CN102695804A - 用于分离颗粒的方法和设备，包括分离和增殖胚胎及干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及根据颗粒流经台阶式通道的能力分离颗粒的设备。这些颗粒中的至少一些容纳在由第一台阶限定边界的通道中，但是这些颗粒中的至少一些不能通过由第二台阶限定边界的更窄的通道，结果实现颗粒的分离。本发明所述的设备和方法可用于分离多种类型的颗粒。例如，其可用于从母血样品例如母亲的动脉血分离胚胎样细胞。

Description

用于分离颗粒的方法和设备,包括分离和增殖胚胎及干细胞

背景技术

研究或使用颗粒所需的基本操作之一是分离不同类型颗粒的能力。例如，在细胞生物学领域中，很多应用需要将一种类型的细胞与另一种类型的细胞分离的能力。在工业废物管理领域的应用中需要将固体颗粒从工业废水或废气中分离的能力。在农业和食品加工领域的应用中，需要将颗粒状污染物从例如谷粒等颗粒状食品分离的能力。

例如，从刚分娩不久的脐部抽取的血液（“脐带血”）是干细胞，例如胚胎干细胞和造血干细胞的丰富来源。造血干细胞可用于治疗血液疾病。存储脐带血样品的方法是已知的。这些方法的缺点是，必须存储相对大体积（例如100到250毫升）的血液，以保存足够量的干细胞来用于将来的医疗程序。存储大体积的脐带血提高了成本，并且降低了程序的便利性。如果在存储之前可将干细胞容易地从脐带血分离，则存储体积可明显减小（例如减小到0.1到1毫升）。但是，目前将干细胞从脐带血分离的方法非常昂贵、麻烦并且有时是无效的。需要从脐带血分离干细胞的有效的且成本效益高的方法。

进一步举例来说，可在孕妇血液中和曾经怀孕过的妇女血液中发现明显的胎元（即胚胎样细胞）。这些细胞在母亲已经生产男孩或孕有男孩时可具有雄性DNA，因此该DNA看起来产生于胎儿。这些细胞在母血中很少，可能每毫升母血仅存在10到12个细胞。在母血中观察到的胚胎样细胞中，胚胎滋养细胞在妇女生产之后可相对快速地减少。其它种类的胚胎样细胞据报道在怀孕数年或数十年后仍以少量在妇女血液中继续存在。一些胚胎样细胞的稀少性和明显短的持续时间使其很难收集。因此，关于这些细胞几乎一无所知。需要快速、经济并且有效地从母血分离胚胎样细胞的方法。还需要从母血中的其它胚胎样细胞分离胚胎滋养细胞的方法。

用于操纵生物细胞和其它小颗粒并且具有尺寸在从几十微米（生物细胞的尺寸）到纳米（一些生物高分子的尺寸）范围内的结构元件的机械装置已经有所描述。例如，美国专利号5,928,880、美国专利号5,866,345、美国专利号5,744,366、美国专利号5,486,335和美国专利号5,427,946描述了用于处理细胞和生物分子的装置。PCT申请公开号WO 03/008931描述了用于颗粒和细胞分离、识别、分类和操纵的微结构。

使血液通过以数微米的一维尺度限定的空间具有挑战性。必须考虑倾向于破坏细胞完整性的潮压力和由于细胞的“堆积”可能引起的通道空间阻塞。如果细胞完整性受到损害，则这还由于血液凝固（以级联方式）的倾向而变得更复杂。而且，已知大颗粒（细胞、团聚细胞、细胞外材料和生物样品中不具有明显特征的“碎屑”）可能阻塞现有装置的流体通道，抑制其效率和操作。

本文公开的主题可用于分离和操纵生物细胞、细胞器和来自颗粒或细胞混合群体的其它颗粒。

发明内容

本发明涉及用于分离例如细胞等颗粒的设备。所述设备包括主体、盖和分离元件。所述主体和盖限定空间。所述分离元件容纳在所述空间中。所述空间具有流体入口区域和流体出口区域。所述分离元件具有在所述空间中限定流体连接入口区域和出口区域的台阶式通道的形状。所述分离元件包括第一台阶和第二台阶，其每一个延伸到所述台阶式通道中。由所述第二台阶限定边界的通道比由所述第一台阶限定边界的通道更窄。当包含颗粒的流体存在于入口区域处时，流体可从所述入口区域流经所述第一通道、流经所述第二通道并且进入所述出口区域中。如果悬浮在所述流体中的颗粒粒度不超过每一个通道的窄尺寸，或如果颗粒可充分变形以使得它们能以变形形状挤过每一个通道，则所述颗粒可通过所述第一和第二通道。可通过将用于所述第二通道的窄尺寸选择成仅允许一些颗粒从其通过来分离颗粒。第一通道的窄尺寸可选择成使流体中的颗粒可单独通过第一通道，但是如果两个颗粒横跨第一通道的窄尺寸叠置，则这两个颗粒不能同时通过第一通道。

该设备可包括利于流体从所述设备外部流到所述入口区域中的流体入口端口，利于流体从所述设备的出口区域流到外部的流体出口端口，或两者都包括。流体转移装置（例如泵或重力进料流体储存器）可与入口端口和出口端口中的一个或两个流体连接，以利于流体流经所述台阶式通道。出于分离颗粒目的，这样的流体流动可沿从所述入口区域朝向所述出口区域的方向。流体流动可沿从所述出口区域朝向所述入口区域的方向，例如用于冲刷出在从入口区域到出口区域流体流动过程中不能穿过所述第二通道的颗粒。

分离元件的台阶限定所述台阶式通道中的通道，并且可具有两个或多个这样的台阶。所述台阶可由以直角相交的平面区域（形成标准直角台阶）形成，或台阶的升高部分（即过渡面）可倾斜，以使第一平面台阶区域可由倾斜的平直表面或由弯曲表面连接到第二平面台阶区域。平面台阶区域可基本上平行于所述盖的一部分、所述主体的一部分或与两者都平行，并且应具有等于其限定边界的通道的窄尺寸倍数（例如2、4、10或1000倍）的长度（沿容积流体流方向）。平面区域的宽度（沿垂直于容积流体流的方向）应等于其限定边界的通道的窄尺寸的倍数（例如10、1000或10000倍）。

所述设备在所述空间中可具有一个或多个支撑结构，用于在所述装置的装配和操作过程中保持所述台阶式通道的尺寸。所述支撑结构可完全横跨所述分离元件和主体或盖之间的距离，或其可仅横跨该距离的一部分，以提供用于元件变形的空间（例如在装配和夹紧所述设备时）。

本发明包括分离颗粒的方法。所述方法包括在所述设备的入口区域处引入颗粒，允许颗粒移动（即通过内源性细胞运动性或在所引起的流体流的影响下）通过台阶式通道到达出口区域。通过所述通道中的台阶防止至少一些颗粒进入出口区域，结果实现所述颗粒的分离。能够穿过所述台阶式通道中的所有台阶的颗粒可从出口区域收集。不能穿过所述台阶式通道中的至少一个台阶的颗粒可从所述台阶式通道的在所述台阶上游的部分收集，其中所述台阶抑制颗粒移动通过所述台阶式通道。例如，截获的颗粒可通过将一种装置（例如导管）插入所述台阶式通道中，通过使流体流反向和将截获的细胞经由入口区域冲刷出所述台阶式通道，或通过拆开所述装置并且直接回收所截获的颗粒，来实现回收。如果截获的颗粒为细胞，则其可溶解在所述台阶式通道中，并且通过沿任意方向流动而收集溶解产物。

附图说明

当结合附图阅读时，可更好地理解前面的发明内容和下面本发明的具体实施方式。所包括的这些图用于示出本发明。本发明不限于所示的具体布置方式和手段。

图1包括图1A和1B。图1A是一个实施例中的设备的一部分的正视图。图1B是图1A中所示的设备的部分沿平面1B的竖直截面图，显示了限定空间11的主体10。盖12跨过整个空间11布置，与主体10形成不漏流体的密封。具有第一台阶61和第二台阶62的分离元件14布置在空间11内，在入口端口16和出口端口18之间。第一台阶61具有宽表面31和过渡面41。第二台阶62具有宽表面32和过渡面42。

图2包括图2A、2B和2C。图2A是具有内部支撑结构20的实施例中的所述设备的一部分的正视图。图2B是图2A中所示设备的部分沿平面2B的竖直截面图。图2C是图2A中所示设备的一部分沿平面2C的竖直截面图。

图3包括图3A和3B，示出本文描述的设备的构造，其中第一和第二通道的几何形状可选择成在整个第一和第二通道实现基本上恒定的线性流速。图3A是一系列通道的正视图，其中每一个通道的宽度沿从入口区域到出口区域的方向增大。图3B是图3A中所示的一系列通道沿平面3B的竖直截面图，其中每一个通道的高度沿从入口区域到出口区域的方向减小。

图4是分离元件的一部分的立体图，显示了台阶的长度“l”、高度“h”和宽度“w”，并且标示出容积流体流“BFF”经过台阶的方向。

图5是彩色图，显示出装配的设备的盖12的正视图，显示了在如本文实例2中描述的适当装配的设备中的光图样。

图6是示出用于本文所述的实例3和4中的实验中的设备的分离元件14的盖12、底座10和第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八台阶（61-68）相对排布的示意图。流体流的方向显示为“D”。

图7是显示出本文实例4中所述的实验的分离区域内发现胚胎样细胞的近似位置的图谱。标示为“出口区域”的相对竖直位置的部分近似对应于测试盒（cassette）的设置具有4.2和4.4微米的盖到台阶距离的台阶的部分，标示为“入口区域”的相对竖直位置的部分近似对应于测试盒的设置具有5.2和5.4微米的盖到台阶距离的台阶的部分。

图8包括图8A和8B。图8A是膜81的一部分的一个实施例的视图。图8B是图8A的膜81沿平面8B截取的竖直剖面的部分的放大图。在该特定实施例中，膜81为带孔的并且在一侧上带有涂层，因此图8B示出了延伸穿过膜81的孔82，以及涂层83。在图8所示的实施例中，涂层83被涂覆到膜81的一个面上，但并不涂覆到另一个面上，涂层并不延伸入孔82中，也并不填充孔82。

图9A是图2A中所示类型装置沿平面9A截取的竖直剖视图，该装置包括介于主体10和盖12之间的膜81。内部支撑结构20帮助实现膜21在装置内平坦、平整地移置。内部支撑结构20还帮助限定空间11，并且提供对空间11的尺寸的控制。

具体实施方式

本发明涉及用于根据颗粒穿过通道的能力分离颗粒的设备。颗粒（例如悬浮在液体或气态流体中的颗粒或真空中的颗粒）移动通过由设备中的分离元件限定的台阶式通道。台阶式通道包含至少两个串联流体连接的通道，每一个通道具有窄的尺寸。流体中大部分或全部颗粒能够移动到第一通道中，但是颗粒的仅一部分能够移动通过第二通道。最终结果是，一些颗粒可移动通过整个台阶式通道，而其它颗粒则保留在该设备中，例如保留在第一通道内。因而实现颗粒的分离。颗粒的移动可由例如流体流动、重力、振动或这些方式的任意组合来促动。

膜或其它可半透或可透的屏障可与用来将能够穿过屏障的颗粒与不能穿过屏障、穿过屏障的能力较差、或者穿过屏障的速度较慢的颗粒分离的设备组合使用。在本实施例中，所述设备可用于根据颗粒穿过通道的能力和颗粒穿过膜的能力这两个方面来分离颗粒。设备的一个或多个部分（包括膜）可涂有试剂，该试剂特别地与感兴趣的颗粒结合以加强对期望颗粒的回收、分离或者两者。

定义

在本文中使用时，下面的术语中的每一个具有其在本部分中所涉及的意思。

如图4中关于矩形台阶所示出的，台阶的“长度”（或由台阶限定边界的通道的长度；图4中的“l”）指台阶沿容积流体流通过对应于该台阶的通道的方向延伸的距离。

如图4中关于矩形台阶所示出的，台阶的“高度”（图4中的“h”）指台阶沿远离分离元件的方向延伸超出在先（即上游）台阶表面的距离。

如图4中关于矩形台阶所示出的，台阶的“宽度”（或由台阶限定边界的通道的宽度；图4中的“w”）指台阶沿垂直于容积流体流方向在台阶上方延伸的距离。

通道的“窄尺寸”指分离元件的一个台阶的宽部分和设备的相对的大体平行的面之间的距离（例如面向空间的盖或主体的面）。例如，对于在垂直于容积流体流通过通道的方向的平面中具有矩形横截面的通道，通道的窄尺寸为该平面中在台阶的平直表面和设备的相对面的平直表面之间延伸并且相对于台阶的平直表面和设备的相对面的平直表面这两者中的每一个成直角的直线的长度。进一步举例来说，图1B中通道51和52中的每一个的“窄尺寸”是每一个台阶表面31和32与盖12的最接近表面之间的最小距离。

通道的“通流面积”为通道的在垂直于通道中的流体流方向的平面中的横截面。

详细说明

本发明涉及用于根据颗粒流经至少两个通道的能力分离颗粒的设备，所述至少两个通道中的第二（下游）通道52比第一（上游）通道51窄。该设备包括布置在由主体10和盖12形成的空间11中的分离元件14。在空间11中，分离元件14将空间的入口区域15与空间的出口区域17分隔。入口区域和出口区域通过由分离元件14以及主体10和盖12中的一者或两者限定的台阶式通道流体连通。形成在分离元件中的台阶限定第一和第二通道。该设备可任选地具有与空间11的入口区域15流体连通的入口端口16和与空间11的出口区域17流体连通的出口端口18，以便于向入口区域和出口区域提供和收回流体。

在一个实施例中，设备包括膜或其它屏障81，所述膜或其它屏障81与空间11处于流体连通，并且相对于另一类型的颗粒而言，能选择性地透过期望类型的颗粒。替代地，膜或其它屏障81上可附装有试剂，相对于另一类型的颗粒而言，该试剂选择性地与期望类型的颗粒结合。在既包括分离元件14又包括膜或其它屏障81的设备中，分离元件和膜或其它屏障81可选择成加强对同一颗粒类型的分离（即，两个元件加强期望颗粒的分离）或对不同颗粒类型的分离（即，两个元件促进从颗粒混合物分离多种颗粒类型，包括彼此分离）。

在操作中，入口区域15中的颗粒进入第一通道51，并且如果其能够，则进入第二通道52。第二通道52中的颗粒进至出口区域17。不能进入或沿第二通道传送的细胞不会到达出口区域17。以这种方式，将能够到达出口区域17的颗粒与不能到达出口区域17的颗粒分离。两种颗粒群体可分别从该设备回收。例如，在出口区域17处的颗粒可在从出口区域收回的液体流中回收（例如通过出口端口或通过插入出口区域17中的导管）。不能经过第二通道52到达出口区域17的颗粒可通过沿相反方向将其冲刷经过第一通道51并且进入入口区域15进行回收。这样的颗粒可从入口区域15收回。替代地，不能经过第二通道52到达出口区域17的颗粒可留在设备中，或通过将该设备拆开进行回收。既不能进入第一通道51又不能进入第二通道52的颗粒可从入口区域15回收。

本文所述的设备可用于多种应用中。除了从混合的颗粒群体中分离颗粒，该装置还可用于例如识别或进一步操纵所分离的颗粒群体中的一种或多种的应用中。相对于以前用于颗粒分离的装置，该设备的结构和操作可通过将颗粒进行分离而防止阻塞。有利的是，使用本文所述的设备分离的颗粒可悬浮在液体或气态流体中，或根本不在流体中（例如在真空中）。而且，颗粒悬浮于其中的任何流体可流经该设备或保持静止。即，颗粒可进行分离，而与是否使颗粒悬浮于其中的任何流体移动经过该设备的空间无关。因而，例如，在干颗粒混合物中的颗粒可通过将该混合物提供到入口区域并且振动或摇动装置（定向成使重力倾向于将颗粒引过分离区域）进行分离。在认为颗粒不期望或不必要悬浮在流体中的情况下（例如，当将植物种子从例如其它植物种子等其它颗粒物质分离时），这样使用可能是有利的。

现在单独地更详细地讨论该设备的部件和部分。

主体和盖

该设备具有在其间限定空间11的主体10和盖12。空间11的部分地由分离元件14限定的部分是台阶式通道。该台阶式通道还由与分离元件14的一个或多个台阶式表面31和32相对的主体10的表面、盖12的表面或这些表面的组合限定。（即，沿一定位向以使主体10和/或盖12的一个或多个台阶式通道限定表面接触分离元件14的一个或多个台阶式通道限定表面从而使得所述表面在表面之间形成延伸的内腔（即台阶式通道））。为了简化该设备的结构，大部分或所有台阶式通道限定表面可成形或加工到分离元件14中，分离元件14为形成在盖12或主体10的凹部中的一体部件，所述凹部由平直表面围绕，以使主体10或盖12的相对表面仅需要为另一个平直表面，以当在主体10和盖12的平直表面之间接触时形成台阶式通道。

分离元件14优选与主体10和盖12中的一个形成一体（成形或机加工为主体10和盖12的一部分）。在本实施例中，设备的操作部分主要包括两件，即盖12和具有作为其一部分的分离元件14的主体10，或主体10和具有作为其一部分的分离元件14的盖12。主体10和盖12中的哪一个具有分离元件14不重要，因为主体10和盖12形成空间11的壁，并且限定空间11，在该空间中布置分离元件14。优选地，不具有分离元件14的部件的一部分简单地为与具有分离元件14的并且其中具有空间11的部件的平直边缘配合的平直表面，以在两部件装配时，空间11通过平直表面的配合而密封，并且分离元件14布置在如此密封的空间11中。在该实施例中，部件之一具有形成或机加工在其中的空间11和分离元件14，或者，替代地，具有形成或机加工在其中的空间11，并且具有设置、装配、成形或粘附在空间11中的分离元件14。

除了主体10和/或盖12的在空间11中限定台阶式通道的一个或多个部分以及主体10和盖12的配合来密封空间11的一个或多个部分以外，对主体10和盖12的形状并无严格要求。对主体10和/或盖12的限定台阶式通道的一个或多个部分的要求在本发明的与台阶式通道相关的部分中讨论。主体10和盖12的配合来密封空间11的一个或多个部分没有任何特别的形状或位置要求，只要其在设备装配时将密封空间11，允许设置由主体10和盖12两者限定边界的任何孔口（例如入口端口或出口端口）。密封可通过主体10和12的相关部分之间的直接接触实现。替代地或另外地，例如粘合剂、油脂、垫圈、蜡等密封物可应用在主体10和盖12的密封表面上。所述密封应能够抵抗设备操作过程中在设备内产生的预期内部压力。例如，在很多实施例中，内部流体压力通常不大于每平方英寸25磅的表压（psig），并且对于这样的实施例，能够防止流体在该压力下泄漏的密封就足够。在使用该设备分离生物细胞的实施例中，更通常的操作压力预期在>0-15psig范围内。在一些实施例中，该设备可通过向出口区域施加负压（即真空）进行操作，在所述实施例中，密封应防止来自装置外部的空气或液体进入所述空间（当然不是防止通过入口区域进入）。

对于主体10和盖12的其余部分的尺寸和形状并无严格要求，并且可选择成便于例如制造、处置或操作该设备。举例来说，对于具有基本上平直的盖12（例如，类似用于显微镜载玻片的盖玻片）的设备，主体10可具有空间11和形成或机加工在其中的分离元件14，并且主体10的在空间11外部的部分可形成或机加工成使主体10适于将其固定在具有固定几何形状的框架或支架中。因而，例如，主体10可具有凸缘、把手、螺纹孔、光滑孔、用于容纳夹的凹入部或凹陷部、或形成、应用或加工在其中或其上的其它结构，并且这样的结构可便于在用于操作该设备的装置中使主体10可再现地定向或在用于将空间11和分离元件14中的一者或两者都机加工在主体10中的装置中使主体10可再现地定向。

主体10、盖12或两者都可限定端口，流体通过所述端口可引入空间11中或从空间11收回。例如，主体10可限定入口端口16，其与入口区域15流体连通。引入入口端口16的流体可流入入口区域15中，将已经在那里的流体（由于空间密封）排入台阶式通道中，并且因此进入第一通道51和第二通道52中，并进入出口区域17中。只要颗粒可流经当前的和介于中间的通道和区域，则悬浮在这些区域和通道中的一个内的流体中的颗粒可被携带到下游区域或通道中。类似地，通过形成在主体10中的出口端口18从出口区域17收回流体可引起流体从与出口区域17流体连通的通道流动，并且从与其流体连通的通道和区域流动。

端口可为延伸穿过盖或主体的简单的孔，或其可具有与其关联的配件（套环、环、转接器或其它配件），以便于将流体流动装置连接到端口。主体10、盖12或两者都可在空间11的入口区域15中限定入口端口16，在空间11的出口区域17中限定出口端口18，或同时限定入口端口16和出口端口18。流体可通过入口端口16引入入口区域15中。流体可通过出口端口18从出口区域17收回。将流体连续引入入口区域15中并且同时将流体从出口区域17收回或排出可形成流经该设备的连续流体流。类似地，将流体从出口区域17连续收回并且同时将流体注入或引入入口区域15中可形成连续流。

空间

主体10和盖12在其装配时形成空间11。空间11具有入口区域15、出口区域17和介于入口区域15和出口区域17之间的分离区域。分离元件14布置在分离区域内，并且与主体10、与盖12或与两者一起限定台阶式通道。台阶式通道包括至少第一通道51和第二通道52，第一通道51和第二通道52串联流体连接，并且由分离元件14中的台阶限定。台阶式通道可包括任意数量的另外的台阶，其每一个可在空间中限定另外的通道。

在装置的操作过程中，空间11的至少入口区域15、出口区域17和台阶式通道由流体填充。优选整个空间11在操作过程中由流体填充。在一个实施例中，连接入口区域15和出口区域17的唯一的流体路径为台阶式通道。存在于入口区域15中的颗粒可进入并且通过台阶式通道的第一台阶51，除非其由第一通道51的尺寸（即窄尺寸）或形状排除在外。存在于第一通道51中的颗粒可进入第二通道52，除非其由第二通道52的尺寸（即窄尺寸）或形状排除在外，或除非其被第一通道51的尺寸（即窄尺寸）或形状抑制移动经过第一通道51。存在于第二通道52中的颗粒可进入出口区域17，除非其被第二通道52的尺寸（即窄尺寸）或形状抑制移动经过第二通道52。颗粒在该设备中的移动可通过经过该通道的流体流动、通过细胞的固有运动性或通过这两者的组合引起。随着时间过去，不能进入第一通道51的颗粒将在入口区域15中被分离；能够进入第一通道51但是不能进入第二通道52（或不能自由移动通过第一通道51）的颗粒将在第一通道51中被分离；能够进入第二通道52，但是不能自由从其通过的颗粒将在第二通道52中被分离；并且既能够移动通过第一通道51又能够移动通过第二通道52的颗粒将在出口区域17中被分离（或在从出口区域17收回或排出的流体中被分离）。

以该方式分离的颗粒可从其各自位置回收（使用多种已知方法中的任一种，包括本文描述的一些方法）。举例来说，导管可插入该设备的区域或通道（例如入口区域15或第一通道51），并且其中存在的颗粒可通过在导管内腔中产生吸力来收回。进一步举例来说，可使用倒冲法（即流体流从出口区域17沿入口区域15的方向流动）来收集在入口区域15处收集、收回或排出的流体中存在于入口区域15、第一通道51和第二通道52中的一个或多个中的颗粒。进一步举例来说，存在于入口区域15处的颗粒可使用出于该目的设置的与入口区域15流体连通的端口，通过跨过入口区域15的横穿（相对于经由台阶式通道从入口区域15到出口区域17的容积流体流）流体流来收集。

分离元件

分离元件14位于由主体10和盖12限定的空间11中，并且位于空间11的入口区域15和出口区域17之间，为设备的具有限定部分台阶式通道的表面的部件。主体10和盖12中的一个或两个限定台阶式通道的其余边界，所述台阶式通道流体连接入口区域15和出口区域17。分离元件14具有包括至少两个台阶的形状，所述台阶形成第一通道51和第二通道52中的每一个的边界的至少一者。主体10和盖12中的一个或两个限定第一通道51和第二通道52的其余边界。

台阶式通道为孔，在设备的操作过程中，颗粒通过所述孔移动，流体通过所述孔流动，或者两者都存在。分离元件14具有台阶式结构，其限定台阶式通道至少一侧的台阶式形状。分离元件14具有至少两个台阶，第一台阶61和第二台阶62。第一台阶61在台阶式通道中限定第一通道51的边界。第二台阶62限定第二通道52的边界，第二通道52比第一通道52具有更小的窄尺寸（参见例如图2B）。第一和第二通道串联流体连接，第二通道52在设备的正常操作中在第一通道51的下游。在设备装配时，流体必须流经台阶式通道中的第一和第二通道的每一个，以从入口区域15移动到出口区域17。

分离元件14与主体10和盖12的至少一个相连。分离元件14可附接到主体10或盖12的表面。分离元件14可替代地与主体10或盖12中的一个形成一体，以当主体10和盖12装配时，分离元件14的一个或多个台阶式表面与主体10或盖12的形成台阶式通道边界的一个或多个表面相对。替代地，分离元件14可以是与盖12或主体10分离的部件。如果主体10、盖12和分离元件14为单独的部件，则这些部件优选地具有的尺寸和形状使得分离元件14在设备装配时通过挤压在盖12和主体10之间而保持就位。

设备中的流体压力（例如在第二通道52中）施加在由流体接触的所有表面上，并且这样的流体压力可引起可变形材料的弯曲或隆起。而且，施加到该设备的部件上以将该设备固定在其装配状态中的外部压力（例如将盖12推抵主体10的部分的一个或多个夹紧装置）也可引起形成该设备的一个或多个部件的柔性材料的弯曲或隆起。由于由分离元件14以及主体10和盖12中的至少一个限定的第二通道52为操作中由设备分离颗粒的主要机构，优选第二通道52的窄尺寸在第二台阶62的整个宽度上仔细地保持相对恒定。

举例来说，第二通道52具有由分离元件14的第二台阶62和由主体10和盖12中的一个或两个限定的边界。将主体10和盖12夹在一起可在形成第二通道52的边界的部件上施加外力，由此倾向于引起该部件弯曲，并且使第二通道52的窄尺寸变窄。这样的弯曲和变窄可通过在第二通道52的内腔中包括一个或多个支撑结构20减小或消除。支撑结构20可以是例如从分离元件14的限定第二通道52的边界的表面沿主体10或盖12的相对表面的方向延伸的杆状延伸部。替代地，具有矩形横截面的延伸部可远离限定第二通道52边界的主体10或盖12的表面沿分离元件14的相对表面的方向延伸，可形成支撑结构20。一个以上的支撑结构20可平行或串联布置，以形成一个或多个坚固的或节段式臂，并且这样的支撑结构可在所述空间中限定多个流动路径，所述多个流动路径在其端部的一个或两个处汇合。作为第三替代方案，支撑结构20可以是布置在第二通道52内腔中的分立部件，并且所述分立部件基本上或完全横跨分离元件14和主体10或12的相对表面之间的窄尺寸。支撑结构20在分离元件14的限定第二通道52的表面上的碰触、在主体10或盖12的限定第二通道52的表面上的碰触或同时在两个表面上都进行的碰触限制或抑制所述表面弯曲，将窄尺寸保持为基本上等于或大于支撑结构20的厚度的值（例如，用于防止盖12完全压抵第二台阶62的宽表面32并防止将第二通道52的窄尺寸减小到低于所需值）。

支撑结构20将所述设备的部件支撑在其适当结构中，提高设备的尺寸稳定性。通过提高尺寸稳定性，支撑结构20可增强设备在各种操作条件下（例如在变化夹紧力或变化流体压力的情况下）的操作性，并且延长设备的寿命。支撑结构20还可通过防止主体10或盖12变形和改变台阶式通道的第一和第二通道中的一个或多个的窄尺寸来提高设备的颗粒分离准确性。支撑结构20还可在第一和第二通道外部布置在空间11中，并且横跨所述空间的高度。这样的支撑结构20可保持空间11在第一和第二通道外部的开放性。在支撑结构20不与由支撑结构20碰触的表面形成一体的情况下，支撑结构20可不附接到该表面、粘附到该表面（例如使用介于该表面和支撑结构的一部分之间并且将该表面和支撑结构的一部分粘合的粘合剂）或与该表面熔合。

支撑结构20可将否则单一的流体流动路径在空间11中分为两个或多个流体流动路径（参见例如图2A中的支撑结构）。在图2中图示的实施例中，该设备包括平直盖12；主体10，其具有与盖12配合的平直表面，并且限定具有入口区域15和出口区域17的空间11；和分离元件14，其包括第一台阶61和第二台阶62，并且与四个支撑结构20形成一体。当分离元件14布置在空间11中在所述入口区域15和出口区域17之间时，支撑结构20的高度等于空间11的深度，以使支撑结构20的上表面基本上与主体10的平直表面共面（如图2B和2C中所示）。当盖12抵靠主体10的平直表面装配时，支撑结构20的顶部表面与盖12的限定空间22的表面接触，由此防止夹紧压力（施加到盖12以将其保持平齐抵靠主体10的平直表面）使盖12变形。由支撑结构20提供给盖12的支撑用于保持第二通道52的窄尺寸和第一通道51的窄尺寸，甚至在否则将使盖12向里朝向空间偏转的夹紧压力施加到盖12时也如此作用。如果盖12与一个或多个支撑结构20熔合或粘合，则图2中图示的设备还可抵抗第一通道51和第二通道52的窄尺寸的扩张，该窄尺寸的扩张可能产生于由该设备中的流体压力引起的盖12的向外（即远离空间11）弯曲。

对支撑结构20的形状、外形、尺寸和方向并无严格要求。支撑结构20可具有例如矩形、偏菱形、圆形、椭圆形或翼形横截面。除了形成引导流体流的壁（如图2中图示的支撑结构那样），支撑结构20可在流体流动路径中产生湍流，并且在紧接这样的支撑结构的下游的位置处引起颗粒的混合和或移动。举例来说，具有圆形横截面并且靠近第二通道52的前（即最上游）边缘设置的支撑结构可在第二通道52前边缘处引起湍流，推挤可能否则堵塞第二通道52的颗粒，由此增强通过第二通道52的流体流动。

分离元件14可限定除了本文讨论的台阶式通道之外的流体流动路径。这样的流体流动路径可例如在入口区域15和台阶式通道之间或在台阶式通道和出口区域17之间延伸。进一步举例来说，由分离元件14的第一台阶61限定的第一通道51可通过由分离元件限定的流体流动路径与由分离元件14的第二台阶62限定的第二通道52连接（即并非第一通道51直接与第二通道52连通）。

在一些应用中，重要的是，存在于入口区域15处的颗粒样品基本上同时进入多个台阶式通道的每一个。如果使用例如图2中图示的装置，则明显的是，通过入口端口16提供到入口区域15的颗粒在其到达最靠近入口端口16的台阶式通道（图2A中的中央通道）之后到达最外面的台阶式通道（图2A中最左侧和最右侧的通道）。参照图2中图示的装置，分离元件14可限定开始于入口端口16并且以多种路径延伸到各台阶式通道中的每一个的壁或通道，以使沿每一个流动路径的直线流动距离相等。因而，延伸在入口端口16和中央流动路径之间的流动路径将相对于延伸在入口端口16和最外部流动路径之间延伸的流动路径弯曲、倾斜或成蛇形。最终结果是，由于直线流动路径具有相等的长度，因此提供到流动路径中的每一个的入口端口端部的颗粒基本上同时到达流动路径的台阶式通道端部。

分离元件14包括至少两个台阶，所述两个台阶包括第一台阶61和第二台阶62，所述第一台阶61比所述第二台阶62更靠近（沿台阶式通道）入口区域15。悬浮在流体中的颗粒流经包括第一通道51和第二通道52的台阶式通道，所述第二通道52的窄尺寸比所述第一通道51的小。流体中的大部分或全部颗粒能够流入第一通道51中，但是仅颗粒中的一些能够流经第二通道52。最终结果是，流体中的一些颗粒可流经整个台阶式通道，而其它颗粒保留在所述设备中，例如在第一通道51内。因而实现颗粒的分离。

分离元件14的台阶可具有多种形状中的任何形状。在一个实施例中（例如在图1中图示的设备中），第一台阶61和第二台阶62具有传统的“楼梯”台阶结构，即以直角相交的两个平面表面。即，第一台阶61的过渡面41和第一台阶61的宽表面31以直角相交，第二台阶62的过渡面42也和第二台阶62的宽表面32以直角相交。替代地，台阶的过渡面和宽表面能以在90和180度之间的角度相交，例如，如图3中所示。台阶的过渡面和宽表面也能以在0和90度之间的角度相交，形成突出部。

形成突出部的台阶和具有以接近90度的角相交的面的台阶可在台阶的面相交处的边缘附近引起湍流。这样的湍流可驱逐否则可能堵塞台阶的宽表面和主体10或盖12的相对面之间的通道的颗粒，并且该湍流可由此抑制通道的堵塞，增强流经该装置的流体流动（并且减小流体压降），这是有利的效果。而且，当台阶形成突出部，并且台阶高度足够大以至于否则可能堵塞通道的颗粒可停留在由突出部形成的凹部中时，这样的台阶也可降低通道的堵塞，并且提高设备的性能。在样品中相对大的不期望颗粒的大约尺寸可预期的情况下，可将设计用于捕获或排除这样的颗粒的一个或多个台阶结合到该装置中，从而以不会显著抑制流经台阶式通道的流体流的位置和数量捕获该不期望的颗粒。

具有以在90度和180度之间的角度相交的过渡面和宽表面的台阶可阻塞具有多种粒度的颗粒（即具有介于由台阶的宽表面限定的通道窄尺寸和台阶上游空间的窄尺寸之间的粒度的那些颗粒）通过。通过在台阶的过渡面上不同位置处抑制具有略微不同粒度的颗粒通过，具有以在90度和180度之间的角度相交的过渡面和宽表面的台阶可比具有以90度或更小的角度相交的过渡面和宽表面的台阶更大程度地防止由台阶的宽表面限定的通道堵塞。

通过增大台阶的宽度也可降低或避免由于颗粒堵塞由台阶的宽表面限定的通道而引起的对流体流经台阶的堵塞。由于每一个颗粒阻塞流体流仅因为颗粒遮挡了通流面积，因此较宽的台阶需要由更大数量的阻塞颗粒来堵塞。台阶的宽度可以一种或两种方式增大。第一，台阶的宽度可通过简单地增大台阶的线性宽度（如图4中所示）来增大。第二，台阶的宽度可通过减小台阶的线性度（即平直度）来增大台阶的宽表面和过渡面相交处的边缘的长度来增大。

例如，在具有矩形横截面的流体通道中，直接横跨（即与侧面成直角）通道延伸的台阶具有一最上游边缘，该最上游边缘具有仅等于通道宽度的边缘长度。如果台阶的形状为半圆形，其中半圆形的弧延伸成使得半圆形的中心位于半圆形的最上游边缘的下游，因此台阶的边缘长度等于半圆形的长度，半圆形的长度为数字pi（π）乘以通道宽度并且除以2（即大约1.57×通道的宽度）。类似地，具有形状类似圆形或椭圆形弧、类似人字（即类似字母V）、类似之字、类似蛇形线或类似不规则线的边缘的台阶具有的边缘长度将都大于垂直横跨具有矩形横截面的流体通道延伸的台阶的边缘长度。具有这样形状的边缘的台阶可用于本文所述的设备中。

除了第二台阶62限定第二通道52的边界，第二通道52如本文所述用于分离颗粒以外，对于第一台阶61和第二台阶62的尺寸并无严格要求。由于该原因，第二台阶62和由分离元件14的第二台阶62和主体10或盖12的一个或多个相对表面限定的相应的第二通道52的尺寸应仔细选择。关于选择这些尺寸的标准包括要通过其穿过第二通道52的能力来进行分离的颗粒的尺寸。

例如，如果要将相对大的细胞从混合粒度的细胞群体分离，则第二通道52的窄尺寸应选择成使相对大的细胞基本上不能进入第二通道52，并且使群体中的其它细胞能够进入并且穿过第二通道52。在该情况下，第二台阶62的形状和宽度应根据期望存在于样品中的相对大细胞的数量来选择，以降低、延迟或避免第二通道52可能被该相对大细胞堵塞。

类似地，如果要将具有有限流动性（即相对不可变形的颗粒）的颗粒与具有较大流动性（即相对可变形的颗粒）的类似粒度的颗粒分离，则第二通道52的窄尺寸应选择成与两种类型的颗粒粒度紧密匹配，这应理解为，虽然这两种类型的颗粒都能够进入第二通道52，但是相对可变形的颗粒将一般来说能够以比具有有限流动性的颗粒更少的时间穿过第二通道52。在该实例中，包括多个第二通道52可能是有利的，所述第二通道52每一个具有足够容纳期望数量的颗粒而不明显堵塞的宽度和形状。在该实例中，有利的是，每一个第二通道52具有相对短的长度，以最小化由于相对可变形颗粒引起的堵塞，相对可变形颗粒比具有有限流动性的颗粒以更少的时间穿过第二通道52。

第一台阶61和第二台阶62中的每一个的宽度（即如本文限定的并且图4中所示的）可考虑期望使用该设备进行处理的样品，根据颗粒在台阶上的期望堆积进行选择。根据第二通道52的窄尺寸，可估算不能进入第二通道52的颗粒的比例和数量。将该信息与不能进入第二通道52的颗粒平均粒度结合可得出可能被不能进入第二通道52中的颗粒堵塞的总台阶长度的估计值，并且该估计值可用于选择适当的台阶宽度。每一个台阶的宽度优选选择成防止经过该台阶的流动的完全阻塞。台阶（和相应的由台阶限定的通道）的宽度可选择成显著（例如10倍、1000倍或100000倍）大于通道的窄尺寸。例如，对于胚胎样细胞从母血中的分离，认为台阶宽度约为相应通道的窄尺寸的至少1000（一千）倍，并且优选为10000（一万）倍是符合需要的。相对宽的台阶允许颗粒在通道中堆积，同时限制通道的堵塞。

在一些情况下，期望将第一通道51的窄尺寸选择成使不能进入第二通道52的颗粒形成不超过一个颗粒厚（即沿第一通道51的窄尺寸方向）的层。第一台阶61的宽度和长度可选择成容纳期望数量的这样的细胞。

对分离元件14的第一和第二台阶的长度（即如本文限定并且图4中所示的）通常并不严格要求，因为是第一和第二通道（其分别由第一和第二台阶限定边界）的窄尺寸提供本文所述的设备的分离功能。在期望在台阶上堆积或观察颗粒的情况下，台阶的长度可选择成在台阶上容纳期望或估计数量和粒度的颗粒。在设备的分离能力取决于不同类型的颗粒可穿过第一通道51和第二通道52中的一个或两个所采用的相对速率差的情况下，台阶的长度可能影响所获得的分离程度，较长的台阶提高受不同穿过速率影响的分离能力。台阶长度可通过增加单个台阶的长度、通过增加所选长度的台阶的数量（每一个台阶限定具有相同窄尺寸的通道）或通过这些方式的组合来增大。

在一些实施例中，平面台阶区域可基本上平行于盖的一部分、主体的一部分或与两者都平行，并且应具有等于其限定边界的通道窄尺寸（沿容积流体流方向）的倍数（例如2、4、10或1000）的长度。平面区域的宽度（沿垂直于容积流体流方向）应等于由其限定边界的通道的（例如10、1000或10000）窄尺寸的倍数。在本文所述的装置实施例的一些实例中，对于三个单独的测试盒的设计中的每一个，平面区域的宽度比（沿垂直于容积流体流的流动方向）的范围为从在最开放端处的1318到最窄（出口）端处的805；在最开放端处的659到最窄（出口）端处的967；在最开放端处的537到最窄（出口）端处的725范围内。从测试盒的入口侧到出口侧，基片（chip）的每一个上的梯度将台阶宽度对高度的比增大66.7。该宽度对高度比将根据期望在测试盒内捕获的颗粒量与期望通过测试盒的颗粒量的比例而改变。如本文实例4中所述，由本文所述类型的装置捕获的胚胎细胞对（白血球细胞+红血球细胞）的比率可能非常高，并且适当选择台阶高度和长度可容许母血样中所有有核血细胞以大于99.99%的通过率通过。

虽然本文已经参照第一台阶61和第二台阶62描述了所述设备，但是该设备中可包括另外的台阶（例如三个、四个、十个或一百个台阶），每一个台阶限定一个具有窄尺寸特征的台阶式通道内的通道。

该设备可包括单个分离元件14或多个分离元件14。举例来说，该设备可包括限定第一台阶61的第一分离元件和限定第二台阶62的第二分离元件。如果与主体10形成一体，则第一和第二分离元件14可布置在主体10上不同位置处，只要两个分离元件14都在空间11中，介于空间11的入口区域15和出口区域17之间，并且在相同的台阶式通道中限定台阶。替代地，限定第一台阶61的分离元件可与主体10形成一体（或附接到主体10），限定第二台阶62的第二分离元件可与盖12形成一体（或附接到盖12），只要两个分离元件都在空间11中，介于空间11的入口区域15和出口区域17之间，并且在相同的台阶式通道中限定台阶。类似地，只要满足相同的条件，两个分离元件可以是分立的件。

分离元件14可由单个材料件构造（并且可与主体10和盖12中的一个形成一体）或其可由多个材料件构造。举例来说，类似于图1中图示的设备的分离元件14可由两个矩形杆状（实心形式，具有三对平行表面，每一对关于其它两对成直角取向）材料形成，一个杆放置于空间11中的主体10的平直部分顶部，并且形成第一台阶61，第二个杆放置于第一杆顶上，并且形成第二台阶62。

通道几何形状

每一个台阶的几何形状应选择成使至少一些颗粒能够通过由该台阶限定的通道，并且至少一些其它颗粒不能通过由该台阶限定的通道。刚性颗粒通过通道的能力取决于颗粒的特征尺寸。刚性颗粒不能通过高度小于颗粒短尺寸的通道。刚性颗粒基本上不会被抑制通过高度大于颗粒的长尺寸的通道。刚性颗粒可通过高度大于其短尺寸但是小于其长尺寸的通道，但是该通道至少在一定程度上抑制颗粒通过。

类似于刚性颗粒的该能力，可变形颗粒（例如生物学细胞、气泡或谷粒）穿过通道的能力可取决于其特征尺寸。另外，可变形颗粒可穿过窄尺寸小于颗粒短尺寸的通道，只要颗粒可变形“挤”过通道。该能力取决于颗粒的刚度、通道的尺寸和施加到颗粒的流体压力。在这些量不可知或不可预知的情况下，可收集经验数据来确定或估计这样的颗粒穿过给定尺寸通道的能力，并且这样的经验数据可用于选择用于本文所述设备的第一和第二通道的适当的尺寸。

在本发明的几个部分中，举例参照了具有矩形横截面（这样的横截面沿垂直于容积流体流的方向截取）的流体通道。本文所述设备的流体通道不限于这样的矩形通道。流体通道的壁可相互垂直，并且垂直于主体10、盖12和分离元件14中的一个或多个。壁也可具有其它布置形式。在一个实施例中，流体通道是圆形的，例如通过由具有圆形端头的旋转钻头去除材料形成的通道。类似地，流体通道可以在一侧是圆形的（例如形成在主体10中的部分），并且在另一侧是平直的（例如由平直盖12限定边界的部分）。

剪应力的降低

流体剪应力可损害可变形或易破碎的颗粒，例如生物细胞。因此期望在设备用于处理这样的颗粒时减小设备中的流体剪应力。在流体通道中线性流速快速改变的位置处，例如在流体通道的几何形状改变的位置处，可出现显著的流体剪应力。流体通道的几何形状可选择成使设备中的线性流速增大、减小或保持恒定。增大或减小线性流速产生流体剪应力。流体剪应力的水平可选择成使一些种类的颗粒破裂、变形或损坏，而另一些种类的颗粒没有。例如，可通过产生使易碎颗粒破裂的流体剪应力，将坚固的颗粒与具有相同粒度的易碎颗粒分离。坚固颗粒保留在通道中，而易碎颗粒碎屑通过第二台阶62流入出口区域17中。类似地，通过选择适当的流体通道尺寸，可在整个设备上（或至少其整个台阶式通道上）保持基本恒定的线性流速。

主体10、盖12和分离元件14可成形为使台阶式通道的相对于流体流动方向的横截面积增加、减小或保持恒定。台阶式通道的横截面积影响设备中流体的压力和流速。如果分离元件具有恒定宽度，则由第一通道51的高度和宽度限定的横截面积将小于入口区域15的横截面积。第二通道52的横截面积（例如如果第二通道在横截面上为矩形，则由第二通道的高度和宽度限定）小于第一通道51的横截面积。当通道的横截面积减小时，流经该横截面积的流体压力和流体的流速增大。流体通道的几何形状可选择用于抵消流体压力和流速中的这些变化。例如，具有矩形横截面的通道的宽度可在通道高度减小时成比例增大，以使通道的横截面积保持恒定。对于分离元件14，在每一个台阶由倾斜过渡面分隔的情况下，由过渡面限定的通道宽度可以恒定速率增大，所述恒定速率等于通道的高度减小的速率。通过由这样的分离元件限定的通道的流体压力和流速保持恒定。这样的通道的实例显示在图3中。

换句话说，主体10、盖12和分离元件14可成形为使整个设备的窄通道在所有位置处的流体流量相等。例如，在图3中所示的设备中，整个入口区域15、由表面41、31、42和32限定的通道和出口区域17的流体流量可恒定。或者，主体10、盖12和分离元件14可成形为使流体流量沿容积流体流的方向增大或减小。例如，主体10或盖12的限定空间11的宽度的表面可沿入口区域15或出口区域17的方向逐渐减小。

当设备在台阶式通道中无流体的情况下操作时，当然不用关注流体剪应力。由于气态流体的粘度大大低于液态流体的粘度，因此当颗粒悬浮在气态流体（例如空气）中时，比在液态流体中更不用关注流体剪应力。类似地，由于流体剪应力以已知方式随流体粘度改变，因此本文所述设备的适于适应不同粘度流体的改型对于本领域普通设计人员是显而易见的。

主体、盖或两者都可具有与分离元件的台阶表面流体连接的一个或多个流体通道，以从所述台阶（包括悬浮在该台阶上的流体中的任何细胞）去除流体。而且，当台阶在该台阶中具有区域或分立的凹槽时，盖或主体可机加工成使流体通道最接近地与台阶上的分立凹槽或区域流体连通，以去除台阶的凹槽或区域附近的流体。这样的局部通道可在颗粒由该通道捕获时通过仅捕获紧邻通道的相对少量的流体来提高纯度。同样，主体、盖、分离元件或这些中的一些组合可在对应于所选台阶或台阶的所选凹槽或区域的位置处具有构造于其中或其上（例如通过蚀刻、薄膜沉积或其它已知技术）的光学、电子或光电装置。这样的装置可用于检测细胞（例如使用检测器来检测透过在台阶表面和盖或主体之间的流体的光或其它射线的减少）或操纵细胞（例如，使用可激活的加热元件来消融经过或停留在加热元件附近的细胞）。构造在盖、主体或台阶上的装置可制成可通过给所述装置分配电子地址单独激活。以该方式，可在装置的分立区域处检测细胞，并且可操纵在所选区域处的细胞而不操纵其它位置处的细胞。

细胞从所选台阶（或多个所选台阶）的收集可通过简单地从该台阶或台阶的一部分收回流体来进行。在一些情况下，例如当细胞和其停留其上的台阶之间出现粘连时，有利的是向该设备施加能量来将细胞移走或使用其它方式促进其去除。该能量可以多种形式施加，优选形式通常取决于细胞或待移动对象的类型和抑制细胞或对象从台阶去除的力或现象的特性。例如，从台阶的一部分收回流体可同时与在相同台阶的另一部分增加流体进行。可施加到设备来收集细胞的能量采用的其它形式的实例包括摇动、敲击或振动设备或以超声、热、红外或其它射线、气泡、压缩空气等形式施加能量。

代替回收保留在分离元件的一个或多个台阶上的细胞，相反，可对细胞进行检测或操纵。在一个实施例中，一个或多个细胞通过向细胞施加电、机械或热能来溶解，由此释放细胞在该设备的空间中的含量。可在该设备中分析或操纵细胞含量，或其可从该设备回收，并且在设备外部进行分析或操纵。例如，保留在台阶上特定位置处的细胞可使用设置在或聚焦在该特定位置处的装置溶解，由此将细胞的DNA释放到空间中。通过向该空间提供PCR化学试剂，可在空间中放大DNA，或可收集DNA（例如在收集从空间所选部分获得的流体的容器中，或者，替代地，通过使流体经过该空间并且收集出口流体中的DNA）并且在该设备外部放大DNA。该设备可因而用于分析各个细胞或细胞群体的含量。

使用本文所述的设备可应用多种用于在装置中收集或操纵细胞的方法中的任意一种。例如，可使用应用已知的“光镊”装置、激光显微解剖装置和颗粒粘合薄膜和膜的方法。在采用膜或薄膜的实施例中，膜或薄膜可覆盖在孔或流体通道上，将孔或流体通道与空间的剩余部分密封。当观察到感兴趣的颗粒附着到或停留在膜或薄膜上时，可分离或刺穿膜或薄膜的接触颗粒的部分（或围绕颗粒的区域），将颗粒设置成与之前由膜或薄膜分离的孔或流体通道流体连通。如果膜或薄膜具有使其可识别的光学、磁性能，则膜或薄膜的分离部分（例如具有附着到其的感兴趣的颗粒）可通过甄别颗粒特性或膜或薄膜的特性（例如光谱光度测量性能或磁性能）而隔离。而且，如果膜或薄膜具有使得可沿所选方向推动膜移动的性能（例如磁性能），则膜可用于机械地操纵附着到其的颗粒。例如，通过向薄膜悬浮于其中的流体施加具有一定方向的磁场，或通过移动磁探针来将具有附着到其的细胞的磁性膜或薄膜的分离部分朝向例如通道、腔室或容器等期望位置引导，细胞附着到其的磁性膜或薄膜的分离部分可用作输送该细胞的载体。

膜或其他屏障

设备可包括膜或其他屏障81，膜或其他屏障81与空间11的一部分处于流体连通。膜或其他屏障81选择成使得其优先地将在空间中接触它的期望颗粒与不期望颗粒分离。在一个实施例中，膜或其他屏障81为具有限定尺寸的孔的膜，以使得小于所述孔的颗粒能够穿过膜（例如，当跨过膜存在压差或者流体流动时），而阻止大于孔的颗粒穿过膜。替代地，膜或其他屏障81可为由疏水性材料制成的带孔膜，以使得比较亲水性的颗粒将倾向于被从膜表面排斥（并且不穿过其孔），而比较疏水性的颗粒可穿过膜的孔。在另一种替代方案中，膜或其他屏障81为屏障（带孔的，或者优选无孔的），该屏障由期望颗粒能够穿过但不期望颗粒不能穿过的材料制成。

举例来说，胚胎滋养细胞能够穿过母亲的子宫组织，包括子宫的细胞外基质。这些细胞包含在本文中所公开的设备的空间11中并且与由子宫膜或类似材料（例如基膜提取物，如可以从加利福尼亚圣胡塞的BD Biosciences（BD Biosciences，San Jose，California）公司获得的基膜基质产品的Matrigel系列（Matrigel line））制成的屏障形成接触，这些细胞能够钻入并穿过这些材料构成的较薄屏障。已知少数其它细胞类型（如果有的话）能够穿透这种基质。

例如，可利用胚胎滋养细胞不能穿过本文中所述的设备的空间11的区域这一情况，来如本文中其它地方所述的那样分离母血中的胚胎滋养细胞。存在于母血中的其它细胞也可不能穿过空间11的相同区域，并且可与设备内的胚胎滋养细胞保留在一起。如果该细胞群体与由Matrigel^TM类型材料制成的薄固屏障接触，则胚胎滋养细胞将能粘附至屏障、进入屏障并穿透屏障，并且可与不能粘附至屏障、进入屏障并穿透屏障的其它细胞群体分离。按这种方式，基于细胞和材料的两种性能（即，穿过本文中所述设备的能力和与基膜类基质屏障的屏障的相互作用），可实现胚胎滋养细胞与存在于母血中的其它细胞和材料分离。同样地，这种设备可用于将能够与这种屏障相互作用或穿过这种屏障的胚胎滋养细胞与已失去（或从未具有）这种能力的胚胎滋养细胞分离。

膜或其它屏障81可为本文中所述设备的一部分，在使用所述设备进行颗粒分离之后与所述设备结合，或在使用所述设备进行颗粒分离之前或之后与所述设备分开地使用。在一个优选实施例中，膜或其它屏障81位于邻接空间11的一部分的位置，在使用所述设备进行颗粒分离之后，期望颗粒预期保留于所述空间11的一部分中。在该实施例中，第一颗粒群体可如在此所述被分离，产生包括期望颗粒的第二颗粒群体（例如能够穿过第一通道51但是不能进入第二通道52的颗粒）。如果膜或其它屏障81位于邻接包含第二颗粒群体的空间11的一部分的位置，则这些颗粒可利用它们与膜或其它屏障81相互作用的能力差别而被分离。举例来说，如果膜或其它屏障81包括特别地与第二群体中的颗粒的子集结合的材料（例如单克隆抗体），则该子集可与群体中的其它颗粒分离。类似地，举例来说，如果第二群体中的颗粒的子集能够穿过膜或其它屏障81，则该子集可与第二群体中的不能穿过膜或其它屏障81的其它颗粒分离。

当膜或其它屏障81的一个面邻接空间11的一部分时，膜或其它屏障81的另一相反面可邻接第二空间或第二材料。第二空间或第二材料可任选地包括与穿过膜或其它屏障81的颗粒相互作用（例如结合至颗粒或被颗粒消耗）的一种或多种成份。举例来说，在用于分离细胞群体的一种设备中，该设备可包括选择性地允许细胞子集穿过其的半透膜，其中膜的一面邻接在所述子集的细胞预期出现位置的设备的空间11而膜的另一面邻接第二空间，该第二空间包含用于支持细胞的新陈代谢和/或繁殖的生长培养基。替代地，或另外地，第二空间可包含第二材料，该第二材料特别地与选定类型的细胞结合，以便使得当选定类型的细胞穿过膜时，它们与第二材料结合并且趋向于不重新穿过膜。细胞或其它颗粒经过膜或其它屏障81可通过穿过膜或其它屏障81的流体流动、通过细胞或颗粒的运动能力、通过重力、通过扩散或者别的方式实现。

构成材料和方法

用于构造主体10和盖12的一种或多种材料除了应足够硬，以至于部件在本文所述设备的操作过程中可保持其形状，并且基本上不变形或破碎之外，对用于构造主体10和盖12的一种或多种材料的特性并无严格要求。在使用可变形材料的情况下，在设计部件的尺寸和形状时应考虑在操作条件下预期的变形。合适的材料的实例包括玻璃、例如聚四氟乙烯和环氧树脂等固体聚合物和例如硅等结晶矿物质。如果需要，主体10、盖12、分离元件和本文描述的其它部件可每一个由不同的材料形成。优选地，所有部件由相同的材料形成，以使得例如温度对部件膨胀或收缩的影响对于所有部件来说都相同。

观察设备中颗粒的运动、状态或行为可能是有利的。在这样的情况下，主体10和盖12的至少一个应由便于观察装配的设备中的颗粒的材料构成。例如，多种玻璃对于人类肉眼可见的光谱区域内的光的波长是透明的。该设备的一个或多个构件由这样的玻璃构造，允许操作者在设备操作中通过视觉检测空间中的颗粒（例如第一通道51中颗粒的堆积）。

用于构造分离元件14的材料除了应足够硬，以至于分离元件14将在本文所述的设备操作过程中保持其形状，并且基本上不变形或破碎之外，对其特性也无严格要求。

用于构造该设备及其部件的材料的选择可能受其中待分离的颗粒的本性影响。颗粒的本性还可能影响关于哪种表面处理（如果有的话）可适于控制颗粒与颗粒在该装置中可能遇到的表面的相互作用的决定。例如，如果颗粒要在没有基本上粘着或附着到该装置的情况下在该装置中分离，则材料和/或表面处理应选择用于降低或消除颗粒粘着到该表面的可能性。替代地，该装置的一个或多个表面（例如第一台阶61的宽表面31）可以处理成使得颗粒（或混合颗粒群体中的特定类型的颗粒）粘着到一个或多个表面或与一个或多个表面粘合。例如，生物细胞已知在其表面上表达多种蛋白质，并且可通过已知方法产生特异性结合到所选类型蛋白质的抗体。如果特异性结合到在特定类型的细胞表面上表达的蛋白质的抗体被固定到台阶式通道中的表面，则可预期特定类型的细胞与抗体的结合来抑制或终止细胞通过设备中的表面，提高那些细胞从在表面（不能结合抗体的表面）上没有表达蛋白质的细胞的分离。

流体转移装置

用于构造所述设备的方法的选择可能受其中待分离的颗粒粒度的影响。对于用于构造所述设备及其部件的具体方法并无严格要求。已知多种用于成形具有准确到微米和纳米尺度的形状和构造的部件的方法。例如，可使用多种已知显微机械加工方法中的任何方法。这样的显微机械加工方法的实例包括例如旋转涂布和化学气相沉积等薄膜沉积法、激光制造和例如UV或X-射线法等光刻法、精密加工法或通过湿化学法或等离子法进行的蚀刻法。（参见例如Manz等人，1991年，Trends in Analytical Chemistry，10：144-149）。替代地，部件可使用多种已知的成形方法中的任何方法模铸制成，而不是机加工。已知多种用于宏观尺度的成形和机加工部件的方法，例如切割、雕刻、成形、雕版、焊接和铸造。

主体10、盖12和分离元件14可单独构造并且装配来形成该设备，并且这样的装配可由设备的制造商或使用者进行。替代地，分离元件14可构造成盖12或主体10之一的一体部件。在一个实施例中，单个盖12制成能够密封利用多个主体10（例如，每一个在主体10的空间中具有分离元件14，多个分离元件14具有不同的性能，例如具有不同的台阶高度）中的任意多个形成的空间11。

可分离的颗粒

设备根据各种颗粒穿过本文所述设备的第一和第二通道的能力来分离颗粒。可使用该设备分离的颗粒包括活颗粒，例如动物或植物细胞、细菌或原生动物，或无生命颗粒。本文所述的设备可用于分离较大的颗粒（例如谷粒、啮齿动物排泄物、气泡和保龄球）和较小的颗粒（例如亚细胞器、病毒和沉淀矿物质颗粒）。

颗粒的影响其穿过本文所述设备的第一和第二通道的能力的属性包括颗粒的粒度、形状、表面性能和变形性。

随机在流体中翻滚的颗粒将扫出等于直径为颗粒最长尺寸的球的体积的排外体积。因而，直径为1微米的刚性球、直径为1微米并且厚度为0.2微米的随机翻滚的盘状刚性颗粒和长度为1微米并且直径为0.1微米的随机翻滚的棒状刚性颗粒将各扫出相等的排外体积。忽略表面性能的影响，这些颗粒中的每一种将能够穿过窄直径大于1微米的通道。盘状和棒状颗粒将能够穿过窄直径小于1微米并且大于0.2微米的通道。棒状颗粒将能够穿过窄直径小于0.2微米并且大于0.1微米的通道。这些颗粒的非刚性（即可变形）类似物穿过这些通道中的一个的能力（和这样的穿过可发生的速率）取决于颗粒变形程度和范围，以及颗粒在通道内适配所需要变形的程度。而且，颗粒的表面性能和限定通道的表面可影响颗粒穿过通道的速率，并且可防止发生这样的穿过（例如，如果颗粒与通道表面热切地结合或如果通道表面和颗粒相互排斥）。

在重要的实施例中，可分离的颗粒为存在于混合细胞群体（即包含多种类型的细胞的细胞悬浮液）中的生物细胞。本文所述设备的第一和第二通道的适当窄尺寸的选择允许根据生物细胞粒度、形状、表面性能、变形性或这些性能的一些组合分离生物细胞。可使用本文所述的设备分离的生物细胞的实例包括在母血中循环的胚胎细胞、胚胎干细胞（在母血中或个体自身的胚胎干细胞）、成体干细胞、肿瘤细胞、细菌和其它病原体以及免疫系统细胞（例如，各种白细胞，如T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞）。该方法可用于分离这些类型的细胞混合物。本文所述的方法也可用于分离亚细胞器（例如细胞核、叶绿体和线粒体）。

在另一个重要实施例中，该设备用于将传染病因子（例如细菌或病毒）或其它病原体（例如原生动物或寄生虫）从样品隔离。在这些实施例中，该设备可用于诊断目的，例如分离从对象获得的生物样品来确定对象是否感染有传染因子。在这些实施例的另一个实例中，例如水样品或食品或配料等样品可通过使用本文所述的设备直接对样品或与样品接触的流体进行病原体存在的评估来评估，所述病原体如果被对象摄取，则将提供对象生病或得其它病症的可能性。

例如，干细胞可与存在于母血中或胎盘血液中的其它细胞分离。这样的血液包含多种细胞，包括干细胞、红血球细胞和血小板。如实例5中在此所述，当所寻求的细胞具有超过毛细血管标称直径的尺寸（即，直径>8-10微米）时，优选地在毛细血管床上游收集血液。因此，动脉血（例如取自肝总动脉的血）或者得自此类前毛细血管血的流体（例如肺和支气管流出物和分泌物，或者包含它们的流体，例如支气管灌洗流体）为大的细胞例如胚胎滋养细胞和干细胞的一个优选来源。人类干细胞倾向于显示出等于直径为约12微米的球的排外体积。人类红血球细胞倾向于显示出等于直径为约5.5微米的球的排外体积。人类血小板倾向于显示出等于直径为约1微米的球的排外体积。忽略变形性和表面性能的影响，干细胞，而不是红血球细胞或血小板，将被窄尺寸在4到8微米数量级的通道排除在外。提供到本文所述的带有具有4到8微米窄尺寸的第二通道52的设备的入口区域15的干细胞基本上不会被送到该设备的出口区域17，但是红血球细胞和血小板将被送到。如果第一通道51的窄尺寸大于约12微米（例如，如果第一通道51的窄尺寸为18微米），则干细胞、红血球细胞和血小板将全部穿过第一通道51。如果母血或胎盘血液被提供到本文所述的带有具有18微米窄尺寸的第一通道51和具有小于8微米窄尺寸的第二通道52的设备的入口区域15，并且血液通过该设备的台阶式通道，则红血球细胞和血小板将通过（即通过第一和第二通道到所述设备的出口区域17）所述设备，而干细胞将保留在所述第二通道52的上游。如果使用构造成如图1中所示的设备（即其中第一和第二通道之间没有介于中间的通道或腔室），则干细胞将堆积在第一通道51中。在血液通过之后，其它无细胞流体通过该设备倾向于增加与干细胞分离的红血球细胞和血小板的比例。反流冲洗所述设备（即使用沿从出口区域17经过台阶式通道朝向入口区域15流出的流体流）可将干细胞从所述设备冲洗到入口区域15中，在那里可回收所述干细胞。

台阶式通道中的颗粒受到由流经通道的任何流体作用于其上的剪切力、挤压力和其它力。如果存在表现出不同抗变形、挤压、破裂、溶解或破损（即改变颗粒穿过第一和第二通道中的一个或两个的速率和能力的任何特性）能力的颗粒（例如生物细胞），则可利用颗粒对流体流的响应的差异来不同地影响颗粒通过（或不能通过）台阶式通道的情况。例如，在包括在流体剪应力下易于溶解的细胞和流体剪应力下基本上不溶解的基本上相同粒度的细胞的细胞类型混合物中，这两种类型的细胞可在相对低流体流速的条件下（即流速足够低以至于几乎没有或没有细胞溶解）与其它颗粒分离。在这样的分离之后，流体流速可增大，以在台阶式通道的至少一部分内产生足够的流体剪应力，以至于第一类型的细胞，而不是第二类型的细胞将溶解，在从出口区域流出的流出物中产生第一细胞类型溶解产品，并且第二类型细胞保留在该设备中。

流体转移装置

本文所描述的设备可通过将颗粒提供到设备的空间11的入口区域15，并且允许颗粒通过存在于入口区域15、台阶式通道和出口区域17中的流体移动进行操作，这样的移动可归因于细胞本身的运动性或非运动颗粒在重力影响下被动下沉。在后面的情况下，该设备将需要定向成使重力倾向于引起比流体更重的颗粒从入口区域15经过台阶式通道朝向出口区域17“下落”，对于比流体轻的颗粒，引起该颗粒从入口区域15经过台阶式通道朝向出口区域17“上升”。

更一般地，本文所述的设备通过将容纳流体（例如包含颗粒的悬浮液或无颗粒流体）的储存器或另一种流体转移装置，例如泵流体连接到入口区域15来操作。通过在该设备的入口区域15处引入流体、通过连续从该设备的出口区域收回流体或这两种方式都采用，来实现流体流经该设备。在入口区域15处引入的流体将空间11中已经存在的流体移出，并且引起流体从空间11内排出到出口区域17或通过与出口区域17流体连通的出口端18排出。当颗粒穿过该设备的台阶式通道时，其将从其进入出口区域17中。这样的颗粒可从积聚在出口区域17或与其流体连通的储存器的流体或从由与出口区域17流体连通的出口端口18收回的流体回收。在流体流经该设备过程中不能穿过第一通道51或第二通道52的颗粒将保留在该设备中，并且可从其回收。

对用于向入口区域15提供流体流的流体转移装置的特性并无严格要求。流体转移装置可以仅仅是容纳流体的储存器，在重力作用下，其允许流体排出，借助于在储存器和与入口区域流体连通的入口端口16之间的流体连接而通过所述设备。机械泵可通过泵出口和入口端口16之间的密封流体连接而将流体传送到入口端口16。由泵传送的流体将存在于该设备的入口区域15中的流体转移到台阶式通道中，并且因此排向出口区域17，排出的流体可从出口区域17收回、收集或排出。替代地，机械泵可通过密封流体连接而从与该设备的出口区域17流体连通的出口端口18回收流体。流体从出口区域17的收回降低了出口区域17处的流体压力，引起流体从与该设备毗邻的台阶式通道转移到出口区域17中，并且从入口区域15转移到台阶式通道中。

设备空间11中的流体的主动排出（例如通过将流体泵送到入口区域15引起）增大空间中流体的压力。增大的流体压力可改变该设备的尺寸（例如通过引起该设备的部件的弯曲或移动）、该设备中颗粒的尺寸（例如可变形的填充气体的颗粒倾向于在周围流体压力增大时粒度减小）或两者都改变。而且，流体压力的脉动或以其它方式改变可引起设备中局部流体流的瞬时变化。

瞬时局部的流动变化可能是有利的。例如，不能进入台阶式通道的第一或第二通道的颗粒可能被推抵通道的上游延伸部，阻挡流体流通过通道的被颗粒阻塞的部分。流体流中在通道被颗粒阻塞的点处的瞬时变化可能交替将颗粒推抵开放的通道和从开放的通道推离，由此暂时缓解阻塞，并且允许流体流经通道的之前阻塞的部分。

流体脉动或其它快速流动变化在流体中和悬浮在流体中的颗粒上产生剪应力，颗粒可能被这样的剪应力损坏。颗粒损坏（例如生物细胞溶解）可通过减小流体中的剪应力和其起因而减小。除了本发明中在别处讨论的设备流体通道几何形状的修改之外，与该设备连接的流体转移装置的类型和特性的改变可增大或减小流体中的剪应力。例如，以相对恒定的体积速率（即不是如很多蠕动泵那样的较大脉动的体积速率）输送流体的泵可减小由于设备中流体压力的潮涌振荡引起的流体剪切应力。进一步举例来说，以相对恒定的压力输送流体的泵（即监控泵输出流中的流体压力并且相应调节体积流速来保持恒定压力的泵）可减小流体剪切应力，否则如果体积流速没有相应进行调整，则流体剪切应力将随着台阶式通道的第一和/或第二通道的部分被颗粒或碎屑阻塞而增大。适用于将流体移动通过设备的泵的实例为低脉动注射泵。这样的泵可包括搅拌机构，其可用于防止颗粒在设备操作过程中沉淀。

流体从空间11内的负排量（例如由于流体从出口区域17收回引起的）减小空间11中的流体压力，并且可导致类似的问题，包括该设备的部件的变形和移位以及瞬间流体变化。流体从空间11的负排出量还可引起设备中流体内形成气泡，并且气泡可能中断设备的运转（例如由于阻塞流体流经通道的一部分或由于对设备中的颗粒产生表面张力相关的作用）。因此，应避免气泡形成。由于该原因，优选设备中空间11内流体的正流体排量。

在一种变型中，通过将离心“力”施加到与设备的入口区域15流体连通的容纳流体的储存器而通过该设备排出流体。离心“力”通过围绕轴线旋转储存器产生，并且流体角动量守恒推动流体远离所述旋转轴。该“力”可用于通过将储存器出口与设备的入口区域15流体连接而从设备的空间11排出流体。例如，在从靠近旋转轴的位置朝向远离旋转轴的位置的线性布置中，可离心操作的设备可包括流体储存器、空间11的入口区域15、台阶式通道和空间11的出口区域17。来自储存器的流体被离心“力”推入入口区域15中，因此穿过台阶式通道（第一通道51相对于第二通道52靠近旋转轴设置），并且因此到达出口区域17，出口区域17可包括用于收集已经通过设备的流体的第二储存器。不能穿过第二通道52的颗粒将在流体储存器中的一些或全部流体已经通过该设备后保留在空间11中。

确认设备的装配

在很多应用中，本文所述设备的流体通道的重要尺寸具有相对有限的公差。即，该设备的恰当运转可能取决于尺寸保持在相对窄范围内（即在微米到几十纳米数量级）的流体通道。由于该设备包括至少盖12和主体10，其装配来形成可操作装置，并且由于操作中在该设备中施加主动内部流体压力，其倾向于将盖12和主体10分离，因此通常采用一些夹紧或以其它方式将主体10和盖12保持在其装配位置中的装置。由于将盖12和主体夹紧或以其它方式保持在其装配位置中产生的压力可引起盖12或主体10的部件变形，因此可能改变这些部分的重要尺寸。在变形发生时检测这样的变形很重要。

本发明包括确认本文所述设备适当装配的方法。该方法以下述设备为例，该设备包括限定空间11的主体10，和覆盖空间11并且具有与覆盖空间11的面相对的平直表面的盖12。但是，通过包括待检查变形的部件中的面上的平直表面，基本上可使用相同的方法来检测用于其它构造的部件中的变形。为了确认设备的适当装配，将主体10和盖12装配，包括所有夹紧装置、保持件或在主体10或盖12的任何部分上施加压力的其它装置。任选地，使无颗粒流体在要使用的操作压力下流经该设备。使用光线照射盖12的平直表面。检测由盖12的平直表面反射或折射的射线的干涉图样。干涉图样表明盖中弯曲的位置和程度，并且允许确认例如盖12的限定空间11的面和由主体10限定的空间11的壁之间的距离变化是否在适当公差范围内。

该设备可包括确认设备适当装配的多种视觉指示器。视觉指示器为主体或盖的一个特征，其在该设备适当装配时具有一种外观，在设备没有适当装配时具有不同的外观。基本上任何可视觉观察的现象可用作视觉指示器。如上面指出的，可使用表明设备的一部分变形的干涉图样。刻画、描画或雕刻在配合部件上的直线的对准可用作适当装配的视觉指示器。

使用设备

该设备可用于分离悬浮在流体样品中的颗粒，例如生物细胞。流体样品在空间11的入口区域15处引入。样品中的颗粒从入口区域15移动到由分离元件14以及主体10和盖12中的至少一个限定的台阶式通道中。设备中颗粒的运动可能由于颗粒的固有运动性（例如由于能动的生物细胞）而发生、由于颗粒通过设备中的流体的密度引起的沉淀或上浮而发生或响应于设备中引入的容积流体流而发生。台阶式通道包括第一通道51，其由分离元件14的第一台阶61限定边界。第一通道51具有窄尺寸（即，第一台阶61的表面和主体10和/或盖12的相对面之间的距离），由于一些颗粒的粒度（计入颗粒的变形性），这些颗粒可能不能进入第一通道51。能够穿过第一通道51的颗粒继续沿台阶式通道移动到第二通道52，所述第二通道52由分离元件14的第二台阶62限定边界。第二通道52具有比第一通道51的窄尺寸更窄的窄尺寸（即第二台阶62的表面和主体10和/或盖12的相对面之间的距离），由于一些颗粒的粒度（计入颗粒的变形性），这些颗粒可能不能进入第二通道52。能够穿过第一通道51和第二通道52的颗粒继续沿台阶式通道移动到空间11的出口区域17。该设备因而分离不能进入第一通道51的颗粒、能够穿过第一通道51但是不能进入第二通道52的颗粒和能够穿过第一通道51和第二通道52的颗粒。由于这些颗粒能够进入但是不能穿过（在操作期间）第一和第二通道中的一个，因此这些颗粒群体可分别回收。替代地或另外地，可回收从设备的出口区域回收的流出物。在一个实施例中，不能穿过第一和第二通道中的一个或两个的颗粒可在回收流出物之前溶解或以其它方式降解（即允许溶解或降解产品通过装置）。

在相同的流体样品施加到每一个设备的入口区域15的情况下，可一次（即同时）运转多个设备。多个设备可具有共用的入口区域15或与多个入口区域15中的每一个流体连通的共用的上游储存器。是否多个并联的设备共用相同的主体10、相同的盖12或两者都共用不重要。当然多个分立设备可独立运转。在一个实施例中，多个设备被聚集、结合或压在一起来形成整块（例如，多块晶片（wafer）构成的块，每一片晶片在晶片一个面上用作一个设备的主体10，在晶片的相对面上用作相邻设备的盖12），在该整块的一端具有入口区域15（或流体通道，其与入口区域15流体连通）。包含颗粒的流体样品可施加到整块的端部，由此流体样品可提供到该整块的每个设备的入口区域15。通过将流体在压力下（例如使用泵）提供到整块的相同端部，可将流体流引入通过整块的所有设备。该布置允许按比例增大本文描述的设备和方法而无需重新调整或设计设备的组成件。替代地，可仅增加晶片的数量来适应期望数量的颗粒。

使用本文所述的设备和方法获得的颗粒和细胞可用于多种其它目的中的任何目的。而且，对于这些目的中的许多而言，在出于分离目的操作设备之后，不需要将可能保留在设备中的颗粒隔离。例如，在很多情况下，可以观察到完整的生物细胞或生物细胞组成与试剂（例如抗体、酶基质、可能互补的核酸和营养物）的相互作用，对于保留在设备中的细胞和对于从设备回收的细胞可观察到的那些相互作用一样。而且，存在于设备中的流体通道可利于这样的试剂输送到保留在设备中的细胞。因而，该设备既可用于分离细胞，又可用于之后用作观察细胞与各种试剂相互反应的反应容器。

当该设备用于容纳包含生物细胞的流体时，该流体应优选选择成具有足够保持生物细胞完整性的渗透压浓度。如果认为细胞的生存能力或其它生物功能很重要，则该流体还应选择成用于保持期望的一种或多种生物功能。

具有保留其中的颗粒的设备还可用作用于存储试剂、保持试剂或使试剂与颗粒接触的容器。例如，该设备可用于在该设备中分离存在于样品（例如用以冲洗例如鸡蛋等食品的流体样品）中的细菌。当在设备中分离细菌之后，可将培养基提供到该设备的空间11，以促进细菌的成活和繁殖。可将指示剂（例如与特定细菌抗原特异性结合的抗体，或仅可由有害细菌代谢的试剂）提供到该空间，并且可观察其与空间中的细胞的相互作用。这样的实例可用于分析食品由致病菌的污染。

血样的时效

使用本文所述的设备时，发现设备中的血液和血细胞的流动特性随时间明显改变。据信，血细胞的变性在血液抽取出之后很快开始，并且变性的影响在若干小时后开始危害本文所公开的设备实现的分离的效率。这可能至少部分由于缺乏氧、营养物、暴露于可能附着到设备表面的白血球细胞的碎片或暴露于由溶解的白血球细胞释放的酶所引起。在血样抽取出约6到8小时后，血细胞倾向于变得不稳定，并且更易于在通过设备时溶解。在血样抽取出约10-12小时之后，变得更难有效分离血样中的细胞。血液应优选在其抽取出后6小时内使用，并且在抽出后不超过12小时内使用。

在对超过8小时时效的血样的进一步操作中，明显的是，血样中观察到的变化对于本文所述的设备和方法来说不是特有的，而相反是可能与使用血样进行的多种分析相关的更一般的现象。在涉及血液或血细胞通过相对窄的通道（即100微米或更小）的任何分析中，似乎使用在分析前12小时内，并且优选在分析前10小时内、8小时内或7小时内从对象获得的血液进行分析是有利的。由于本文所述的设备可由几乎不具有相关的专门技术的操作者方便地操作，因此该设备可用于在非常接近血液从对象获得时间的时间分析血样，例如在医生办公室中或在抽血室处。

实例

现在参照下面的实例描述本发明的主题。这些实例仅提供用于示例目的，并且本发明不限于这些实例，而是涵盖所有明显由于本文提供的教导而显而易见的所有变型。

实例1

从母血分离胚胎细胞

本文所公开的这类设备用于在1毫升母血样中将胚胎样的大的有核细胞从其它细胞分离。

聚碳酸酯设备使用已知的环氧树脂铸塑工艺构造，并且包括主体10，所述主体10在由主体10限定的八个通道的每一个中具有形成一体的分离元件14。该应用可以使用的其它材料包括环烯烃共聚物和聚丙烯环烯聚合物。

分离元件在台阶式通道中具有限定串联布置的通道的六个台阶，所述串联布置的通道具有分别为10、7、5、4、3和2微米的窄尺寸。每一个台阶（和通道）长度为1毫米。夹到主体10的标准载玻片用作盖12。主体10的在分立的台阶式通道之间的部分用作支撑结构20。盖12使用硅橡胶粘合剂粘到主体10。

为了模拟母血，从男性胎儿得到血样，并且与得自妇女的血液混合。将该混合物使用标准程序肝素化，并且冷藏过夜。其它抗凝剂，例如EDTA钾也适用于该应用。将样品放到室温下，并且使用注射器注入多个通道的入口区域15中。在样品通过该设备之后，将该设备在显微镜下观察。观察到似乎是胎元的大细胞（即大于正常血细胞的细胞）被捕获在台阶式通道的几个位置处。

通过将装配的设备短暂离心分离，使大细胞粘着到盖玻片。离心分离后，将盖12从主体10取下，通过使用3：1的甲醇：乙酸混合物的Carnoy固定剂将粘着到盖12的细胞固定。然后将细胞使用标准原位免疫荧光杂交（FISH）技术进行处理，以用于使用市场上可买到的试剂盒检测染色体X和Y。

在载玻片上观察到代表到X和Y染色体上特定序列位点的FISH探针的杂交的荧光信号，表明雄性（即包含Y染色体）胚胎细胞已经使用该设备从血样分离。观察到至少一些大细胞是多核的，意味着为滋养细胞。

与可能出现在母血中的其它类型的胚胎细胞（例如原始胚胎干细胞）不同，胚胎滋养细胞被认为在终止妊娠后相对快速地从母血中消失。由于来自以前妊娠的滋养细胞不可能存留在妇女血液中，因此胚胎滋养细胞的分离可能比其它类型的胚胎细胞（包括妇女的可能从以前的妊娠留存的已知或未知的那些胚胎细胞）的分离提供关于妇女现在的胎儿状态的更多信息。

实例2

本文所述的设备的装配的评估可通过在照射下观察从设备反射的光、折射的光或反射的光和折射的光两者来实现。图5是图示出在适当装配的设备上观察到的光的图样的彩色图。

图5中所示的设备由塑料主体形成，所述塑料主体具有与其形成一体的分离元件，并且具有应用到其的平直玻璃盖。台阶式通道由台阶式通道的（本例）上表面上的盖以及由台阶式通道的（本例）下表面上的分离元件限定。九个支撑结构从入口区域（沿图5中所示的箭头的方向）到出口区域基本上延伸分离元件的整个长度，将台阶式通道分为10个单独的流动通道。分离元件具有八个基本上平行于盖的平直部分，所述平直部分（台阶）离盖的限定台阶式通道的表面限定4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2和5.4微米的距离。

荧光从光源以基本上垂直于盖的照射角并且直接在盖的上方发出。图5显示了视线关于盖成约30-45度定位的观察者观察到的图像。可以看到，可观察到“棋盘”样的光的图样，如图5中所示。不受任何特定操作理论的限制，据信从盖的顶部（即台阶式通道的外部）表面反射的光与由盖的底部表面反射的光、由分离元件的平直部分反射的光相结合或与这些光的某种组合相结合，以产生图5中所示的颜色。当设备适当装配时，观察到与分离元件和支撑结构的图样对应的光的图样，而与光变化的起因或解释无关。盖或主体中的变形例如使棋盘图样扭曲，使得对应于分离元件的平直部分的矩形显示为歪斜或弯曲。

实例3

从人体绒毛膜绒毛样品分离胚胎细胞

在本实例中所述的实验中，本申请中所述类型的设备用于从成体和胚胎细胞混合物中分离胚胎细胞，该混合物存在于从已知怀有男胎的怀孕妇女获得的绒毛膜绒毛（CV）样品中。

本实例中所述的实验中使用的设备为两部件式测试盒，具有玻璃盖和使用微注射成型工艺由聚碳酸酯制造的主体，主体上具有在分离元件和盖之间限定多个台阶的隔板，如图6中所示。测试盒的主体和盖限定具有入口区域和出口区域的空间。入口和出口区域通过分离区域彼此流体连通。分离区域包括平直部分（即相对宽的通道），其中主体和盖之间的最小距离为4微米，主体和盖之间的最大距离为5.4微米。对于八个台阶而言，盖到台阶的距离（沿流体流的方向）为5.4微米、5.2微米、5.0微米、4.8微米、4.6微米、4.4微米、4.2微米和4.0微米，如图6中所示。沿流体流方向的分离区域的长度（即图6中所示的8个台阶结构的从左到右的距离）为20毫米，并且分离区域内的八个台阶中的每一个沿流体流方向的长度为2.5毫米。分离区域的宽度（即图6中所示的8个台阶结构沿垂直于图6中所示的平面视图的维度延伸的距离）为24毫米。装配设备的空间的总内部容积为约12.2微升，空间的分离区域的容积（即盖和台阶分离元件之间的部分）为约2.2微升，入口和出口区域的容积之和为约10微升。该型号的测试盒标示为D3v2。

在一个替代实施例中，可使用类似的设备，该设备不同之处基本上仅为八个台阶的盖到台阶的距离（沿流体流方向）为4.4微米、4.2微米、4.0微米、3.8微米、3.6微米、3.4微米、3.2微米和3.0微米。该型号的测试盒标示为D2V3。

在流体流操作过程中，测试盒容纳在专门设计的支架中，该支架用于夹紧测试盒，并且确保玻璃盖与测试盒主体配合以防止任何流体从测试盒泄漏。对支架的精密结构并无严格要求，支架用于均匀地向测试盒的各部分施加足够压力以将其保持在一起，并防止由于测试盒内相对于大气压力的正或负流体压力而泄漏。关于本实例中所述的实验，支架由两个金属部件构造，所述两个金属部件具有用于调节将金属部件和夹在其间的测试盒部件保持在一起的力的配件。金属部件中的一个限定“窗口”（参见图5），其近似地对应于主体和盖之间的空间区域，通过所述窗口可进行对空间内细胞的视觉观察。另一个金属部件基本上为实体，除了其包括与入口和出口端口对准的孔，所述孔用于容纳向测试盒内空间提供流体和从测试盒内空间收回流体的连接件。

使用配备有1.25毫升注射器的Hamilton PSD3注射泵获得通过测试盒的流体流。泵使用在MatLab^TM工具控制工具箱上运行的应用程序进行软件控制。该系统还包括压力传感器，其使测试盒内的流体压力能够得到恒定控制。将系统部件连接的流体导管和配件选择成适应预期压力，但是对其特性并无严格要求。基本上可使用任何流体导管和配件。

这些研究中使用的分子探针得自Abbott Molecular，并且包括

X Spectrum Orange^TM探针（从使用试剂处理的细胞中的X染色体提供红色荧光信号）和Y Spectrum Green^TM探针（从使用试剂处理的细胞中的Y染色体提供绿色荧光信号）。所有其它试剂都为足够高级别的，以防止非特异性杂交。

CV样品容纳在15毫升螺纹盖塑料管中，该塑料管盛装在约5毫升Dulbecco的改性的磷酸盐缓冲液（pH为7.2的DMPBS；0.90毫摩尔CaCl₂；0.49毫摩尔MgCl₂，2.7毫摩尔KCl，1.47毫摩尔KH₂PO₄，1.38毫摩尔NaCl，和8.06毫摩尔Na H₂PO₄）中的多片组织，来自组织样品的细胞悬浮在该缓冲液中。使细胞悬浮液自然吸气，将固体组织碎片保留在管底部（保留在管中的材料的体积小于0.25毫升）。将吸气溶液放置在15毫升螺纹盖塑料管中，并且以3,000rpm（ca.1500×g）离心分离5分钟。在离心分离和去除上清液之后，约0.1毫升的压缩的细胞保留在管中。将约2毫升DMPBS添加到管，并且使用漩涡式混合器将各组分充分混合，以使颗粒状细胞再次悬浮起来。该再次悬浮的细胞样品存放在4摄氏度下约1小时。

将再次悬浮的细胞样品在标准载玻片上展开，使用Wright-Giemsa染料进行染色，并且在白光照射下在400×放大倍数下进行检查。染色的标本显示出样品中存在（胚胎）滋养细胞。样品中观察到的其它细胞据信为嗜中性白血球（有核白血球细胞）和红血球细胞。通过该方法观察样品中的胚胎滋养细胞和其它细胞表明胚胎滋养细胞明显大于样品中大部分其它细胞。

使用上述注射泵设备将悬浮细胞的1.25毫升等分试样通过施加到入口区域而通过D3v2测试盒。在施加样品之前，测试盒已经先经通过一定数量的DMPBS而进行填装。该样品以0.025毫升每分的流体流动速率通过测试盒。在样品通过过程中，监控并观察射流系统中的压力，以在4.6-6.8psig范围内变化。

在样品已经通过测试盒之后，将固定溶液（甲醇：乙酸比率为3：1）的三个0.1毫升等分试样通过测试盒。在固定溶液通过之间等待10分钟时间。在本段中描述的工艺过程中，通过向设备施加冰水冷却测试盒和支架。在室温下（约20摄氏度）进行前述步骤。

固定之后，通过向出口区域施加真空来干燥测试盒，这有效地从测试盒中的空间将所有流体去除。测试盒在4摄氏度下存放过夜。存放后，在100×放大倍数下通过显微镜观察测试盒。在分离区域中观察到直径大于约20微米的若干有核细胞，一些在出口区域中，另一些在测试盒分离区域中的第一分离台阶处。在测试盒分离区域中的第一分离台阶下游没有观察到直径大于约20μm的细胞。

将测试盒拆开，并且将玻璃盖取下，使用标准FISH技术处理。使用荧光显微镜检查盖，所述荧光显微镜配备有计算机控制的镜台，所述镜台与自动检测算法系统联接。盖也使用DAPI染色，以能够观察到完整的细胞核（即用于证实捕获细胞）。FISH和DAPI染色可如在从Abbott Molecular（Chicago，IL）获得的商用工具箱中提供的那样进行。

DAPI和FISH染色的盖的检查表明玻璃盖上具有大量有核细胞。大部分细胞在测试盒的对应于盖到台阶距离为4.2和4.4微米的台阶的部分处的相对小的面积中观察到。这些细胞显示为被拉伸或以其它方式变形。存在雄性细胞（即产生对应于既存在X染色体又存在Y染色体的荧光信号的细胞）。得出结论如下：这些细胞来源于怀孕妇女的男性胚胎。也检测到了雌性细胞（即产生对应于存在X染色体的荧光信号，但是没有对应于存在Y染色体的任何荧光信号的细胞）。得出结论如下：这些细胞来源于孕妇，而不是来源于她的男性胚胎。检测到的细胞中没有展示出多分叶的核，由此得出如下结论：所捕获的细胞不是白血球细胞。

实例4

从母血样品隔离胚胎细胞

在本实例中所述的实验中，本申请中所述类型的设备用于从得自已知怀有男胎的孕妇循环系统的血样分离胚胎细胞。

用于本实例中所述的实验中的设备是实例3中所述的D3v2测试盒，其操作如在该实例中所述。所使用的分子探针和染色程序与实例3中所描述的相同。

通过静脉穿刺从已知怀有男胎（通过超声成像）的22个孕妇中的每一个以成对的约5毫升等分试样收集血液。胎儿的胎龄在从17周6天到29周6天范围内，平均胎龄为21周5天，胎龄中位数为20周2天。每一个血样收集在5毫升试管中，并且存放在冰浴中，直到其制备用于测试盒。样品收集和样品制备之间所花时间小于一小时。

在一些情况下，使相同的样品通过两个测试盒，一个随后使用FISH试剂染色，另一个使用Wright-Giemsa试剂染色。这使得能够比较生物组织学结果（Wright-Giemsa染色细胞）和通过FISH程序获得的结果。在其它情况下，将来自一个患者的两份同样的血样通过不同的测试盒，以证实结果的可重复性。

在准备泵送通过测试盒时，通过将患者血样吸入Hamilton注射器来使血样通过测试盒。1.25毫升血样以0.025毫升每分的流动速率泵送通过各测试盒。在血样通过过程中监控流体系统中的压力，并且观察所述压力，使其在7-9pisg内变化。

血样通过测试盒之后，将1.25ml Dulbecco改性的磷酸盐缓冲液沿与样品流相同方向并且以与样品流相同的流速通过测试盒，以去除来自样品的任何残余材料，而不是保留在测试盒中的细胞。在该清洗程序后，使固定剂的三个0.1毫升等分试样以0.025毫升每分通过测试盒。在固定剂通过之间允许等待10分钟时间。在固定剂等分试样通过和间隔时间过程中，测试盒和支架通过将冰水施加到该设备来冷却。

在固定剂通过之后，以两种方法中的一种处理测试盒。一些测试盒在紧接着固定剂通过之后去除固定剂（使过滤的空气通过测试盒，直到测试盒没有固定剂液滴），在4摄氏度下存放过夜，并且在过夜存放之后进行FISH处理。固定剂保留在测试盒内的其它测试盒在4摄氏度下存放，直到积累四个或更多个测试盒，此时，将固定剂去除，将测试盒在4摄氏度下存放过夜，并且在存放过夜之后将测试盒进行FISH处理。FISH处理必须去除盖，并且使用X SpectrumOrange^TM

Y Spectrum Green^TM处理，如实例3中所述。DAPI用作对比染料，并且用于表明存在完整的细胞核。

在染色之后，手动使用荧光显微镜或使用与自动检测计算系统联接的镜台检查染色细胞附着到其的玻璃盖。

对于一些测试盒，固定到盖上的细胞仅使用Wright-Giemsa染色，以检查捕获在测试盒内的细胞类型和分布。

现在描述从该实例中的实验获得的结果。

将得自22个孕妇的母血样品通过38个测试盒。二十六（26）个测试盒使用本文所述的FISH/DAPI程序处理，12个测试盒仅使用Wright-Giemsa染色。在用于FISH的26个测试盒中，发现12个适用于分析，而14个没有正确杂交或获得反染色，表明其没有适当固定。

适用于分析的12个测试盒中，在对约12.5%的总覆盖面积使用自动显微镜和算法系统扫描时，3个提供雄性正信号。由于担心自动系统的精确性，将一些测试盒重新手动扫描。重新扫描测试盒显示出在12个测试盒中的每一个上出现雄性正信号，各板上检测到在1到11个之间的雄性细胞（12个板的每一个上检测到的雄性细胞数量为1，2，2，2，2，3，3，3，3，4，8和11）。那些雄性细胞中，大部分（64%）在测试盒盖的对应于台阶到盖的距离为4.0、4.2和4.4微米的部分上检测到。约36%的雄性细胞在测试盒盖的对应于盖到台阶的距离为4.6、4.8、5.0、5.2和5.4微米的部分上检测到。

图7提供了识别的细胞中的每一个的位置的相关“图谱”，识别的细胞提供关于雄性胚胎细胞的正信号。大部分识别的细胞位于测试盒的出口或排出口部分，一些细胞在入口区域中。这表明测试盒能够捕获胚胎细胞，但不使其通过。

来自一个测试盒的结果表明，捕获了11个胚胎细胞（即，显示出表示其细胞核中X和Y染色体都存在的荧光信号的细胞），比约300个成体雌性细胞（认为是主要是白血球细胞）少。

使用Wright-Giemsa染料将12个测试盒染色，以检查捕获的细胞的形态学。这些测试盒不用于FISH分析，仅通过光学显微镜进行观察。这些测试盒中的两个提供给有核白血球细胞专家（移植免疫学家），该专家没有被告知已经应用到测试盒的样品的性质。该专家认为捕获的细胞包括具有粒性白细胞和与其混合的单核细胞的主要为“上皮细胞”的不规则谱带。虽然这些细胞的细胞学形态被专家描述为上皮样细胞，但是考虑到免疫学家没有被告知可能在这些观察的细胞中包括胚胎滋养细胞的事实，这些细胞被认为是滋养细胞或其它大细胞。胚胎滋养细胞已知为上皮细胞，其大批进入胎盘中的母亲血管内。

胚胎滋养样细胞在测试盒盖的对应于盖到台阶的距离为4.0、4.2和4.4微米的部分处观察到，其中发现大部分细胞提供X和Y染色体信号。这些滋养样细胞的估计频率比预期用于循环癌细胞或用于正常血液中类似形态的其它细胞的高得多。该观察结果表明，测试盒捕获了人类循环系统中通常观察不到（或仅观察到非常低的数量）的细胞。

用于本实例中所述的实验的测试盒的检查情况表明，测试盒通常捕获来自母血的每一个1.25毫升样品的在200到4,000个之间的细胞。通过对捕获细胞的观察显而易见的是，捕获的细胞的至少一些为胎元细胞。但是同样显而易见的是，测试盒能够从血样捕获多种其它带在血液中的细胞。这些其它细胞包括白血球细胞。对细胞被捕获在用于这些实验的测试盒中所处位置的分析表明细胞主要在三个分立区域处被捕获。约30-35%的细胞在测试盒的设有盖到台阶的距离为5.2和5.4微米的台阶处的部分被捕获。约25%的细胞捕获在测试盒的设有盖到台阶的距离为4.0、4.2和4.4微米的台阶处的部分被捕获。剩余的捕获细胞在测试盒的对应于中间台阶（即盖到台阶的距离为5.0、4.8和4.6微米）的部分处被捕获。

在用于这些实验中的条件下，观察到捕获的中性粒细胞（其通常具有约9-10微米的细胞直径）能够沿测试盒的分离腔室在流体流方向比单核细胞（其通常具有约10-30微米的细胞直径）移动得更远，所述单核细胞更通常被保持在更靠近分离腔室的上游侧。这些观察结果表明，本申请中所述的设备可用于从母血细胞分离胚胎细胞和又可用于分离不同类型的母血细胞。（相对较大的）单核细胞倾向于比（相对更小的）中性粒细胞更通常地在更靠近分离腔室的上游部分被捕获的观察结果支持了细胞穿过分离腔室的能力与粒度成反比的论点。因而这些观察结果表明，可推断带超过在血液中的细胞以外的结果，从而推定，无论是血细胞还是不是血细胞的细胞（和不是细胞的颗粒）可使用例如本文所述的设备通过粒度进行分离。

在本实例中描述的实验中得到的另一个感兴趣的观察结果涉及相对于其在血液中出现的频率，单核细胞比中性粒细胞更优选保持在测试盒中。正常血样中中性粒细胞和单核细胞的数量分别基本在50-70%和2-8%范围内。即，在正常血液中，中性粒细胞倾向于在数量上超过单核细胞一个数量级或更多。但是，在本实例中所述的实验中，中性粒细胞：单核细胞的比率更接近（55-65）：（35-45）。使用本文所述的装置获得的样品中中性粒细胞：单核细胞的该比率比存在于正常血液中的比率（约50：1）高得多（分离腔室上游侧为1.03：1，下游侧为1.67：1）。这些结果表明，本申请中所述的设备至少在如本实例中所述构造时，捕获单核细胞比其捕获中性粒细胞更有效。

假设1毫升母血中存在4百万到1千万之间的白血球细胞，则本实例中所述的实验表明，本文所述的测试盒的使用基本上从1.25ml母血样品消除了所有红血球细胞、血小板和血浆，以及高于99%的所有中性粒白血球细胞，同时保留可能感兴趣的明显可分离的几种细胞的集合，包括胚胎细胞。如果假设1.25毫升血样中存在约2.5-6.25×10¹⁶个细胞，则本实例中讨论的结果表明，本文所述的设备的操作导致基本上所有细胞通过测试盒，因为测试盒仅捕获553±316（平均值±样本数N为6的平均值的标准误差），同时仍保留感兴趣的细胞。特定细胞的分离程度非常显著，约10¹⁴倍净化，甚至可忽略不计分离区域中颗粒的分离。

本实例中所述的实验结果表明，本实例中所述的测试盒能够适应使血液通过以微米在一个维度限定的窄空间。在本实例中所述的装置中，流体压力和可能破坏细胞完整性并且由于细胞“挤入”引起窄通道堵塞的其它特性在所用的血样上不会引起这些结果。也没有观察到血液的凝固。不受任何操作理论的限制，据信，本实例中所述的测试盒在测试盒内提供适当的距离，以保持足以使所有红血球细胞、血小板和大部分白血球细胞通过的空间，同时根据颗粒的粒度或直径提供分离选择过程。

本实例中所述的研究限定了在对细胞损害最小并且不堵塞的情况下足以使1.25毫升血液通过测试盒的流动条件。而且，使用仅一个分离单元实现在小于1小时内使血样通过。该细胞分离时间基本上比使用其它细胞分离方法可获得的更短，并且足以在临床和商用相关的时间段输送限定的血液细胞次级群体。这些快速方法和用于执行这些方法的设备允许收集诊断感兴趣的细胞群体，无论是妊娠胚胎诊断还是其它诊断、治疗或研究应用。捕获全部胚胎细胞，同时还使大部分其它细胞通过测试盒的能力可提供完全的胚胎基因样品，以用于分析和检测例如遗传畸形。这些数据还表明，由该装置捕获的材料适用于使用在分子诊断技术中。

本实例中所述的测试盒和方法提供了用于选择细胞和其它对于治疗、诊断和一般的研究应用生物学感兴趣的颗粒的有用工具，在所述治疗、诊断和一般研究应用中，使样品富含用于分析的细胞和颗粒或获得用于分析的纯的群体很重要。在遗传学、表型分析、外成分析中的应用为可能从这样的分离方法受益的领域。

实例5

从母亲的动脉血样品隔离胚胎细胞

人的胚胎滋养细胞被认为具有基本上在14.3到30微米范围内的细胞直径。哺乳动物毛细血管的腔可具有显著地更小的直径，约为15微米或者更小（参见，例如，Wang等人，2007，Exp.Eye Res.84：108-117，其中观察到施给至动脉血的具有>8微米直径的微球粒并不重进入系统循环；Maxwell等人，1985，Heart Circ.Physiol.248(2):H217-H224类似地观察到对经过肠的毛细血管循环的动脉施给的微球粒的大约9微米的尺寸限制）。

鉴于这些观察结果，确定活体内的胚胎滋养细胞（和同样大的细胞）将选择性地集中于系统毛细血管床的动脉侧上。根据这种确定可以得出，毛细血管动脉侧的流体为特别合适的胚胎滋养细胞来源。此类流体可包括动脉血，尤其是在毛细血管床上游（相对于生理学上的血液流动）的动脉血。这些流体还可包括在动脉血经过毛细血管（例如肺或者支气管分泌物）或其它狭窄通道（例如肝总动脉中的血液）之前得自动脉血的流体。

本实例中所述的观察结果还表明相当大数量滋养细胞（和同样大的细胞）可预期在毛细血管床中积聚，尤其是在此类毛细血管床的动脉侧上。在紧靠毛细血管床上游所取的血可预期比较富集胚胎滋养细胞（和同样大的细胞）。

鉴于母亲的循环中胚胎滋养细胞比较稀薄，从富集胚胎滋养细胞的身体位置收集胚胎滋养细胞可对于此类细胞的可否检测到产生重要影响。因此，根据本实例中的观察结果，相对于静脉血样品而言，获得母亲动脉血、得自动脉血（即在此类血经过毛细血管之前）的流体、或者在紧靠毛细血管床上游收集的母血的样品，可改进胚胎滋养细胞（和同样大的细胞）能够被从此类样品收集的可能性。

实例6

使用用于胚胎滋养细胞的细胞表面标记

他人报告称，鞘糖脂标示的红细胞糖苷脂出现在胚胎滋养细胞和数量有限的其它细胞的表面上，并且红细胞糖苷脂用作人类细小病毒B19的受体。B19的VP2衣壳蛋白特别地与细胞表面红细胞糖苷脂结合。Wegner等人，2004，Infect.Dis.Obstet.Gynecol.12:69-78。Wegner等人报告称空的B19衣壳特别地与人类绒毛状滋养细胞结合。

他人报告称，B19并未单独结合红细胞糖苷脂，而是代之以结合一种或多种鞘糖脂和/或其它分子的联合体。Kaufmann等人，2005，Virology 332:189-198。不管B19及其衣壳蛋白质结合的实体的确切身份如何，B19及其衣壳蛋白质结合人类胚胎滋养细胞，并且看起来需要在这些滋养细胞的膜中出现红细胞糖苷脂以用于此类结合。因此，B19、其衣壳和衣壳蛋白质，及其它红细胞糖苷脂-结合试剂可用于从其它人类细胞（包括从出现于怀孕和先前怀孕的母亲的血液中的人类细胞）中识别和分离人类胚胎滋养细胞。

红细胞糖苷脂在人类广泛地表达。显然，只有小比例的人类群体不能在它们的红细胞样细胞上表达红细胞糖苷脂。据报道，红细胞糖苷脂的表达在发育的头三个月的人类胎儿的滋养细胞中最高。因此，红细胞糖苷脂可用作用来识别胚胎滋养细胞的标记，并且细胞的红细胞糖苷脂表达的强度可用作滋养细胞从胎儿分离的发育阶段的指示器，比较早期的滋养细胞基本上以比后期滋养细胞更高的水平（或细胞表面密度）表达红细胞糖苷脂。

相对于通过与染色体材料（即，其中每个细胞只有一个至若干个复制品存在）混合来识别胚胎滋养细胞的原位混合方法中的荧光，包括检测红细胞糖苷脂的细胞检测方法可具有显著更大的信噪比，这是由于在细胞表面上出现多个红细胞糖苷脂分子。而且，红细胞糖苷脂表达与胚胎滋养细胞发育早期的相关性允许基于红细胞糖苷脂表达的强度来选择或分离细胞。

红细胞糖苷脂可用作细胞表面标记来识别胚胎滋养细胞及其它表达红细胞糖苷脂的细胞。其它特征（例如细胞尺寸和构造）可用于将滋养细胞与表达红细胞糖苷脂的其它细胞（例如红细胞样细胞、巨核细胞、内皮细胞和胚胎心肌细胞）区别。

特别地与红细胞糖苷脂反应或结合至红细胞糖苷脂的任何试剂可用于识别表达红细胞糖苷脂的细胞，包括例如针对红细胞糖苷脂提出的单克隆抗体、人类细小病毒B19VP2衣壳蛋白质（例如色素蛋白标记的蛋白质、放射标记的蛋白质或生物素标记的蛋白质）、空的B19衣壳、或完整的B19病毒。此类试剂还能够用作捕获试剂，例如通过将试剂粘附至在此所述的装置的表面以使得表达红细胞糖苷脂的细胞将特别地粘附至该表面来实现。

实例7

分离的细胞的培养和/或增殖

在此所述的方法和设备可用于分离和选择培养胚胎滋养细胞以便获得用于非侵入性产前检查的样品。

胚胎滋养细胞可被与（例如）母血样品的其它细胞分离并且通过以下步骤培养：首先引起这些细胞侵入带孔膜并穿过带孔膜迁移，留下不能进行此类侵入的污染性的母亲的有核细胞。然后，可使用已知的用来引起这些细胞中的增殖行为的因素，来引起胚胎滋养细胞从侵入表现型转换到增殖表现型。增殖的细胞分裂并且增加它们的数量至期望水平，例如足以满足现有分析技术敏感度要求的细胞数量。这些涉及引起从侵入表现型转换至增殖表现型以便选择性地培养滋养细胞（或其它细胞）的方法可用于对能使用培养的胚胎细胞诊断的任何病症进行非侵入性产前检查。

为了便于在此所述的表现型转换，在一个实例中通过在装置的主体与盖之间增加带涂层的或无涂层的带孔膜而改变在此所述的颗粒分离装置。该装置如在此所述地操作以便分离细胞，并且通过另外执行步骤以分离和放大细胞，如在本实例中所述，它们利用胚胎细胞侵入、迁移与增殖的能力。

细胞分离过程

本文中其它地方所述的过程进行如下改变。本文中所述的设备用来从样品（例如母血样品）分离和富化胚胎细胞，如本文中所述。被分离的细胞被置于位于主体10和膜81之间的空间11中。引发胚胎细胞的侵入表现型（例如通过向空间增加已知的用于引发此类表现型的化合物），这造成胚胎细胞跨过膜离开包含污染性母亲的细胞的空间。迁移的胚胎细胞移动至膜81的孔82，并且穿过膜81侵入位于膜81与盖12之间的间隙。在该间隙内，胚胎细胞的表现型被再次转换，这次转换成增殖表现型，这造成细胞分裂和数目增加。如此所产生的扩展的胚胎细胞群体可用于例如需要胚胎遗传物质的胚胎诊断方法。因为这些细胞能从可非侵入地由胎儿获得的样品（例如从母亲的周围血液样品）获取，这些方法相对于其它胚胎诊断方法具有一个优点，即不需要扰动胎儿以便获得胚胎样品。

在本实例中所述的设备和方法也可用于除了胚胎细胞以外的细胞和颗粒。它们不仅可用于胚胎细胞分离，而且可用于分离细菌、病毒、原生动物、多细胞生物体例如蠕虫、昆虫、寄生虫、矿物和有机颗粒、有机和无机分子。

膜或其它屏障81可为带孔或无孔的，并且可由一种或多种材料制成和/或涂有一种或多种材料。膜或其它屏障81的用途是提供一种结构，该结构使得一个群体中的至少两种类型的细胞能够基于该群体中的至少一种类型细胞与该结构结合和/或穿过该结构的能力而被分离。显然，多个膜或其它屏障81可用于（从空间11中的颗粒的有利位置，或者串联地或者并联地）本文中所述的方法和设备中。

背景

胚胎滋养细胞在母亲的周围血液中非常稀有。为了可用于大多数现有的分析技术，样品中的胚胎细胞必须基本上与非胚胎（例如母亲的）细胞分离。当前可用的胚胎细胞收集方法和设备通常不能产生具有足够数量和纯度的胚胎细胞的样品。有用的胚胎细胞不需要是存在于相应的胎儿中的细胞；对于许多应用，如果胚胎细胞是从胎儿获取的细胞的后代，就是足够的。

通常，主胚胎细胞（例如胎盘中的滋养细胞）在系统发育上经过至少两种不同的表现型。在早期，胚胎滋养细胞显示出增殖表现型，它们在其中、分裂和繁殖。后来，它们分化为侵入表现型并且从胚胎侧移动至胎盘的母亲侧（即它们进入胎盘或穿过胎盘侵入）。人们相信，显示出侵入、迁移的表现型的胚胎滋养细胞为到达母亲的血流的胚胎滋养细胞，例如在它们沿母亲的螺旋动脉的内（内皮）表面迁移时。

胚胎滋养细胞中的表现型转换的这种过程由多种条件的组合引起，包括通过氧浓度的变化，通过引起、引发或支持表现型改变的信号分子的出现。这些条件和信号分子可用于引发活体外的胚胎滋养细胞的表现型转换，例如在本文中所述的设备和方法中。

分离的胚胎滋养细胞的活体外扩展

在本实例中所述的方法和设备利用早期胚胎细胞增殖和侵入的自然能力，以便使得能够分离和培养胚胎滋养细胞。这通过首先引起样品中的胚胎滋养细胞侵入带孔膜和迁移穿过带孔膜来实现（例如，使用已知的方法，例如Logan等人，1992，Cancer Res.52:6001-6009或Yang等人，2009，J.Histochem Cytochem.57:605-612中所述的方法）。滋养细胞侵入穿过孔，留下不能实现此类侵入的污染性母亲有核细胞。因此，从这些污染性细胞分离了滋养细胞。

使用已知的用于引发增殖行为的因素使得分离的胚胎滋养细胞从侵入表现型转换至增殖表现型（例如下列所述的一种或多种：Red-Horse等人，2004，J.Clin.Invest.114:744-754；Ray等人，2009，Placenta 30:96100；Genbacev等人，1997，Science 277：1669-1672；Gobble等人，2009，Placenta 30:869-875；Truman等人，1986，“TheEffect of Substrate and Epidermal Growth Factor on HumanPlacental Trophoblast Cells in Culture”，Springer，Berlin；Zhou等人，2008,“Extreme Makeover：Converting One Cell into Another，”Elsevier.Cambridge；美国专利U.S.no.7,244,707）。增殖的细胞分裂并且数目增加至选定水平，例如足以满足现有商业分析技术的敏感度要求的水平。

图8示出了膜或其它屏障81的一个适当的实施例。图8A是膜81的一部分的一个实施例的视图。图8B是图8A的膜81沿平面8B截取的竖直剖面的部分的放大图。在该特定实施例中，膜81为带孔的并且在一侧上带有涂层，因此图8B示出了延伸穿过膜81的孔82，以及涂层83。在图8所示的实施例中，涂层83被涂覆到膜81的一个面上，但并不涂覆到另一个面上，涂层并不延伸入孔82中，也并不填充孔82。

图9示出了包括膜或其它屏障81的装置。图9是图2A中所示类型装置沿平面9A截取的竖直剖视图，该装置包括介于主体10和盖12之间的膜81。内部支撑结构20帮助实现膜21在装置内平坦、平整地移置。内部支撑结构20还帮助限定空间11，并且提供对空间11的尺寸的控制。在细胞被分离之后，一个群体的细胞，包括胚胎滋养细胞，保留在与膜81处于流体连通的空间内。置于膜上的试剂（例如B19VP2蛋白质）引起胚胎滋养细胞与膜结合。不结合的细胞被从空间移除，例如通过利用移除此类细胞的流体对其进行冲洗来移除。然后该空间被填充以培养基和能够引发胚胎滋养细胞的增殖表现型的一种或多种试剂。滋养细胞在膜81上和/或在空间11内增殖并且可被从其收集。

在图9中部分地所示的装置的另一个实施例中，代替盖12，存在一个具有内部支撑结构20的第二相同主体10。然而，该第二主体被以成镜像方式被应用至膜81的另一侧，因此两个相同主体在膜的两侧上彼此“成镜像”。这产生了多个互相分离并且接触膜的相反两面的空间。在本实施例中，膜两侧上的空间11为各个种类例如细胞、分子等等提供了空间，以便从一个空间穿过膜渗透或侵入至相对的空间（即横穿膜）。因此，如果膜由胚胎滋养细胞在其侵入表现型能够迁移穿过的材料（例如基膜基质的薄膜）制成，并且包括侵入胚胎滋养细胞的细胞群体出现在膜的一个面上，则可出现胚胎滋养细胞的透入（即侵入），导致胚胎滋养细胞（然而并非群体的其它细胞）出现在位于膜的相对另一侧的空间中。本实施例还提供了从在膜的相对两侧的空间引入或取出不相同的流体或样品的可能性。

例如，能够透过膜81的胚胎滋养细胞的活体外分离和扩展可以实现，如下所述。

胚胎细胞及其它同样尺寸的细胞可使用本文中所述的设备从母亲的周围血液样品隔离（忽略关于膜或其它屏障81的公开内容）。按尺寸分离的细胞群体可利用流体清洗以便基本上除去红血球细胞、血小板、其它小细胞和等离子。这时，群体中的至少某些细胞为胚胎滋养细胞，但是群体中也可能有母细胞（例如大的有核胸腺依赖性细胞）。尽管如此相对于原始母血样品而言，可保留于设备的空间11内的该细胞群体显著地富集胚胎细胞（例如1000倍）。

试剂被加至空间，该试剂引发群体中的胚胎滋养细胞显示出侵入表现型。举例来说，可向空间供应包含高达20%氧的气体混合物（即代替空间中的液体或位于空间中的液体上方）。这种处理使得胚胎滋养细胞能够透过它们所接触的膜81（例如，如果膜81接触空间11，或者如果滋养细胞被从空间11回收并且在别处与膜81接触）。如果必要或者期望的话，设备（或者设备的包含期望细胞的部分）可被旋转或者以另外方式操纵，以便激励细胞显示出侵入表现型。替代地或者另外地，引发胚胎滋养细胞朝向试剂迁移的试剂（例如Smurf 2基因产品）可被螯合在膜81的与膜81的空间11侧相对的这一侧上，由此引发胚胎滋养细胞朝向膜或者穿过膜迁移。

在胚胎滋养细胞已经透过膜进入第二空间或者进入第二材料之后，它们可被收集。替代地，如果期望更大数量或者浓度的胚胎滋养细胞，可使第二空间或者第二材料（或者任选地整个设备）经受引发滋养细胞增殖的条件（例如减少氧浓度，或者增加如已知用于引发增殖表现型的特定激酶等因素）。不管在收集之前是否引发细胞增殖，可利用各种方法和试剂试验细胞（例如通过分析其物理特性或者如本文中所述的其与B19 VF2蛋白质结合的能力），以便确认其身份为胚胎滋养细胞。

本文中所述的膜81可由类似人类胎盘细胞外基质的配方制成或者涂有类似人类胎盘细胞外基质的配方，或者由重构的基膜状基质制成。市场上可买到的用于制成此类膜和涂层的产品包括Matrigel（TM）（Collaborative Research，Lexington,Massachusetts）；和基膜提取物Cultrex（TM；Trevigne Inc.，Gaifhersburg，Maryland）。如图8B中所示，可从膜的一侧连续地延伸至另一侧的孔，因此将膜的相对的平面流体地连接到彼此（并且流体地连接膜的任一面上的空间）。孔尺寸与形状以及它们的涂敷或填充可取决于特定应用、装置设计和被分离的颗粒、细胞或分子的类型，等等。

适当设备的另一个实施例可参考图9描述。在本实施例中，代替地，本体10可包括或承载在膜81与盖12之间的额外的支撑和供应层。这种层可例如由刚性模制或挤压的塑性或弹性硅酮橡胶制成。该层为这种一体化的装置提供两个需要的功能。首先，该层可提供结构-以便提供用于循环培养基的供应通道组，并且还提供用于增殖/分裂目标细胞的扩展的空间。第二，该层可提供机械的支撑，例如类似于图9的内部支承结构20的脊部。该膜可被夹紧在这些脊部与支承结构20之间。这样，将从盖12通过脊部至膜81至支承结构20和至主体10提供力的转移，以便保证悬挂在分离装置的主体与盖之间的膜的扁平均匀夹紧和伸展。

膜81可包括成形的部分，用于引导流体的流动、细胞的迁移或者两者。在一个实施例中，涂敷膜81的第一层83是透明的，而第二层被沉积、印刷（或者刻划）在第一层上（即在与第一层的接触膜81的面相对的面上），以便产生升高的脊部和凹进的槽部（通道）。条和槽部的宽度可根据细胞处理可预期达到什么程度来选择，以便使得细胞能够利用其处理而到达和感测槽部，然后，如果存在吸引它们的因素例如槽部中的培养基流，则迁移进入槽部。替代地，主体10和盖12中的一者或者两者可具有提供同样的功能的凹槽或者其它成形表面。当然，膜81可成形或者切割成适配主体10与盖12之间的空间11，并且可具有用来适应设备的其它元件（例如入口和出口端口）的孔或配件。

膜或其它屏障81可具有均一的厚度，或者厚度可变化。膜或其它屏障81中的一个或者两个面可具有一定形状，例如遍布各处形成有凹槽，或者按照多个重复模式模制，取决于特定应用、装置设计和所分离的颗粒、细胞或分子的类型。此类多个模式变型也可应用于膜的材料、孔隙度、和涂层的变化，这些变化可以或可以不与上述的结构和几何变化相对应。

可以使用在它们之间具有一个基质层的两个膜或其它屏障81代替单个膜或其它屏障81。膜或其它屏障81的边缘可密封在一起，有效地形成扁平的袋。基质可包含例如培养基和/或引起胚胎滋养细胞的侵入或增殖表现型的化合物。举例来说，如果基质包括细胞培养基和能够引起胚胎滋养细胞的增殖表现型的因素，则进入基质的侵入滋养细胞可转变成增殖表现型，并且引起其在细胞培养基中的增殖。

在一个选择性地分离和增殖细胞的方法的替代实施例中，可将选定类型的细菌（例如人类病原体）与取自人类的样品分离，并且引起其在本文中所述的设备中增殖。

细菌很小，通常难以在微流体装置中分离。然而，细菌可使用本文中所述的设备分离，该设备包括细胞分离设备，该细胞分离设备根据细胞穿过装置的部分的能力来分离细胞，并且还包括介于设备的空间11与选择性地吸引一个或多个所关心的细菌和/或促进细菌增殖的培养基之间的带孔膜。如果膜与设备的空间11中的流体处于流体连通，则空间中的细菌可横跨膜（主动地或被动地）移动并且在培养基中增殖。此类设备和方法可用于检测样品中的小数量的细菌（例如样品如血液、尿、食品、产品、废水等等中的稀少群体的细菌或其它微生物病原体）。

除了在膜或其它屏障81的与空间11相对的侧上包括引诱剂或培养基之外，其它设备或成分可位于该空隙中。举例来说，该空隙可用作反应/检测腔室，例如充以凝胶，用于DNA的凝胶电泳。举例来说，已迁移进入凝胶的细菌可被溶解，并且其核酸可与其它试剂以电泳方式分离或反应或混杂。

本文引用的每一个专利、专利申请和公开的公开内容以其全文以引用的方式并入本文中。

虽然本文参照具体实施例来公开本发明的主题，但是显而易见的是，本领域其它技术人员可设计本发明主题的其它实施例和变型，而不偏离本发明主题的精神和范围。所附权利要求包括所有这样的实施例和等同变型形式。

Claims (86)

1.一种从母血样品分离胚胎样细胞的方法，所述方法包括：在设备的入口区域处引入样品，其中所述设备包括主体、盖和分离元件，

所述主体和盖限定容纳所述分离元件的空间，所述空间具有入口区域和出口区域，并且

所述分离元件具有第一台阶和第二台阶，并且限定流体连接所述入口区域和出口区域的台阶式通道，

所述台阶式通道包括由所述主体和所述盖中的至少一个与所述第一台阶限定边界的第一通道，并且还包括由所述主体和所述盖中的至少一个与所述第二台阶限定边界的第二通道；

所述第一通道具有窄尺寸，并且流体连接所述第二通道和所述入口区域；

所述第二通道具有比所述第一通道的窄尺寸更窄的窄尺寸，所述第二通道的窄尺寸在8到15微米范围内；

和在所述台阶式通道中沿从所述入口区域朝向所述出口区域的方向引入流体流，其中，母血细胞穿过所述第一通道和第二通道并且传送到所述出口区域，胚胎样细胞不能进入所述第二通道。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括从所述设备收集所述胚胎样细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述胚胎样细胞通过在所述台阶式通道中沿从所述出口区域朝向所述入口区域的方向引入流体流来收集，由此所述胚胎样细胞能够进入所述入口区域。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，在分离所述胚胎样细胞之后，通过从所述第一流体通道收集流体来收集所述胚胎样细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，通过拆开设备并且从所述第一通道收回所述胚胎样细胞来收集所述胚胎样细胞。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，通过在所述第一通道中插入导管并且经由所述导管的内腔收集所述胚胎样细胞来收集所述胚胎样细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，还包括溶解所述胚胎样细胞来在所述第一通道内产生溶解产物并且收集包含所述溶解产物的流体。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述主体和盖中的至少一个限定与所述入口区域流体连通的流体入口端口，以便于流体在所述设备的外部和所述入口区域之间流动。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述主体和盖中的至少一个限定与所述出口区域流体连通的流体出口端口，以便于流体在所述设备的外部和所述出口区域之间流动。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离元件与所述主体和所述盖中的至少一个形成一体。

11.根据权利要求1所述的方法，还包括用于保持所述第一通道的窄尺寸的支撑结构，所述支撑结构位于所述第一通道中，并且沿所述第一通道的窄尺寸的方向延伸。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述支撑结构与所述分离元件形成一体，并且从所述分离元件延伸离开。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述支撑结构与所述主体和所述盖中的一个形成一体，并且从其延伸离开。

14.根据权利要求1所述的方法，还包括用于保持所述第二通道的窄尺寸的支撑结构，所述支撑结构位于所述第二通道中，并且沿所述第二通道的窄尺寸的方向延伸。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分离元件限定多个台阶式通道，其中每一个台阶式通道i）流体连接所述入口和出口区域，并且ii）包括由第一台阶限定边界的第一通道和由第二台阶限定边界的第二通道。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述台阶式通道中的一个的第一通道的窄尺寸与其它台阶式通道中的至少一个的第一通道的窄尺寸不同。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一通道和第二通道的几何尺寸选择成使流经所述台阶式通道的流体在所述第一通道和第二通道中的线性流速基本上相等。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述台阶式通道的所有部分的几何尺寸选择成使流经所述台阶式通道的流体的线性流速在整个所述台阶式通道上基本上相等。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一台阶和所述第二台阶中的每一个由所述分离元件的以直角相交的一对平面表面限定。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一台阶和所述第二台阶中的至少一个由所述分离元件的以在90和180度之间的角度相交的一对平面表面限定。

21.一种用于分离颗粒的设备，所述设备包括主体、盖和分离元件，

所述主体和盖限定容纳所述分离元件的空间，所述空间具有入口区域和出口区域，并且

所述分离元件具有第一台阶和第二台阶，并且限定流体连接所述入口区域和出口区域的台阶式通道，

所述台阶式通道包括由所述主体和所述盖中的至少一个与所述第一台阶限定边界的第一通道，并且还包括由所述主体和所述盖中的至少一个与所述第二台阶限定边界的第二通道，

所述第一通道具有窄尺寸，并且流体连接所述第二通道和所述入口区域；

所述第二通道具有比所述第一通道的窄尺寸更窄的窄尺寸；

其中，从所述入口区域传向所述出口区域的颗粒能通过颗粒不具有穿过所述第一通道和所述第二通道中的任一个或两个的能力的情况而进行分离。

22.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一通道和第二通道的窄尺寸选择成使从所述入口区域传向所述出口区域的流体中的颗粒能通过颗粒具有能够穿过所述第一通道的能力以及颗粒不具有穿过所述第二通道的能力的情况而进行分离。

23.根据权利要求21所述的设备，其中，所述主体和盖中的至少一个限定与所述入口区域流体连通的流体入口端口，以便于流体在所述设备外部和所述入口区域之间流动。

24.根据权利要求21所述的设备，其中，所述主体和盖中的至少一个限定与所述出口区域流体连通的流体出口端口，以便于流体在所述设备外部和所述出口区域之间流动。

25.根据权利要求21所述的设备，其中，所述分离元件与所述主体和所述盖中的至少一个形成一体。

26.根据权利要求21所述的设备，还包括用于保持所述第一通道的窄尺寸的支撑结构，所述支撑结构位于所述第一通道中，并且沿所述第一通道的窄尺寸的方向延伸。

27.根据权利要求26所述的设备，其中，所述支撑结构与所述分离元件形成一体，并且从所述分离元件延伸离开。

28.根据权利要求26所述的设备，其中，所述支撑结构与所述主体和所述盖中的一个形成一体，并且从其延伸离开。

29.根据权利要求21所述的设备，还包括用于保持所述第二通道的窄尺寸的支撑结构，所述支撑结构位于所述第二通道中，并且沿所述第二通道的窄尺寸的方向延伸。

30.根据权利要求21所述的设备，其中，所述分离元件限定多个台阶式通道，其中每一个台阶式通道i）流体连接所述入口区域和所述出口区域，并且ii）包括由第一台阶限定边界的第一通道和由第二台阶限定边界的第二通道。

31.根据权利要求30所述的设备，其中，所述多个台阶式通道的每一个的流体路径长度基本上相等。

32.根据权利要求30所述的设备，其中，所述台阶式通道中的一个的第一通道的窄尺寸与其它台阶式通道中的至少一个的第一通道的窄尺寸不同。

33.根据权利要求30所述的设备，其中，所述台阶式通道中的一个的第二通道的窄尺寸与其它台阶式通道中的至少一个的第二通道的窄尺寸不同。

34.根据权利要求30所述的设备，其中，所述台阶式通道中的每一个包括在入口区域和第一通道之间延伸的入口通道，并且其中，所述入口通道中的每一个的流体路径长度基本相等。

35.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一通道和第二通道的几何尺寸选择成使流经所述台阶式通道的流体在所述第一通道和第二通道中的线性流速基本上相等。

36.根据权利要求35所述的设备，其中，过渡通道流体连接所述第一通道和第二通道，并且其中，所述过渡通道的几何尺寸选择成使流经所述台阶式通道的流体在所述第一通道和所述过渡通道中的线性流速基本上相等。

37.根据权利要求36所述的设备，其中，所述过渡通道为基本上矩形的通道，其中，所述过渡通道的宽度和高度的数学乘积沿所述过渡通道的从第一通道到第二通道的长度基本上恒定。

38.根据权利要求35所述的设备，其中，所述台阶式通道的所有部分的几何尺寸选择成使流经所述台阶式通道的流体的线性流速在整个台阶式通道上基本上相等。

39.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一通道和第二通道的几何尺寸选择成使所述第一通道的通流面积与所述第二通道的通流面积的比在0.5和2之间。

40.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一台阶和所述第二台阶中的每一个由所述分离元件的以直角相交的一对平面表面限定。

41.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一台阶和所述第二台阶中的至少一个由所述分离元件的以在90和180度之间的角度相交的一对平面表面限定。

42.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一台阶由所述分离元件的平面表面限定，所述平面表面与所述盖和主体中的一个间隔开等于横跨所述平面表面的所述第一通道的窄尺寸的距离。

43.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一通道和第二通道中的每一个的通流面积为矩形。

44.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一通道和第二通道中的每一个的通流面积为半椭圆形。

45.根据权利要求21所述的设备，其中，所述分离元件限定至少三个台阶，所述至少三个台阶在所述台阶式通道中沿从所述入口区域到所述出口区域的方向为依次更窄的通道限定边界。

46.根据权利要求21所述的设备，其中，所述第一通道由所述分离元件的平面表面限定边界，所述平面表面基本上平行于所述主体和所述盖中的一个的平面表面。

47.根据权利要求46所述的设备，其中，所述分离元件的平面表面的沿容积流体流方向的长度至少为所述第一台阶的窄尺寸的四倍。

48.根据权利要求46所述的设备，其中，所述平面表面沿垂直于容积流体流的方向的宽度至少为所述第一通道的窄尺寸的1000倍。

49.一种分离颗粒的方法，所述方法包括在所述设备的入口区域处引入悬浮在流体中的颗粒，其中所述设备包括主体、盖和分离元件，

所述主体和盖限定容纳所述分离元件的空间，所述空间具有入口区域和出口区域，并且

所述分离元件具有第一台阶和第二台阶，并且限定流体连接所述入口区域和出口区域的台阶式通道，

所述台阶式通道包括由所述主体和所述盖中的至少一个与所述第一台阶限定边界的第一通道，并且还包括由所述主体和所述盖的至少一个与所述第二台阶限定边界的第二通道，

所述第一通道具有窄尺寸，并且流体连接所述第二通道和所述入口区域；

所述第二通道具有比所述第一通道的窄尺寸更窄的窄尺寸；

和在所述出口区域处收集颗粒，由此将所述出口区域处的颗粒与不能进入所述第二通道的其它颗粒分离。

50.根据权利要求49所述的方法，其中，在所述颗粒在所述入口区域处引入之后，沿从所述入口区域向着所述出口区域的方向在所述台阶式通道中引起流体流。

51.根据权利要求50所述的方法，其中，流体流通过重力引起。

52.根据权利要求49所述的方法，其中，所述流体为气体。

53.根据权利要求50所述的方法，其中，流体流通过与所述入口区域流体连通的储存器中的静液压力引起。

54.根据权利要求50所述的方法，其中，流体流利用与所述入口区域和所述出口区域中的至少一个流体连通的泵引起。

55.根据权利要求54所述的方法，其中，控制通过所述泵引起的流体流的体积速率，以在泵操作过程中保持所述入口区域和出口区域之间的压降基本恒定。

56.根据权利要求49所述的方法，其中，所述颗粒为细胞。

57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述细胞悬浮于其中的流体为血液。

58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述血液为母血。

59.根据权利要求57所述的方法，其中，所述血液在将所述细胞引入所述设备之前不超过8小时取自对象。

60.根据权利要求56所述的方法，其中，所述细胞为活动细胞。

61.在包括分析流经窄通道的血样的方法中，改进之处包括在使所述血样流经所述窄通道之前不超过6小时从相应的对象收集血样。

62.根据权利要求61所述的改进，其中，所述窄通道具有不大于约100微米的窄尺寸。

63.根据权利要求61所述的改进，其中，所述窄通道具有不大于约25微米的窄尺寸。

64.根据权利要求61所述的改进，其中，所述窄通道具有不大于约10厘米的窄尺寸。

65.根据权利要求61所述的改进，包括在使所述血液流经所述窄通道之前不超过2小时从相应的对象收集血样。

66.一种确认设备适当装配的方法，所述设备包括限定空间的主体和覆盖所述空间的盖，其中，所述设备对于所述盖和由所述主体限定的空间的壁之间的距离的变化具有低公差，所述方法包括

装配盖，所述盖具有与限定所述空间的面相对的平直表面；

随后利用射线照射所述盖的平直表面；和

检测由所述盖反射或折射的射线的干涉图样，其中，所述干涉图样表示所述盖中的弯曲的位置和程度，并且允许确认所述盖的限定所述空间的面和由所述主体限定的所述空间的壁之间的距离的变化是否在适当公差内。

67.根据权利要求58所述的方法，其中所述母血是动脉血。

68.根据权利要求57所述的方法，其中所述流体选自包括动脉血和得自毛细血管上游的动脉血的流体的组。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述流体选自包括取自肝总动脉的血液、肺分泌物和支气管灌洗流体的组。

70.根据权利要求书1所述的方法，其中该设备进一步包括与空间流体连通的屏障，其中胚胎样细胞与该屏障包括的材料的相互作用不同于样品中的其它细胞。

71.根据权利要求书70所述的方法，其中胚胎样细胞能够穿过屏障。

72.根据权利要求71所述的方法，其中引起胚胎样细胞显示出侵入表现型。

73.根据权利要求72所述的方法，其中通过增加设备内的氧浓度引起胚胎样细胞显示出侵入表现型。

74.根据权利要求71所述的方法，其中屏障为包括人类胎盘的细胞外基质的成分的膜。

75.根据权利要求70所述的方法，其中该设备进一步包括由屏障限定边界并位于屏障的与该空间相对的面上的腔室，由此穿过屏障的细胞进入该腔室。

76.根据权利要求75所述的方法，其中该腔室包含吸引胚胎滋养细胞的试剂。

77.根据权利要求76所述的方法，其中该试剂为SMURF2基因产品。

78.根据权利要求76所述的方法，其中该腔室基本上完全地充以试剂。

79.根据权利要求75所述的方法，其中该腔室包含引起胚胎滋养细胞显示出增殖表现型的试剂。

80.根据权利要求75所述的方法，其中该腔室包含支持胚胎滋养细胞增殖的培养基。

81.根据权利要求80所述的方法，其中该腔室包含引起胚胎滋养细胞显示出增殖表现型的试剂。

82.根据权利要求书1所述的方法，还包括在将胚胎样细胞从样品的其它细胞分离之后将设备保持在足以支持胚胎样细胞增殖的条件下。

83.根据权利要求书1所述的方法，其中该设备的限定空间的一部分涂有特别地结合胚胎样细胞的试剂。

84.根据权利要求83所述的方法，其中该试剂包括人类细小病毒B19的VP2蛋白质。

85.根据权利要求83所述的方法，其中该试剂为空的人类细小病毒B19衣壳。

86.根据权利要求83所述的方法，其中该试剂为人类细小病毒B19的基本上纯净的VP2蛋白质。

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