BR112019017410A2

BR112019017410A2 - Dispositivo e método para separar células móveis

Info

Publication number: BR112019017410A2
Application number: BR112019017410-9A
Authority: BR
Inventors: Ernesto Héctor Repetto Herberto
Original assignee: Selectivity Sas
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2020-03-31
Also published as: CA3053877A1; JP7161499B2; JP2020508081A; US20200032199A1; CN110325632B; CN110325632A; EP3587561A4; AU2018223254A1; AU2024201489A1; AR107746A1; WO2018154169A1; EP3587561A1

Abstract

a presente invenção descreve um dispositivo e um método para separar células móveis de uma população de células, que compreende uma membrana com canais.

Description

DISPOSITIVO E MÉTODO PAPA SEPARAR CÉLULAS MÓVEIS Campo da técnica da invenção [001] A presente invenção descreve um dispositivo para separar células móveis de uma população de células e um método de separação. É especialmente definido dentro das técnicas de recuperação de espermatozóides para Tecnologia Reprodutiva Assistida (ART) em que qualidade e uma quantidade de espermatozóides são necessárias para serem recuperados, em relação a sua mobilidade, morfologia e integridade de DNA (1) sem a necessidade de outros dispositivos.

Estado da técnica [002] Há muitos métodos e dispositivos para separação celular no estado da técnica. Tais métodos e dispositivos têm como base as propriedades características de células móveis como espermatozóides, como reotaxia (4) dentre outros. Os dispositivos e métodos para separação no estado da técnica usam membranas de filtragem, gradientes de densidade, membranas perfuradas que bloqueiam a passagem de células, dentre outros.

[003] As patentes US6129214 (A) e US6357596B1 descrevem um método e um dispositivo para separar os melhores espermatozóides com o uso de uma membrana, em que os espermatozóides que penetram a membrana podem ser mantidos em um meio adequado. De acordo com o que é mencionado na descrição, esse dispositivo separa espermatozóides móveis quando os mesmos passam através de uma membrana porosa de 5 a 8 pm de poro. Esse dispositivo não separa espermatozóides por reotaxia, mas filtra espermatozóides não móveis.

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2/22 [004] O pedido de patente US2008311653 (Al) descreve um método e aparelho para regular fluido ideal de sêmen e separar espermas móveis. 0 dispositivo consiste em um recipiente de formato cilíndrico, uma membrana composta por poros (orifícios de entre 10 e 150 pm de diâmetro), e um segundo recipiente cilíndrico que é montado junto com o primeiro. 0 método de separação tem como base a capacidade de os espermatozóides nadarem a montante (nadar para cima). 0 método usa um sistema de correntes que induz reotaxia, mas sua realização se torna complexa visto que o mesmo necessita de um grau de especialização e dispositivos que o dispositivo da presente invenção não necessita. A quantidade de meio exigida por esse método é mais e não pode ter continuidade sem uso de um forno. O pedido W02008104042A1 descreve um processo de separação celular espermática por uma membrana de filtragem de poro de 2 a 3 microns. A dita membrana pode ser de diversos materiais, como PES, PVDF, MCE, PTFE, Náilon, policarbonato, etc. Esse tipo de dispositivo não permite a passagem de células móveis, mas retém as mesmas nos poros de membrana.

[005] A patente US5575914A descreve um coletor de filtro de esperma que tem material de filtro de algodão de vidro comprimido para separar espermatozóides de baixa mobilidade daqueles de uma alta mobilidade. A mesma também tem como base reotaxia; a mesma filtra espermatozóides não móveis.

[006] O Pedido de Patente CA2834007A1 descreve um dispositivo para separar esperma que usa uma matriz radial de microcanais dispostos de modo a direcionar esperma de um reservatório para outro. Os ditos microcanais têm entre 50

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3/22 e 300 microns em largura, de 100 a 200 microns em altura, e entre 6 e 9 mm em comprimento. Os microcanais são cilíndricos em formato. Esse dispositivo é complexo em projeto e fabricação. Os espermatozóides não nadam a montante e, portanto, o dispositivo direciona os mesmos sob a definição de nado com obstáculo, isto é, o formato dos canais redireciona espermatozóides. Além disso, esse dispositivo precisa de um fogão. Do contrário, a presente invenção alcança autosseleção com a vantagem da capacidade dos espermatozóides de penetrar e nadar a montante, visto que uma corrente inicial é gerada dentro do dispositivo em direção ao local em que o esperma deve ser colocado. Ademais, o formato de canal da presente invenção alcança rendimentos extraordinários sem necessitar de dispositivos adicionais.

[007] O pedido US2016017273 revela um método um a dispositivo para separar espermatozóides que aplica a técnica de nado para cima.

[008] Os dispositivos e métodos presentes no estado da técnica têm desvantagens técnicas em comparação com a presente invenção, visto que o meio usado para a separação pode se tornar coagulados, os mesmos necessitam de manipulação por alguém relativamente versado em manuseio de instrumento laboratorial e, portanto, também é necessária manipulação em ambientes controlados, tornando impossível que os mesmos sejam usados no campo ou em salas de consultório. Por outro lado, a maior parte dos mesmos necessita de operações de filtragem e/ou centrifugação extra, favorecendo a probabilidade de contaminação de amostra, perda de material, alteração de DNA, etc., seja devido ao tempo de manipulação de amostra aumentado ou

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4/22 pressão aumentada ocasionados por rotações durante a centrifugação.

[009] A presente invenção fornece um dispositivo e um método para a separação de células móveis que não necessita das operações de filtragem e/ou centrifugação; sua manipulação é simples e alcança excelentes resultados de separação dessas células móveis de uma população de células, incluindo a separação de células móveis com DNA danificado. Um recurso excepcional da presente invenção é que o mesmo não necessita de um forno para realizar separação celular móvel. Isso permite tomar as ações necessárias para inseminação artificial em seres humanos, bem como em animais sob condições básicas, sem a necessidade do equipamento usual em relação a esse tipo de técnicas. 0 dispositivo da presente invenção ainda permite inseminação artificial no campo.

Breve descrição da invenção [010] 0 dispositivo da presente invenção para a separação de células móveis de uma população de células, de preferência, espermatozóides, compreende um primeiro reservatório e um segundo reservatório ligado por pelo menos uma membrana, caracterizado pelo fato de que a dita membrana que compreende pelo menos um canal com pelo menos uma extremidade mostra uma redução em seu diâmetro em relação ao interior do dito canal. E em que a dita membrana é produzida a partir de, de preferência, um material selecionado a partir do grupo que compreende vidro, PET, metal, polímero, fibra de carbono e as misturas ou combinações dos mesmos. Em que o dito canal compreende, de preferência, em pelo menos uma de suas extremidades, um formato selecionado a partir do

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5/22 grupo composto por formatos cônicos ou de hipérbole, e a dita membrana compreende, em uma modalidade preferencial, uma multiplicidade de canais. Em uma modalidade preferencial, a dita membrana é uma placa perfurada.

[011] Além disso, o dito canal compreende, em outra modalidade preferencial, ambas as extremidades de formatos selecionados a partir do grupo composto por formatos de hipérbole, parábola e cônico.

[012] Em outras modalidades, a dita membrana compreende uma multiplicidade de canais que permitem a separação de espermatozóides móveis em um lado da dita membrana e dos elementos ou células não móveis que permanecem no outro lado da membrana.

[013] De preferência, o dito dispositivo de separação de células móveis da invenção tem canais que compreendem um primeiro diâmetro externo de entre 50 e 200 pm; um primeiro interno de entre 8 e 15 pm, e comprimento de entre 50 e 600 pm; mais preferencialmente, os mesmos compreendem um primeiro diâmetro externo de entre 50 e 200 pm e um segundo diâmetro externo de entre 10 e 50 pm; um primeiro interno de entre 8 e 15 pm e um comprimento de entre 50 e 350 pm.

[014] Ademais, o dispositivo de separação de células móveis da presente invenção apresenta, de preferência, a dita membrana com entre 1.000 e 20.000 canais/cm²; e, de preferência, o volume do dito primeiro reservatório é entre 1 e 5 ml, e o volume do dito segundo reservatório é entre 0,5 e 1,5 ml; e em que o dito segundo reservatório compreende um nivel maior que o dito primeiro reservatório. Ademais, o dito segundo reservatório é

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6/22 preenchido com um meio de cultura que gera uma corrente dentro do dito meio de cultura em relação ao dito primeiro reservatório.

[015] Em que a dita membrana é produzida a partir de um material selecionado a partir do grupo que compreende vidro, PET, metal, cerâmicas, polímero, fibra de carbono e as misturas ou combinações dos mesmos.

[016] Em algumas modalidades, o dispositivo de separação de células móveis da presente invenção permite alcançar uma redução de esperma com DNA danificado no dito segundo reservatório em relação a uma amostra de sêmen fresco. A presente invenção tem sucesso ao reduzir em até nove vezes o valor do Teste de TUNEL (danos ao DNA) em comparação com o método direto. Em particular, uma redução de pelo menos 3 vezes é observada para a invenção realizada em PET (de 35% a 10%, para amostra D, tabela 1) ; e até 9 vezes para a invenção em vidro (de 35% a 4% para a mesma amostra D). Além disso, o dispositivo da presente invenção aumenta a quantidade de espermatozóides com morfologia

normal	em pelo menos 80% (valores	de morfologia para	a
Amostra	D) .
	[017] Outro objetivo da	presente invenção é	um
método	para separar células móveis	de uma população	de

células que compreende as seguintes etapas:

[018]	a)	colocar o	meio de cultura	para inundar
o reservatório 2 [019]	e canais; b) colocar	a população de	células em

contato em reservatório 1 com uma face de uma membrana que compreende pelo menos um canal com pelo menos uma extremidade que tem uma redução em seu diâmetro em relação ao dito canal,

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7/22 tornando o mesmo menor que o nível do reservatório meio 2, o que permite que o mesmo continue a passar o meio para o reservatório 1 e, desse modo, produza o efeito de contracorrente inicial, [020] c) incubar;

[021] d) recuperar as células móveis com uma porcentagem maior de morfologia normal da outra face da dita membrana.

[022] Em que o dito método de separação para células móveis de uma população de células na etapa b compreende uma contracorrente em um meio de cultura que flui no sentido oposto da passagem das ditas células móveis, em que a dita corrente é gerada por diferença de pressão, ou capilaridade e, de preferência, a dita diferença de pressão é ocasionada pela diferença em nivel entre os reservatórios localizados em ambos os lados da dita membrana. Além disso, a dita etapa c compreende incubar por um periodo de entre 1 e 90 minutos a uma temperatura que está na faixa de 35 a 37 °C. De preferência, entre 10 e 90 minutos. E, de preferência, o método da presente invenção usa o dispositivo da presente invenção.

Breve descrição das figuras [023] Figura 1: Corte transversal, vista frontal que mostra uma membrana (101), em que a imagem ampliada exibe os canais de membrana (102) .

[024] Figura 2: Corte transversal lateral do dispositivo que mostra o primeiro reservatório (201) , a membrana (203) e o segundo reservatório (202). O mesmo também mostra a vista ampliada do formato preferencial do tipo de membrana canal também é mostrado.

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8/22 [025] Figura 3: Esquema possível completo do dispositivo da presente invenção que mostra o primeiro reservatório (201), a membrana (203) e o segundo reservatório (202) .

[026] A Figura 4 representa o dispositivo adaptado à técnica de injeção de esperma intracitoplasmática (ICSI).

[027] A Figura 5 mostra vistas esquemáticas de alguns dos formatos que os canais de membrana da presente invenção podem adotar.

[028] A Figura 6 mostra uma modalidade alternativa do dispositivo da presente invenção.

Descrição detalhada da invenção [029] De acordo com a presente invenção, uma população de células compreende um fluido que pode ser um meio de cultura, um fluido biológico com uma grande variedade de células dentre as quais há células com capacidade locomotora, doravante chamadas de células móveis. O exemplo da presente invenção compreende a separação de células móveis do tipo espermático; no entanto, o dispositivo e método também se aplicam a outros tipos de células móveis como microrganismos ou parasitas.

[030] De acordo com a presente invenção, membrana significa qualquer material caracterizado pelo fato de que contém pelo menos um canal que passa de uma face para a outra da membrana e conecta ambos os reservatórios do dispositivo da presente invenção.

[031] A presente invenção descreve um dispositivo e um método para a separação de células móveis, de preferência, células espermáticas, que não tem como base

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9/22 as premissas de nadar para cima ou que é usada pela maior parte de outros sistemas, mas tem como base dois aspectos 1) a busca por um gameta ou célula de um lugar para entrar, aleatoriamente, facilitado pelo formato de canal e 2) as microcorrentes geradas pelos próprios espermatozóides e que acabam por direcionar os posteriores por reotaxia (primeiramente induzidos por diferença de pressão e, posteriormente, autoinduzidos pela passagem através do canal estreito).

[032] 0 dispositivo da presente invenção não necessita de qualquer outro elemento laboratorial para realizar de acordo com seu uso pretendido; isto é, nenhum tubo adicional, ou centrifuga, nenhum fogão exigido. O mesmo não necessita de eletricidade, ou, o que torna o mesmo uma ferramenta básica e inovadora quando o mesmo diz respeito à extensão de fertilização assistida no mundo amplamente, possibilitando que profissionais de cuidados com a saúde e veterinários tenham acesso por si só a uma ferramenta a ser usada em, por exemplo, áreas rurais distantes dos laboratórios. A incubação exigia pelo método da presente invenção pode ser realizada mantendo o dispositivo dentro do pulso fechado de um adulto ou em contato com o corpo humano.

[033] O dispositivo da presente invenção compreende um primeiro reservatório (201), em que a amostra de sêmen da qual os espermatozóides devem ser separados são colocados, um segundo reservatório (202) em que espermatozóides ou células móveis migram e são coletados, em que ambos os reservatórios são ligados por uma membrana (203) . A dita membrana compreende uma ou mais perfurações que constituem canais através dos quais células móveis

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10/22 migram. As ditas perfurações, chamadas de canais, podem ser ter o mesmo diâmetro ou diâmetros diferentes de acordo com a seção medida, isto é, levando em consideração a seção que é ligada ao primeiro reservatório, em que a seção que é ligada ao segundo reservatório e a seção localizada entre as duas seções já mencionadas (ambas chamadas de seções externas), chamadas doravante de seção intermediária.

[034] Em um aspecto preferencial da presente invenção, os canais da membrana são do mesmo diâmetro em todas as seções dos ditos canais.

[035] Em outro aspecto da presente invenção, o diâmetro dos canais é diferente nas seções ligadas aos reservatórios em relação à seção intermediária. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, as ditas seções externas dos ditos canais são de um diâmetro maior que o diâmetro da seção intermediária do dito canal.

[036] Em outro aspecto da presente invenção, as ditas seções externas de canal são geométricas em formato, como cônicas, hiperbólicas ou parabólicas.

[037] O dispositivo da presente invenção opera na ausência de filtragem ou da aplicação de métodos de eletromagnetismo, ou correntes estáticas ou de rotulação imunológica. O dispositivo da presente invenção faz com que os espermatozóides nadem da mesma maneira que os mesmos nadariam in vivo, migrando em grupos de um reservatório que passa através de uma membrana em direção ao outro reservatório, deixando para trás detritos, em maior parte, espermatozóides com DNA danificado e células não móveis. Reotaxia - a propriedade que tem o projeto e comportamento natural de gametas para penetrar interfaces - é tomada como

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11/22 vantagem. 0 dito comportamento é observado em uma extensão maior em espermatozóides com DNA que não é danificado. 0 dispositivo usa a propriedade de reotaxia de espermatozóides

gerada	por uma diferença em	pressão	entre	os	dois
reservatórios, alcançada, dessa	maneira,	devido	ao	maior
nível	inicial do segundo	reservatório	(em	que

espermatozóides móveis são recuperados), o que persiste até que ambas as pressões estejam equilibradas, embora as mesmas também estejam envolvidas como as forças de acionamento da dita corrente de capilaridade e, possivelmente, diferença em concentração em ambos os reservatórios. Além do fenômeno ocasionado pela corrente, é um fato que há uma corrente de fluido do segundo reservatório em direção ao primeiro, que gera um impulso para os espermatozóides saudáveis nadarem a montante. Até o momento, as correntes induzidas através de cada canal através do meio de cultura em direção ao dito primeiro reservatório por toda a coleta de sêmen, favorece reotaxia dos espermatozóides que possuem tal propriedade intacta, em que o sistema, a partir desse momento (pressão equilibrada ou fluxo de taxa zero), é autossustentado pelas microcorrentes induzidas agora pelo grupo de espermatozóides que continuam a passar através da membrana.

[038] Essa condição dos espermatozóides mais aptos de passar através da membrana da presente invenção está de acordo com os resultados no aumento significativo na porcentagem de morfologia normal e na redução altamente significativa na porcentagem de DNA danificado. As características da presente invenção permitem a autosseleção dentre gametas de mobilidade linear rápida, que está de acordo, como é esperado, com uma porcentagem em uma

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12/22 morfologia normal aumentada e uma porcentagem maior de DNA sem alterações.

[039] No dispositivo da presente invenção, os espermatozóides estão seguindo uma microcorrente ocasionada pelo fluxo entre o compartimento do meio de recuperação e o compartimento de sêmen e, posteriormente, autossustentado por aqueles posteriores. Em outras palavras, após um encontrar a entrada, os outros percebem o caminho favorecido pelas microcorrentes ocasionadas pelo primeiro flagelo, aos quais a microcorrente dos flagelos sucessivos s juntam, aprimorando, desse modo, a corrente e, portanto, o efeito de reotaxia. Dessa maneira, os espermatozóides saem do plasma seminal por si só e acessam o meio de cultura de inseminação, deixando para trás no plasma seminal todos os tipos de elementos que não são espermatozóides ou, de outra maneira, espermatozóides não móveis (células, detritos, espermatozóides imóveis e também espermatozóides sem capacidade de reotaxia), visto que os mesmos não mostram a capacidade de espermatozóides de penetrar nesse tipo de orifício.

[040] O dispositivo da presente invenção compreende pelo menos uma membrana com um ou mais canais de formatos selecionados a partir dos a seguir: cônico, hiperbólico, paraboloide de rotação, dentre muitos outros com enrolamento permitido em pelo menos uma das extremidades dos canais, como pode ser visto na Figura 5. A quantidade, qualidade e tipo de canais varia de acordo com o material usado para fabricação da placa. O tamanho dos reservatórios para a amostra de sêmen também pode variar de acordo com o volume a ser processado, dentre outros fatores. Os métodos

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13/22 de fabricação são conhecidos no estado da técnica e podem ser realizados por laser, dentre outros mecanismos de perfuração.

[041] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a membrana compreende uma densidade de canal de entre 1.000 e 20.000 por cm² de membrana.

[042] Em outro aspecto da presente invenção, as perfurações ou canais da membrana da presente invenção compreendem um comprimento de entre 100 e 600 pm.

[043] Como foi anteriormente mencionado, os canais da presente invenção compreendem três seções de diâmetros diferentes; um primeiro diâmetro externo ligado ao dito primeiro reservatório (em que sêmen é colocado), um primeiro diâmetro interno e um segundo diâmetro externo que se liga à membrana com o dito segundo reservatório (em que as células móveis são coletadas em um meio de cultura fornecido para esse objetivo). Desse modo, o dito primeiro diâmetro externo compreende entre 50 e 200 pm, o dito primeiro interno compreende entre 8 e 15 pm, e o dito segundo diâmetro externo compreende entre 10 e 50 pm.

[044] Em outro aspecto da presente invenção, as perfurações da membrana compreendem formatos geométricos diferentes como cilíndrico, cônico, parabólico, hiperbólico, hiperboloide de rotação. De preferência, os formatos geométricos de perfuração de entrada e saída são uma curva de rotação que pode ser reta (o que gera um cone) ou, de outro modo, uma curva do tipo de um formato parabólico ou hiperbólico, resultando em uma figura de rotação com um diâmetro externo maior que o primeiro diâmetro interno (204).

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14/22 [045] Surpreendentemente, foi constatado que os formatos descritos das ditas perfurações que se originam dos canais da dita membrana, quando enrolados na entrada, favorecem uma configuração que aumenta a eficácia do dispositivo da invenção significativamente para obter uma maior concentração de células móveis viáveis.

[046] Os reservatórios do dispositivo da presente invenção compreendem uma capacidade volumétrica que depende de diversos fatores: o volume da amostra a ser processada, as dimensões da membrana, dentre outros. Em uma modalidade preferencial, os reservatórios usados para uma membrana de 1x3 cm variam entre 0,5 e 4,0 ml. É vital destacar que o dispositivo da presente invenção gera uma corrente no fluido ou meio de cultura de tal maneira que as células móveis, de preferência, espermatozóides, usem sua capacidade de nadar a montante para sua separação. A dita corrente é ocasionada por uma diferença de pressão nos reservatórios. A fim de gerar diferença de pressão, o segundo reservatório contém um nível de líquido maior, gerando, desse modo, uma corrente em direção ao primeiro reservatório através da membrana. Em uma modalidade preferencial, no dispositivo da presente invenção, a amostra a ser separada é colocada no dito primeiro reservatório e fluido ou meio de cultura é carregado no dito segundo reservatório para recuperar células móveis separadas do restante da população em sua passagem através da dita membrana. Para gerar diferença em pressão e, portanto, fazer com que uma corrente flua para o primeiro reservatório, primeiro, o segundo reservatório tem que ser preenchido com o mesmo nível ou um nível maior que o dito primeiro reservatório; de modo subsequente, o primeiro

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15/22 reservatório é preenchido com a amostra da população de células a ser separada.

[047] O dispositivo da presente invenção separa espermatozóides móveis dentro de um período de entre 1 e 90 minutos. De preferência, entre 10 e 90 minutos.

[048] Em outro aspecto da presente invenção, o mesmo pode ser realizado na ausência de um fogão, visto que o mesmo também funciona mesmo quando é aquecido pelo calor liberado pelos próprios operadores.

[049] Em outro aspecto da modalidade da presente invenção, o dispositivo é adaptado à técnica de injeção de esperma intracitoplasmática (ICSI). Para inseminação com microinjeção de sêmen em um ovócito, separação de espermatozóides de alta performance na mesma membrana de injeção pode ser usada. A mesma tem como base uma modalidade alternativa da presente invenção, mas com dimensões adequadas para o processo de ICSI. Uma modalidade alternativa preferencial da presente invenção com apenas um canal que é mostrado na Figura 4 compreende os ditos dois reservatórios, também chamados de microcuvetes (402 e 403) ligados por um canal com uma entrada em formato de funil que conecta ambos os reservatórios (404). Ambos os reservatórios são cobertos por uma cobertura de vidro (401), possibilitando, desse modo, um canal de 10 μ. Esse sistema permite recuperação de espermatozóides de alta qualidade in situ. Nessa modalidade alternativa, a membrana tem apenas um canal.

[050] Em outra modalidade alternativa da presente invenção, a invenção compreende um formato cilíndrico como mostrado na Figura 6, que compreende uma

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16/22 cobertura (601), um orifício próximo à abertura do dito tubo (602), um primeiro reservatório (604) e um segundo reservatório (603), em que pode ser visto que o nível do segundo reservatório, saída e reservatório de coleta para os espermatozóides selecionados é maior que o nível do primeiro reservatório em que a amostra de sêmen com os espermatozóides a serem separados é carregada. A Figura 6 mostra uma ampliação da seção que exibe a membrana (605) com canais (606) junto com o fluxo de espermatozóides.

Exemplos do Pedido

Exemplo 1

Dispositivo com Testes de membrana de vidro D, E e F [051] Em uma membrana de vidro, o dispositivo de separação de células móveis da presente invenção (MXM) compreende duas placas de reservatórios separadas por uma placa de membrana de vidro de espessura de 130 ±40 pm com canais cônicos que têm o comprimento da largura de vidro, de cerca de Imm, um primeiro diâmetro de 15 pm (entrada) e um segundo diâmetro de 8 pm (saída). No primeiro momento, meio de recuperação Ham F10 IX com HEPES foi colocado, suplementado com SSS e Penicilina/estreptomicina foi colocada no reservatório de recuperação (segundo reservatório) ; então, amostras de sêmen D, E e F foram colocadas após terem sido processadas de acordo com o Protocolo WHO2010, no reservatório remanescente (primeiro reservatório).

[052] Nesse exemplo, a membrana é lcm x 2cm, com uma densidade de 6.600 perfurações/cm2. O primeiro reservatório, em que a amostra a ser processada é colocada,

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17/22 tem uma capacidade volumétrica máxima de 3 ml, e o segundo reservatório compreende uma capacidade máxima de 1 ml.

Exemplo 2

Dispositivo com Teste de membrana de PET A, B, C e D [053] A membrana produzida a partir de PET foi produzida com 2.500 canais, cada uma com 200 pm de comprimento. Os canais cônicos compreendem um primeiro diâmetro (entrada) de 15 pm e um segundo diâmetro (saida) de 10 pm. A membrana de PET é lem x 2cm. Os reservatórios são os mesmos usados para a membrana de vidro no exemplo 1. Em primeiro lugar, meio de recuperação Ham F10 IX com HEPES foi colocado, suplementado com SSS e Penicilina/estreptomicina foi colocada no reservatório de recuperação (segundo reservatório) ; então, amostras de sêmen A, B, C e D foram colocadas após terem sido processadas de acordo com o Protocolo WHO2010, no reservatório remanescente (primeiro reservatório) .

[054] Para ambos os exemplos, o procedimento de usar o dispositivo da presente invenção é o seguinte:

[055] Etapa 1- Meio Ham F10 IX com HEPES (0,6 a 0,7 mililitros) é colocado no nivel do segundo reservatório. HamFlO IX com HEPES é carregado com uma pipeta Pasteur de ponta de tubo para possibilitar a entrada da cuvete; quando a mesma é preenchida, membranas são preenchidas com meio de Ham que são imersas na superfície interna e na superfície imediata do lado de sêmen.

[056] Etapa 2 - Imediatamente após, a amostra de sêmen é colocada no primeiro reservatório. A membrana

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18/22 deve ser completamente coberta pela amostra a ser processada; a superfície da dita membrana deve ser usada até o máximo.

[057] Etapa 3 - Incubação prossegue por uma hora (pode estar na faixa de 20 minutos a 60 minutos) em contato com o corpo, embora a mesma possa ser realizada em um forno.

[058] Etapa 4-0 dispositivo é retirado do estado de incubação (seja no forno ou estando em contato com o corpo); um forno a 36 °C foi usado para o Exemplo 2, e o primeiro para o Exemplo 1. A amostra processada é recuperada do meio de recuperação, isto é, do segundo reservatório com o uso de uma seringa e agulha de tuberculina. Essa amostra processada está pronta para ser usada em inseminação artificial.

[059] Para avaliação de sêmen antes e após a recuperação, as diretrizes de WHO 2010 foram observadas. Para avaliar DNA, o Teste de TUNEL (Rotulação Final de Pequeno Corte de dUTP de Transferase Terminal) foi aplicado com o uso de um citômetro de fluxo ou um microscópio fluorescente.

Resultados [060] Os resultados do instrumento mostram que aplicar o método da presente invenção (MXM) ao vidro como o material de escolha duplica a porcentagem de formatos normais (morfologia estrita) em relação ao sêmen não tratado, de 13,3% no método direto (média de amostras D, E, F) de formatos normais para 27,0% (n:3) com o dispositivo da presente invenção. Ao comparar MXM da presente invenção (vidro), com nado para cima, a presente invenção alcança um

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19/22 aprimoramento de 50 % (amostras D, E, F) na morfologia dos espermatozóides selecionados. (Tabela 1) [061] No caso da presente invenção com o uso de PET como o material escolhido, a porcentagem de espermatozóides com formato normal triplicou em comparação com o método direto aumentou de 10,3% para 36,0% (para amostras A, B, C, D), valores médios dos resultados obtidos em cada teste. Enquanto no caso de nado para cima, um valor de quase o dobro para espermatozóides de formato normal é alcançado, de 11,3% a 18,0% de formato normal que aplica o método da presente invenção. É válido mencionar que o nado para cima é a técnica básica normal para recuperação de espermatozóides levando em consideração inseminação artificial de complexidade alta ou baixa, com a desvantagem de que o tempo de exposição e manipulação junto com centrifugação pode levar a alterações de DNA.

[062] Por outro lado, a morfologia é avaliada ao aplicar o critério de Kruger, WHO. Uma amostra cujo Teste de Túnel (2) para integridade de DNA, produziu um valor de 35% (patológico, visto que os calores de referência devem estar abaixo de 20%) foi tomada para realizar o mesmo estudo sobre nado para cima e em MXM com PET e vidro, da mesma amostra (amostra D). Os valores obtidos, como é observado na tabela a seguir, mostram um aprimoramento significativo quando se usa MXM em PET: o valor original reduz em mais de um terço (de 35 para 10), um valor extremamente significante. Por outro lado, os valores do Teste de Túnel para os métodos de nadar para cima, bem como MXM em vidro da presente invenção para a amostra D, mostram um aumento do dito valor com uma redução de quase nove vezes.

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20/22 [063] Embora seja observado que com o nado para cima a amostra D alcança uma redução em espermatozóides de DNA danificado que também é igual àquela constatada em MXM, o último método da presente invenção produz uma amostra com espermatozóides de uma morfologia três vezes melhor para a dita amostra.

Tabela 1: Resultados de testes nos Exemplos 1 e 2

AMOSTR A	Presente invenção em PET	Presente invenção em VIDRO	Nado para cima	DIRETO
	MORFOL OGIA	TÚNEL	MORFOL OGIA	TÚNE L	MORFOL OGIA	TÚNEL	MORFOL OGIA	TÚN EL
A	22				13		12
B	43				26		6
C	43				18		10
D	35	10	24	4	8	3	13	35
E			31		26		15
F			26		20		12

Aument o em % da % de morfol ogia normal em relaçã o ao sêmen não tratad o	Compar ação de A, B, C, D ocorre a partir de uma média de 10,3% de format o normal em sêmen não tratad o para 35,7%. Isso		Compar ação de D, E, F ocorre a partir de 13,3% de média de format os normai s em sêmen não tratad os para 27,0% de		Compar ação de A, B, C, D, E, F ocorre a partir de 11,3% de média de format os normai s de sêmen não tratad o para 18,5%.		0

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	iznplic a que a % de format os nozmai s é tripli cada.		format os normal s . Isso izoplic a que format os norznai s são duplic ados.		Isso aument a menos que o dobro de format os normai s .
Aument o de % da % de morfol ogia normal em relaçã o ao nado para cima	Compar ação A B, C, D ocorre a partir de 16, 3% média de format os normal s em nado até 35,7% com MXM. Isso implic a que format os nozmai s aument aram 120%.		Compar ação de D, E, F ocorre a partir de 18,0% para 27,0%. Isso é aument o de morfol ogia para MXM, de 50% em relaçã o ao nado para cima
Porcen tagem de esperm atozoi des com		Porce ntage m de esper matoz oides danif		Pore enta gem de espe rmat ozoi		Porce ntage m de esper matoz oides danif

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DNA	icado	des	icado
danifi	s	dani	s
cado	reduz	fica	reduz
reduzi	iu	dos	iu
u em	para	redu	para
relaçã	1/3	ziu	1/10
o a	em	para	em
sêmen	relaç	1/10	relaç
fresco	ão à	em	ão à
(apena	amo st	rela	amo st
s	ra	ção	ra
Amostr	sem	à	sem
a D)	trata	amos	trata
	mento	tra	mento
		sem
		trat
		amen
		to

Referências :

(1) Aitken RJ, Sawyer D. The human spermatozoon— not waving but drowning. Adv Exp Med Biol 2003;518:85-98 (2) A Agarwal, SS Allamaneni - Minerva Ginecol, 2004 - clevelandclinic.org (3) D Mortimer - Human Reproduction, 1991 - ESHRE (4) K Miki, DE Clapham - Current Biology, 2013 Elsevier

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo para a separação de células móveis de uma população de células que compreende um primeiro reservatório e um segundo reservatório ligado por pelo menos uma membrana, caracterizado pelo fato de que a dita membrana compreende pelo menos um canal com pelo menos uma extremidade que compreende uma redução em diâmetro em relação ao interior do dito canal.
2. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito canal compreende em pelo menos uma de suas extremidades um formato selecionado a partir do grupo que compreende de formatos de hipérbole, parábola e cônico.
3. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita membrana compreende uma multiplicidade de canais.
4. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito canal compreende ambas as extremidades com formatos selecionados a partir do grupo que compreende formatos de hipérbole, parábola e cônico.
5. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas células compreendem espermatozóides.
6. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita membrana compreende uma multiplicidade de canais que permitem a separação de espermatozóides móveis em um lado da dita membrana e dos elementos ou células não móveis que permanecem no outro lado da membrana.

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7. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos canais compreendem um primeiro diâmetro externo de entre 50 e 200 pm, e um primeiro interno de entre 8 e 15 pm.
8. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito canal compreende um primeiro diâmetro externo de entre 50 e 200 pm, e um segundo diâmetro externo de entre 10 e 50 pm e um primeiro interno de entre 8 e 15 pm.
9. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita membrana compreende entre 1.000 e 20.000 canais/cm2.
10. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o volume do dito primeiro reservatório é entre 1 e 5 ml, e o volume do dito segundo reservatório é entre 0,5 e 1,5 ml.
11. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o volume do dito primeiro reservatório é entre 1 e 5 ml, e o volume do dito segundo reservatório é entre 0,5 e 1,5 ml; e em que o dito segundo reservatório compreende um nível maior que o dito primeiro reservatório.
12. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito segundo reservatório é preenchido com um meio de cultura que gera uma corrente dentro do dito meio de cultura em direção ao dito primeiro reservatório.

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13. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita membrana é produzida a partir de um material selecionado a partir do grupo que compreende vidro, PET, metal, cerâmicas, polímero, fibra de carbono e as misturas ou combinações dos mesmos.
14. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os espermatozóides com DNA danificado obtido no segundo reservatório é reduzido, em comparação com a amostra fresca, em pelo menos três dobras.
15. Dispositivo para a separação de células móveis, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que aumentar a morfologia normal de espermatozóides em pelo menos 80% em comparação com o método direto.
16. Método para separar células móveis de uma população de células caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

a. colocar o meio de cultura para inundar um segundo reservatório e canais;

b. colocar a população de células em contato com um primeiro reservatório com uma face de uma membrana que compreende pelo menos um canal com pelo menos uma extremidade que tem uma redução em seu diâmetro em direção ao interior do dito canal, tornando o mesmo menor que o nível de um segundo reservatório, que permite que o mesmo continue a passar o meio para o primeiro reservatório e, desse modo, produzir o efeito de contracorrente inicial;

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c. incubar;

d. recuperar células móveis de uma porcentagem maior de morfologia normal do outro lado da dita membrana.
17. Método para separar células móveis de uma população de células, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a etapa b compreende uma corrente de um meio de cultura que flui a montante em relação à passagem das ditas células móveis, em que a dita corrente é gerada por uma diferença na pressão.
18. Método para separar células móveis de uma população de células, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita diferença em pressão é gerada pela diferença de nível entre reservatórios localizados em ambos os lados da dita membrana.
19. Método para separar células móveis de uma população de células, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dita etapa c compreende incubação por um período de entre 1 e 90 minutos a 35 a 37 °C.
20. Método de separação de células móveis de uma população de células, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dita etapa c compreende incubação por um período de entre 10 e 90 minutos a 35 a 37 °C.
21. Método de separação para células móveis de uma população de células, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende o uso do dispositivo de separação, de acordo com a reivindicação 1.