CN110325632B - 用于分离活动细胞的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分离活动细胞的装置，所述装置由两个储存器形成，这两个储存器共用由穿孔板形成的侧部，其中至少一个通道具有变窄的直径，呈圆锥形状。包含细胞的样品被放置在第一储存器中，第二储存器填充有培养基，在液位标记高于第一储存器的液位标记时，产生朝向第一储存器的液流。该装置用于在精液样品中选择最合适的精子用在辅助生殖技术中。

Description

用于分离活动细胞的装置和方法
技术领域
本发明描述了一种用于从细胞种群中分离活动细胞的装置和分离方法。特别地，其用于辅助生殖技术(ART)的精子回收技术中，其中需要与精子的活动性、形态学和DNA完整性(1)相关地回收一定质量和数量的精子，而不需要其他装置。
背景技术
在现有技术中存在用于细胞分离的许多方法和装置。这些方法和装置基于作为精子的活动细胞的特征性质(例如趋流性等)(4)。现有技术中用于分离的装置和方法使用过滤膜、密度梯度、阻断细胞通过的穿孔膜等。
专利US6129214(A)和US6357596B1描述了使用膜来分离最佳精子的方法和装置，其中穿透膜的精子可以被保持在合适的培养基中。根据说明书中所述的，该装置在活动精子通过5-8μm孔的多孔膜时分离活动精子。该装置不是借助趋流性来分离精子，而是过滤非活动精子。
专利申请US2008311653(A1)描述了一种用于调节精液的最佳流动和分离活动精子的方法和装置。该装置由圆柱形容器、包括孔(直径在10μm和150μm之间的开孔)的膜以及与第一圆柱形容器组装在一起的第二圆柱形容器组成。分离方法基于精子向上游游动(游上来)的能力。该方法使用引起趋流性的液流系统(system of currents)，但其实施却变得复杂，这是因为它需要一定程度的专业化和多种装置，而那是本发明的装置所不需要的。该方法所需的培养基的质量较高，并且不使用烘箱就不能进行。
申请WO2008104042A1描述了通过2-3微米孔过滤膜的精子细胞分离方法。所述膜可以是各种材料，诸如PES、PVDF、MCE、PTFE、尼龙、聚碳酸酯等。这种类型的装置不允许活动细胞通过而是将它们扣留在膜孔中。
专利US5575914A描述了一种精子过滤器捕集器，其具有压缩的玻璃棉过滤材料以将低活动性精子与高活动性精子分离。它也不是基于趋流性；它过滤非活动精子。
专利申请CA2834007A1描述了一种用于分离精子的装置，该装置使用微通道的径向阵列，该微通道的径向阵列设置成将精子从一个储存器引导到另一个储存器。所述微通道的宽度为50至300微米，高度为100至200微米，长度为6至9mm。微通道的形状为圆柱形。该装置的设计和制造复杂。精子不会向上游游动，因此，该装置在“沿壁游动”的定义下引导精子，即通道的形状会重新定向精子。此外，该装置需要炉。相反，本发明利用精子穿透和向上游游动的能力实现了自我选择，因为在装置内朝向精子将要被放置的位置产生初始流。而且，本发明的通道形状实现了非凡的收益而无需额外的装置。
申请US2016017273公开了一种应用游动技术分离精子的方法和装置。
与本发明相比，现有技术中存在的装置和方法具有技术缺点，因为用于分离的培养基可能变得堵塞，它们需要由在实验室仪器处理方面相对熟练的人来操作，因此也需要在受控制的环境下进行处理，因此无法在现场或咨询室使用。另一方面，它们中的大多数都需要额外的过滤操作和/或离心操作，无论是由于增加的样品操作时间还是由于离心过程中的旋转引起的压力，导致样品污染、材料损失、DNA改变等可能性。
本发明提供了一种用于分离活动细胞的装置和方法，其不需要过滤操作和/或离心操作；它的操作简单，并且实现了分离细胞种群中那些活动细胞的优异结果，包括活动细胞与受损DNA的分离。本发明的一个显著特征是它不需要烘箱来执行活动细胞分离。这允许在基本条件下对人类以及动物的人工授精采取必要的行动，而不需要与这种类型技术相关的常规装置。本发明的装置甚至允许现场人工授精。
发明内容
用于从细胞种群(优选精子)中分离活动细胞的本发明装置包括至少通过一膜连结的第一储存器和第二储存器，其特征为，所述膜包括至少一个通道，所述通道的至少一个端部显示其直径朝向所述通道的内部减小。并且其中所述膜优选地从包括玻璃、PET、金属、聚合物、碳纤维及其混合物或组合的组中选择的材料制成。其中所述通道优选地在其至少一个端部中包括从包含圆锥形和双曲面形状的组中选择的形状，并且在优选实施例中，所述膜包括多样性的通道。在优选实施例中，所述膜是多孔板。
另外，在另一个优选实施例中，所述通道两端的形状均选自包括圆锥形、抛物面形和双曲面形的组。
在其他实施例中，所述膜包含多样性的通道，允许将活动精子分离在所述膜的一侧上而将剩余的元素或非活动细胞分离在膜的另一侧上。
优选地，本发明的所述活动细胞分离装置具有通道，这些通道包括：介于50μm至200μm之间的第一外径；介于8μm至15μm之间的内径；介于50μm至600μm之间的长度；更优选地，这些通道包括：介于50μm至200μm之间的第一外径和介于10μm至50μm之间的第二外径；介于8μm至15μm之间的内径以及介于50μm至350μm之间的长度。
此外，本发明的活动细胞分离装置优选地具有带有1000至20000个通道/cm2的所述膜；并且优选地，所述第一储存器的容积介于1ml至5ml之间，所述第二储存器的容积介于0.5ml至1.5ml之间；并且其中所述第二储存器具有比所述第一储存器更高的液位。另外，所述第二储存器填充有培养基，在所述培养基内朝向所述第一储存器产生液流(current)。
其中所述膜由从包括玻璃、PET、金属、陶瓷、聚合物、碳纤维及其混合物或组合的组中选择的材料制成。
在一些实施例中，本发明的活动细胞分离装置能够在所述第二储存器中使具有受损DNA的精子相对于新鲜精液样品减少。与直接方法相比，本发明成功地将TUNEL测试(DNA损伤)的值减少达九倍。特别地，对于以PET实现的本发明，观察到至少3倍的减少(对于样品D，从35％至10％，表1)；对于以玻璃实现的本发明，观察到达9倍的减少(对于相同的样品D，从35％到4％)。此外，本发明的装置将具有正常形态的精子量增加至少80％(样品D的形态值)。
本发明的另一个目的是用于从细胞种群中分离活动细胞的方法，包括以下步骤：
a)将培养基放置成淹没储存器2和通道；
b)使储存器1中的细胞种群与包含至少一个通道的膜的面接触，所述通道的至少一个端部的直径朝向所述通道减小，使其低于储存器培养基2的液位，这允许它继续将培养基传送到储存器1，从而产生初始逆液流效应，
c)孵育；
d)从所述膜的另一面回收具有较高百分比的正常形态的活动细胞。
其中用于从细胞种群中分离活动细胞的所述分离方法在步骤“b”中包括培养基中的在所述活动细胞流动的相反方向流动的逆液流，其中所述液流由于压力差或毛细管作用而产生，并且优选地，所述压力差是由于位于所述膜的两侧处的储存器之间的液位差引起的。此外，所述步骤“c”包括在35℃至37℃的温度下孵育1分钟至90分钟之间的时间。优选10至90分钟之间。并且优选地，本发明的方法使用本发明的装置。
附图说明
图1是横截面主视图，示出了膜(101)，其中放大的图像显示膜通道(102)。
图2是装置的侧剖视图，示出了第一储存器(201)、膜(203)和第二储存器(202)。还示出了膜通道类型的优选形状的放大视图。
图3是本发明的装置的完整可能方案，示出了第一储存器(201)、膜(203)和第二储存器(202)。
图4示出了适用于卵胞浆内精子注射(ICSI)技术的装置。
图5示出了本发明的膜通道可采用的一些形状的示意图。
图6示出了本发明的装置的备选实施例。
具体实施方式
根据本发明，细胞种群包括可以作为培养基的流体，或具有许多种细胞的生物流体，其中存在具有活动能力的细胞(下文称为活动细胞)。本发明的实施例包括精子类型的活动细胞的分离；然而，所述装置和方法也适用于其他类型的活动细胞，诸如微生物或寄生虫。根据本发明，膜是指任何材料，其特征为包含至少一个通道，所述通道从膜的一个面通到另一个面，并连接本发明的装置的两个储存器。
本发明描述了用于活动细胞(优选为精子细胞)的分离的装置和方法，所述装置和方法不是基于游动的前提或大多数其他系统所使用的前提，而是基于以下两个方面：1)由配子或细胞借助于通道形状来搜寻随机进入的位置，2)由精子自身产生微液流并最终通过趋流性(首先由压力差诱导且随后由于穿过狭窄通道而自诱导)引导后面的精子的微液流。
本发明的装置根据其预期用途不需要任何其他实验室元件来实现其目的；即，不需要额外的管子、离心机或炉。它也不需要电力，当提到向世界范围广泛推广辅助受精时，这使得它成为基本和创新工具，使得医疗保健专业人员和兽医能够自己获得在例如远离实验室的农村地区使用的工具。将装置保持在成人的闭合拳头内或与人体接触就可以执行本发明方法所需的孵育。
本发明的装置包括：第一储存器(201)，待从中分离出精子的精液样品被放置在所述第一储存器中；第二储存器(202)，精子或活动细胞迁移并被收集在第二储存器中，且第一和第二储存器通过膜(203)连结。所述膜包括一个或多个穿孔，所述穿孔构成通道，活动细胞通过所述通道迁移。根据所测量的区段，所述穿孔(被称为通道)可以具有相同或不同的直径，即，考虑连结至第一储存器的区段、连结至第二储存器的区段以及位于已经提到的这两个区段(都被称作外部区段)之间的区段(在下文中被称为中间区段)。
在本发明的优选方面中，膜的通道在所述通道的所有区段中具有相同的直径。
在本发明的另一个方面中，通道的直径在连结至储存器的区段中相对于中间区段不同。在本发明的优选实施例中，所述通道的所述外部区段的直径大于所述通道的中间区段的直径。
在本发明的另一个方面中，所述通道外部区段具有例如圆锥形、双曲线形或抛物线形的几何形状。
本发明的装置在没有过滤或应用电磁或静液流或免疫标记方法的情况下操作。本发明的装置使精子以与它们在体内相同的方式游动，从一个储存器穿过膜向另一个储存器成群地迁移，留下碎屑(主要是具有受损DNA的精子和非活动细胞)。利用了趋流性，这是一种具有配子的穿透界面的设计和自然行为的特性。在具有未受损的DNA的精子中更大程度地观察到所述行为。该装置利用由两个储存器之间的压力差产生的精子的趋流特性，所述压力差由于第二储存器(活动精子被回收在该第二储存器中)的较高初始液位而实现，这种情况持续存在，该压力差直到在两个压力均衡前都存在，尽管还涉及所述毛细管液流以及两个储存器中可能的浓度差异作为驱动力。除了由液流引起的上述现象之外，事实上还存在从第二储存器朝向第一储存器的流体液流，其产生用于健康精子向上游游动的脉动。直到那一瞬间，所引起的液流通过每个通道通过培养基朝向用于全部精液收集的所述第一储存器，有利于保持这种特性完整的精子的趋流性，从那个时刻(平衡压力或零速率流动)开始系统通过当前由持续穿过膜的精子群引起的微液流自持。
最易于穿过本发明的膜的精子的这种状况与正常形态的百分比显著增加和受损DNA的百分比显著降低的结果吻合。本发明的特征允许在具有快速线性活动性的配子之间进行自我选择，其如预期的那样，与增加的正常形态的百分比和没有改变的DNA的更高百分比吻合。
在本发明的装置中，精子跟随由回收培养基的隔室和精液隔室之间的流动引起、且随后由跟随的那些微液流自持的微液流。换句话说，在找到入口之后，其他者也会发现它们的由第一鞭毛引起的微液流辅助的路径，后续鞭毛的微液流加到其中，从而增强液流并因此增强趋流效应。这样精子自身离开精浆并进入授精培养基，在精浆中留下所有类型的非精子或非活动精子(细胞、碎屑、静止精子以及没有趋流性能力的精子)的元素，因为它们没有表现出穿透这种孔的精子的能力。
本发明的装置包括至少一个膜，所述膜具有选自以下形状的一个或多个形状的通道：锥形、双曲线、旋转抛物面，以及允许在通道的至少一个端部加宽的许多其它形状，如图5中可以看到的。通道的数量、质量和类型根据用于制造板的材料而变化。除了其他因素之外，用于精液样品的储存器的尺寸也可以根据待处理的体积而变化。制造方法在现有技术中是已知的，并且可以通过激光器以及其他穿孔机构来执行。
在本发明的一个优选实施例中，膜包括的通道密度为每平方厘米膜具有1,000至20,000个通道。
在本发明的另一方面中，本发明的膜的穿孔或通道包括100至600μm之间的长度。
如前所述，本发明的通道包括不同直径的三个区段：第一外径，连结到所述第一储存器(精液放置于所述第一储存器中)；内径；以及将膜与所述第二储存器(在所述第二储存器中，活动细胞收集在为此目的提供的培养基中)连结的第二外径。因此，所述第一外径包括在50μm至200μm之间，所述内径包括在8μm至15μm之间，并且所述第二外径包括在10μm至50μm之间。
在本发明的另一个方面中，膜的穿孔包括不同的几何形状，例如圆柱形、圆锥形、抛物线形、双曲线形、旋转双曲面形。优选地，几何入口和出口穿孔形状是旋转曲线，其可以是直的(其产生锥形)或者是抛物线或双曲线形状类型的曲线，导致旋转图形的外径大于内径(204)。
令人惊奇的是，已经发现，源于所述膜的通道的所述穿孔的所述形状，当入口处被加宽时，有利于显著提高本发明装置效率的构造，以获得更高浓度的能成活的活动细胞。
本发明的装置的储存器包括的体积容量取决于各种因素：待处理的样品的体积、膜的尺寸等。在优选实施例中，用于1×3cm的膜的储存器在0.5和4.0ml之间不等。重要的是要强调本发明的装置在流体或培养基中产生液流，以使得活动细胞(优选精子)利用它们向上游游动的能力进行分离。所述液流由储存器中的压力差引起。为了产生压力差，第二储存器包含更高的液位，从而穿过膜朝向第一储存器产生液流。在优选实施例中，在本发明的装置中，待分离的样品被放置于所述第一储存器中；且流体或培养基被装载到所述第二储存器中，以回收穿过所述膜时与其通道上的种群(population)的其余部分分离的活动细胞。为了产生压力差并因此导致流到第一储存器的液流，首先必须将第二储存器填充到与所述第一储存器相同的液位或更高的液位；随后，第一储存器填充待分离的细胞种群的样品。
本发明的装置在1分钟至90分钟的时间内分离活动精子。优选在10分钟至90分钟的时间内分离活动精子。
在本发明的另一个方面中，可以在没有炉的情况下执行所述操作，因为甚至当它被操作者自己释放的热度加热时也可以工作。
在本发明实施例的另一个方面中，该装置适用于卵胞浆内精子注射(ICSI)技术。为了通过将精液显微注射到卵母细胞中进行授精，可以使用在相同注射膜上分离高性能精子。该装置基于本发明的备选实施例，但其尺寸适合于ICSI工艺。仅具有图4中所示一个通道的本发明优选备选实施例包括所述两个储存器，也称为微型分析杯(402和403)，其通过通道连结，所述通道具有用于连接两个储存器的漏斗形入口(404)。两个储存器都被盖玻片(401)覆盖，因此能够实现10μ通道。该系统允许原位回收高质量的精子。在该备选实施例中，膜仅具有一个通道。
在本发明的另一个备选实施例中，本发明包括如图6所示的圆柱形，包括盖(601)、靠近所述管子的开口的孔(602)、第一储存器(604)和第二储存器(603)，其中可以看到第二储存器(用于所选择精子的出口和收集储存器)的液位高于装载有待分离的精子的精液样品的第一储存器的液位。图6示出了该区段的放大图，显示出具有通道(606)的膜(605)，精子沿着所述通道流动。
应用实例
实例1
带玻璃膜的装置测试D、E和F
在玻璃膜上本发明的活动细胞分离装置(MXM)包括由130±40μm厚的玻璃膜板分隔的两个储存器板，所述玻璃膜板具有锥形通道，这些锥形通道具有约1mm的玻璃宽度的长度、15μm的第一直径(入口)和8微米的第二直径(出口)。首先放置HEPES的回收培养基HamF10 1X，补充以SSS，并且青霉素/链霉素被放置在回收储存器(第二储存器)中；然后，在根据WHO2010方案处理后，精液样品D、E和F被放置在剩余的储存器(第一储存器)中。
在该实施例中，膜为1cm×2cm，密度为6600穿孔/cm2。放置待处理样品的第一储存器的最大体积容量为3mL，且第二储存器的最大容量为1mL。
实例2
带PET膜的装置测试A、B、C和D
由PET制成的膜形成有2500个通道，每个通道的长度为200μm。圆锥形通道包括15μm的第一(入口)直径和10μm的第二(出口)直径。PET膜为1cm×2cm。储存器与实施例1中对应于玻璃膜的储存器相同。首先放置HEPES的回收培养基Ham F10 1X，补充以SSS，并且青霉素/链霉素被放置在回收储存器(第二储存器)中；然后，在根据WHO2010方案处理后，精液样品A、B、C和D被放置在剩余的储存器(第一储存器)中。
对于这两个例子，使用本发明的装置的程序如下：
步骤1-放置HEPES的培养基Ham F10 1X(0.6-0.7毫升)以达第二储存器液位。用能够进入分析杯的吸管尖式巴斯特转液管装载具有HEPES的Ham F10 1X；当它被填充时，膜中充满了Ham培养基，该培养基浸泡精液侧的内表面和直接表面。
步骤2-之后立即将精液样品放置于第一储存器中。膜应完全被待处理的样品覆盖；所述膜的表面必须最大限度地使用。
步骤3-随后与身体接触地进行孵育一小时(可能在20分钟至60分钟之间)，尽管可以在烘箱中进行。
步骤4-将装置从孵育状态(无论是烘箱还是与身体接触)中取出；实施例2使用36℃的烘箱，实施例1使用拳头。使用注射器和结核菌素注射针从回收培养基中(即，从第二储存器中)取出经处理的样品。该经处理的样品已准备好用于人工授精。
对于回收前后的精液评估，查看WHO 2010指南。为了评估DNA，使用流式细胞仪或荧光显微镜执行末端转移酶介导的dUTP切口末端标记技术(TUNEL)测试。
结果
该仪器的结果表明，应用本发明的方法(MXM)，对于以玻璃作为所选的材料，关于未处理的精液，正常形状(严格的形态)的百分比加倍，即，从正常形状的直接方法(样品D、E、F的平均值)中13.3％变为使用本发明装置的为27.0％(n:3)。比较本发明的MXM(玻璃)，在游动的情况下，本发明在所选择的精子的形态上实现了50％(样品D、E、F)的改善。(表1)在使用PET作为所选材料的本发明情况下，与直接方法相比，正常形状的精子的百分比增至三倍，即，从10.3％增加到36.0％(对于样品A、B、C、D)，在每次测试中获得的结果的平均值。而在游动的情况下，使用本发明的方法，对于正常形状的精子实现几乎两倍的值，即，从正常形状的11.3％到18.0％。值得一提的是，考虑到高或低复杂性的人工授精，游动是用于精子回收的正常基本技术，缺点是暴露时间和操作以及离心可能导致DNA改变。
另一方面，应用克鲁格标准WHO评估形态学。一种样品进行了用于DNA完整性的通道测试(2)，产生35％的值(病理学，因为参考值必须低于20％)，以使用PET和玻璃对游动和在MXM上进行相同的研究，来自同一样品(样品D)。如下表所示，当在PET上使用MXM时获得的值示出了显著改进：原始值减少超过三分之一(从35到10)，这是非常显著的值。另一方面，对于样品D，游动方法以及本发明的在玻璃上的MXM的通道测试值显示出所述值的改善，几乎减少了九倍。
尽管观察到用游动的样品D实现了DNA损坏的精子的减少，其也与从MXM发现的相同，但是本发明的后一种方法产生对于所述样品具有三倍更好的形态的精子的样品。
表1：示例1和2中的测试结果
参考文献：
(1)Aitken RJ，Sawyer D.The human spermatozoon--not waving butdrowning.Adv Exp Med Biol 2003；518：85-98
(2)A Agarwal，SS Allamaneni-Minerva Ginecol，2004-clevelandclinic.org
(3)D Mortimer-Human Reproduction，1991-ESHRE
(4)K Miki，DE Clapham-Current Biology，2013-Elsevier

Claims (10)

1.一种从细胞种群中分离活动细胞的方法，
所述方法使用的装置包括通过至少一膜连结的第一储存器和第二储存器，其特征在于，所述膜包括多个通道，所述通道的至少一个端部包含朝向所述通道的内部减小的直径；
所述方法包括以下步骤：
a.将培养基放置成淹没所述第二储存器和所述通道；
b.使所述第一储存器中的细胞种群与包括多个通道的所述膜的面接触，所述通道的至少一个端部的直径朝向所述通道的内部减小，其中所述第一储存器被待分离的所述细胞种群的样品填充至低于所述第二储存器的液面，所述第二储存器具有相比所述第一储存器较高的初始液位，以允许继续将培养基传送到所述第一储存器，且产生初始逆液流效应，使得所述活动细胞沿逆流游动以使其分离；
c.孵育；
d.从所述膜的另一面回收具有较高百分比的正常形态的活动细胞；
其中，所述活动细胞是精子，且所述通道包括：连接到所述第一储存器且介于50μm至200μm之间的第一外径，将所述膜与所述第二储存器连结的且介于10μm与50μm之间的第二外径，以及介于8μm至15μm之间的内径。
2.根据权利要求1所述的从细胞种群中分离活动细胞的方法，其中，步骤c包括在35℃-37℃下孵育1分钟至90分钟之间的时间。
3.根据权利要求1所述的从细胞种群中分离活动细胞的方法，其中，步骤c包括在35℃-37℃下孵育10分钟至90分钟之间的时间。
4.一种从细胞种群中分离活动细胞的装置，所述装置包括通过至少一膜连结的第一储存器和第二储存器，其特征在于，所述膜包括多个通道，所述通道的至少一个端部包含朝向所述通道的内部减小的直径，所述第一储存器适于被待分离的所述细胞种群的样品填充，且所述第二储存器适于容置液体至高于所述第一储存器从而穿过所述膜产生从所述第二储存器朝向所述第一储存器的液流，所述第二储存器比所述第一储存器具有的较高初始液位，其中，所述活动细胞是精子，且所述通道包括：连接到所述第一储存器且介于50μm至200μm之间的第一外径，将所述膜与所述第二储存器连结的且介于10μm与50μm之间的第二外径，以及介于8μm至15μm之间的内径，其中所述装置适于执行根据权利要求1所述的方法。
5.根据权利要求4所述的分离活动细胞的装置，其中，所述通道在其至少一个端部具有从包含锥形、抛物面形状和双曲面形状的组中选择的形状。
6.根据权利要求4所述的分离活动细胞的装置，其中，所述通道的两个端部具有从包含锥形、抛物面形状和双曲面形状的组中选择的形状。
7.根据权利要求4所述的分离活动细胞的装置，其中，所述膜包括1000至20000个通道/cm2。
8.根据权利要求4所述的分离活动细胞的装置，其中，所述第一储存器的容积介于1ml至5ml之间，所述第二储存器的容积介于在0.5ml至1.5ml之间；并且其中，所述第二储存器的液位高于所述第一储存器。
9.根据权利要求4所述的分离活动细胞的装置，其中，所述第二储存器填充有培养基，在所述培养基内产生朝向所述第一储存器的液流。
10.根据权利要求4所述的分离活动细胞的装置，其中，所述膜由从包括玻璃、PET、金属、陶瓷、聚合物、和碳纤维的组中选择的材料制成。
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