JP2022528808A - 運動性細胞選別装置 - Google Patents

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Abstract

運動性細胞選別装置運動性細胞選別装置を開示する。この装置は、チャンバ（４）と、チャンバと流体連通する入口（５）および出口（６）と、チャンバ内に配置された複数の離散的障壁（８）とを備えている。各離散的障壁は、少なくとも１つの壁（１５、１６）と、排出口に向けられた少なくとも１つの鋭角エッジ（１７）を備える。

Description

本発明は運動性細胞選別装置に関する。
年齢を重ねてから家庭を持つことを始めるようにする夫婦が増える傾向にある。しかし、夫婦の待つ時間が長ければ長いほど、成功に妊娠できる可能性は低くなる。したがって、妊娠の可能性を高めることができる生殖補助治療は、個人的にも、より広く、社会的にも、ますます重要になってきている。
生殖補助治療は一般的に２つのカテゴリに分けられている。
子宮内人工授精（ＩＵＩ）は、準備した精子サンプルをカテーテルを使って（女性の）子宮内に導入し、子宮内で受精させるプロセスである。この方法は、男性側の不妊症および女性側の不妊症の両方に用いることができる。一般的に他の同等の治療に比べて侵襲性は低いが、成功率が低いため、使用される機会が減っている。
体外受精（ＩＶＦ）は、準備した精子サンプルと卵母細胞（卵）を組み合わせて、実験室内で胚を作ることを含むプロセスである。ＩＶＦは、さらに２つの異なる治療、すなわち、実験室の皿の上で卵母細胞と準備した精子サンプル（通常、５万から１０万個の精子細胞）を組み合わせて受精させることを含む従来のＩＶＦと、準備した精子サンプルから単一の精子細胞を選択して卵母細胞に直接注入する卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）による体外受精のＩＶＦとに分けられる。いずれのＩＶＦ治療が成功した場合、受精卵は制御された環境の中で特殊な培養液の中で３～５日間、胚へと成長させられ、その後、子宮に移植されて着フロアさせてと胚として成長させる。
生殖補助治療では、一般的に精子の準備または「精子洗浄」段階を採用する。この段階の目的は、望ましくない汚染物質（細胞残屑、バクテリア、免疫細胞、粘液、受精成功の可能性に悪影響を及ぼすその他の化学物質など）を含む可能性のある精液から精子細胞を分離すること、（精子サンプルが凍結された場合）あらゆる凍結保存剤化学物質を除去すること、そしてサンプルから運動性の高い精子細胞のみ、好ましくは最も運動性の高い精子細胞を選択することである。
一般的に、精子分離を行うには３つの方法がある。
単純な洗浄では、精子を適切な精子洗浄剤に懸濁し、遠心分離を行って精子細胞を採取する。この方法では、化学物質の汚染を希釈するには成功であるが、死細胞または細胞残屑を除去することはできず、生きている細胞と死細胞を分離することはできない傾向にある。
密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）では、密度の異なる液体が入った試験管の中でサンプルを遠心分離する。液体は、適切な密度の細胞のみが採取され、細胞残屑または重度の損傷を受けた細胞がとり残されるように調整されている。無傷で泳いでいる細胞は、通常、わずかにより高い密度を持っているので、この方法は、密度の差に基づいて細胞を分離するのに使用できるが、運動特性には直接影響しない。
いわゆる「スイムアップ」では、適切な精子洗浄液のサンプルを、遠心分離によって徐々にペレット化された精液サンプルの上に注意深く浮かべる。運動性細胞は洗浄液の中にスイムアップし、運動性のない細胞はペレットの中に残る。
現在の洗浄方法には、１または複数の問題を抱える傾向がある。
まず、少なくとも１回の遠心分離段階を行う必要がある傾向にあるが、これは細胞にＤＮＡ損傷を与えると考えられている。第二に、スイムアップは進行性運動率を選択するものではないので、選択された精子の質が低くなる可能性がある。第三に、ＤＧＣはある程度の特異性を持って運動性細胞を分離することができるが、そのプロセスの効率は様々で、例えば、何種類の異なる液体を使用するか、それらの液体の密度、遠心分離の速度、技術者のスキルなど、多くの要因に依存する。また、ＤＧＣはＤＮＡ損傷を増加させることができ、さらに胚の生存率に影響を与えることが示されている。
洗浄方法の代わりとなるものは数多く出現している。
一つの方法は、マイクロ流路分離を使うことである。精子分離装置の例としては、ＺｙＭｏｔ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ社（米国メリーランド州、ゲイサーズバーグ）から発売されているＺｙＭｏｔ（ＴＭ）ＭｕｌｔｉおよびＺｙＭｏｔ（ＴＭ）ＩＣＳＩがある。これらの装置は、狭いチャネルに沿って精子細胞の壁反射を利用するか、または薄い膜を使ってスイムアップを補助する機能を持っている。
もう一つの方法は、細胞を緩やかな液体の流れにさらすことで、精子細胞の向きを変え、採取チャンバに泳ぎ込むレオタクティック分離である。
また、もう一つの方法として、電気泳動は、電界を利用して誘電率に基づいて細胞を分離する方法である。磁性粒子を特定の細胞に結合させ、その後、主に細胞を分離することに依存する方法であるが、磁気分離も使用できる。
運動性精子を分離する方法は、ＷＯ ２０１６／０３５７９９ Ａ１に記載されている。
また、ＷＯ ２０１７／１２７７７５ Ａ１にも参照している。
本発明の第１の態様に係る運動性細胞選別装置が提供される。運動性細胞は精子であってよく、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、鳥のいずれの精子であってよい。この装置は、チャンバと、チャンバと流体連通する入口および出口と、チャンバ内に配置された複数の離散的障壁とを備える。各離散的障壁は、少なくとも１つの壁と、出口に向けられた少なくとも１つの鋭角エッジを備える。
これにより、化学的、電気的、熱的および／または重力的な勾配を最小限に抑えながら、或いはさらに避けながら、最も運動性の高い細胞だけでなく、徐々に運動性細胞も分離および濃縮することができ、細胞損傷のリスクを低減するように役立つことができる。これらの種類の細胞は、妊娠の成功率および低い流産率と密接に関連している傾向がある。これは、許容できる形態および構造を持つと判断された細胞を優先的に分離するのにも役立てる。
障壁は、（平面図で）三日月形または矢じり形であることが好ましい。しかし、障壁の形状は、涙形、半円形、シェブロン形であってよい。
少なくとも１つの壁は、第１および第２の壁を備えてよく、少なくとも１つの鋭角エッジは、第１および第２の壁の間の第１の鋭角エッジを備えてよい。第１の壁は、凸状、直線状または凹状であってもよい。第２の壁は、凹状または直線状であってもよい。少なくとも１つの鋭角エッジは、第２の鋭角エッジをさらに含んでよい。第２の鋭角エッジは、第１の壁と第２の壁との間に、例えば、三日月形の障壁を形成してもよい。少なくとも１つの壁は、第３の壁を含んでもよく、第２の鋭角エッジは、第２の壁および第３の壁の間にあってもよい。
鋭角エッジは、２つの壁（または壁の２つの部分）が０°より大きく９０°より小さい角度で接することで画定される。好ましくは、その角度は３０°未満である。各鋭角エッジの曲率は、０μｍより大きく５０μｍ以下、好ましくは２０μｍ未満であってよい。
装置の直径は、２．５ｃｍ～３．５ｃｍであってよい。
装置のチャネル４は１００μｍ未満であってよい。
チャンバは、第１および第２の端部にそれぞれ設けられた入口と出口との間を通るチャネルを備え、第１および第２のチャンバ壁を備えてもよい。チャンバは、周辺部と中央部を有する円盤状であってもよく、上記入口はチャンバの周辺部に環状に配置され、出口は中央部に配置されている。チャンバの高さは、５０～３００μｍであることが好ましい。好ましくは、チャンバの高さは１００μｍ超である。
入口および／または出口は、直径が１～８ｍｍであってよい。入口は、直径が３ｍｍであってよい。入口は、直径が５ｍｍであってよい。出口は、直径が５ｍｍであってよい。
各離散的障壁は、好ましくは、１０～５００μｍ、または１００～１５０μｍの幅を有する。各離散的障壁は、１２５μｍの幅を有してよい。各離散的障壁は、好ましくは、１０～１０００μｍまたは１００～２５０μｍの長さを有する。
各離散的障壁は、１７５μｍの長さを有してもよい。
各離散的障壁は、好ましくは、２０～５００μｍ、または１００～５００μｍの第１の隙間によって、第１の方向（例えば、列）の隣接の障壁から分離される。
各離散的障壁は、好ましくは、２０～５００μｍ、または１００～５００μｍの第２の隙間によって、第２の異なる方向（例えば、行または列）の隣接の障壁から分離される。離散的障壁は、フロアまたは天井からチャンバ内に突出してもよい。また、離散的障壁は、同一形状であってもよい。また、離散的障壁は、周期的な配列で配置されてもよく、長方形または六角形の配列で配置されてもよい。
本発明の第２の態様によれば、第１の態様の装置を含む子宮内人工授精キットが提供される。
本発明の第３の態様によれば、第１の態様の装置を使用する方法が提供され、この方法は、運動性細胞を含むサンプルを入口に供給し、少なくとも１分間の期間を待ち、その期間を待った後、出口から精製されたサンプルを採取することを備える。
時間の期間は、少なくとも５分であってもよく、好ましくは少なくとも１０分である。時間の期間は、１０～２００分、または１０～１２０分、または１０～６０分であってもよい。本方法は、装置を培養用温度に加熱することをさらに備えてよい。培養用温度は、３７℃であってよい。
サンプルおよび／または装置は、１または複数の緩衝液でパージおよび／または洗浄される。
サンプルは、精子細胞が互いにくっつく確率を下げるために、緩衝液で洗浄されてよい。
本発明の特定の実施形態が、ここで、添付の図面を参照して、例として説明されるだろう。
第１および第２のポートと、第１および第２のポストの間を走り、同伴性構造を含むマイクロチャネルを有するマイクロ流体チップの斜視図である。 巻き込み構造の配列の斜視図である。 第１のタイプの巻き込み構造の平面図である。 第２のタイプの巻き込み構造を示す図である。 第１のタイプの巻き込み構造の配列を含むマイクロチャネルの平面図である。 第２のタイプの巻き込み構造の配列を含むマイクロチャネルの平面図である。 巻き込み構造のさらなる例の平面図である。 巻き込み構造のさらなる例の平面図である。 巻き込み構造のもう一つの例の平面図である。 壁構造の平面図である。 壁構造の平面図である。 壁構造の平面図である。 第１の装置および巻き込み構造の写真である。 第２の装置および巻き込み構造の写真である。 精子を選別および抽出する方法の処理フロー図である。 精子を選別および抽出する方法の処理フロー図である。 サンプル解析の結果を示す表である。 サンプル解析の結果を示す表である。 サンプル解析の結果を示す表である。 サンプル解析の結果を示す表である。 サンプル解析のまとめの結果を示す表である。 サンプル解析のまとめの結果を示す表である。 精子運動性の棒グラフである。 精子運動性の棒グラフである。 精子形態の棒グラフである。 精子形態の棒グラフである。 精子ＤＮＡ断片化の棒グラフである。 精子ＤＮＡ断片化の棒グラフである。 精子ＤＮＡ断片化の棒グラフの写真である。 精子ＤＮＡ断片化の棒グラフの写真である。
図１を参照すると、サンプル３中の精子などの運動性細胞２を選別する装置１が示されている。
装置１は、例えば、高さの低いチャネルまたはディスクの形をしたチャンバ４と、入口５と、チャネル４と流体連通する出口６とを含む。チャンバ４の高さは、長さおよび幅などの横方向の寸法よりも小さく、好ましくははるかに小さい（少なくとも１０倍、さらには１００倍）。チャンバ４は、好ましくは５０～３００μｍの高さｈを有している。チャンバ４、入口５および出口６は、運動性細胞２を含むサンプル３が入口５に供給されると、運動性細胞２がチャンバ４を通って出口６に向かって泳ぐように配置されている。チャンバ４内を泳ぐ際に、運動性の低い細胞２（例えば、不動細胞）はチャンバ４内に保持され、運動性の高い細胞２はチャンバ４に沿って進行する傾向があるように、運動性に基づいて運動性の高い細胞２が選別され、分離される。
図２も参照すると、装置１は、チャンバ４内に配置された離散的障壁８（または「ラチェット」）の配列７を含み、上記離散的障壁８は、第１の内面９、例えばチャンバ４のフロアから、第２の反対側の内面、例えばその天井までチャンバ４内に突出している。配列７は、好ましくは、六角格子または立方体格子などの周期的な二次元配列の形態をとる。障壁８は、１０～５００μｍの第１の隙間ｇ１によって側方の隣接の障壁から、および１０～５００μｍの第２の隙間ｇ２によって前後の隣接の障壁から分離されている。
各障壁８は、それぞれ第１のポート５に向かっておよび第１のポート５から離れるように配向された異なる形状の第１および第２の面１３、１４を有する概して非対称である。第１の面１３は、少なくとも１つの壁１５を含み、第２の面１４は、好ましくは、少なくとも１つの壁１６を含む。ここで、壁１５、１６は、「側壁」と呼ばれることがある。壁１５、１６または壁１５の反対側の端部は、１または複数の鋭角エッジ１７（ここでは「不連続性」と称する）で接する。壁１５、１６の間の角度は、０°より大きく９０°より小さいものであり、好ましくは３０°未満である。エッジ１７の曲率は、０μｍより大きく５０μｍ（マイクロメートル）以下であり、好ましくは２０μｍ未満である。
チャンバ４、入口５、出口６および障壁８は、運動性細胞２が入口５からチャンバ４を通って泳ぐのに１０～６０分、好ましくは約２０分の時間ｔを要するように構成されている。
装置１は、周囲温度、すなわち室温で動作してよい。しかし、装置１は、例えばホットプレート、オーブンまたは水浴の形態のヒータ（図示せず）を備えて、装置の動作温度を培養に適した温度、例えば約３７℃に上昇させてもよい。
特に図１を参照すると、装置１は好ましくはマイクロ流体チップの形態をとっている。装置１は、ガラスおよび／またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、またはポリオクタンジオール－ｃｏ－クエン酸（ＰＯＣ）などの高分子材料から形成された第１および第２の平面部分（図示せず）のアセンブリを備えてよい。第１の部分（「ベース」と呼ばれることもある）は、チャンバ４および障壁８の底面（または「フロア」）および側面を画定するパターン化された面（図示せず）を有してもよい。第２の部分（「カバー」と呼ばれてもよい）は、特徴のない（例えば、平坦な）ものであってもよく、チャンバ４の上部（または「天井」）を画定してもよい。また、カバーは、第１および第２のポート（図示せず）を含んでもよく、未精製のサンプルおよび精製されたサンプルがそれぞれ提供され、採取されてもよい。第１および第２の部分（図示せず）は、同じ材料を備えてよく、異なる材料を備えてよい。装置１は、例えば、成形または３Ｄプリントなど、異なる方法で製作されてもよい。
障壁８は、運動性細胞２が表面に沿って泳ぐ傾向があるという表面同伴性を利用して、運動性細胞を選別する。障壁８は、鋭角不連続性を有する曲面１５、１６を有しており、泳ぐ細胞を所望の移動方向に導く。
図３および図４を参照すると、第１および第２の障壁形状８１，８２が示されている。特に図３を参照すると、第１の形状６１は、一般的に、第１のエッジ１７１，１で接合された２つの凸部１５１，１、１５１，２と、鋭い第２および第３のエッジ１７１，２、１７１，３を介して凸部９１，１、９１，２に接合された１つの凹部１６１とを有する矢じりのような形状を有する。細胞を選別するために、障壁８１は、１つのエッジ１７１，１を有する側が装置８１の入口５の方を向くように方向付けられる。所望の方向に泳ぐ細胞は、障壁８１に沿って徐々に誘導され、一方、間違った方向に泳ぐ細胞は、凹部１６１によって向きを変えられ、出口６に向かって再配向される。
第１の障壁８１は、第３の円１８３によって画定された切り抜きを有する第１および第２の交差する仮想円１８１、１８２の交点の半分によって画定される。凸面壁１５１，１、１５１，２は、それぞれが第１の半径ｒ１を有する第１および第２の重なり合う仮想円１８１、１８２の交差した円弧によって画定される。凹面壁１６１は、第２の半径ｒ２を有する第３の仮想円１８３の交差した円弧によって画定される。この場合、ｒ２＜ｒ１である。第１の障壁８１、は、１０～５００μｍの幅ｗ１と、１０～１，０００μｍの長さｌ１とを有する。この例では、ｒ１＝４５０μｍ、ｒ２＝８２μｍ、ｗ１＝１５０μｍ、およびｌ１＝１７７μｍである。
特に図４を参照すると、第２の形状８２は、一般的に１つの凸部１５２と１つの凹部１６２とを有する三日月のような形状をしており、上記１つの凸部１５２および１つの凹部１６２は、鋭いエッジ１７２，１、１７２，２を介して結合されている。エッジ１７２，１、１７２，２は、装置の出口６に向かって方向付けられている。凸側に遭遇した細胞は単に誘導され、凹側に遭遇した細胞は出口に向かって再配向される。
第２の障壁８２は、第３および第４の重なり合う仮想円１８３、１８４によって画定される。凸状および凹面壁１５２、１６２は、それぞれ第３の半径ｒ３および第４の半径ｒ４を有する第３および第４の円１８３、１８４の第４および第５の円弧によって画定される。第１の障壁８１、は、１０～５００μｍの幅ｗ２と、１０～１，０００μｍの長さｌ２とを有する。この例では、ｒ３＝１２５μｍ、ｒ４＝１３７μｍ、ｗ２＝２５０μｍであり、２つの円は３９μｍでオフセットしている。
図５を参照すると、チャンバ４は、入口５と出口６との間の経路（直線、曲線であり得、または屈曲部を含み得る）に沿って走る、概ね直線的なチャネルの形をしている。チャネル４は、この場合ではサメのヒレのような形状を持つ、繰り返されるバーブ２０を有する壁１９を有する。第１の形状８１の障壁８の長方形の配列７が使用される。異なるタイプの配列、例えば六角形、および／または異なる障壁形状、例えば第２の形状８２を使用することができる。チャネル４は、異なる形状を有してもよい。
図６を参照すると、チャンバ４は放射状（または「円形」）になっていてよく、これにより運動性細胞が周辺の環状の入口５の周りに導入され、中央の出口６に向かって内側に泳ぐようになっている。チャンバ４は、帆立貝構造２２を有する概ね円形の壁２１によって画定される。第２の形状８２の障壁８の放射状の配列７が使用される。異なるタイプの配列、例えば六角形、および／または異なる障壁形状、例えば第１の形状８１を使用することができる。
再び図３を参照すると、障壁の第１の形状６１は、一般的に、２つの凸面壁１５１，１、１５１，２からなる第１の面１３を有する矢じりのような形状を有している。ただし、これらの壁は他の異なる形状を持つことができる。
図７ａ～図７ｂを参照すると、第１の面１３は、直線状の壁１５３，１、１５３，２、或いは凹面壁１５４，１、１５３，２を有してよく、これらが鋭角エッジ１７３，２、１７３，３、１７４，２、１７４，３で凹面壁１６３、１６４と接するようになってもよい。例えば、バーブは、半分の矢じり、半分の三日月、または半分の修正矢じり（２つの凹面壁を持つ完全な修正矢じり）であってもよい。
図８を参照すると、第１の面１３に２つ以上の壁がある場合、壁１５５，１、１５５，２は同じ形状でなくてもよい。例えば、一方の壁１５５，１が直線状であり、他方の壁１５５，２が凸状であってもよい。したがって、エッジ１７５，２、１７５，３は、異なる鋭さを有していてもよい。
図９ａ～図９ｃを参照すると、チャンバ４の壁１９１、１９２、１９３は、本明細書で説明した障壁の形状に基づいてもよい、異なる形状のバーブ２０１、２０２、２０３を有することができる。
図１０ａおよび図１０ｂを参照すると、図６に示したものと同様の装置１の写真と、これらの装置に使用される図３に示したような障壁８１の写真とが示されている。図１０ａは、直径ｄｉが３ｍｍの入口５と、直径ｄｏが５ｍｍの出口６とを有する装置１を示している。この装置１は、５×３、または５×３ｍｍ装置とも呼ばれる。装置１の直径ｄは、２．５～３．５ｃｍである。５×３装置１は、図３に示されるように、１００μｍ超のピッチで間隔を置いて配置された障壁８１を含むが、障壁は、使用するサンプルに応じて、より大きなまたはより小さなピッチを有してもよい。図１０ａおよび図１０ｂの下部には、装置１の障壁８１の高倍率写真が示されている。これらの矢じりのような障壁８１を有する装置は、「ラチェット１」、またはより単純に「Ｒ１」とも呼ばれることがある。３×５装置１のチャネル４は、１００μｍ未満である。図１０ｂは、直径ｄｉが５ｍｍの入口５と、同じく直径ｄｏも５ｍｍの出口６とを有する装置１を示す。この装置１は、５×５または５×５ｍｍ装置とも呼ばれる。装置１の直径ｄは、３．５ｃｍである。障壁８の構造、ピッチおよびチャネル４は、３×５装置と５×５装置で同じである。
５×３装置では、抽出段階で望ましくない細胞やその他の破片がより少なく取り除かれるため、より良い結果が得られるが、５×５装置よりも５×３装置からサンプルを抽出するのがより困難な場合がある。５×５装置は、５×５装置よりも低品質のサンプルを得ることができるが、装置からサンプルを抽出するのがより簡単になることができる。
入口５の直径ｄｉと出口の直径ｄｏは、１～８ｍｍであってもよい。装置の直径ｄは、１～１０ｃｍであってよい。入口および出口のサイズは、各サンプルの品質および／または種類に応じて最適化することができる。
図３も参照すると、図１０ａおよび図１０ｂの装置の障壁８１は、１２５μｍの幅ｗ１と１７５μｍの長さｌ１を有してよい。
３×５装置１は、６０μｌの精液サンプルを用いて、正常な品質の精子と精液中の高品質の精子を分離するのに使用され、５×５装置は、１００μｌの精液サンプルを用いて、正常な品質の精子と低品質の精子と精液中の高品質の精子を分離するにの使用された。
図１１および図１２を参照すると、正常な精子と質の悪い精子の精液サンプルを採取し、装置１に挿入して質の高い精子を分離している。
１４人の射精者から精子を採取した。射精は、世界保健機関の基準による精子の進行性運動率（ＰＲ）に基づいて、正常群と異常群とに分けた。すべての方法で選別した精子と精液サンプルについて、精子濃度、進行性運動率、全運動性、形態、およびＤＮＡ断片化（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＴｄＴ ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ Ｅｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）アッセイを使用）を測定した。
具体的には、図１１を参照して、装置１を用いて通常の精子品質のサンプルから高品質の精子を分離する方法の段階を説明する。段階Ｓ１では、サンプルを、例えばＥａｒｌｅ'ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１ＸＥＢＳＳ）などの緩衝液を用いてパージする。他の適切な緩衝液を使用してもよく、その種類と濃度は、サンプルとプロセスの望ましい結果に依存する。段階Ｓ２では、互いにくっついた精子の変化を減少するために、例えば、１ＸＥＢＳＳに０．２％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加えた緩衝液でサンプルを洗い流す。しかし、精子同士がくっつく確率を下げる効果のある他の適切な緩衝液を使用してもよい。段階Ｓ３では、この段階でサンプル内に過剰な液体がある場合、装置に装填する前にサンプルからこの液体を除去してもよい。段階Ｓ４では、サンプルおよび／または装置を、３７℃のホットプレート上で温める。段階Ｓ５では、精液サンプルを４等分して装置１の４つの入口５に装填するが、一部の入口５だけにサンプルの一部が装填されるようにしてもよい。段階Ｓ６では、サンプルを入れた装置１を３７℃で５分間インキュベートし、顕微鏡を用いて手動で、または顕微鏡とビデオカメラを用いて自動でのいずれかで精子の移動を観察し、サンプルが正しく装填されたことを確認する。なお、サンプルが正しく装填されたことを確認するための他の方法として、例えば、段階Ｓ７の開始時に光学センサまたは運動センサを使って確認してもよい。段階Ｓ７では、サンプルの入った装置を６０分間インキュベートする。段階Ｓ８では、培養後の精子の観察を手動または自動で行う。段階Ｓ９では、ピペットを用いて、装置１から出口６を介して精子を抽出する。出口６から抽出される量は、３５～６０μｌの間であってよい。
具体的には、図１２を参照して、装置１を用いて、精子の質が悪いサンプル中の高品質の精子を分離する方法の段階を説明する。質の悪い精子サンプルの場合、段階Ｓ１～Ｓ６は、通常の質の精子サンプルの場合と同じである。段階Ｓ７では、サンプルを入れた装置を１２０分間インキュベートする。段階Ｓ８およびＳ９は、通常の品質の精子サンプルの場合と同じである。出口６から抽出される量は、４０～７５μｌの間であってもよい。
代替のプロセスを作業装置で使用してもよい。上記のプロセスの各段階は、変更または除去されることがある。例えば、段階Ｓ３を完全に除去してもよい。また、さらなる段階を追加することも可能である。例えば、サンプルおよび／または装置を洗浄し、または、緩衝液を追加してパージしたりするなどの段階を追加することもできる。プロセスの段階に関連するタイミング、温度、サンプルの量は、特定のサンプル、種、またはプロセスの目的に応じて最適化することができる。例えば、段階Ｓ７では、サンプルの種類、サイズ、および精子の速度に応じて、培養時間を長くしたり短くしたりすることができる。プロセスの最後に装置から抽出される量は、使用されるサンプルの種類と量、およびサンプルに添加される緩衝液の種類と量に応じて、高くても低くてもよい。また、高スループットのシステムでは、段階Ｓ６を除去し、または段階Ｓ８と組み合わせて、段階Ｓ８の最初にサンプルの観察を行うこともできる。
図１３を参照すると、精液サンプルの処理が成功したかどうか（チェックで示す）、または失敗したかどうか（クロスで示す）が表に示されている。正常な精子を持つ１０人（Ｎ１～Ｎ１０）と、質の悪い精子を持つ６人（Ａ１～Ａ６）のサンプルは、質の高い精子を分離するための５つの方法を受けた。これらの方法は、密度勾配遠心分離（ＤＧＣ）、スイムアップ（ＳＵ）、図２および図３に示されるような障壁８１を備えた５×３装置および５×５装置両方を用いる方法（「Ｒ１」とも表示）、および図４に示される障壁８２を備えた装置を用いる方法（「Ｒ２」と表示）であった。表から分かれるように、正常な品質の精子９サンプルが５×３装置１を用いて成功に処理され、品質の悪い精子５サンプルが５×５装置１を用いて成功に処理された。Ｒ２法では、正常な精子と質の悪い精子の群の両方を含む総計４つのサンプルを成功に処理した。
図１４～図１６を参照すると、サンプルの解析結果が表に表示されている。この結果は、濃度、進行性運動率（％ＰＲ）、運動率（％Ｍｏｔｉｌｅ）、抽出量、抽出濃度、正常および異常な形態を示す精子の割合（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎの分類に基づく）、およびＴＵＮＥＬ法に基づく無傷または断片化した精子の割合を示す。
特に図１６を参照すると、質の悪い精子の結果を詳細に示す表には、精子がＡｓｔｈｅｎｏに分類される低運動性の状態であるかどうかも示されている。
図１７および図１８を参照すると、図１３～１６に示された方法論の結果が、まとめの形式で示されている。
図１９を参照すると、図１３に示した表の方法で得られた正常品質の精子と、未処理の精液の結果について、進行性運動率と運動率±平均の標準誤差（±ＳＥＭ）を棒グラフで示している。この図には、ＬＳＤを用いた一元配置分散解析（最小有意な差を伴う一元配置分散解析）の統計解析の結果も含まれており、Ｒ１ ５×３装置を使用することで、生のサンプル、密度勾配遠心分離を行ったサンプル、およびスイムアップ法を行ったサンプルよりも有意に高い運動性および進行性運動率のサンプルが得られることが示されている。
図２０を参照すると、図１３に示した表の３つの方法と未処理の精液、具体的には密度勾配遠心分離法とＲ１ ５×５装置を用いた方法から得られた質の悪い精子の結果について、進行性運動率と運動率±平均の標準誤差（±ＳＥＭ）を棒グラフで示している。また、ＬＳＤを用いた一元配置分散解析では、Ｒ１ ５×５装置から抽出したサンプルと、未処理の精液および密度勾配遠心分離を行った精液の両方との間で、進行性運動率および運動性に有意な差が見られた。
図２１を参照すると、図１３に示した表の方法で得られた正常な品質の精子の結果と、未処理の精液の結果について、正常な形態の割合±平均の標準誤差を棒グラフで示している。また、ＬＳＤを用いた一元配置のＡＮＯＶＡでは、Ｒ５×３装置から抽出したサンプルと未処理の精液の正常な形態の割合に有意な差があることが示されている。
図２２を参照すると、Ｒ１ ５×５装置を用いて密度勾配遠心分離と処理を行った質の悪い精子と、未処理の精液の結果について、正常な形態の割合±平均の標準誤差を示した棒グラフが示されている。
図２３を参照すると、図１３の表に示した方法と未処理の精液から得られた正常な品質の精子の結果について、精子の断片化の割合±平均の標準誤差を棒グラフで示している。ＬＳＤを用いた一元配置のＡＮＯＶＡでは、Ｒ１ ５×３およびＲ１ ５×５装置から抽出されたサンプルの断片化の割合が、他の方法および未処理の精液と比較して有意な差も示されている。
図２４を参照すると、Ｒ１ ５×５装置を用いて密度勾配遠心分離と処理を行った質の悪い精子と、未処理の精液の結果について、精子の断片化の割合±平均の標準誤差を棒グラフで示している。また、ＬＳＤを用いた一元配置分散解析では、Ｒ１ ５×５装置で抽出したサンプルの断片化の割合が、密度勾配遠心分離を行ったサンプルおよび未処理の精液と比較して有意な差が示された。
図２５を参照すると、２００倍に拡大した断片化した精液の写真で、未処理の精液と、Ｒ１ ５×３装置を使用して密度勾配遠心分離、スイムアップ、処理を行ったサンプルが示されている。断片は水色に見えるように染色され、「ＬＢ」と表示されている。
図２６を参照すると、６００倍の倍率での断片化された精液の写真が、未処理の精液、および密度勾配遠心分離、スイムアップ、およびＲ２ ５×３装置を用いた処理を受けたサンプルについて示されている。断片は緑色（ここでは「Ｇ」で表示）、部分的に断片化された精子はオレンジ色（ここでは「Ｏ」で表示）、断片化されていない、損傷のない精子は赤色（ここでは「Ｒ」で表示）に染色される。
［変更形態］以上に説明された複数の実施形態に対して様々な修正がなされ得ることが理解されよう。このような変更は、運動性細胞選別装置およびその構成部品の設計、製造、使用において既に知られている同等の特徴およびその他の特徴を含んでいてもよく、ここに既に記載されている機能の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。１つの実施形態の複数の特徴は、別の実施形態の複数の特徴により、置き換えられたり、補足されたりし得る。
凹面または凸面は、円の弧で画定する必要はない。例えば、楕円、双曲線、その他の適切な曲線の円弧で表面を画定してもよい。曲率は、表面に沿って変化してもよい。
請求項は、本願において複数の特徴の複数の特定の組み合わせに対してまだ明確に述べられてはいないが、本発明の開示の範囲は、それがいずれかの請求項において現に請求されているものと同じ発明に関するか否かを問わず、かつ、それが本発明が軽減するように同じ技術的課題のいずれかまたは全てを軽減するか否かを問わず、明示的にであれ、黙示的にであれ、本明細書において開示されたあらゆる新規の特徴もしくはあらゆる新規の特徴の組み合わせまたはそれらを一般化したものも含むことが理解されるべきである。出願人らは、ここに、新しい請求項が、本願または本願から派生する更なる出願のプロセキューション中にそのような複数の特徴および／またはそのような複数の特徴の複数の組み合わせに対して明確に述べられ得ることを通告する。

Claims (25)

  1. チャンバと、
    前記チャンバと流体連通する入口および出口と、
    前記チャンバ内に配置された複数の離散的障壁であって、各離散的障壁は、少なくとも１つの壁と、前記出口に向かって配向された少なくとも１つの鋭角エッジとを含む複数の離散的障壁と、
    を備える、運動性細胞選別装置。
  2. 前記少なくとも１つの壁は、
    第１および第２の壁を含み、
    前記少なくとも１つの鋭角エッジが、前記第１および第２の壁の間にある第１の鋭角エッジを有する
    請求項１に記載の運動性細胞選別装置。
  3. 前記第１の壁は、凸状、直線状または凹状である、請求項２に記載の運動性細胞選別装置。
  4. 前記第２の壁が凹状である、請求項２または３に記載の運動性細胞選別装置。
  5. 前記第２の壁が直線状である、請求項２または３に記載の運動性細胞選別装置。
  6. 前記少なくとも１つの鋭角エッジは、第２の鋭角エッジをさらに有する、請求項２から５のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  7. 前記第２の鋭角エッジは、前記第１の壁と前記第２の壁との間にある、請求項６に記載の運動性細胞選別装置。
  8. 前記少なくとも１つの壁は、
    第３の壁を含み、
    前記第２の鋭角エッジは、前記第２の壁と前記第３の壁との間にある、請求項７に記載の運動性細胞選別装置。
  9. 前記チャンバは、第１および第２の端部にそれぞれ設けられ、第１および第２のチャネル壁を有する、入口と出口との間を走るチャネルを備える、請求項１から８のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  10. 前記チャンバが周辺部と中央部とを有する円盤状であり、前記入口が環状であり、前記チャンバの前記周辺部に配置され、前記出口が前記中央部に配置されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  11. 前記チャンバの高さが５０～３００μｍである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  12. 前記複数の離散的障壁は、１０～５００μｍの幅を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  13. 前記複数の離散的障壁は、１０～１，０００μｍの長さを有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  14. 前記複数の離散的障壁は、１０～５００μｍの第１の隙間によって、第１の方向で隣接の障壁から分離されている、請求項１から１３のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  15. 前記複数の離散的障壁は、１０～５００μｍの第２の隙間によって第２の異なる方向で隣接の障壁から分離されている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  16. 前記複数の離散的障壁がフロアまたは天井から前記チャンバ内に突出している、請求項１から１５のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  17. 前記複数の離散的障壁が同じ形状および／または同一の寸法を有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  18. 前記複数の離散的障壁が周期的な配列で配置されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  19. 前記配列は長方形の配列である、請求項１８に記載の運動性細胞選別装置。
  20. 前記配列は六角形の配列である、請求項１８に記載の運動性細胞選別装置。
  21. 子宮内人工授精キットを備える、請求項１から２０のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置。
  22. 運動性細胞を含むサンプルを入口に供給する段階と、
    少なくとも１分間の期間で待機する段階と、
    前記期間で待機した後、前記出口から精製されたサンプルを採取する段階と、
    を備える、請求項１から２０のいずれか一項に記載の運動性細胞選別装置を使用する方法。
  23. 前記期間が少なくとも５分である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記期間が１０分間～６０分間である、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記運動性細胞選別装置を、培養用温度、例えば３７°Ｃに加熱させる段階
    をさらに備える、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
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