Oregon)或者GELRED(Biotium,Hayward,California)染色,使染色质染色,其在具有DNA断裂和没有DNA断裂的被裂解的精子周围的分散不同。然后具有断裂的DNA的细胞和具有完整的DNA的细胞在每个载玻片上被可视化地识别。
关于图1,可以看到在流式细胞仪中分选的精子的前向荧光对于侧向荧光的图(图1A)。该图上一个亚群体包含大比率的死亡或将死的精子(图1A中的R2),其他组包含活精子(图1A中的R1)。在商购的流式细胞仪(例如MoFlo SX或者MoFlo SX XDP(Beckman Coulter,Miami,Florida))上显示的分选参数的区域被标示出来,其示出了基于前向荧光和侧向荧光来选通精子细胞的图。图1B示出了来自R1的精子细胞的原位荧光显微照片,使用了Sperm-Halomax试剂盒,其中细胞具有小而紧密的晕环表明精子没有经历DNA断裂。在该载玻片上,可以看到单个的精子,其染色质松散地分散于膜的周围,表明该精子已经或正在经历DNA断裂。关于图1C,示出了来自R2的精子,可以看到其中的几个精子具有很宽的分散的染色质的晕环,表明了DNA断裂。
关于图2A和2B,一个亚群体包括主要是死亡的精子(图2A中的R2),其余两组主要由活精子(图2A中的R1)亚群体组成,所述活精子亚群体包含携带X-染色体(图2B中的R3)和携带Y-染色体(图2B中的R4)的精子,纯度为约95%。MoFlo SX XDP可构造为将R3、R4和R2中的每一个选入分开的容器中,而MoFlo SX可以用于从R2精子中分离出R1精子。使用STS Sexed Semen Purity Analyzer(Sexing Technologies,Navasota,TX),其提供了携带X和Y染色体的精子群体的高分辨率的峰,并依据2000个精子设立每次分析的基础,从而测定样品的性别比率纯度。相对于各分选前的样品(该样品获取自染色和孵育后而在分选之前)中得到的水平,分析并比较所有这些亚群体的DNA断裂的水平。各样品分选总计2x 106个精子。基于图2A中的区域2分选死亡的精子,排除落在该区域之外的所有其他细胞。分选前精液样品中死亡细胞的比例平均为13%,由此提供的平均分选速度是800至900个死亡精子/秒。因此,通过该过程从初始样品中除去了约85%的包含断裂的DNA的精子。
实施例1-进行第一个实验以分析性别分选前、后DNA断裂量的差异。精子样品取自5只Jersey公牛,每个样品被分成两份等分试样。第一组等分试样被性别分选然后冻存。第二组等分试样被直接冻存。表1示出了在每只公牛的分选前及分选后获得的DNA断裂的水平。
表1(DNA断裂%,性别分选)
  参考   分选前   分选–XY
  公牛1   7.00   1.10
  公牛2   7.50   1.10
  公牛3   11.00   4.00
  公牛4   9.00   5.00
  公牛5   5.30   4.60
  平均值±SD   7.96±2.15   3.16±1.91
5只公牛分选前的样品中的DNA损伤的基线水平的范围是从5.3%至11%,其平均值和标准方差为7.9±2.1。景性别分选的精子样品中获得的精子DNA断裂的水平要低得多,其平均值和标准方差为3.1±1.9。精子DNA断裂减少平均为63%,但是公牛2中的减少则高达85%。
实施例2-第二个实验特别观察性别分选后的各分选的亚群体中的DNA断裂。又有5只jersey公牛用于该实验;各自进行收集和分选,得到三个精子亚群体。第一精子亚群体主要由经由常规的分选技术由红色食品染料或碘化丙啶指示的被视为死亡的那些精子构成。第二及第三亚群体主要由活的分选的精子细胞构成。在分选之前对各样品的一部分进行测试以建立DNA断裂的基线。如表2所示,DNA断裂的基线具有的平均值和标准方差为7.9±2.5。各公牛平均时,在分选的携带X染色体的亚群体中测定的DNA断裂具有的平均值和标准方差是1.8±1.5,而携带Y染色体的亚群体的平均值和标准方差是1.2±0.6。第三精子亚群体含有所有的死亡精子,其倾向于积聚了大多数的DNA断裂的精子,具有的平均值和标准方差是12±4.4。
表2(DNA断裂%,经分选的亚群体)
  参考   分选前   分选-死亡的   分选-X   分选-Y
  平均值±SD   7.9±2.5   12±4.4   1.8±1.5   1.2±0.6
实施例3-进行第三个实验以分析在解冻之后的100个性别分选精子储存管中的精子DNA断裂的分布,以比较10只Holstein公牛于不同时间收集的样品间的变化。各精子储存管被收集并性别分选出携带X染色体的精子。由表3可以看出,由相同的公牛在不同的日期收集的精子储存管往往存在非常相近的DNA断裂。虽然存在一些偶然的异常值,不过获自单个公牛的大多数样品显示出相似的DNA断裂,而与其是否在不同的日期收集无关。
表3(DNA断裂%,不同日期收集的X分选的样品)
Figure BDA00002165931400131
实施例4-第四个实验的重点是定期评估常规的和分选的样品中的DNA断裂,从而确定各样品中DNA断裂的发生率。对于常规的精子,此前的实验已经有所显示,并在表4中再次显示,其相比于性别分选的精子具有较高的DNA断裂基线。然而,在24、48和72小时对性别分选的精子进行监测之后,看起来性别分选的精子在约24至48小时期间经历了DNA断裂的大幅度增加,而常规精子在至少约72小时之前都维持了基线水平。常规精子在约48小时显示出DNA断裂的轻微增长。表4说明了8只公牛的常规精子在t0(C-To)的DNA断裂,以及相同公牛的性别分选样品在t0(S-T0)测定的精子DNA断裂。正如所期望的,每只公牛的S-T0绝对低于C-T0。不过,24小时后(S-T24),48小时后(S-T48)和72小时后(S-T72),性别分选样品的DNA断裂剧烈变化,而常规精子在约72小时内倾向于保持为接近于其基线水平。表4也表明了交叉定位时间点(CPT),其可用作精子DNA断裂率的指示,例如,较低的CPT表示DNA断裂的增长较快,较高的CPT则表示DNA断裂的增长较慢。对每只公牛取平均,全部8只公牛的CPT平均为约33小时。平均来看,33小时后性别分选样品中的DNA断裂多于常规样品。
表4(CPT和随时间推移的DNA断裂%–分选的)
  CPT   C-T0   S-T0   S-T24   S-T48   S-T72
  公牛1   27h   5.00   0.33   1.66   10.50   70.00
  公牛2   44h   2.00   0.33   0.66   5.00   45.00
  公牛3   25h   2.66   0.33   0.66   17.00   32.00
  公牛4   33h   2.00   0.33   0.00   11.00   26.00
  公牛5   51h   4.00   0.00   0.66   2.50   66.00
  公牛6   41h   4.00   2.00   2.66   8.00   29.00
  公牛7   27h   3.33   0.00   1.00   19.66   32.00
  公牛8   19h   1.00   0.00   1.00   19.00   37.00
  r2   0.31   0.27   0.59   0.64   0.68
  Durbin-Watson   2.05   1.98   1.99   2.41   2.55
  P   0.24   0.26   0.27   0.09   0.06
图3示出了表4中的数据的图形表示。图3A示出了约72小时内的随时间推移的DNA断裂的百分率。比较起来,图3B示出了在72小时的期间内经分选精子中的DNA断裂。将图3B与图3A作对比,可以看出常规精子在72小时的孵育时间里以更为缓慢且更为平稳的比率增长,而分选的精子常常在约24小时至48小时之间存在精子DNA断裂的急剧增长。图3C示出了常规精子的平均值和分选精子的平均值,并通过这种方式更加清楚地展示了初期具有较低的DNA断裂百分率的分选精子。图3C也更为明确地示出了与常规精子相比分选精子中急剧增大的DNA断裂,以及此时平均来看分选的精子开始显示出比分选精子更多的DNA断裂的CPT。对于获得的并描绘于图3C中的样品,CPT在大约33小时时发生。因此,本文中所公开的各实施方式的一个目的是延长性别分选的精子的CPT时间以提高性别分选精子的有效寿命。
用包含喹诺酮的改进的方法减少精子DNA断裂
实施例5
第五个实验说明了精子DNA的降解与细菌感染(BI)的存在之间的关联。该实验显示出最初未检测到细菌,并且即使当精液在含有抗生素的常规的扩增剂中冻存的情况中,在解冻精液后细菌感染的存在。第一个实验也说明了存在细菌感染的样品中的精子DNA的断裂率倾向于以对数方式极快地增加,而不存在细菌感染的样品中的DNA断裂则倾向于以线性方式更为缓慢地增加。该实验还描述了精子DNA断裂与细菌量之间的关系。
分析中包含了来自47只不同的Holstein公牛的市售冻存精液样品。由每只公牛随机选取6只精子储存管,标准是精子储存管来自不同射精的精液。总计282只精子储存管用于评估精子DNA断裂的动力学。所有动物的年龄均为13至125个月,是健康的,并处于可控的饲喂、圈养和光周期的条件下。使用人工阴道并遵循标准精液特性的质量控制来收集精液样品,使用市售的含有卵黄的扩增剂INRA 96培养基(IMV Technologies,Spain)将各射精精液分成不同的单一剂量,并使用自动冷冻装置IMV Digitcool (IMV,Cedex,France)冷冻,然后保存在液氮中。在放大40倍的目镜下分析时,认为样品被细菌感染的阈值水平被建立为每个显微镜视野下有5个细菌。
冻存的样品通过在37℃的水浴中浸没30秒钟解冻。精子储存管在37℃的水浴中孵育不超过4天。在孵育0、4、24、48、72和96小时后确定精子DNA断裂。将各精子储存管在INRA 96培养基(IMV Technologies,Spain)中稀释为5×106~10×106个精子/mL,并通过Sperm-
Figure BDA00002165931400151
试剂盒(Halotech DNA,Spain)测试精子DNA断裂。为进行各次实验,使用25μL的各稀释的等分试样。使该体积与50μL的低熔点琼脂糖混合。取10μL的该混合物,使其在预处理的载玻片(Sperm-
Figure BDA00002165931400152
kit)上被增容,其上覆盖23x23mm的盖玻片,然后放置在冰箱(4℃)中的冷金属板上5分钟。之后,移开盖玻片,将各载玻片水平设置在10mL的细胞裂解液(Sperm-
Figure BDA00002165931400153
kit)中5分钟,然后于室温在dH2O中洗涤载玻片5分钟。裂解过程得到的拟核在一系列乙醇浴(70%、90%和100%)中脱水2分钟。一旦载玻片干燥,则使用1/1比例的10x GelRed fluorocrome(Biotium,USA)和Vectashield抗褪色培养基(Vectashield,Vector,Burlinghan,CA,USA)对其进行染色。通过荧光显微术和绿色激发使样品可见。计数精子并将其分为两组:断裂的和未断裂的,基于300个精子的测定计算百分比。研究来自六个不同个体的精子样品以确定Holstein公牛精液样品中存在的细菌门(bacterialphyla)。在三个样品中,使用荧光显微镜未检测到感染,而在另外三个个体中即使当样品已经在解冻后评估了BI,感染也清楚可见。使用苯酚-氯仿异戊醇(25:24:1)(Amresco Inc.)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(Sigma-Aldrich S.A.)对样品进行DNA提取。使用编码ARNr 16S的细菌基因的特定区域而设计的引物,通过聚合酶链式反应(PCR)对DNA进行扩增。引物的序列如下:正向5′-GAG TTT G(AC)T CCT GGCTCAG-3′,反向5′-ACG G(CT)TACC TTG TTACGACTT-3′。使用Illustra GFX PCRDNA和Ged Band Purification试剂盒(General Electric Healthcare S.A.)进行DNA纯化。使用
Figure BDA00002165931400161
-Teasy vector systems试剂盒并依据
Figure BDA00002165931400162
-Teasy vector system方案进行细菌DNA片段与克隆载体
Figure BDA00002165931400163
-Teasy(Promega S.L)的连接以及转染JM109感受态细胞。
每个精液样品选取十个白色菌落,然后进行DNA提取。最终,对提取自60个菌落的质粒DNA按照正向排序。
使用SPSS的17.0版本进行统计分析。使用数据库Ribosomal database Project(http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp)使rRNA 16S的序列与特定的细菌分类单位相关联。
GelRed染色与精子染色质扩散测试相结合时,得到高分辨率的显微镜图像。呈现分散的染色质斑点的晕环的精子头部包含断裂的DNA,而具有小的晕环的头部表明精子不存在DNA断裂。
精子DNA断裂的基线水平(T0)在所有公牛中都极为相近,表现为其值从不超过20%,平均为3.65%±1.55%。不过,在37℃进行孵育之后,各精液样品中精子DNA断裂(SDF)的水平随时间的推移而增加。为分析细菌感染随时间推移对精子质量的影响,在孵育的不同时间点评估精子DNA断裂,将数据绘图,并根据聚簇标准“具有细菌感染的动物v.s.不具有细菌感染的动物”进行对比。图5A示出了无细菌感染的组在不同时间间隔的精子DNA断裂的值,存在细菌感染的组显示在图5B中。图5C是未被感染的动力学图示,被感染的精液样品图5D示出了在存在细菌感染时精子DNA的断裂率的一些差异。
在分析了47只Holstein公牛个体中的每一只公牛的六只不同精子储存管之后,观察到:来自24只公牛的全部精子储存管在37℃孵育4天后未见感染,而其中的23只在不同的孵育时间检测到细菌感染(表5)。
表5(被感染的精子储存管的百分比和检测感染的时间)
  T0   T4   T24   T48   T72   T96
  H-1   84%   100%
  H-2   84%   100%
  H-3   67%   84%   100%
  H-4   67%   84%   100%
  H-5   50%   84%   100%
  H-6   33%   84%   100%
  H-7   33%   100%
  H-8   33%   84%   100%
  H-9   50%   84%   100%
  H-10   17%   50%   84%   100%
  H-11   100%
  H-12   50%   84%   100%
  H-13   67%   84%   100%
  H-14   84%   100%
  H-15   67%   84%   100%
  H-16   33%   100%
  H-17   100%
  H-18   84%   100%
  H-19   17%   67%   84%   100%
  H-20   33%   50%   67%   100%
  H-21   33%   67%   100%
  H-22   17%   33%   67%   100%
  H-23   33%   100%
表5中示出了依据所建立的阈值水平的在不同孵育时间的细菌的阳性存在。观察各公牛间的在检测到细菌存在时的差别。在一些情况(H-11、H-14、H-17、H-22和H-23)中,解冻后即刻检测到感染;然而,在另外的情况中,感染的出现延迟了24至48小时。在特定孵育时间的被感染的精子储存管的比例也在各个个体间有所变化(表5)。然而,一般说来,来自同一只公牛的大多数精子储存管在孵育后的同一时期显示出可检测到的感染。在显示出细菌感染的那23只公牛中,在T0时15%的精子储存管中明确检测到感染,孵育24小时后在50%的精子储存管中明确检测到感染,在孵育96小时后在所有的精子储存管中明确检测到感染。
为分析SDF的相对比率(rSDF),比较不同时间间隔的各回归线的斜率。rSDF被表达为每小时精子DNA断裂的增加。将全部孵育时间(T0~T96)分成两个间隔:T0至T48,和T48至T96。求算各时间间隔的rSDF,结果示于表6中。具有细菌感染的那些精液样品中DNA受损的比率更高(表6a)。平均说来,对被感染的样品评估的总体rSDF为0.7每小时,而没有被感染的那些样品,其SDF比率为0.05每小时(表6b)。有趣的是,一些被感染的精子储存管没有显示出明显的DNA受损的动力学的斜率,而是表现为未被感染的精子储存管,正如图5D中接近X轴的曲线所表示的。
表6a(显示细菌感染的不同公牛中精子DNA断裂的比率)
  T0-T48   T48-T96   T0-T96
  I1   1.92   0.09   1.01
  I2   1.57   0.12   0.84
  I3   1.24   0.41   0.82
  I4   0.06   0.79   0.42
  I5   1.03   0.35   0.69
  I6   1.22   0.48   0.85
  I7   1.10   0.81   0.96
  I8   1.29   0.29   0.79
  I9   1.47   0.33   0.90
  I10   1.04   0.49   0.77
  I11   0.02   0.02   0.02
  I12   0.08   1.72   0.90
  I13   0.35   1.64   0.99
  I14   0.66   0.64   0.65
  I15   0.02   1.99   1.01
  I16   0.67   0.00   0.33
  I17   1.28   0.70   0.99
  I18   1.54   0.44   0.99
  I19   0.38   1.18   0.78
  I20   0.05   0.81   0.43
  I21   0.63   1.29   0.96
  I22   0.03   1.06   0.55
  I23   0.10   0.39   0.25
  平均值   0.77   0.70   0.73
表6b(显示不存在细菌感染的不同公牛中精子DNA断裂的比率(rSDF))
Figure BDA00002165931400191
Figure BDA00002165931400201
在比较两组动物(F=0.761;P=388)时,T0时未观察到DNA受损水平的差异。比较图5A、5B和5C及5D,DNA受损水平快速变化。因此,当在后续的孵育时间比较受感染的和未受感染的精子储存管中的精子DNA断裂的水平时,得到的统计值如下:T0h:F=0.425;P=0.388;T4h:F=0.425;P=0.518;T24h:F=6.895;P=0.012*;T48h:F=31.477;P=0.000*;T72h:F=73.255;P=0.000*;T96h:F=132.860;P=0.000*(*显著性差异)。统计分析表明细菌感染通常在孵育24小时时显著增大了精子DNA断裂的水平。然而,在一些情况(参见图5D)中,在孵育后的最初几个小时期间就观察到精子DNA断裂水平的快速增大。
另外,分析各公牛的SDA的动态分布时,可以获得rSDF的三个不同的基本分布:对数的、线性的或指数的。伴随对数函数的是孵育最初几个小时期间内的SDF的高增长,而指数函数说明了在孵育的最初几个小时的期间内缓慢地增长。根据各分布获得的较高的R2值对不同公牛进行分组的结果示于表7中。对数曲线是被污染样品中的主要趋势,而线性曲线则是未被污染的样品中的主要趋势(表7)。另外,也必须考虑曲线的斜率,这是因为对于相似的R2值,就DNA断裂动力学而言,低斜率值更佳。
表7(所有被研究的Holstein公牛中rSDF的不同曲线的分布)
表8说明此前未被检测到的细菌量能够使精子DNA的完整性迅速恶化。然而,以细菌感染告终的精子中的DNA的断裂率倾向于以对数方式增加,不存在细菌感染的精子则倾向于具有呈线性增加的DNA断裂。应当注意,该实施例描述的INRA 96包含抗生素盘尼西林和庆大霉素。庆大霉素广泛用于精子悬浮液,但高于一定浓度时会损害精子胞膜。因此,即使在包含这些抗生素的扩增剂中也会发展出的细菌感染事实说明了需要害处更小的无菌培养基。
实施例6
第六个实施例描述了使用环丙沙星(来自氟喹诺酮亚类的喹诺酮)作为用于保存精子等生殖细胞的抗生素。该实验中所示的环丙沙星(喹诺酮)处理减少了由于细菌感染造成的精子DNA断裂的发生。
该实施例采用了总计四只公牛。两只公牛被归类为不良公牛,原因是在该实验前这两只公牛的精子样品在24小时后显示出很高的细菌感染发生率。由于各种原因该结果也一贯发生在其他方面健康的公牛中。不管确切原因为何,选择两只公牛,其历史上产生的精液样品中存在细菌感染。类似地,选定两只公牛,其历史上产生的精液样品中不存在细菌感染。
由四只公牛的每一只收集精液,并在收集时测试,然后再次在24和48小时标记时进行测试。当GelRed染色与精子染色质扩散测试相结合时获得高分辨率的显微镜图像,由该图像确定DNA断裂。呈现分散的染色质斑点的晕环的精子头部包含断裂的DNA,而具有小的晕环的头部表明精子不存在DNA断裂。
为四只公牛中的每一只建立对照组,第二组用Acromax中稀释的1μg/mL的环丙沙星处理,并在解冻时(时间为0小时)染色。表8显示了对照组及处理组中的每一只在染色时、在24小时时和在48小时时的结果。
表8(用环丙沙星处理的公牛以及对照组中的精子DNA断裂的比率)
Figure BDA00002165931400211
表8显示出其精子用环丙沙星处理的不良公牛I和不良公牛II相对恒定的精子DNA断裂(2%~3%),表明这些样品中无细菌感染。与此形成鲜明对比的是,不良公牛1的对照组在24小时后逐步上升至12.67%的精子DNA断裂,然后达到24.33%的DNA精子断裂。DNA断裂的急剧增加表示这些样品中存在细菌感染。不良公牛2的样品可能开始就具有较高的细菌量,因为精子DNA断裂增加得极为迅速,在24小时标记从4.67%增至12.33%,然后在48小时标记增至80%,表明在未被处理的不良公牛II样品中有显著的细菌感染。
来自良好公牛I和II的被处理的和未被处理的每一个样品从收集时起直到48小时均维持了相对恒定的精子DNA断裂(约3%~4%)。这些结果表明环丙沙星对于防止细菌感染是有效的,并且使用环丙沙星不会促进DNA断裂和精子恶化,而许多抗生素在某些水平会促进DNA断裂和精子恶化。这些结果还显示出来自两只良好公牛I和良好公牛II的样品中不存在细菌感染。来自良好公牛I和II的被处理的和未被处理的样品也表明环丙沙星处理不会促进精子DNA断裂,因为未被感染的处理样品和未被感染的未处理的样品显示出相似的精子DNA断裂水平。
令人惊讶的是,环丙沙星在1μg/mL时就实现了防止细菌感染以及伴随的DNA断裂增加的良好结果。本领域中已知的用于防止精子样品中的细菌感染的抗生素未能防止许多感染,因为在杀死所有的或近似所有的细菌时所需的剂量时其对于精子胞膜是有害的。因此,这些抗生素必须以更小的剂量使用。
在一个实施方式中,要求保护的发明涉及为保存精子以用于存储或处理的目的而形成的精子悬浮液,具体而言涉及包含环丙沙星(喹诺酮)的精子悬浮液,其目的是消除或几乎消除细菌感染并且其改善了精子DNA断裂。特别是,要求保护的发明的某些实施方式涉及可包含本领域中已知的多种精子扩增剂中的任一种的精子悬浮液。通常,在极高的自然浓度下收集诸如精子样品等细胞样品,而这些浓度可随着物种的不同而不同,这些样品往往被极高度地浓缩以便于有效的分选或存储。精子样品然后用扩增剂稀释以建立有用的精子浓度。扩增剂还提供培养基从而使在诸如存储、受精或分选等过程中保持精子的健康和活动力。作为描述性实例,可以使用TRIS扩增剂、TALP扩增剂和HEPES INFA 39等扩增剂。这些扩增剂可选地包含抗菌成分,以及用于调节氧化吸收或可逆地降低精子活动力的试剂。
通过改进精子染色方案减少精子DNA的断裂
用于分选携带X染色体和Y染色体的精子的流式细胞术技术目前用于研究和商业应用。在进行性别分选过程前的制备样品过程中,精子通过可能影响其质量的不同的pH处理。通常用于精子性别分选的那些精子扩增剂的pH的差异可能导致精子DNA损伤的量不同。
性别分选过程中的关键步骤是用荧光染料对精子样品染色,该染色过程一般用Hoechst 33342进行。为使该荧光染料渗透精子的细胞膜并以化学计量方式与精子DNA相关联,必须将精子样品的温度和pH升高超过有利于健康精子的水平。按照常规,精子的pH用透明的TALP(7.4pH)升高至约7.4pH。为缩短染色时间,精子样品随后在约34℃~39℃的较高的温度下与染料孵育。
此前,在Hoechst染色后通过添加第二TALP使精子样品的pH返回至正常的pH范围(例如,对于牛为6.8pH)。第二TALP一般与透明的TALP的组成类似,不过可以包含红色食品染料且pH为5.5。该第二TALP往往被称为红色TALP。5.5pH被预先设计为使样品的总体pH返回到大约为精子的正常的pH范围(例如,对于牛为6.8pH)。
在以下的实施例中,检查来自30只公牛的新鲜的精液样品的行业可接受的活动力、浓度和形态。各公牛提供来自不同射精精液的两份样品。使用的样品的pH在6.1~7.6之间变化,平均为6.6。各精子样品用Hoechst 33342染色,TALP的计算量基于精液的浓度,依照用于染色的行业标准并结合流式细胞仪中的分选。各样品随后与红色TALP(其包含红色食品染料,为5.5pH、6.4pH和7.4pH)混合。pH 5.5的红色TALP代表了添加红色食品染料作为染色过程的一部分的行业标准。
红色TALP例如可制备在包含葡萄糖和BSA的HEPES类培养基中并含有4%的卵黄,不过本领域的技术人员将理解也可以制备含有其他百分比的卵黄。可将NaOH或HCl加入到红色TALP中以调整TALP至所需的pH。
实施例7
来自不同品种的公牛(n=30)的新鲜的精液样品获自Texas的一个公牛群(SexingTechnologies,Navasota,TX,USA)。由每只公牛随机选择两份样品,标准为“样品来自不同射精精液”。该研究中所用的样品的pH值在6.1~7.6之间,平均为6.6。
所有的公牛都是健康的,并接受受控的饲喂、圈养和接收自然光照条件及环境温度。使用人工阴道收集精液样品,并使该样品经历标准精液特性的质量控制(最小活动力≥55%;最小浓度为约9亿/mL,使用SP1-Cassette,Reagent S100和
Figure BDA00002165931400231
SP-100TM系统-ChemoMetec A/S,Gydevang 43,DK-3450
Figure BDA00002165931400232
Denmark-测定;初级形态≤15%,次级形态≤15%,总形态计数不超过25%)。
将各精液分成四个单独的剂量,并装入12x 75mm的管(Hauppauge,New York)中。保留一个纯精液样品为对照,另外三个等分试样用16μL的8.1mM Hoechst 33342(Molecular Probes,Eugene,Oregon,USA)和基于纯精液浓度计算的量的改良Tyrode白蛋白乳酸盐丙酮酸盐(透明的TALP,Ph 7.4)处理。为了在性别分选过程中分离活的和死亡的精子,将三个不同pH处理水平(5.5、6.4和7.4)的红色TALP添加至精子样品中。
使用SCDt(Fernández等.2005;López-Fernández等2007),公牛Sperm-
Figure BDA00002165931400241
试剂盒(Halotech DNA,Madrid,Spain),在添加红色TALP处理(T0Hr)后1小时和在34℃孵育24小时对精子DNA断裂的动力学进行评估。用透明的TALP(pH 7.4)将用于评估精子DNA损害的最终浓度调节至3至5x106个精子/mL。
为进行每个实验,5微升(μL)的各稀释的等分试样与10μL的低熔点琼脂糖混合。接下来,取2μL的该混合物,使其在8个圆形预处理的载玻片(Sperm-
Figure BDA00002165931400242
kit)上被增容,其上覆盖23x23mm的盖玻片,然后放置在冰箱(4℃)中的冷金属板上5分钟。之后,移开盖玻片,将各载玻片水平设置在10mL的细裂解液(Sperm-
Figure BDA00002165931400243
kit)中5分钟,然后于室温在dH2O中洗涤载玻片5分钟。裂解过程得到的拟核在一系列乙醇浴(70%、90%和100%)中脱水2分钟。一旦载玻片干燥,则使用1:1比例的Sybr10x荧色物(Biotium Inc.,Hayward,California,USA)和
Figure BDA00002165931400245
(VectorLaboratories Inc.Burlingame,California,USA)Mounting Medium对其进行染色。使用以自动扫描软件控制的Leica DMLA型机械化的落射荧光显微镜,通过荧光显微术使样品可见。使用的是配备有金属卤化物灯的Leica EL6000荧光光源和常规用Plan-Fluotar 40倍物镜。
呈现小而紧密的染色质分散的晕环的精子头部包含正统的DNA分子,而呈现大而不齐整的分散的染色质的晕环的头部则确定精子具有断裂的DNA。对精子进行计数并将其分成两组:断裂的和未断裂的,基于对300个精子的测定计算百分比。
对于数据的初步修订,使用Microsoft Office Excel 2007创建图形。使用方差分析(AVONA)来确定是否在各组的平均值之间存在统计学差异(α=0.05)(SPSSv.17.0forWindows,SPSS Inc.,Illinois,USA)。使用邦费罗尼事后检验来确定各组之间的成对方向差。
当Sybr Green染色与精子染色质扩散测试相结合时,获得高分辨率的显微镜图像。呈现分散的染色质斑点的晕环的精子头部包含断裂的DNA,而具有小的晕环的头部表明精子不存在DNA断裂。
为分析pH扩增剂随时间推移对精子质量的影响,在两个不同的孵育时间(0小时和24小时)评估精子DNA断裂,将数据绘图,并根据扩增剂的pH进行比较。各组绘制于图6中时,不同时间的精子DNA断裂的值和每次处理的动力学图示(所有公牛的平均值)显示出明显的差异。
原始样品中的精子DNA断裂的基线水平(T0)在所有公牛中都极为相近,从不表现超过18%的值,平均为6.5%±3.9%。增加不同的pH处理(pH 5.5:5.7+3.9%;pH 6.4:5.5+3.9%;pH 7.4:5.1+3.9)时,该值并未显示在0Hr时的明显差异(P=0.749;F=0.406)。然而,精子在34℃孵育24小时后,依据所添加的扩增剂的pH,精子DNA的断裂随时间推移差异地增加(P=0.001;F=5.640)。
邦费罗尼事后检验也确定了各pH组之间在0Hr时没有DFI的显著差异(表10)。不过,在24Hr时,用红色TALP 7.4处理的样品组与原始精液(P=0.001)以及用红色TALP 5.5处理的样品之间(P=0.039)显现出DFI的显著差异(表9)。
表9(对于pH处理组和纯对照组在9小时的DFI的邦费罗尼事后检验)
邦费罗尼事后检验
Figure BDA00002165931400251
未显示出显著差异(P>0.05)。
表10(对于pH处理组和纯对照组在24小时的DFI的邦费罗尼事后检验)
邦费罗尼事后检验
Figure BDA00002165931400261
用红色TALP 7.4处理的样品组与原始精液(P=0.001)以及用红色TALP 5.5处理的样品之间(P=0.039)显现出DFI的显著差异。
该研究的结果表明DNA分子会受到pH波动的影响。看起来较低的pH能够增大DNA随时间推移而受损的比率。这对于改善性别分选过程可能是十分重要的。值得注意的是,未被稀释的纯精液对照组整体上具有更高的DNA断裂水平,表明了高精子浓度和精浆的负面效果。
用于减少经分选的精子中的DNA断裂的改进的过程
在一个实施方式中,精子用氟喹诺酮亚组中的喹诺酮(即环丙沙星)处理。该抗生素显示出杀死所有的或几乎所有的细菌(所述细菌能够耐受得此前在实施例5和6中的精子细胞处理中已知的常规抗生素)的能力,且其本身不会损害精子。诸如庆大霉素等常规的抗生素受限于在缓冲液中的或通过其他培养基所能应用于精子的剂量。作为一个实例,庆大霉素的剂量在超过常规剂量时会对精子胞膜产生损害。实施例5中发现的细菌感染是惊人的,即使在存在常规剂量的庆大霉素和盘尼西林时也发现了该细菌感染。
环丙沙星等喹诺酮的添加可以在精子处理的全过程中的任何不同的时间点进行。例如,可以在获得精子时用喹诺酮处理所述精子。无论精子是通过解冻冷冻的精子储存管还是通过收集精液获得,都可以通过直接收集到包含喹诺酮的缓冲液中或通过使精子样品与包含喹诺酮的溶液混合而引入喹诺酮。
一旦精子样品被荧光DNA选择性染料等标记物染色,就可以通过流式细胞术来检验精子。应当理解,也可以使用用于测量和检测分子标记和/或荧光标记的其他方法;这些方法包括但不限于使用分光光度计和微流体芯片,并且这些也应当被视为所公开的方法的实施方式。可以按照如上提及的美国专利6,357,307中的描述使用流式细胞术,以确定各细胞中的DNA的量,并基于该测定来分离细胞。
一旦细胞经过评估,它们可以以多种方式分离。美国专利6,357,307论述了利用与流式细胞术联合使用的电磁偏转。不过,本方法的实施方式也涵盖了利用微流体通道来分离所述细胞。美国专利申请公开2006/0270021号和美国专利7,298,478号(其全部内容以引用的方式特此并入本文中)提供了能够用于分离精子的微流体槽的实例。无论何种分离方法,均理想的是减少分选的精子亚群体中的DNA断裂以促进成功的妊娠和分娩。本文中所提出的实施方式涉及改变精子处理过程以减少性别分选后存在的DNA断裂或者减少性别分选后DNA断裂比率的增大。
在一个方面中,通过使用喹诺酮改善了DNA断裂的水平,已经发现所述喹诺酮比庆大霉素等普通的抗生素更为有效,且不具有伴随使常见抗生素的剂量增大的对精子胞膜的有害作用。在另一个方面中,已经显示出通过改变执行某些染色步骤时的pH,对染色过程的改进使性别分选的精子亚群体中的DNA断裂有所改善。
现在回到图4,图中示出了实施本文中所描述的某些方法的系统。所述系统包括建立用于分析和/或分选的细胞供应的细胞源1。随着从鞘液源4引出的鞘液3,所述细胞被引进喷嘴2。鞘液3在细胞周围形成鞘液环境,这样两者都通过喷嘴孔口5而从喷嘴2送出。
将液体提供给喷嘴2的压力影响了离开喷嘴孔口5的流体8的速度。流体8可进一步通过振荡器控制器7被振荡器6控制,该控制器7在喷嘴2和喷嘴孔口5中产生压力波。这些压力波经过喷嘴4和喷嘴孔口5传递至流体8,导致在断开点规则地形成液滴9。可以调节喷嘴孔口5的直径和振荡器6的频率从而产生足够大以夹带分离的细胞的液滴。
根据夹带在每个液滴9中的细胞的特征,对夹带单独细胞的液滴9进行分析和/或分选。作为流式细胞仪的一部分,可以引入细胞传感系统10以判断这些区别。细胞传感系统10可包括检测器或传感器11,以对流体8所包含的细胞作出响应。细胞传感系统10可依据诸如生殖力特性等特性的相对存在或缺失而产生作用。例如,可以使用DNA选择性染料的存在、缺失或量来表征细胞为更多具有X染色体还是Y染色体。
作为一个实例,如荧色物染料等DNA选择性染料可以作为分子标记物与细胞内的DNA结合。所述DNA选择性染料可以被如激光器等激发装置12激发,其发射照射光束以导致该DNA选择性染料反应或发荧光。为了性别分选精子的目的,每个精子均可以用如Hoechst 33342等DNA选择性染料染色。每个通过细胞的总荧光取决于每个细胞内含有的DNA的量,因此提供区分携带X染色体精子和携带Y染色体精子的手段。精子样品包含大量的死的或膜受损的精子,而这些精子对于分选来说是不可取的。为了除去受损的精子,采用了第二染色步骤,该步骤引入了淬灭染料。淬灭染料通过减弱或减少来自受损精子内部的可检测到的荧光而改变了DNA选择性染料与膜受损的精子之间的相互作用。这样,受损的精子不会产生可能将被量化为携带X染色体或携带Y染色体的荧光。相反,低荧光发射表征精子是受损精子或死精子。
用第一荧光染料和第二淬灭染料染色细胞的过程可能有助于已经显示为在分选后发生的DNA断裂。本文中所示的一个实施方式中,第二染料应用于具有较高的pH的第二培养基中,该pH可以是与包含DNA选择性染料的第一培养基的pH极为相似的pH。应理解,在牛的情况中,第一和第二染料的pH可以大约为7.4左右,但是染色条件对于通过荧光染料来染色不同物种的精子而言是已知的,而且本文中所示的实施方式涵盖了:除了第二染料之外,在相同的或相似的pH下也可以进行那些过程。本文中公开的其他方面涉及使第二培养基的pH与第一培养基相协调。
荧光可以被传感器11获得,并被转化成电信号。所述电信号可以被输入到分析仪13中,根据发射的荧光做出判断。分析仪13可以连接液滴充电器,该液滴充电器用于对流体8并进而对液滴9(就在其被断开之前)进行差异性的充电。可以调节检测和充电的时机,使得流体恰好在液滴(其含有被分析的细胞)断开之前带电。一旦所述液滴被断开,其保留所述流体的电荷。
图4也示出了喷嘴2两侧的偏转板14,以引导细胞进入几个可能轨道中的一个。所述偏转板可以被相反的电场充电,例如,分别为左手板大约+2500伏特,右手板-2500伏特。应理解,依据所述装置,所述板在任一极化中可以被充电至不超过约4000伏特。本领域熟悉流式细胞仪操作的技术人员可以使用多种电荷配置将这种偏转板设定为任意数量的配置。例如,液流的速度越快,需要越高的电压将液滴拉进特定的轨道。如果液滴落在偏转板之间,它们会被吸引向带有相反电荷的板,或者在没有对液滴9施加电荷的情况中则垂直下落。收集容器15被图示为三个用于收集液滴的容器:未带上电荷的,带上正电荷的和带上负电荷的。应理解,图4中示出的一组3个容器15可以配置在MoFlo SX上,但所示流体中的一个用于废的或空的液滴。因此,为了将样品分选为三个群体,需要一个额外的容器用于废样。可以配置MoFlo SX XDP以用于富含X的液流、富含Y的液流、未被分选的活的液流以及包含死精子的废液流。
淬灭染料主要用于区分样品中死的或膜受损的精子与其他的健康的精子。这可通过淬灭染料在死精子中的积聚来实现。Hoechst 33342等荧色物染料将同时与死精子和活精子的DNA结合。然而,只有死的或膜受损的细胞将会在膜内同时具有荧色物和淬灭染料。当辐射能量(通常是在UV波长操作的激光器)激发这种死的或受损的精子时,荧色物染料所发出的一部分光将被膜内的淬灭染料吸收或衰减。这样,死细胞被淬灭,因而它们仅能发射出强度较弱的信号,与产生更强的信号的未淬灭的活的精子形成对比。
要根据淬灭染料吸收或衰减由荧色物染料发出的光或荧光的能力来具体选择淬灭染料,而这可能导致分辨率的其他问题。一个问题源自使用了传统的淬灭染料(如红色食品染料40),特别是在使用流式细胞术时,这是因为除了与死精子关联的淬灭染料之外,还有一些淬灭染料存在与核心流中。该松散的或无关的淬灭染料随后会减弱活细胞和死细胞中由荧色物产生的信号。简而言之,该无关的染料往往使所有的信号均减弱,使得检测器更难以捕捉到所关注的光。这导致检测器的分辨率的损失。活细胞和死细胞间的差异通常仍是清晰可辨的。不过,这种分辨率的损失会影响性别分选精子的纯度,因为携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子中DNA的量的差异通常约为2%~4%。
令人惊讶的是,已经发现黄色6食品染料通过提供对死精子的有效淬灭并破坏核心流中较少的发射光而改进了用于分选精子的流式细胞术的分辨率。黄色6食品染料进入膜受损的精子中以致其极大地减弱同一DNA上的荧光染料所产生的任何荧光。该黄色染料淬灭了死细胞发出的荧色物足以使死细胞明显区别于活细胞,但核心流中的黄色染料只减弱了较少的光,表明携带X染色体的精子和携带Y染色体之间的精子的分辨率得以改进。在一个实施方式中,通过使用黄色6食品染料作为淬灭染料,可以减少荧色物染料的量。众所周知,用于荧色物染料的染色条件对于脆弱的精子是苛刻的。任何减少染色所需的荧色物染料的量或染色所需的孵育时间的步骤都对精子的长期健康提供了相当大的好处。因此,作为淬灭剂的黄色6食品染料通过改善分选精子的活力而提供相当大的好处。
类似地,相比于现有技术中的这些染料,使用绿色食品染料、橙色食品染料或蓝色食品染料也是有益的。作为淬灭染料的黄色食品染料在分辨率不良的其他情况中也能够提供类似的好处。例如,解冻的此前冷冻的精子比新鲜的精子更难分辨,而使用黄色染料作为淬灭染料可改善分辨率。还应理解,与标准剂量的红色食品染料相比,为获得改善的结果还可以在较低的浓度下使用红色食品染料。不过,增大红色食品染料的量已经显示出对分选分辨率存在负面影响。
图7A示出了性别分选精子的流式细胞仪的屏幕截图,特别示出了流动的样品中的精子的前向荧光相对于流动的样品中的精子的侧向荧光。该图中的精子用荧色物染料(Hoechst 33342)以及红色食品染料40染色。图7A中的区域R2代表被红色食品染料高度淬灭的精子。由于该红色食品染料所致,这些被淬灭的精子未发出强烈的前向荧光或侧向荧光。相反,区域R1则描绘了活的未被淬灭的精子,其均被适当地定向并且是活跃的,产生了明显的前向荧光和侧向荧光。R1中的这些精子通常随后被选通以分离为富含X和/或富含Y的精子群体。图7B示出了对与图7A相同的公牛进行的典型染色,不过使用黄色染料6作为淬灭剂。比较图7A和图7B,可以看出图7B仍保持了R1和R2之间的明显区别。黄色6食品染料还在公牛的活精子与死精子分离不良的情况中提供了有利之处。具体而言,黄色6食品染料可增大至至少400%的浓度,同时维持良好的分辨率。相反,红色食品染料增大至超过100%时则极快地对分选分辨率产生显著影响。
现在参看图8A和8B,图中示出了表示两种分选物的峰值前向荧光的单参数直方图。图8A对应于用红色食品染料处理的图7A,图8B对应于用黄色食品染料处理的图7B。在各图中,两个不同的峰可以表示各自具有X染色体和Y染色体的精子群体。这些峰重叠得越多,分辨率越低,导致纯度越低,而且在大多数情况中,可能不得不减小分选速度以获得能够接受的纯度,且分辨率不良。
尽管本发明描述了数量有限的实施方式,但是本领域技术人员可从本公开中受益,并将理解到可以设计其它的实施方式,其并没有背离本文公开的本发明的保护范围。具体而言,用喹诺酮处理精子样品以减少给定样品中的细菌感染和DNA断裂的水平,可以预计该处理在其他类型的生殖细胞样品(如卵母细胞、胚胎和其他相关的细胞类型的悬浮液)中也同样将工作良好。使用现有技术,或本专利提交日之后开发的技术,在权利要求的范围内可以实施众多的替代性实施方式。
因此,可以对所列举的实施方式中描述说明的处理步骤和结构进行许多改进和变化。因而,本发明的范围应当仅由权利要求所限定。以上的说明书描述了至少以下方面。
1.一种用于减少的精子样品中DNA断裂的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得精子样品;
b.使所述精子样品与喹诺酮结合;和
c.抑制所述精子样品中的细菌生长。
2.如权利要求67所述的方法,其中,所述喹诺酮包括氟喹诺酮。
3.如权利要求68所述的方法,其中,所述氟喹诺酮包括环丙沙星。
4.如权利要求67所述的方法,所述方法还包括冻存所述精子样品的步骤。
5.如权利要求67所述的方法,所述方法还包括用缓冲溶液增容所述精子样品以形成增容的精子样品的步骤。
6.如权利要求71所述的方法,其中,使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤还包括对选自由所述精子样品、所述增容的精子样品和所述缓冲溶液组成的组中的一种施用所述喹诺酮。
7.如权利要求72所述的方法,其中,所述缓冲溶液选自由TRIS类缓冲液、柠檬酸钠类缓冲液、卵黄类缓冲液、奶类缓冲液、TALP类缓冲液、HEPES类缓冲液、磷酸盐类缓冲液、硼酸盐类缓冲液、碳酸氢盐类缓冲液、含有BSA的缓冲液及其组合组成的组。
8.如权利要求67所述的方法,其中,使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤还包括用喹诺酮孵育所述精子样品。
9.如权利要求67所述的方法,其中,使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤基本上发生在收集精子的时候。
10.如权利要求70所述的方法,所述方法还包括将冻存的所述精子样品解冻的步骤。
11.如权利要求76所述的方法,其中,使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤发生在将冻存的所述精子样品解冻的步骤之后。
12.如权利要求67所述的方法,其中,以约0.05μg/ml~约20μg/ml的浓度提供喹诺酮。
13.如权利要求78所述的方法,其中,以约0.2μg/ml~约5μg/ml的浓度提供喹诺酮。
14.如权利要求79所述的方法,其中,以约0.1μg/ml~约2μg/ml的浓度提供喹诺酮。
15.如权利要求67所述的方法,其中,形成抗菌培养基的步骤还包括对IVF培养基和/或IVF过程施用喹诺酮以减少或抑制卵子和/或胚胎的细菌污染的步骤。
16.如权利要求67所述的方法,所述方法还包括以下步骤:
a.基于所需的生殖力特征对所述精子样品中的精子进行区分;和
b.基于所述所需的生殖力特征分选精子。
17.如权利要求82所述的方法,其中,基于所需的生殖力特征分选精子的步骤还包括:对所述精子样品中的精子进行性别分选以形成携带X染色体的精子的性别富集群体和/或携带Y染色体的精子的性别富集群体。
18.如权利要求67所述的方法,所述方法还包括由所述精子样品建立授精样品的步骤。
19.一种用于处理精子样品以使得更少的精子具有DNA断裂的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得精子样品;
b.用具有pH的第一培养基中的DNA选择性染料对所述精子样品进行染色;
c.对包含第二染料的第二培养基的pH调整使之与所述第一培养基的pH相协调;和
d.用所述第二培养基中的所述第二染料对所述精子样品进行染色。
20.如权利要求85所述的方法,所述方法还包括以下步骤:
a.根据与各精子相关联的DNA选择性染料的量将经染色的精子样品分选为不同的亚群体;和
b.基于所述分选步骤收集至少一个精子亚群体。
21.如权利要求86所述的方法,其中,将所述第二培养基的pH调整至所述第一培养基的2pH之内。
22.如权利要求87所述的方法,其中,将所述第二培养基的pH调整至所述第一培养基的1pH之内。
23.如权利要求88所述的方法,其中,将所述第二培养基的pH调整为大致与所述第一培养基的pH相同。
24.如权利要求85所述的方法,其中,所述第二染料是淬灭染料。
25.如权利要求90所述的方法,其中,所述第二培养基包含红色TALP。
26.如权利要求91所述的方法,其中,所述红色TALP包含TALP类的缓冲剂和红色食品染料。
27.如权利要求92所述的方法,其中,所述淬灭染料是选自由红色食品染料、percoll、碘化丙啶和台盼蓝组成的组中的一种。
28.如权利要求85所述的方法,其中,所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的pH为约5.5~约7.4。
29.如权利要求85所述的方法,其中,所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的pH为约6.4~约7.4。
30.如权利要求85所述的方法,其中,所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的pH为约5.5~约6.4。
31.如权利要求96所述的方法,其中,所述红色TALP的pH大于5.5。
32.如权利要求85所述的方法,其中,所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的pH为大致与所述第一培养基的pH相同的值的步骤。
33.如权利要求85所述的方法,其中,所述精子样品包含牛精子,并且所述第一染料和第二染料的pH均为约7.4。
34.如权利要求85所述的方法,其中,所述第二培养基的pH大于5.5。
35.如权利要求85所述的方法,其中,基于携带X染色体或Y染色体来分选所述精子。
36.如权利要求85所述的方法,其中,所述第一染色剂包括荧光DNA选择性染料。
37.如权利要求102所述的方法,其中,所述第一染色剂包括Hoechst 33342。
38.如权利要求85所述的方法,其中,所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括基于所述第一培养基的pH和所述精子样品的pH调节所述第二培养基的pH的步骤。
39.如权利要求104所述的方法,其中,所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的pH以实现精子样品的pH为6.6~7.2的步骤。
40.如权利要求85所述的方法,所述方法还包括在缓冲溶液中增容所分选的精子的步骤,所述缓冲溶液选自由TRIS类缓冲液、柠檬酸钠类缓冲液、卵黄类缓冲液、奶类缓冲液、TALP类缓冲液、MOPS类缓冲液、HEPES类缓冲液、磷酸盐类缓冲液、KMT类缓冲液、硼酸盐类缓冲液、碳酸氢盐类缓冲液、包含BSA的缓冲液及其组合组成的组。
41.如权利要求85所述的方法,其中,所述用所述第一培养基和第二培养基进行染色的步骤与单一的pH调整事件同时进行。
42.如权利要求85所述的方法,其中,所述获得精子的步骤还包括将此前冷冻的精子存储管解冻。
43.如权利要求86所述的方法,所述方法还包括将所分选的精子冻存的步骤。

Claims (70)

1.一种用于抑制细胞样品中细菌的生长的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得生殖细胞样品或精子样品;
b.使所述生殖细胞样品或精子样品与喹诺酮结合;和
c.抑制所述生殖细胞样品或精子样品中的细菌生长。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述喹诺酮包括氟喹诺酮。
3.如权利要求2所述的方法,其中,所述氟喹诺酮包括环丙沙星。
4.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括冻存所述精子样品的步骤。
5.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括用缓冲溶液增容所述精子样品以形成增容的精子样品的步骤。
6.如权利要求5所述的方法,其中,使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤还包括对选自由所述精子样品、所述增容的精子样品和所述缓冲液组成的组中的一种施用所述喹诺酮。
7.如权利要求6所述的方法,其中,所述缓冲溶液选自由TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP、HEPES、磷酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、MOPS、含有BSA的缓冲液及其组合组成的组。
8.如权利要求1所述的方法,其中,使所述生殖细胞样品或精子样品与喹诺酮结合的步骤还包括用喹诺酮孵育所述生殖细胞样品或精子样品。
9.如权利要求1所述的方法,其中,使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤基本上发生在收集精子的时候。
10.如权利要求4所述的方法,所述方法还包括将冻存的所述精子样品解冻的步骤。
11.如权利要求10所述的方法,其中,使所述精子样品与喹诺酮结合的步骤发生在将冻存的所述精子样品解冻的步骤之后。
12.如权利要求1所述的方法,其中,以约0.05μg/ml~约20μg/ml、约0.2μg/ml~约5μg/ml和/或约0.1μg/ml~约2μg/ml的浓度提供所述喹诺酮。
13.如权利要求1所述的方法,其中,形成抗菌培养基的步骤还包括对IVF培养基和/或IVF过程施用喹诺酮以减少或抑制卵子和/或胚胎的细菌污染的步骤。
14.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括以下步骤:
a.基于所需的生殖力特征对所述精子样品中的精子进行区分;和
b.基于所述所需的生殖力特征分选精子。
15.如权利要求16所述的方法,其中,基于所需的生殖力特征分选精子的步骤还包括:对所述精子样品中的精子进行性别分选以形成携带X染色体的精子的性别富集群体和/或携带Y染色体的精子的性别富集群体。
16.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括由所述精子样品建立授精样品的步骤。
17.一种增容的精子样品,所述样品包含:
a.精子;
b.喹诺酮;和
c.缓冲溶液。
18.如权利要求17所述的增容的精子样品,其中,所述喹诺酮包括氟喹诺酮。
19.如权利要求18所述的增容的精子样品,其中,所述氟喹诺酮包括环丙沙星。
20.如权利要求17所述的增容的精子样品,其中,以约0.05μg/ml~约20μg/ml、约0.2μg/ml~约5μg/ml和/或约0.1μg/ml~约2μg/ml的浓度提供所述喹诺酮。
21.如权利要求17所述的增容的精子样品,其中,所述缓冲溶液选自由TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP、MOPS、HEPES、磷酸盐、KMT、硼酸盐、碳酸氢盐、含有BSA的缓冲液及其组合组成的组。
22.如权利要求17所述的增容的精子样品,其中,所述精子包括根据生殖力特征分选的精子。
23.如权利要求22所述的增容的精子样品,其中,所述生殖力特征包括存在X染色体或存在Y染色体。
24.一种对受到污染的细胞样品或细胞培养基进行灭菌的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得包含生殖细胞的细胞样品;
b.对受到污染的细胞样品或细胞培养基施用一种或多种喹诺酮;和
c.通过消除或最大限度地减少所述细胞样品中的细菌或微生物的水平来恢复细胞系。
25.如权利要求24所述的方法,其中,对所述受到污染的细胞样品或细胞培养基施用一种或多种喹诺酮的步骤还包括用所述一种或多种喹诺酮孵育所述细胞样品或细胞培养基。
26.如权利要求24所述的方法,其中,细胞培养样品或细胞培养物包含选自由精子、卵母细胞、卵子、胚胎、经培养的胚胎组成的组中的一种。
27.一种用于产生胚胎的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得精子样品;
b.将所述精子样品的一部分添加至含有未受精的卵子的悬浮液中以形成配子悬浮液;
c.在所述配子悬浮液中用一个所述精子使所述卵子受精;
d.使一种或多种喹诺酮与所述精子样品或所述配子悬浮液或者两者结合;和
e.抑制所述精子样品或所述受精卵中的细菌生长。
28.如权利要求31所述的产生胚胎的方法,所述方法还包括以下步骤:
a.使用DNA选择性染料对所述精子样品中的精子进行染色;和
b.基于所述DNA选择性染料的相对吸收对所述精子样品中的精子进行分选。
29.如权利要求32所述的方法,其中,所述DNA选择性染料的相对吸收代表X染色体或Y染色体的存在。
30.一种用于处理精子样品的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得精子样品;
b.用具有pH的第一培养基中的DNA选择性染料对所述精子样品进行染色;
c.对包含第二染料的第二培养基的pH调整使之与所述第一培养基的pH相协调;和
d.用所述第二培养基中的所述第二染料对所述精子样品进行染色。
31.如权利要求30所述的方法,所述方法还包括以下步骤:
a.根据与各精子相关联的DNA选择性染料的量将经染色的所述精子样品分选为不同的亚群体;和
b.基于所述分选步骤收集至少一个精子亚群体。
32.如权利要求31所述的方法,其中,将所述第二培养基的pH调整至所述第一培养基的2pH和/或所述第一培养基的1pH之内。
33.如权利要求32所述的方法,其中,将所述第二培养基的pH调整为大致与所述第一培养基的pH相同。
34.如权利要求31所述的方法,其中,所述第二染料是淬灭染料。
35.如权利要求34所述的方法,其中,所述第二培养基包含红色TALP。
36.如权利要求35所述的方法,其中,所述红色TALP包含TALP类的缓冲剂和红色食品染料。
37.如权利要求34所述的方法,其中,所述淬灭染料是选自由红色食品染料、黄色食品染料、percoll、碘化丙啶和台盼蓝组成的组中的一种。
38.如权利要求30所述的方法,其中,所述对第二培养基的pH调整的步骤还包括调整所述第二培养基的pH至约5.5~约7.4、约6.4~约7.4和/或约5.5~约6.4的步骤。
39.如权利要求40所述的方法,其中,所述红色TALP的pH为大于5.5。
40.如权利要求34所述的方法,其中,对所述第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的pH为大致与所述第一培养基的pH相同的值的步骤。
41.如权利要求34所述的方法,其中,所述精子样品包含牛精子,并且所述第一染料和第二染料的pH均为约7.4。
42.如权利要求34所述的方法,其中,所述第二培养基的pH大于5.5。
43.如权利要求34所述的方法,其中,基于携带X染色体或Y染色体来分选所述精子。
44.如权利要求34所述的方法,其中,所述第一染色剂包括荧光DNA选择性染料。
45.如权利要求44所述的方法,其中,所述第一染色剂包括Hoechst 33342。
46.如权利要求34所述的方法,其中,对第二培养基的pH调整的步骤还包括基于所述第一培养基的pH和所述精子样品的pH调节所述第二培养基的pH的步骤。
47.如权利要求46所述的方法,其中,对第二培养基的pH调整的步骤还包括调节所述第二培养基的pH以实现精子样品的pH为6.6~7.2的步骤。
48.如权利要求34所述的方法,所述方法还包括在缓冲液中增容所分选的精子的步骤,所述缓冲液选自由TRIS、柠檬酸钠、卵黄、奶、TALP、MOPS、HEPES、磷酸盐、KMT、硼酸盐、碳酸氢盐、包含BSA的缓冲液及其组合组成的组。
49.如权利要求34所述的方法,其中,所述用所述第一培养基和第二培养基进行染色的步骤与单一的pH调整事件同时进行。
50.如权利要求34所述的方法,其中,所述获得精子的步骤还包括将此前冷冻的精子存储管解冻。
51.如权利要求35所述的方法,所述方法还包括将所分选的精子冻存的步骤。
52.一种处理精子的方法,所述方法包括以下步骤:
a.收集包含精子的精液;
b.在进行任何其他处理步骤之前,对选自所述精液的pH和所述精液的浓度中的一个进行调节;
c对经调节的精子进行染色;和
d.将经染色的缓冲的精子分选为性别富集的亚群体。
53.如权利要求52所述的方法,其中,所述的调节步骤包括在任何其他的处理步骤之前在缓冲溶液中调节所述精液的pH。
54.如权利要求52所述的方法,其中,所述的调节步骤包括调节所述精液中的精子的浓度。
55.如权利要求52所述的方法,其中,所述的调节所述精液中的精子的浓度的步骤还包括将所述精液离心的步骤。
56.如权利要求55所述的方法,其中,对具有低浓度的精子的精液进行离心,然后与TALP缓冲液再结合,由此调节所述样品的pH和/或浓度。
57.如权利要求56所述的方法,其中,所述TALP缓冲液包含包括pH为约7的缓冲液。
58.如权利要求52所述的方法,其中,对于给定的精液,通过调节所述精液的浓度或pH使得处理过程中导致的DNA断裂的量相对于未被调节的精液部分减少。
59.如权利要求52所述的方法,其中,通过将所述精液直接收集到缓冲溶液中来完成所述pH或浓度的调节步骤。
60.一种对精子进行染色的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得精子;
b.在受控的染色条件下用荧色物染料孵育所述精子;
c.向所述精子中添加淬灭染料,其中,所述淬灭染料选自由黄色食品染料、橙色食品染料、绿色食品染料及其组合组成的组。
61.如权利要求60所述的方法,其中,所述淬灭染料包括黄色食品染料。
62.如权利要求61所述的方法,其中,所述黄色食品染料包括6号黄色食品染料。
63.如权利要求61所述的方法,其中,黄色食品染料提供了比传统的红色食品染料淬灭剂更高的分选分辨率。
64.如权利要求60所述的方法,其中,所述受控的染色条件包括:
a.在30℃~39℃的温度进行孵育;
b.在7.0~7.4的pH进行孵育;和
c.孵育20分钟~1小时的时间。
65.如权利要求60所述的方法,其中,所述获得精子的步骤还包括将已冷冻的精子解冻。
66.如权利要求60所述的方法,其中,将所染色的精子在微流体装置中进行分选。
67.如权利要求60所述的方法,其中,所述荧色物染料包括Hoechst 33342。
68.如权利要求60所述的方法,其中,所述添加所述淬灭染料的步骤在于受控的染色条件下进行孵育的步骤之后发生。
69.如权利要求60所述的方法,其中,所述添加所述淬灭染料的步骤在用所述荧色物染料进行孵育的过程中发生。
70.一种对通过权利要求60的方法染色的精子进行分选的方法,还包括以下步骤:
a.使所述经染色的精子流经微流体装置;
b.使所染色的精子曝露于辐射能量以激发所述荧色物染料;
c.基于所染色的精子响应所述辐射能量而发出的荧光能量来区分携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子。
CN201080065616.7A 2010-04-01 2010-12-30 减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统 Pending CN102812123A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32018310P 2010-04-01 2010-04-01
US61/320,183 2010-04-01
US32419210P 2010-04-14 2010-04-14
US61/324,192 2010-04-14
PCT/US2010/054549 WO2011053727A2 (en) 2009-10-30 2010-10-28 Methods and systems for reducing dna fragmentation in a population of sperm cells
USPCT/US2010/054549 2010-10-28
PCT/US2010/062598 WO2011123166A2 (en) 2010-04-01 2010-12-30 Methods and systems for reducing dna fragmentation in a processed sperm sample

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102812123A true CN102812123A (zh) 2012-12-05

Family

ID=44712821

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080065616.7A Pending CN102812123A (zh) 2010-04-01 2010-12-30 减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130011825A1 (zh)
CN (1) CN102812123A (zh)
BR (1) BR112012025022A2 (zh)
CA (1) CA2794934A1 (zh)
WO (1) WO2011123166A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110325632A (zh) * 2017-02-24 2019-10-11 西莱提维公司 用于分离活动细胞的装置和方法
CN111323361A (zh) * 2020-03-17 2020-06-23 南通大学 一种快速分离精子头、精子尾和正常有活力精子的方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10292445B2 (en) * 2011-02-24 2019-05-21 Rochester Institute Of Technology Event monitoring dosimetry apparatuses and methods thereof
EP2761275B1 (en) * 2011-09-30 2017-06-21 Inguran, LLC Sperm staining and sorting methods
US10620213B2 (en) 2012-10-05 2020-04-14 Inguran, Llc High pressure sperm sorting and flow cytometer methods
WO2014055112A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Inguran, Llc High efficiency methods of sex sorting sperm
US9189742B2 (en) 2013-11-20 2015-11-17 Justin London Adaptive virtual intelligent agent
CA2905670A1 (en) 2014-09-26 2016-03-26 Inguran, Llc Sex sorted sperm demonstrating a dose response and methods of producing sex sorted sperm demonstrating a dose response
US11279913B2 (en) 2017-01-20 2022-03-22 Inguran, Llc Sperm processing method, apparatus and related media compositions
CA3096539A1 (en) * 2018-04-09 2019-10-17 Inguran, Llc Methods and compositions for determining the presence or absence of dna aberrations

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2552582B2 (ja) 1989-05-10 1996-11-13 アメリカ合衆国 子の性の前選択の方法
US7208265B1 (en) * 1999-11-24 2007-04-24 Xy, Inc. Method of cryopreserving selected sperm cells
US6263745B1 (en) 1999-12-03 2001-07-24 Xy, Inc. Flow cytometer nozzle and flow cytometer sample handling methods
EP2258172B1 (en) 2000-05-09 2017-04-19 Xy, Llc Flow cytometer for diffentiating x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations of spermatozoa
MXPA05000865A (es) * 2002-07-22 2005-04-28 Xy Inc Sistema para el proceso de celulas espermaticas.
DK2305171T3 (da) * 2003-03-28 2022-03-21 Inguran Llc Apparat og fremgangsmåder til tilvejebringelse af kønssorteret dyresæd
BRPI0408852A (pt) * 2003-03-28 2006-04-04 Monsanto Technology Llc processo para a coloração de espermatozóide
US7298478B2 (en) 2003-08-14 2007-11-20 Cytonome, Inc. Optical detector for a particle sorting system
US20060270021A1 (en) 2004-06-07 2006-11-30 Shuichi Takayama Integrated microfluidic sperm isolation and insemination device

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110325632A (zh) * 2017-02-24 2019-10-11 西莱提维公司 用于分离活动细胞的装置和方法
CN110325632B (zh) * 2017-02-24 2024-04-26 西莱提维公司 用于分离活动细胞的装置和方法
CN111323361A (zh) * 2020-03-17 2020-06-23 南通大学 一种快速分离精子头、精子尾和正常有活力精子的方法
CN111323361B (zh) * 2020-03-17 2022-05-10 南通大学 一种快速分离精子头、精子尾和正常有活力精子的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011123166A3 (en) 2011-12-29
US20130011825A1 (en) 2013-01-10
BR112012025022A2 (pt) 2015-09-22
CA2794934A1 (en) 2011-10-06
WO2011123166A2 (en) 2011-10-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102812123A (zh) 减少经处理的精子样品中的dna断裂的方法和系统
US10563170B2 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
JP2021500927A (ja) 配偶子の生存能力および機能の向上を目的とする、組成物ならびに方法
US10226041B2 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
US20230097054A1 (en) Low sugar sperm media and compositions
Luño et al. Colloid centrifugation reduces bacterial load in chilled dog semen
Guo et al. Assessment of semen quality and anti‐oxidative enzyme activity between bovine sex‐sorted and non‐sex‐sorted frozen–thawed semen
Masenya et al. Comparative study on semen characteristics of Kolbroek and Large White boars following computer aided sperm analysis®(CASA)
Mirshamsi et al. Selection of developmentally competent sheep zygotes using the Brilliant Cresyl Blue (BCB) test, after IVF
US10550177B2 (en) Antibody for determining sex of sperm, and use thereof
Gallardo-Soler et al. Effect of boar semen supplementation with recombinant heat shock proteins during summer
Ivanova et al. Post thaw treatment of frozen buffalo semen with antioxidants vitamin C and 2-mercaptoethanol
EP2556146A2 (en) Methods and systems for reducing dna fragmentation in a processed sperm sample
Ramteke et al. Buffalo anti-PDC-109 antibodies improve the semen quality profiles and in-vitro zona binding index and minimize the cryoinjury of sperm in cryopreserved buffalo semen
Rashedi et al. Polymyxin B changes the plasma membrane integrity of cryopreserved bull semen
AU2013202649B2 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
Mir et al. Sperm sexing by flow cytometry–past improvements and future prospects: A review
Yoo et al. Evaluation of Sperm Sex-Sorting Method using Flow Cytometry in Hanwoo (Korean Native Cattle)
Hansen Select the Sex of Your Next Calf Prior to Mating: Using Sexed Semen: AN163/AN163, 4/2006
NZ617706B2 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
NZ731211B2 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
NZ712027B2 (en) Compositions and methods for improving the quality of processed sperm

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121205

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication