MX2012006244A - Metodos y aparatos para segregacion de particulas, incluyendo segregacion y proliferacion de celulas fetales y celulas madre. - Google Patents

Abstract

La descripción se refiere a un aparato para segregar partículas con base en su capacidad para fluir a través de un conducto escalonado; por lo menos algunas de las partículas son acomodadas en un conducto limitado por un primer escalón, pero por lo menos algunas de las partículas son incapaces de pasar a través de un conducto más estrecho limitado por un segundo escalón, dando por resultado la segregación de las partículas; el aparato y métodos descritos aquí se pueden usar para segregar partículas de una amplia variedad de tipos; a manera de ejemplo, se pueden usar para segregar células similares a las fetales de una muestra de sangre materna tal como sangre arterial materna.

Description

MÉTODOS Y APARATOS PARA SEGREGACIÓN DE PARTÍCULAS, INCLUYENDO SEGREGACIÓN Y PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS FETALES Y CÉLULAS MADRE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Entre las operaciones básicas necesarias para estudiar o utilizar partículas está la capacidad para segregar diferentes tipos de partículas. Por ejemplo, innumerables aplicaciones en el campo de la biología celular requieren la capacidad de segregar células de un tipo de células de otro tipo. Las aplicaciones en el campo del manejo de residuos industriales requieren la capacidad de segregar partículas sólidas de aguas residuales o gases residuales industriales. Las aplicaciones en el campo de la agricultura y procesamiento de alimentos requiere la capacidad para separar contaminantes en partículas de productos alimenticios en partículas tales como granos.

Por ejemplo, la sangre extraída del ombligo poco después del parto ("la sangre del cordón") es una fuente rica de células madre, tales como células madre embrionarias y células madre hematopoyéticas. Las células madre hematopoyéticas son útiles para tratar trastornos de la sangre. Los métodos de almacenamiento de las muestras de sangre de cordón umbilical son conocidos. Estos métodos tienen el inconveniente de que un volumen relativamente grande (por ejemplo, de 100 a 250 mililitros) de sangre debe ser almacenado con el fin de preservar un número suficiente de células madre para su uso en futuros procedimientos médicos. El gran volumen de sangre del cordón que se almacena aumenta el costo y disminuye la conveniencia del procedimiento. El volumen almacenado podría ser disminuido significativamente (por ejemplo, a 0.1 a 1 mililitro) si las células madre podrían ser fácilmente separadas de la sangre del cordón antes de su almacenamiento. Sin embargo, los presentes métodos de separación de las células madre de sangre del cordón umbilical son caros, engorrosos y a veces ineficaces. Hay una necesidad de un método eficiente y rentable de segregar células madre de sangre de cordón umbilical.

Además, a manera de ejemplo, las células de origen aparentemente fetal (es decir, células similares a las fetales) se pueden encontrar en la sangre de mujeres embarazadas y en la sangre de mujeres que han sido previamente embarazadas. Estas células pueden tener ADN masculino cuando la madre ha dado a luz o está embarazada de un hijo varón, y por lo tanto el ADN parece originarse del feto. Estas células son raras en la sangre materna; puede haber sólo 10 a 12 células por mililitro de sangre materna. Entre las células similares a las fetales observadas en la sangre materna, los trofoblastos fetales pueden degradarse con relativa rapidez después de que la mujer da a luz. Se ha informado que otros tipos de células similares a las fetales soportan en la sangre de las mujeres durante años o décadas después del embarazo aunque sea en pequeñas cantidades. La rareza y la duración aparentemente corta de algunas células similares a las fetales pueden hacer que sean difíciles de capturar. En consecuencia, poco se sabe acerca de las células. Existe la necesidad de una manera rápida, económica y eficaz de segregar células similares a las fetales de la sangre materna. También existe la necesidad de una forma de segregar trofoblastos fetales de otras células similares a las fetales en la sangre materna.

Los dispositivos mecánicos destinados a la manipulación de las células biológicas y otras partículas pequeñas y que tienen elementos estructurales con dimensiones que van desde decenas de mieras (las dimensiones de las células biológicas) a nanómetros (las dimensiones de algunas macromoléculas biológicas) se han descrito. Por ejemplo, la patente de E.U.A. número 5,928,880, la patente de E.U.A. número 5,866,345, la patente de E.U.A. número 5,744,366, la patente de E.U.A. número 5,486,335, and la patente de E.U.A. número 5,427,946 describen dispositivos para manejar células y moléculas biológicas. La publicación de solicitud de patente de E.U.A. número WO 03/008931 describe una microestructura de para partículas, y separación, identificación, clasificación, y la manipulación celular.

El paso de sangre a través de un espacio, que se define, en una dimensión en mieras, presenta desafíos. Las fuerzas de presión tipo marea que tienden a alterar la integridad celular y la obstrucción potencial del espacio del paso debido al "empaquetamiento" de las células deben ser tomadas en cuenta. Esto también se complica por la tendencia a que la sangre se coagule (a manera de cascada) si la integridad celular se ve comprometida. Además, se sabe que las partículas grandes (células, células aglomeradas, materiales extracelulares, y "residuos" mal caracterizados en muestras biológicas pueden obstruir los conductos de fluido de los dispositivos anteriores, inhibiendo su eficiencia y funcionamiento.

El tema descrito aquí se puede utilizar para segregar y manipular las células biológicas, organelos y otras partículas de poblaciones mixtas de partículas o células.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente descripción se refiere a un aparato para segregar partículas tales como células. El aparato incluye un cuerpo, una cubierta, y un elemento de separación. El cuerpo y la cubierta definen un hueco. El elemento de separación está contenido dentro del hueco. El hueco tiene una región de entrada de fluido y una región de salida de fluido. El elemento de separación tiene una forma que define un conducto escalonado que conecta fluidamente las regiones de entrada y salida en el hueco. El elemento de separación incluye un primer escalón y un segundo escalón, cada uno de los cuales se extiende en el conducto escalonado. El conducto limitado por el segundo escalón es más estrecho que el conducto limitado por el primer escalón. Cuando un fluido que incluye partículas está presente en la región de entrada, el líquido puede fluir desde la región de entrada, a través del primer conducto, a través del segundo conducto, y hacia la región de salida. Las partículas suspendidas en el líquido pueden transitar por el primer y segundo conductos si el tamaño de las partículas no excede la dimensión estrecha de cada conducto, o si las partículas son suficientemente deformables que, en una forma deformada, pueden pasar a través de cada conducto. Las partículas pueden ser segregadas al seleccionar una dimensión estrecha para el segundo conducto que permite que sólo algunas de las partículas pasen a través del mismo. La dimensión estrecha del primer conducto se puede seleccionar de tal manera que las partículas en el fluido puedan pasar a través del primer conducto individualmente, pero dos partículas no pueden pasar a través del primer conducto simultáneamente si están apiladas a través de la dimensión estrecha del primer conducto.

El aparato puede incluir un puerto de entrada de fluido para facilitar el flujo de fluido desde el exterior del aparato en la región de entrada, un puerto de salida de fluido para facilitar el fluido de la región de salida al exterior del aparato, o ambos. Un dispositivo de desplazamiento de fluido (por ejemplo, una bomba o un depósito alimentado por gravedad puede ser conectado de forma fluida con uno o ambos de los puertos de entrada y salida para facilitar el flujo de fluido a través del conducto escalonado. Dicho flujo puede estar en la dirección desde la región de entrada hacia la región de salida, para el propósito de segregar partículas. El flujo de fluido puede estar en la dirección desde la región de salida hacia la región de entrada, por ejemplo, para eliminar las partículas que no puedan atravesar el segundo conducto durante el flujo de fluido de la región de entrada a la región de salida.

Los escalones del elemento de separación definen conductos dentro del conducto escalonado, y puede haber dos o más de estos escalones. Los escalones pueden ser formados a partir de regiones planas que se unen en un ángulo recto (formando escalones de ángulo recto clásicos), o la porción vertical (es decir, la cara de transición) del escalón puede estar inclinado, de modo que una primera región de escalón plana puede ser conectada a una segunda región de escalón plana por una superficie plana inclinada o por una superficie curva. Las regiones de escalón plano pueden ser sustancialmente paralelas a una porción de la cubierta, una porción del cuerpo, o ambas, y debe tener una longitud (en la dirección del flujo de fluido volumétrico) igual a un múltiplo (por ejemplo, 2, 4, 10 ó 1000) de la dimensión estrecha del conducto al que se une. El ancho de la región plana (en la dirección perpendicular al flujo de fluido volumétrico) debe ser igual a un múltiplo (por ejemplo, 10, 1000 ó 10000) de la dimensión estrecha del conducto al que se une.

El aparato puede tener uno o varios soportes dentro del hueco para mantener las dimensiones del conducto escalonado durante el ensamble y funcionamiento del dispositivo. El soporte puede abarcar completamente la distancia entre el elemento de separación del cuerpo o la cubierta o se puede abarcar sólo una porción de esa distancia, para proveer espacio para la deformación de un elemento (por ejemplo, en el ensamble y fijación del aparato).

La presente descripción incluye un método de segregación de partículas. El método incluye introducir partículas en la región de entrada del aparato, permitiendo que se muevan (es decir, por la motilidad celular endógena o bajo la influencia del flujo de fluido inducido) a través de un conducto a una región de salida. Al menos algunas de las partículas se impide que entren en la región de salida por un escalón en el conducto, lo que resulta en la segregación de las partículas. Las partículas capaces de atravesar todos los escalones en el conducto escalonado se pueden recoger de la región de salida. Las partículas que no pueden atravesar al menos un escalón en el conducto escalonado se pueden recoger de una porción del conducto corriente arriba del escalón que inhibe su movimiento a través del conducto. Por ejemplo, las partículas atrapadas se pueden recuperar mediante la inserción de un dispositivo (por ejemplo, un catéter) en el conducto, invirtiendo el flujo de fluido y lavando las células atrapadas fuera del conducto a través de la región de entrada, o desensamblando el dispositivo y recuperando las partículas atrapadas directamente. Si las partículas atrapadas son las células, pueden ser lisadas en el conducto escalonado y los productos de lisis recogidos por el flujo en cualquier dirección.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La breve descripción anterior, así como la siguiente la descripción detallada de la invención, se comprenderá mejor cuando se lean junto con los dibujos anexos. Estos dibujos se incluyen con el propósito de ilustrar la descripción. La descripción no se limita a las disposiciones e instrumentaciones precisas mostradas.

La figura 1A es una vista en elevación de una porción del aparato en una modalidad. La figura 1 B es una sección vertical de la porción del aparato mostrado en la figura 1A, tomada a lo largo del plano 1 B, que muestra un cuerpo 10 que define un hueco 11. Una cubierta 12 está dispuesta a través del hueco 11 formando un sello hermético a los fluidos con el cuerpo 10. Un elemento de separación 14 que tiene un primer escalón 61 y un segundo escalón 62 está dispuesto dentro del hueco 11 entre un puerto de entrada 16 y un puerto de salida 18. El primer escalón 61 tiene una superficie ancha 31 y una cara de transición 41. El segundo escalón 62 tiene una superficie ancha 32 y una cara de transición 42.

La figura 2A es una vista elevada de una porción del aparato en una modalidad que tiene estructuras de soporte internas 20. La figura 2B es una sección vertical de la porción del aparato mostrado en la figura 2A, tomada a lo largo del plano 2B. La figura 2C es una sección vertical de una porción del aparato mostrado en la figura 2A, tomada a lo largo del plano 2C.

Las figuras 3A y 3B ilustran una configuración del aparato descrito aquí en el que la geometría de primer y segundo conductos puede ser seleccionada para alcanzar la velocidad de flujo lineal sustancialmente constante a lo largo de primer y segundo conductos. La figura 3A es una vista elevada de una serie de conductos en donde el ancho de cada conducto aumenta en la dirección desde la región de entrada a la región de salida. La figura 3B es una sección vertical de la serie de conductos mostrados en la figura 3A tomada a lo largo del plano 3B, en donde la altura de cada conducto disminuye en la dirección desde la región de entrada a la región de salida.

La figura 4 es una vista en perspectiva de una porción de un elemento de separación que muestra la longitud ?", altura "h", y ancho "w" de un escalón, y que indica la dirección de flujo de fluido volumétrico "BFF" más allá del escalón.

La figura 5 es una imagen en color que muestra una vista en elevación de la cubierta 12 de un aparato ensamblado, que muestra el patrón de luz en un aparato adecuadamente ensamblado, como se describe aquí en el ejemplo 2.

La figura 6 es un diagrama que ilustra las disposiciones relativas de la cubierta 12, la base 10, y primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo y octavo escalones (61-68) del elemento de separación 14 de un aparato usado, en los experimentos aquí descritos en los ejemplos 3 y 4. La dirección del flujo de fluido se muestra como "D. ' La figura 7 es un mapa que muestra los lugares aproximados dentro de la región de separación de los experimentos aquí descritos en el ejemplo 4 en la cual se encuentran las células similares a las fetales. La porción de la posición vertical relativa designada "área de salida" corresponde aproximadamente a la porción del cásete en la que se localizan los escalones que tienen distancias de cubierta a escalón de 4.2 y 4.4 mieras, y la porción de la posición vertical relativa designada "área de entrada "corresponde aproximadamente a la porción del cásete en la que se localizan los escalones que tienen distancias de cubierta a escalón de 5.2 y 5.4 mieras.

La figura 8A es una vista en elevación de una modalidad de una porción de membrana 81 , la figura 8B es una vista ampliada de la porción de la sección vertical de la membrana 81 de la figura 8A, tomada a lo largo del plano 8B. En esta modalidad particular, la membrana 81 es porosa y recubierta en un lado, por lo tanto, la figura 8B muestra poros 82 que se extienden a través de la membrana 81 y el revestimiento 83. En la modalidad mostrada en la figura 8, el recubrimiento 83 se aplica a una cara de la membrana 81 , pero no la otra cara, no se extiende en los poros 82, y no llena los poros 82.

La figura 9A es una sección vertical, tomada a lo largo del plano 9A, de un dispositivo del tipo mostrado en la figura 2A y que incluye una membrana 81 interpuesta entre el cuerpo 10 y la cubierta 12. Soportes internos 20 ayudan al desplazamiento nivelado y uniforme de la membrana 81 dentro del dispositivo. Los soportes internos 20 también ayudan a definir el hueco 1 1 , y proveen control sobre el tamaño del hueco 11.

Listado de componentes 10 cuerpo 1 1 hueco 12 cubierta 14 elemento de separación región de entrada puerto de entrada región de salida puerto de salida soporte superficie ancha del primer escalón superficie ancha del segundo escalón cara de transición del primer escalón cara de transición del segundo escalón primer conducto segundo conducto primer escalón segundo escalón tercer escalón cuarto escalón quinto escalón sexto escalón séptimo escalón octavo escalón empaque membrana u otra barrera poros (a través de membrana 81) revestimiento (de membrana 81) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción se refiere a un aparato para segregar las partículas sobre la base de su capacidad para atravesar un conducto. Las partículas (por ejemplo, partículas suspendidas en un fluido líquido o gaseoso o de partículas en el vacío) se mueven a través de un conducto escalonado definido por un elemento de separación en el aparato. El conducto escalonado contiene al menos dos conductos que están conectados en serie de forma fluida, cada conducto teniendo una dimensión estrecha. La mayoría o todas las partículas en el fluido son capaces de moverse en el primer conducto, pero sólo algunas de las partículas son capaces de moverse a través del segundo conducto. El resultado neto es que algunas partículas pueden moverse a través del conducto escalonado completo, mientras que otras partículas son retenidas dentro del aparato, tal como dentro del primer conducto. Por lo tanto, se obtiene la segregación de partículas. El movimiento de las partículas puede estar motivado, por ejemplo, por el flujo de fluido, la gravedad, vibración, o cualquier combinación de éstos.

Una membrana u otra barrera semi-permeable o penetrable se pueden usar en combinación con el aparato para segregar partículas capaces de atravesar la barrera de partículas que no pueden, menos capaces, o menos rápidamente capaces de atravesar la barrera. En esta modalidad, el aparato se puede utilizar para segregar partículas tanto sobre la base de su capacidad para atravesar el conducto como su capacidad para atravesar la membrana. Una o más porciones del aparato (incluyendo la membrana) puede ser revestida con un reactivo que se une específicamente con las partículas de interés para mejorar la recuperación, la segregación, o ambas, de las partículas deseadas.

Definiciones Como se usa aquí, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con el mismo en esta sección.

Como se ilustra para los escalones rectangulares en la figura 4, la "longitud" de un escalón (o del conducto limitado por el escalón; " en la figura 4) se refiere a la distancia que el escalón se extiende en la dirección del flujo de fluido volumétrico a través del conducto correspondiente al escalón.

Como se ilustra para los escalones rectangulares en la figura 4, la "altura" de un escalón ("h" en la figura 4) se refiere a la distancia que el escalón se extiende en la dirección en alejamiento del elemento de separación más allá de la superficie del escalón anterior (es decir, corriente arriba).

Como se ilustra para los escalones rectangulares en la figura 4, el "ancho" de un escalón (o del conducto limitado por el escalón; "w" en la figura 4) se refiere a la distancia que el escalón se extiende en la dirección que es perpendicular al flujo de fluido volumétrico sobre el escalón.

La "dimensión estrecha" de un conducto se refiere a la distancia entre la porción ancha de un escalón del elemento de separación y la cara opuesta, generalmente paralela, del aparato (por ejemplo, la cara de la cubierta o cuerpo que se mira al hueco). Por ejemplo, para un conducto que tiene una sección transversal rectangular en un plano tomada perpendicular a la dirección del flujo de fluido volumétrico a través del conducto, la dimensión estrecha de conducto es la longitud de una línea en ese plano que se extiende entre y en ángulos rectos con cada uno de la superficie plana del escalón y la superficie plana de la cara opuesta del aparato. Además a modo de ejemplo, la "dimensión estrecha" de cada uno de los conductos 51 y 52 en la figura 1B es la distancia mínima entre cada una de las superficies del escalón 31 y 32 y la superficie más cercana de la cubierta 12.

El "área de flujo" de un conducto es una sección transversal del conducto tomada en un plano perpendicular a la dirección del flujo de fluido en el conducto.

Descripción detallada La descripción se refiere a un aparato para segregar partículas sobre la base de su capacidad de fluir a través de al menos dos conductos, el segundo (corriente abajo) conducto 52 siendo más estrecho que el primer (corriente arriba) conducto 51. El aparato incluye un elemento de separación 14 dispuesto en un hueco 11 formado por un cuerpo 10 y cubierta 12. Dentro del hueco 11 , el elemento de separación 14 separa una región de entrada 15 del hueco de una región de salida 17 del hueco. Las regiones de entrada y salida están en comunicación de fluido por medio de un conducto escalonado definido por el elemento de separación 14 y uno o ambos del cuerpo 10 y cubierta 12. Los escalones formados en el elemento de separación definen el primer y segundo conductos. El aparato tiene opcionalmente un puerto de entrada 16 que comunica fluidamente con la región de entrada 15 del hueco 11 y un puerto de salida 18 que comunica fluidamente con la región de salida 17 del hueco 11 , para facilitar el suministro y retiro del fluido a las regiones de entrada y salida.

En una modalidad, el aparato incluye una membrana u otra barrera 81 que está en comunicación de fluido con el hueco 11 y que es selectivamente permeable a partículas de un tipo deseado, en relación con partículas de otro tipo. Alternativamente, la membrana u otra barrera 81 pueden tener unido a la misma un reactivo que se une selectivamente con partículas de un tipo deseado, en relación a las partículas de otro tipo. En un aparato que incluye tanto el elemento de separación 14 como una membrana u otra barrera 81 , el elemento de separación y de la membrana u otra barrera 81 se pueden seleccionar para mejorar la segregación del tipo de partícula mismo (es decir, los dos elementos mejoran la segregación de las partículas deseadas) o diferentes tipos de partículas (es decir, los dos elementos que promueven la segregación de múltiples tipos de partículas a partir de mezclas de partículas, incluyendo el uno del otro).

Durante el funcionamiento, las partículas en la región de entrada 15 pasan al primer conducto 51 y, si son capaces, en el segundo conducto 52. Las partículas en el segundo conducto 52 pasan a la región de salida 17. Las células que no son capaces de pasar a o a lo largo del segundo conducto 52 o alcanzan la región de salida 17. De este modo, las partículas son capaces de alcanzar la región de salida 17 son segregadas de partículas que no son capaces de alcanzar la región de salida 17. Las dos poblaciones de partículas puede ser recuperadas por separado del aparato. Por ejemplo, las partículas en la región de salida 17 pueden ser recuperadas en una corriente de líquido retirado de la región de salida 17 (por ejemplo, por medio de un orificio de salida o por medio de un catéter insertado en la región de salida 17. Las partículas incapaces de pasar a través del segundo conducto 52 a la región de salida 17 se pueden recuperar lavándolas, en la dirección inversa, a través del primer conducto 51 y hacia la región de entrada 15. Tales partículas pueden ser retiradas de la región de entrada 15. Alternativamente, las partículas que no pueden pasar a través del segundo conducto 52 a la región de salida 17 se puede dejar en el aparato o pueden ser recuperadas al desensamblar el aparato. Las partículas que no pueden entrar ya sea al primer conducto 51 o al segundo conducto 52 pueden ser recuperadas de la región de entrada 15.

El aparato aquí descrito puede ser usado en una amplia variedad de aplicaciones. Además de segregar las partículas de una población mixta de partículas, el dispositivo puede ser usado en aplicaciones en las que una o más poblaciones de partículas segregadas son, por ejemplo, identificadas o manipuladas adicionalmente. La construcción y funcionamiento del aparato se resisten a la obstrucción por las partículas que son segregadas, en relación con los dispositivos previamente utilizados para la separación de las partículas. Ventajosamente, las partículas segregadas pueden ser suspendidas en un fluido líquido o gaseoso, o en ningún fluido en absoluto (por ejemplo, en un vacío). Además, cualquier fluido en el que las partículas son suspendidas, puede fluir a través del aparato o permanecer estático. Es decir, las partículas pueden ser segregadas independientemente de si cualquier fluido en el cual son suspendidas se hace mover a través de los espacios del aparato. Por lo tanto, por ejemplo, las partículas en una mezcla de partículas secas pueden ser segregadas por proveer la mezcla a la región de entrada y vibrando o agitando el dispositivo (orientado de tal manera que la gravedad tienda a sacar las partículas a través de la región de separación). Dicho uso puede ser beneficioso en situaciones en las que la suspensión de partículas en un líquido se considera indeseable o innecesario (por ejemplo, al separar las semillas de plantas de otras partículas, tales como semillas de otras plantas).

Partes y porciones del aparato se describen ahora con mayor detalle por separado.

El cuerpo y la cubierta El aparato tiene un cuerpo 10 y una cubierta 12 que definen un hueco 1 1 entre los mismos. Una porción del hueco 11 , definido en parte por el elemento de separación 14, es un conducto escalonado. El conducto escalonado también está definido por una superficie del cuerpo 10, una superficie de la cubierta 12, o por una combinación de éstos, que se opone a la superficie(s) escalonada 31 y 32 del elemento de separación 14 (es decir, en una orientación tal que la superficie(s) que definen el conducto escalonado del cuerpo 10 y/o cubierta 12 hacen contacto con la superficie(s) que definen el conducto escalonado del elemento de separación 14 de tal manera que las superficies forman un lumen extendido (es decir, el conducto escalonado) entre las superficies. Con el fin de simplificar la construcción del aparato, la mayoría o todas las superficies que definen el conducto escalonado se pueden formar o maquinar a un elemento de separación 14 que es una parte integral formada en una depresión de la cubierta 12 o el cuerpo 10, la porción en depresión siendo rodeada por una superficie plana, por lo que la superficie opuesta del cuerpo 10 o la cubierta 12 sólo necesita ser otra superficie plana a fin de formar el conducto escalonado al contacto entre las superficies planas del cuerpo 10 y la cubierta 12.

El elemento de separación 14 es preferiblemente integral con (formado o maquinado como una parte de) uno del cuerpo 10 y la cubierta 12. En esta modalidad, la porción operativa del aparato consiste esencialmente de dos piezas - ya sea una cubierta 12 y un cuerpo 10 que tiene un elemento de separación 14 como una parte del mismo, o un cuerpo 10 y una cubierta 12 que tiene un elemento de separación 14 como una parte del mismo. No es importante cual del cuerpo 10 y cubierta 12 porta el elemento de separación 14, porque el cuerpo 10 y la cubierta 12 forman las paredes de y definen el hueco 11 en el cual el elemento de separación 14 está dispuesto. Preferiblemente, una porción de la parte no porta el elemento de separación 14 es simplemente una superficie plana que se acopla con bordes planos de la parte que porta el elemento de separación 14 y que tiene el hueco 11 en el mismo, de modo que al ensamblar las dos partes, el hueco 11 es sellado por el acoplamiento de las superficies planas y el elemento de separación 14 está dispuesto dentro del hueco 11 así sellado. En esta modalidad, una de las partes tiene tanto el hueco como el elemento de separación 4 formados o maquinados en el mismo o, alternativamente, tiene el hueco 11 formado o maquinado en el mismo y tiene el elemento de separación 14 colocado, ensamblado, formado o adherido dentro del hueco 11.

Las formas del cuerpo 10 y la cubierta 12 no son críticos, excepto por la porción(es) del cuerpo 10 y/o cubierta 12 que definen el conducto escalonado en el hueco 11 y la porción(es) del cuerpo 10 y cubierta 12 que se acoplan para sellar el hueco 11. Los requerimientos de la porción(es) del cuerpo 10 y/o la cubierta 12 que definen el conducto escalonado se discuten en la sección de esta descripción correspondiente al conducto escalonado. La porción(es) del cuerpo 10 y cubierta 12 que se acoplan para sellar el hueco 1 no tienen ningún requerimiento de forma y lugar particular, distinto del que debería sellar el hueco 11 cuando el aparato es ensamblado, con asignaciones para cualesquiera orificios (por ejemplo, los puertos de entrada o salida) que estén delimitados por lo tanto por el cuerpo 10 y la cubierta 12. El sellado se puede lograr por contacto directo entre las porciones pertinentes del cuerpo 10 y la cubierta 12. De forma alternativa o adicionalmente, selladores tales como adhesivos, grasas, juntas, ceras, y similares se pueden aplicar sobre las superficies de sellado del cuerpo 10 y cubierta 12. El sello debe ser capaz de resistir la presión interna prevista generada dentro del aparato durante su funcionamiento. Por ejemplo, en muchas modalidades, una presión interna del fluido mayor de 11.35 kg por cada 6.45 cm2 de presión manométrica (kg/cm2 manométrico) sería inusual, y un sello capaz de impedir fugas de líquido a esta presión debe ser suficiente para dichas modalidades. Presiones de operación más típicas en modalidades en las que las células biológicas son separadas usando el aparato se prevé que estén dentro del intervalo > 0 ~ 1.0545 kg/cm2. En algunas modalidades, el aparato puede ser operado mediante la aplicación de presión negativa (es decir, vacío) a la región de salida, en cuyas modalidades el sello debe impedir que el conducto de aire o líquido salga del dispositivo hacia el hueco (distinto, desde luego, por medio de la región de entrada).

El tamaño y forma de las porciones restantes del cuerpo 10 y cubierta 12 no son críticos y pueden ser seleccionados para facilitar, por ejemplo, la fabricación, manipulación, o el funcionamiento del aparato. A modo de ejemplo, para un aparato que tiene una cubierta sustancialmente plana 12 (por ejemplo, como un cubreobjetos para una platina de microscopio), el cuerpo 10 puede tener el hueco 11 y elemento de separación 14 formados o maquinados en el mismo, y porciones del cuerpo 10 fuera del hueco 11 se pueden forma o maquinar para adaptar el cuerpo 10 para asegurarlo en un bastidor o soporte de geometría fija. Así, por ejemplo, el cuerpo 10 puede tener rebordes, manijas, agujeros roscados, agujeros suaves, impresiones o muescas para sujetar una abrazadera u otras características formada, aplicada o maquinadas en los mismos o sobre los mismos, y dichas características pueden facilitar la orientación reproducible del cuerpo 10 en un dispositivo para el funcionamiento del aparato o la orientación reproducible del cuerpo 10 en un dispositivo para el mecanizado de una o ambas del hueco 11 y el elemento de separación 14 en el cuerpo 10.

El cuerpo 10, la cubierta 12, o ambos pueden definir un puerto a través del cual el fluido puede ser introducido en o retirada del hueco 11. Por ejemplo, el cuerpo 10 puede definir un puerto de entrada 16 que comunica fluidamente con la región de entrada 15. Fluido introducido en el puerto de entrada 16 puede fluir en la región de entrada 15, desplazando fluido ya allí (porque el vacío está sellado) en el conducto escalonado, y desde allí hacia el primer conducto 51 y el segundo conducto 52 y hacia la región de salida 17. Las partículas suspendidas en el fluido en una de estas regiones y conductos se pueden llevar en una región o conducto corriente abajo, siempre que la partícula pueda fluir a través de los conductos y regiones presentes e intermedios. De manera similar, el retiro de fluido desde la región de salida 17 por medio de un puerto de salida 18 formado en el cuerpo 10 puede inducir el flujo de fluido desde conductos en comunicación fluida con la región de salida 17 y de los conductos y regiones en comunicación de fluido con los mismos.

Los puertos pueden ser simples agujeros que se extienden a través de la cubierta o el cuerpo, o pueden tener accesorios (rebabas, anillos, centros u otros accesorios) asociados con ellos para facilitar la conexión de un dispositivo de flujo de fluido hacia el puerto. El cuerpo 10, la cubierta 12, o ambos pueden definir un puerto de entrada 16 en la región de entrada 15 del hueco 11 , un puerto de salida 18 en la región de salida 17 del hueco 11 , o tanto un puerto de entrada 16 como un puerto de salida 18. El fluido puede ser introducido en la región de entrada 15 a través del puerto de entrada 16. El fluido puede ser retirado de la región de salida 17 a través del puerto de salida 18. La introducción continua de fluido hacia la región de entrada 15 y retiro simultáneo o emisión de fluido de la región de salida 17 puede crear un flujo continuo de fluido a través del aparato. De manera similar, el retiro continuo de líquido de la región de salida 17 y la afluencia o introducción simultánea de fluido hacia la región de entrada 15 puede crear un flujo continuo.

El hueco El cuerpo 10 y la cubierta 12 forman un hueco 11 cuando se ensamblan. El hueco 11 tiene una región de entrada 15, una región de salida 17, y una región de separación interpuesta entre la región de entrada 15 y la región de salida 17. Un elemento de separación 14 está dispuesto dentro de la región de separación y, junto con el cuerpo 10, la cubierta 12, o ambos, definen un conducto escalonado. El conducto escalonado incluye al menos un primer conducto 51 y un segundo conducto 52, que están fluidamente conectados en serie y que están definidos por escalones en el elemento de separación 14. El conducto escalonado puede incluir cualquier número de escalones adicionales, cada uno de los cuales puede definir un conducto adicional en el hueco.

Durante el funcionamiento del dispositivo, por lo menos la región de entrada 15, la región de salida 17, y el conducto escalonado del hueco 11 se llenan con un fluido. Preferiblemente, el hueco entero 1 1 se llena con fluido durante el funcionamiento. En una modalidad, la única trayectoria de fluido que conecta la región de entrada 15 y la región de salida 17 es el conducto escalonado. Las partículas presentes en la región de entrada 15 pueden entrar y pasar a través del primer conducto 51 del conducto escalonado a menos que se excluyan por el tamaño (es decir, la dimensión estrecha) o la forma del primer conducto 51. Las partículas presentes en el primer conducto 51 pueden entrar al segundo conducto 52 a menos que se excluyan por el tamaño (es decir, la dimensión estrecha) o la forma del segundo conducto 52, o a menos que su movimiento a través del primer conducto 51 sea inhibida por el tamaño (es decir, la dimensión estrecha) o la forma del primer conducto 51. Las partículas presentes en el segundo conducto 52 pueden entrar a la región de salida 17 a menos que su movimiento a través del segundo conducto 52 sea inhibido por el tamaño (es decir, la dimensión estrecha) o la forma del segundo conducto 52. El movimiento de las partículas dentro del aparato puede ser inducido por el flujo de fluido a través del aparato, por la motilidad intrínseca de las células, o una combinación de los dos. Con el tiempo, las partículas que no pueden entrar en el primer conducto 51 se segregarán en la región de entrada 15; las partículas capaces de entrar al primer conducto 51 pero que no pueden entrar en el segundo conducto 52 (o para moverse libremente a través del primer conducto 51 ) se segregarán en el primer conducto 51 ; las partículas capaces de entrar al segundo conducto 52 pero incapaces de moverse libremente a través del mismo se segregan en el segundo conducto 52; y las partículas capaces de moverse a través de tanto el primer conducto 51 como el segundo conducto 52 se segregarán en la región de salida 17 (o en el líquido retirado o emitido desde la región de salida 17).

Las partículas segregadas de esta manera se pueden recuperar (usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos, incluyendo algunos aquí descritos) a partir de sus lugares respectivos. A manera de ejemplo, un catéter puede ser insertado en una región o conducto (por ejemplo, la región de entrada 15 o el primer conducto 51) del aparato, y las partículas presentes en el mismo pueden ser retiradas mediante la inducción de succión en el lumen del catéter. Además, a manera de ejemplo, el retroflujo (es decir, el flujo de fluido desde la región de salida 17 en la dirección de la región de entrada 15) se puede utilizar para recoger las partículas presentes en una o más de la región de entrada 15, el primer conducto 51 , y el segundo conducto 52 en el líquido recogido, retirado, o emitida en la región de entrada 15. Además, a manera de ejemplo, las partículas presentes en la región de entrada 15 pueden ser recogidas por un flujo de fluido transversal (con relación al flujo de fluido volumétrico de la región de entrada 15 a la región de salida 17 por medio del conducto escalonado) a través de la región de entrada 15, utilizando los puertos previstos para este propósito en comunicación de fluido con la región de entrada 15.

El elemento de separación Situado en el hueco 11 definido por el cuerpo 10 y la cubierta 12 y entre la región de entrada 15 y la región de salida 17 del hueco 11 , el elemento de separación 14 es una parte del aparato que tiene una superficie que define parte del conducto escalonado. Uno o ambos del cuerpo 10 y la cubierta 12 definen los límites restantes del conducto escalonado, que conecta fluidamente la región de entrada 15 y la región de salida 17. El elemento de separación 14 tiene una forma que incluye al menos dos escalones, los escalones formando por lo menos uno de los límites de cada uno del primer conducto 51 y el segundo conducto 52. Uno o ambos del cuerpo 10 y la cubierta 12 definen los límites restantes del primer conducto 51 y el segundo conducto 52.

El conducto escalonado es el orificio a través del cual las partículas se mueven, el fluido fluye, o ambos, durante el funcionamiento del aparato. El elemento de separación 14 tiene una estructura escalonada, que define la forma escalonada de al menos un lado del conducto escalonado. El elemento de separación 14 tiene al menos dos escalones, el primer escalón 61 y el segundo escalón 62. El primer escalón 61 define un límite del primer conducto 51 en el conducto escalonado. El segundo escalón 62 define un límite del segundo conducto 52, el segundo conducto 52 teniendo una dimensión menor estrecha (véase, por ejemplo, la Figura 2B) que el primer conducto 51. El primer y segundo conductos están fluidamente conectados en serie, el segundo conducto 52 estando corriente abajo del primer conducto 51 durante el funcionamiento normal del aparato. El fluido debe fluir a través de cada uno del primer y segundo conductos en el conducto escalonado con el fin de viajar desde la región de entrada 15 a la región de salida 17 cuando el aparato es ensamblado El elemento de separación 14 está asociado con al menos uno del cuerpo 10 y la cubierta 12. El elemento de separación 14 se puede unir a la superficie del cuerpo 10 o la cubierta 12. El elemento de separación 14 más bien puede ser integral con un cuerpo uno del cuerpo 10 o la cubierta 12, de tal manera que cuando el cuerpo 10 y la cubierta 12 son ensamblados, la superficie(s) escalonada del elemento de separación 14 se llevan a oposición con la superficie (s) del cuerpo 10 o la cubierta (12) que forman los límites de la vía de conducto escalonado. Alternativamente, el elemento 14 de separación puede ser una parte separada de la cubierta 12 o del cuerpo 10. Si el cuerpo 10, la cubierta 12, y el elemento de separación 14 son partes separadas, entonces las partes son preferiblemente dimensionadas y configuradas de tal manera que el elemento de separación 14 se mantiene en su lugar por compresión entre la cubierta 12 y el cuerpo 0 cuando el aparato es ensamblado.

Las presiones de fluido dentro del aparato (por ejemplo, en el segundo pasaje 52) son ejercidas sobre todas las superficies en contacto por el fluido, y dichas presiones de fluido pueden inducir flexión o abultamiento en materiales deformables. Además, la presión externa aplicada a las partes del aparato con el fin de asegurarlo en su estado ensamblado (por ejemplo, una o más abrazaderas que empujan la cubierta 12 contra las porciones del cuerpo 10) también pueden inducir flexión o abultamiento en materiales flexibles que forman un o más partes del aparato. Debido a que el segundo conducto 52 definido por el elemento de separación 14 y al menos uno del cuerpo 10 y la cubierta 12 es el principal mecanismo por el cual las partículas son segregadas por el aparato en funcionamiento, es preferible que la dimensión estrecha del segundo conducto 52 sea cuidadosamente mantenida relativamente constante a través de la anchura del segundo escalón 62.

A manera de ejemplo, el segundo conducto 52 tiene límites definidos por el segundo escalón 62 del elemento de separación 14 y por uno o ambos del cuerpo 10 y la cubierta 12. La sujeción del cuerpo 10 y la cubierta 12 juntos pueden ejercer una fuerza externa sobre una parte que forma un límite del segundo conducto 52, tendiendo así a inducir flexión de la parte y estrechamiento de la dimensión estrecha del segundo conducto 52. Dicha flexión y estrechamiento pueden reducirse o eliminarse mediante la inclusión de uno o más soportes 20 dentro del lumen del segundo segundo conducto 52. Un soporte 20 puede ser, por ejemplo, una extensión en forma de varilla que se extiende desde la superficie del elemento de separación 14 que define el límite del segundo conducto 52 en la dirección de la superficie opuesta del cuerpo 10 o la cubierta 12. Alternativamente, una extensión que tiene una sección transversal rectangular se puede extender fuera de la superficie del cuerpo 10 o la cubierta 12 que define un límite del segundo conducto 52 en la dirección de la superficie opuesta del elemento de separación 14 puede formar un soporte 20. Más de un soporte 20 pueden estar dispuestos en paralelo o en serie para formar una o más paredes sólidas o segmentadas, y estos soportes pueden definir múltiples trayectorias de flujo dentro del hueco, las trayectorias de flujo múltiple se fusionan en uno o ambos de sus extremos. Como tercera alternativa, un soporte 20 puede ser una parte discreta dispuesta en el lumen del segundo conducto 52 y extiende sustancialmente o completamente la dimensión estrecha entre las superficies opuestas del elemento de separación 14 y el cuerpo 10 o la cubierta 12. La incidencia del soporte 20 sobre la superficie del elemento de separación 14 que define el segundo conducto 52, sobre la superficie del cuerpo 10 o la cubierta 12 que define el segundo conducto 52, o sobre ambas superficies, los límites o detiene la flexión de las superficies, manteniendo la dimensión estrecha a un valor sustancialmente igual o mayor que el espesor del soporte 20 (por ejemplo, para evitar que la cubierta 12 deprima por completo contra la superficie ancha 32 del segundo escalón 62 y reduciendo la dimensión estrecha de la segundo conducto 52 por debajo del valor deseado).

Los soportes 20 sujetan las partes del aparato en su conformación apropiada, incrementando la estabilidad dimensional del aparato. Al aumentar la estabilidad dimensional, los soportes 20 pueden mejorar la operatividad del aparato bajo diferentes condiciones de operación (por ejemplo, con diferentes presiones de sujeción, o con diferentes presiones de fluido) y extienden la vida útil del aparato. Los soportes 20 también puede mejorar la exactitud de segregación de partículas del aparato evitando que el cuerpo 10 o cubierta 12 se deforme y altere las dimensiones estrechas de uno o más del primer y segundo conductos del conducto escalonado. Los soportes 20 también puede estar dispuestos en el hueco 11 fuera del primer y segundo conductos, y abarcar la altura del hueco. Dichos soportes 20 pueden mantener la patencia del hueco 11 fuera del primer y segundo conductos. En donde un suporte 20 no es integral con una superficie incidida por el soporte 20, el suporte 20 no puede estar unido a la superficie, adherido a la superficie (por ejemplo, usando un adhesivo interpuesto entre la unión y que se une tanto a la superficie como a una porción del soporte), o fusionado con la superficie.

Los soportes 20 pueden separar una trayectoria de flujo de fluido de otra manera unitaria hacia dos o más trayectorias de flujo de fluidos dentro del hueco 11 (véase, por ejemplo, los soportes 20 en la figura 2A). En una modalidad ilustrada en las figuras 2A-2C, el aparato consta de una cubierta plana 12, un cuerpo 10 que tiene una superficie plana que se acopla con la cubierta 12 y que define un hueco 11 que tiene una región de entrada 15 y una región de salida 17, y un elemento de separación 14 que incluye un primer escalón 61 y un segundo escalón 62 y es integral con cuatro soportes 20. Cuando el elemento de separación 14 está dispuesto en el hueco 11 entre la región de entrada 15 y la región de salida 17, la altura de los soportes 20 es igual a la profundidad del hueco 11, de tal manera que las superficies superiores del soportes 20 son sustancialmente co-planares con la superficie plana del cuerpo 10 (como se ilustra en la figuras 2B y 2C). Cuando la cubierta 12 es ensamblada contra la superficie plana del cuerpo 10, las superficies superiores de los soportes 20 hacen contacto con la superficie de la cubierta 12 que define el hueco 11 , evitando así que la presión de sujeción (aplicada a la cubierta 12 para sostenerla al ras contra la superficie plana del cuerpo 10) deforme la cubierta 12. L sujeción provista a la cubierta 12 por los soportes 20 sirve para mantener la dimensión estrecha del segundo conducto 52 y la dimensión estrecha del primer conducto 51 , aun cuando la presión de sujeción que de otra manera desviaría la cubierta 12 hacia adentro hacia el hueco es aplicada a la cubierta 12. Si la cubierta 12 es fusionada con o adherida a uno o más de los soportes 20, entonces el aparato ilustrado en las figuras 2A-2C también puede resistir la expansión de la dimensión estrecha del primer conducto 51 y el segundo conducto 52 que de otra manera pudiera resultara de flexión hacia afuera (es decir, en alejamiento del hueco 11) de la cubierta 12 inducida por presión de fluido dentro del aparato.

La forma, contorno, tamaño y orientación de los soportes 20 no son críticos. Los soportes 20 pueden tener secciones transversales, por ejemplo, rectangular, romboide, circular, elíptica o en forma de ala. Además de formar paredes que dirigen el flujo de fluido (como lo hacen los soportes 20 ilustrados en las figuras 2A-2C), los soportes 20 pueden inducir turbulencia en trayectorias de flujo de fluido e inducen mezclado y/o desplazamiento de partículas inmediatamente corriente debajo de dichos soportes. A manera de ejemplo, los soportes que tienen secciones transversales redondeadas y colocados cerca del borde anterior (es decir, más corriente arriba) del segundo conducto 52 pueden inducir flujo turbulento en el borde anterior del segundo conducto 52, empujando a las partículas que de otra manera pudieran obstruir el segundo conducto 52 e incrementando así el flujo de fluido a través del segundo conducto 52.

El elemento de separación 14 puede definir las trayectorias de flujo de fluido distintas del conducto escalonado descrito aquí. Dichas trayectorias de flujo de fluido, por ejemplo, se pueden extender entre la región de entrada 15 y el conducto escalonado o entre el conducto escalonado y la región de salida 17. Además, a manera de ejemplo, el primer conducto 51 definido por el primer escalón 61 del elemento de separación 14 se puede conectar con el segundo conducto 52 definido por el segundo escalón 62 del elemento de separación 14 por medio de un a trayectoria de flujo de fluido definida por el elemento de separación (es decir, en vez del primer conducto 51 que comunica directamente con el segundo conducto 52).

En algunas aplicaciones, es importante que una muestra de partículas presentes en la región de entrada 15 entre a cada uno de múltiples conductos escalonados sustancialmente al mismo tiempo. Si un dispositivo tal como el representado en las figuras 2A-2C se utiliza, es evidente que las partículas provistas a la región de entrada 15 por medio del puerto de entrada 16 llegarán a los conductos escalonados más externos (conductos más a la izquierda y más a la derecha en la figura 2A) después de que lleguen al conducto escalonado más cercano al puerto de entrada 16 (conducto central en la figura 2A). Con referencia al dispositivo representado en las figuras 2A-2C, el elemento de separación 14 puede definir paredes o canales que se originan en el puerto de entrada 16 y se extienden por diversas trayectorias a cada uno de los conductos escalonados individuales, de tal manera que la distancia de flujo lineal a lo largo de cada trayectoria de flujo es igual. Por lo tanto, la trayectoria de flujo que se extiende entre el puerto de entrada 16 y la trayectoria de flujo central será curva, angulada o en serpentina en relación con las trayectorias de flujo que se extienden entre el puerto de entrada 16 y las trayectorias de flujo más externas. El resultado final es que, debido a que las trayectorias de flujo lineales son de igual longitud, las partículas provistas al extremo del puerto de entrada de cada una de las trayectorias de flujo llegarán al extremo del conducto escalonado de las trayectorias de flujo sustancialmente al mismo tiempo.

El elemento de separación 14 incluye por lo menos dos escalones, incluyendo un primer escalón 61 más cercano a (a lo largo del conducto escalonado) la región de entrada 15 que un segundo escalón 62. Las partículas suspendidas en un flujo de fluido a través del conducto escalonado que incluye un primer conducto 51 y un segundo conducto 52 que tiene una dimensión estrecha más pequeña que el primer conducto 51. La mayoría o todas las partículas en el fluido son capaces de fluir hacia el primer conducto 51 , pero sólo algunas de las partículas son capaces de fluir a través del segundo conducto 52. El resultado neto es que algunas partículas en el líquido pueden fluir a través del conducto escalonado entero, mientras que otras partículas son retenidas dentro del aparato, tal como dentro del primer conducto 51. Por lo tanto, se logra la segregación de partículas.

Los escalones del elemento de separación 14 pueden tener cualquiera de una variedad de formas. En una modalidad (por ejemplo, en el aparato representado en las figuras 1A-1 B), el primer escalón 61 y el segundo escalón 62 tiene una estructura de escalones de 'escalera' tradicional, es decir, dos superficies planas que se intersectan en un ángulo recto. Es decir, la cara de transición 41 del primer escalón 61 y la cara ancha 31 del primer escalón 61 se encuentran en un ángulo recto, como lo hace la cara de transición 42 del segundo escalón 62 y y la cara ancha 32 del segundo escalón 62. Alternativamente, las caras de transición y amplia de los escalones se pueden encontrar en un ángulo 90 y 180 grados, como se ilustra en las figuras 3A-3B, por ejemplo. Las caras de transición y amplia de los escalones también se pueden encontrar en un ángulo entre 0 y 90 grados, formando un colgante.

Los escalones que forman un colgante y escalones que tienen caras que se encuentran en ángulos cerca de 90 grados pueden inducir flujo turbulento cerca del borde en el cual las caras del escalón se encuentran. Dicha turbulencia puede desprender partículas que de otra manera podrían ocluir el el conducto entre la cara ancha del escalón y la cara opuesta del cuerpo 10 o la cubierta 12, y esta turbulencia puede inhibir la obstrucción del paso de fluido y mejorar el flujo de fluido (y reducir la caída de presión de fluido) a través del dispositivo, que son efectos benéficos. Además, cuando el escalón forma un colgante y la altura del escalón es suficientemente grande que las partículas que de otra manera podrían obstruir el conducto pueden residir en la depresión formada por el colgante, dichos escalones también pueden reducir la obstrucción del conducto y mejorar el rendimiento del aparato. En la medida en que el tamaño aproximado de partículas relativamente grandes, no deseadas en una muestra se puede predecir, uno o más escalones diseñados para capturar o excluir dichas partículas se pueden incorporar, en el dispositivo con el fin de capturar las partículas no deseadas en un lugar y la cantidad que no inhibe significativamente el flujo de fluido a través del conducto escalonado.

Los escalones que tienen caras de transición y amplias que se encuentran en un ángulo entre 90 y 180 grados pueden ocluir el conducto de partículas que tienen una variedad de tamaños (es decir, aquellas que tienen tamaños intermedios entre la dimensión estrecha del conducto definido por la cara amplia del escalón y la dimensión estrecha del espacio corriente arriba del escalón. Al detener el conducto de partículas que tienen tamaños ligeramente diferentes en diferentes posiciones en la cara de transición del escalón, un escalón que tiene caras de transición y amplias que se encuentran en un ángulo entre 90 y 180 grados pueden evitar la obstrucción del conducto definido por la cara amplia del escalón a un grado mayor que un escalón que tiene caras de transición y amplias que se encuentran a un ángulo de 90 grados o menos.

La obstrucción del flujo de fluido más allá de un escalón por partículas que obstruyen el conducto definido por la cara amplia del escalón también se puede reducir o evitar al incrementar la anchura del escalón. Debido a que cada partícula ocluye el flujo de fluido sólo para el área de flujo oscurecida por la partícula, un escalón más ancho será necesariamente obstruido por un mayor número de partículas de oclusión. La anchura de un escalón se puede aumentar en una o ambos de dos maneras. En primer lugar, la anchura del escalón se puede aumentar mediante el simple aumento de la anchura lineal (como se ilustra en la figura 4) del escalón. En segundo lugar, la anchura del escalón puede aumentarse mediante el aumento de la longitud del borde en el que las caras anchas y de transición del escalón se encuentran al disminuir la linealidad (es decir, en forma directa) del escalón.

A manera de ejemplo, en un canal de fluido que tiene una sección transversal rectangular, un escalón que se extiende directamente a través de (es decir, en ángulos rectos a los lados) del canal tiene un borde más corriente arriba con una longitud de borde simplemente igual a la anchura del canal. Si la forma del escalón es un semicírculo, con el arco del semicírculo extendiéndose de tal manera que el centro del semicírculo se encuentra corriente abajo del borde más corriente arriba del semicírculo, la longitud del borde del escalón es igual a la longitud del semicírculo, que es el número pi multiplicado por la anchura del canal y dividido por dos (es decir, aproximadamente 1.57 x la anchura del canal). De manera similar, los escalones que tienen bordes en forma de un arco de un círculo o una elipse, como cheurones (es decir, como la letra V), como en zig-zag, como las líneas de serpentina, o como líneas irregulares todos tienen longitudes de borde mayor que la longitud de borde de un escalón que se extiende perpendicularmente a través de un canal de fluido que tiene una sección transversal rectangular. Los escalones que tienen bordes con dichas formas se pueden usar en el aparato descrito aquí.

Las dimensiones del primer escalón 61 y el segundo escalón 62 no son críticas, excepto que el segundo escalón 62 define un límite del segundo conducto 52, que sirve para segregar las partículas como se describe aquí. Por esa razón, las dimensiones del segundo escalón 62 y el segundo conducto 52 correspondiente definido por el segundo escalón 62 del elemento de separación 14 y la superficie(s) opuesta del cuerpo 10 o cubierta 12 se deben seleccionar cuidadosamente. Criterios relevantes para seleccionar estas dimensiones incluyen las dimensiones de las partículas a ser segregadas por su capacidad para atravesar el segundo conducto 52.

A manera de ejemplo, si células relativamente grandes han de ser segregadas de una población de células de diferentes tamaños, la dimensión estrecha del segundo conducto 52 se debe seleccionar de tal manera que las células relativamente grandes sean sustancialmente incapaces de entrar al segundo conducto 52 y que otras células en la población sean capaces de entrar y atravesar el segundo conducto 52. En este caso, la forma y la anchura del segundo escalón 62 se deben seleccionar en función del número de células relativamente grandes que se prevé que están presentes en la muestra, por lo que la obstrucción del segundo conducto 52 por las células relativamente grandes puede ser reducida, retardada o evitada.

De manera similar, si partículas de fluidez limitada (es decir, partículas relativamente no deformables) han de ser segregadas de partículas de tamaño similar de mayor fluidez (es decir, partículas relativamente deformables), entonces la dimensión estrecha del segundo conducto 52 se debe seleccionar para acoplarse estrechamente al tamaño de los dos tipos de partículas, entendiéndose que aunque ambos tipos de partículas serán capaces de entrar al segundo conducto 52, las partículas relativamente deformables, en promedio, serán capaces de atravesar el segundo conducto 52 en menos tiempo que las partículas de fluidez limitada. En este ejemplo, puede ser ventajoso incluir una pluralidad de segundos conductos 52, cada uno teniendo una anchura y forma suficientes para acomodar el número anticipado de las partículas sin obstrucción significativa En este ejemplo, también puede ser ventajoso que cada segundo conducto 52 tenga una longitud relativamente corta, a fin de reducir al mínimo la obstrucción por las partículas relativamente deformables que atraviesan los segundos conductos 52 en menos tiempo que las partículas de fluidez limitada.

La anchura (es decir, como se define aquí y se muestra en la figura 4) de la cada uno del primer escalón 61 y el segundo escalón 62 se pueden seleccionar con base en la acumulación anticipada de partículas en el escalón, en vista de la muestra anticipada que ha de ser procesada usando el aparato. Con base en la dimensión estrecha del segundo conducto 52, la proporción y el número de partículas que serán incapaces de entrar al segundo conducto 52 se pueden estimar. La combinación de esta información con el tamaño promedio de las partículas que no pueden entrar el segundo conducto 52 puede producir un estimado de la longitud total del escalón que es probable que sea obstruido por las partículas que no pueden entrar el segundo conducto 52, y ese estimado se puede usar para seleccionar una anchura de paso apropiado. La anchura de cada escalón se selecciona preferiblemente para evitar la oclusión total de flujo más allá del escalón. La anchura de un escalón (y el conducto definido por el escalón correspondiente) se puede seleccionar para ser significativamente (por ejemplo, 10, 1000 o 100000 veces) mayor que la dimensión estrecha del conducto. A manera de ejemplo, para la segregación de células similares a las fetales de la sangre materna, una anchura de escalón de aproximadamente por lo menos 1000 (mil), y preferiblemente 10000 (diez mil), veces la dimensión estrecha del conducto correspondiente se considera deseable. Escalones relativamente amplios permiten la acumulación de partículas dentro de un conducto mientras limita la oclusión del conducto.

En algunos casos, es deseable seleccionar una dimensión estrecha del primer conducto 51 , de tal manera que las partículas que no pueden entrar al segundo conducto 52 formen una capa de no más de una partícula de profundidad (es decir, en la dirección de la dimensión estrecha del primer conducto 51). La anchura y la longitud del primer escalón 61 se pueden seleccionar para acomodar el número anticipado de dichas células.

La longitud (es decir, como se define aquí y se muestra en la figura 4) del primer y segundo escalones del elemento de separación 14 generalmente no es crítica, ya que es la dimensión estrecha del primer y segundo conductos (que están delimitadas por el primer y segundo escalones, respectivamente) que proveen la funcionalidad segregativa del aparato descrito aquí. En situaciones en las que se desea acumular u observar partículas en un escalón, la longitud del escalón se puede seleccionar para acomodar el número y tamaño anticipados o estimados de las partículas en el escalón. En casos en los que la capacidad segregativa del aparato depende de la diferencia en las velocidades relativas a las cuales las partículas de diferentes tipos pueden atravesar una o ambos del primer conducto 51 y el segundo conducto 52, la longitud del escalón puede influir en el grado de la segregación logrado, los escalones más largos incrementando la segregación efectuada por las diferentes velocidades de recorrido. La longitud del escalón se puede incrementar al aumentar la longitud de un solo escalón, al aumentar el número de escalones de una longitud seleccionada (cada escalón definiendo un conducto que tiene la misma dimensión estrecha), o por una combinación de éstos.

En algunas modalidades, las regiones de escalón planas pueden ser sustancialmente paralelas a una porción de la cubierta, una porción del cuerpo, o ambos, y deben tener una longitud (en la dirección del flujo de fluido volumétrico) igual a un múltiplo (por ejemplo, 2, 4, 10 ó 1000) de la dimensión estrecha del conducto al que une. El ancho de la región plana (en la dirección perpendicular al flujo de fluido volumétrico) debe ser igual a un múltiplo (por ejemplo, 10, 1000 ó 10000) de la dimensión estrecha del conducto al que une. En algunos ejemplos de modalidades de los dispositivos descritos aquí, la relación de la anchura de la región plana (en la dirección de flujo perpendicular al flujo de fluido volumétrico) oscila entre 1 ,318 en el extremo más abierto y 805 en el extremo más estrecho (salida); 659 en el extremo más abierto y 967 en el extremo más estrecho (salida), 537 en el extremo más abierto y 725 en el extremo más estrecho (salida) para cada uno de los tres diseños de cásete separados. Gradaciones en cada uno de los chips aumenta la relación de anchura a altura del escalón por 66.7 que va desde la entrada hasta el lado de salida de cásete. Esta relación de anchura a altura variará dependiendo de la relación del número de partículas que se desea capturar dentro del cásete al que se desea pasar a través del cásete. Como se describe en el ejemplo 4 en la presente, la relación de células fetales a (glóbulos blancos + glóbulos rojos) que son capturadas por los dispositivos del tipo descrito aquí puede ser bastante alta, y la selección de la altura y longitud del escalón puede permitir que el paso de más de 99.99% del paso de todas las células sanguíneas nucleadas en una muestra de sangre materna.

Aunque el aparato se ha descrito aquí con referencia a un primer escalón 61 y un segundo escalón 62, escalones adicionales (por ejemplo, tres, cuatro, diez o cien escalones) pueden ser incluidos en el aparato, cada escalón definiendo un conducto dentro del conducto escalonado que tiene una dimensión estrecha característica.

El aparato puede incluir un solo elemento de separación 14 o una pluralidad de elementos de separación 14. A manera de ejemplo, el aparato puede incluir un primer elemento de separación que define un primer escalón 61 y un segundo elemento de separación que define un segundo escalón 62. Si es integral con el cuerpo 10, el primer y segundo elementos de separación 14 pueden estar dispuestos en diferentes lugares en el cuerpo 10, siempre que ambos elementos de separación 14 estén dentro del hueco 11 , interpuestos entre la región de entrada 15 y la región de salida 17 del hueco 11 , y definen escalones en el mismo conducto escalonado. Alternativamente, un elemento de separación que define el primer escalón 61 puede ser integral (o unido a) con el cuerpo 0, y un segundo elemento de separación que define el segundo escalón 62 puede ser integral con (o unido a) la cubierta 12, siempre que ambos elementos de separación estén dentro del hueco 11 , interpuestos entre la región de entrada 15 y la región de salida 17 del hueco 11 , y definen escalones en el mismo conducto escalonado. De manera similar, los dos elementos de separación pueden ser piezas discretas, siempre que se satisfagan las mismas condiciones.

El elemento de separación 14 puede ser construido a partir de una pieza unitaria de material (y puede ser integral con uno del cuerpo 10 y la cubierta 12) o puede ser construido a partir de una pluralidad de piezas de material. A modo de ejemplo, el elemento de separación 14 de un aparato como el representado en las figuras 1A-1B puede estar formado por dos barras rectangulares (formas sólidas que tienen tres pares de caras paralelas, cada par siendo orientado en ángulos rectos a los otros dos pares) de material, una barra extendiéndose sobre una parte plana del cuerpo 10 en el hueco 1 1 y formando el primer escalón 61 , y la segunda barra extendiéndose encima de la primera barra y formando el segundo escalón 62.

Geometría del conducto La geometría de cada escalón se debe seleccionar de tal manera que por lo menos algunas partículas sean capaces de atravesar el conducto definido por ese escalón, y por lo menos algunas otras partículas no serán capaces de atravesar el conducto définido por ese escalón. La capacidad de una partícula rígida para pasar a través de un conducto depende de las dimensiones características de la partícula. Una partícula rígida no puede pasar a través de un conducto que tiene una altura que es menor que la dimensión corta de la partícula. Una partícula rígida será sustancialmente desinhibida de pasar a través de un conducto que tiene una altura que es mayor que la dimensión larga de la partícula. Una partícula rígida puede pasar a través de un conducto que tiene una altura que es mayor que su dimensión corta pero menor que su dimensión larga, pero el conducto por lo menos inhibirá un poco que la partícula pase.

La capacidad de las partículas deformables (por ejemplo, las células biológicas, burbujas de gas, o granos de cereal) para atravesar un conducto puede depender, como la capacidad de una partícula rígida, de sus dimensiones características. Además, las partículas deformables pueden atravesar conductos que tienen dimensiones estrechas menores que la dimensión corta de la partícula, en la medida que la partícula pueda deformarse a 'exprimirse' a través del conducto. Esta capacidad depende de la rigidez de la partícula, el tamaño del conducto, y la presión de fluido aplicada contra la partícula. Cuando estas cantidades no son conocidas o predecibles, los datos empíricos pueden ser recopilados para determinar o estimar la capacidad de tales partículas para atravesar un conducto de un tamaño dado, y dichos datos empíricos se pueden usar para seleccionar dimensiones apropiadas para el primer y segundo conductos del aparato descritos aquí.

En varias partes de esta descripción, se hace referencia por ejemplo a los conductos de fluido que tienen secciones transversales rectangulares (dichas secciones transversales tomadas perpendicularmente a la dirección del flujo de fluido volumétrico). Los conductos de fluido del aparato descrito aquí no están limitados a dichos canales rectangulares. Las paredes de los conductos de fluido puede ser perpendiculares entre sí y con uno o más del cuerpo 10, la cubierta 12, y el elemento de separación 14. Las paredes también pueden tener otras disposiciones. En una modalidad, los conductos de fluido son redondeados, tales como conductos formados al eliminar material mediante una broca giratoria que tiene una punta redondeada. De manera similar, los conductos de fluido pueden ser redondeados en un lado (por ejemplo, donde se forman en el cuerpo 10) y planos en el otro lado (por ejemplo, donde son limitados por una cubierta plana 12).

Reducción de esfuerzo cortante Los esfuerzos cortantes de los fluidos pueden dañar partículas deformables o rompibles, tales como células biológicas. La reducción de esfuerzos cortantes del fluido dentro del aparato es por lo tanto deseable cuando el aparato se ha de usar para procesar dichas partículas. Puede ocurrir esfuerzo cortante de fluido significativo en posiciones en los canales de fluido en los cuales la velocidad de flujo lineal cambia rápidamente, tales como en lugares en los cuales la geometría del canal de fluido cambia. La geometría de los canales de fluido se puede seleccionar para aumentar, disminuir o mantener constante la velocidad de flujo lineal dentro del aparato. Aumentar o disminuir la velocidad de flujo lineal crea esfuerzo cortante del fluido. El nivel de esfuerzo cortante del fluido se puede seleccionar para romper, deformar o destruir algunos tipos de partículas sobre otros tipos de partículas. Por ejemplo, las partículas durables pueden ser segregadas de partículas frágiles que tienen el mismo tamaño mediante la inducción de esfuerzo cortante de fluido que rompe las partículas frágiles. Las partículas durables son retenidas en el conducto mientras que los fragmentos de las partículas rompibles pasan al segundo escalón 62 y fluyen hacia la región de salida 17. De manera similar, la velocidad del fluido lineal sustancialmente constante se puede mantener en todo el aparato (o por lo menos en todo el conducto escalonado del mismo) por selección apropiada de las dimensiones del canal de fluido apropiadas.

El cuerpo 10, la cubierta 12, y el elemento de separación 14 pueden estar formados de tal manera que el área de sección transversal del conducto escalonado con respecto a la dirección de flujo de fluido aumenta, disminuye o permanece constante. El área de sección transversal del conducto escalonado afecta a la presión y la velocidad de flujo del fluido en el aparato. Si el elemento de separación tiene una anchura constante, entonces el área de sección transversal definida por la altura y la anchura del primer conducto 51 será menor que el área de sección transversal de la región de entrada 15. El área de sección transversal del segundo conducto 52 (por ejemplo, definido por la altura y la anchura del segundo conducto si es rectangular en sección transversal) será menor que la del primer conducto 51 . A medida que las áreas de sección transversal de los conductos disminuyen, la presión del fluido y velocidad de flujo de fluido que fluye a través de las áreas de sección transversal aumenta. La geometría de los canales de fluido puede ser seleccionado para contrarrestar estos cambios en la presión del fluido y velocidad de flujo. Por ejemplo, la anchura de un conducto que tiene una sección transversal rectangular puede aumentar proporcionalmente a medida que la altura del conducto disminuye, de tal manera que el área de sección transversal del conducto es constante. Para un elemento de separación 14 en donde cada escalón se separa por la cara de transición inclinada, la anchura del conducto definido por la cara de transición puede aumentar a una velocidad constante, igual a la velocidad a la cual la altura del conducto disminuye. La presión del fluido y velocidad de flujo a través del conducto definido por dicho elemento de separación permanece constante. Un ejemplo de dicho conducto se muestra en las figuras 3A-3B.

Dicho de otra manera, el cuerpo 10, la cubierta 12, y el elemento de separación 14 se pueden formar de tal manera que el flujo de fluido es igual en todos los lugares a través del conducto estrecho del aparato. Por ejemplo, en el aparato mostrado en las figuras 3A-3B, el flujo de fluido a lo largo de la región de entrada 15, los conductos definidos por superficies 41 , 31 , 42, y 32, y la región de salida 17 pueden ser constantes. Alternativamente, el cuerpo 10, la cubierta 12 y el elemento de separación 14 se pueden formar de tal manera que el flujo de fluido incrementa o disminuye en la dirección del flujo de fluido volumétrico. Por ejemplo, las superficies del cuerpo 10 o la cubierta 12 que definen la anchura del hueco 11 se pueden ahusar en la dirección de la región de entrada 15 o la región de salida 17.

Los esfuerzos cortantes del fluido, desde luego, no son una preocupación cuando el aparato es operado sin un fluido en el conducto escalonado. Debido a que las viscosidades de los fluidos gaseosos son sustancialmente menores que las viscosidades de los fluidos líquidos, los esfuerzos cortantes de los fluidos son de menor preocupación cuando las partículas son suspendidas en un fluido gaseoso (por ejemplo, aire) que en un fluido líquido. De manera similar, debido a que los esfuerzos cortantes de los fluidos varían en formas conocidas con la viscosidad del fluido, las modificaciones del aparato descritas aquí adecuadas para acomodar fluidos de diferentes viscosidades serán evidentes para el diseñador experto en la técnica.

El cuerpo, la cubierta, o ambos, pueden tener uno o más canales de fluido que conectan fluidamente con la superficie de un escalón del elemento de separación, para remover el fluido del escalón (incluyendo cualesquiera células suspendidas en el fluido sobre ese escalón). Además, cuando el escalón tiene regiones discretas o ranuras en el escalón, la cubierta o cuerpo puede ser maquinado de manera que los canales de fluido comuniquen fluidamente más cercanamente con una ranura o región discreta sobre el escalón, para remover fluido en la proximidad de dicha ranura o región del escalón. Dichos canales locales pueden mejorar la purificación mediante la captura de sólo una cantidad relativamente pequeña de fluido en la proximidad inmediata del canal cuando una partícula es capturada por el mismo. Asimismo, el cuerpo, la cubierta, el elemento de separación, o alguna combinación de éstos, pueden tener un dispositivo óptico, eléctrico u óptico-eléctrico construido en el mismo o sobre el mismo (por ejemplo, por ataque químico, deposición de película, u otras técnicas conocidas) en una posición que corresponde a un escalón seleccionado o una ranura o región seleccionada de un escalón. Dichos dispositivos se pueden utilizar para detectar células (por ejemplo, utilizando un detector para detectar una disminución de la luz u otra radiación transmitida a través del fluido entre la superficie del escalón y la cubierta o cuerpo) o para manipular las células (por ejemplo, utilizando un elemento de calentamiento activable para la ablación de las células que pasan o descansan cerca del elemento de calentamiento). Los dispositivos construidos sobre la cubierta, el cuerpo, o los escalones se pueden hacer de forma individual activables mediante la asignación de una dirección electrónica en el dispositivo. De esta manera, las células pueden ser detectadas en áreas discretas del dispositivo, y las células en las áreas seleccionadas pueden ser manipuladas sin manipular las células en otras posiciones.

La cosecha de células de un escalón seleccionado (o una pluralidad de escalones seleccionados) se pueden realizar simplemente retirando el fluido de dicho escalón o una porción del escalón. En algunos casos, s como cuando la adherencia entre las células y un escalón sobre el cual descansan se produce, puede ser ventajoso aplicar energía al aparato para desalojar las células o de otra manera facilitar su eliminación. La energía se puede aplicar en muchas formas, y una forma preferible generalmente dependerá del tipo de célula o un objeto a ser desplazado y la identidad de la fuerza o fenómeno que inhibe la eliminación de la célula o un objeto del escalón. A manera de ejemplo, el retiro de fluido desde una porción de un escalón puede realizarse simultáneamente con la adición de fluido a otra porción del mismo escalón. Otros ejemplos de formas en la que la energía se puede aplicar al aparato para cosechar las células incluyen agitación, golpeteo o vibración del aparato, o aplicando energía en forma de ultrasonido, calor, radiaciones infrarrojas u otras radiaciones, burbujas, aire comprimido, y similares.

En lugar de recuperar las células que son retenidas en uno o más escalones del elemento de separación, las células más bien pueden ser detectadas o manipuladas. En una modalidad, una o más células son lisadas por aplicación a las células de energía eléctrica, mecánica o térmica, liberando así el contenido de la célula en el hueco del aparato. El contenido de la célula puede ser analizado o manipulado en el aparato, o puede ser recuperado del aparato y analizado o manipulado fuera del aparato. A manera de ejemplo, una célula que es retenida en un lugar particular en un escalón puede ser lisada usando un dispositivo localizado en o enfocado en ese lugar particular, liberando así el ADN de la célula hacia el hueco. El ADN puede ser amplificado en el hueco al proveer reactivos de PCR al hueco, o puede ser recolectado (por ejemplo, en un recipiente en el que el fluido obtenido de una parte seleccionada del hueco es recolectado o, alternativamente, haciendo pasar el fluido a través del hueco y recolectando el ADN en el fluido de salida) y amplificado fuera del aparato. El aparato por lo tanto se puede utilizar para analizar el contenido de las células individuales o grupos de células.

Cualquiera de una amplia variedad de métodos para la cosecha o la manipulación de las células dentro de un dispositivo puede ser utilizado con el aparato descrito aquí. A manera de ejemplo, los métodos que utilizan dispositivos de "pinza óptica", dispositivos de microdisección con láser, y membranas y películas de unión a partículas se pueden utilizar. En modalidades que utilizan una película o membrana, la película o membrana puede traslapar un orificio o canal de fluido, sellar el orificio o canal de fluido del resto del hueco. Al observar que una partícula de interés es adherida a o descansa sobre la película o membrana, la porción de la película o membrana que hace contacto con la partícula (o un área que rodea la partícula) puede ser desprendida o perforada, colocando la partícula en comunicación de fluido con el orificio o canal de fluido previamente segregado por la película o membrana Si la película o membrana tiene una propiedad óptica, magnética por la cual puede ser identificada, entonces la porción desprendida de la película o membrana (por ejemplo, que tiene una partícula de interés unida a la misma) puede ser aislada ya sea por por detección de una característica de la partícula o para una característica (por ejemplo, una propiedad espectrofotométrica o propiedad magnética) de la película o membrana Además, si la película o membrana tiene una propiedad (por ejemplo, el magnetismo) por la cual la película puede ser impulsada a moverse en una dirección seleccionada, la película puede ser usada para manipular mecánicamente las partículas unidas a la misma. Por ejemplo, una porción desprendida de una película o membrana magnética que tiene una célula unida a la misma, se puede usar como un vehículo de transporte para esa célula al aplicar un campo magnético direccional a un fluido en el cual la membrana es suspendida o al mover una sonda magnética para guiar la porción desprendida de la película o membrana magnética con la célula unida a la misma hacia un lugar deseado tal como un canal, cámara o recipiente.

La membrana u otra barrera El aparato puede incluir una membrana u otra barrera 81 que está en comunicación de fluido con una porción del hueco 11. La membrana u otra barrera 81 se selecciona de tal manera que preferiblemente segrega partículas deseadas que hacen contacto con la misma en el hueco de partículas no deseadas. En una modalidad, la membrana u otra barrera 81 es una membrana que tiene poros de un tamaño definido, de tal manera que las partículas más pequeñas que los poros pueden pasar a través de la membrana (v.gr., cuando el flujo de fluido o una presión diferencial ocurre a través de la membrana) mientras que las partículas más grandes que los poros no pasan a través de la membrana. Alternativamente, la membrana u otra barrera 81 puede ser una membrana porosa hecha de un material hidrofóbico, de tal manera que las partículas relativamente hidrofílicas tenderán a ser repelidas de la superficie de la membrana (y no pasarán a través de sus poros) mientras que las partículas relativamente hidrofóbicas pueden pasar a través de los poros de la membrana. En otra modalidad más, la membrana u otra barrera 81 es una barrera (porosa o preferiblemente no porosa) hecho de un material a través del cual pueden pasar partículas deseadas, pero las partículas no deseadas no pueden pasar.

A manera de ejemplo, los citotrofoblastos fetales pueden pasar a través del tejido uterino materno, incluyendo la matriz extracelular del útero. Dichas células, contenidas en el hueco 1 1 del aparato descrito aquí y llevadas a contacto con una barrera hecha de una membrana uterina o un material similar (v.gr., extracto de membrana basal, tal como la línea de Matrigel de productos de matriz de membrana basal disponibles de BD Biosciences, San José, California) son capaces de horadar y penetrar a través de una barrera relativamente delgada de dicho material. Son pocos, si cualquier otro tipo de célula se sabe que es capaz de penetrar dicha matriz.

Por ejemplo, los citotrofoblastos fetales en la sangre materna pueden ser segregados como se describe en otra parte aquí en virtud de su incapacidad para atravesar regiones del hueco 1 1 del aparato descrito aquí. Otras células presentes en la sangre materna también puede ser incapaces de atravesar las mismas regiones del hueco 11 , y pueden permanecer con los citotrofoblastos fetales dentro del aparato. Si esta población de células está en contacto con una barrera sólida delgada hecha de material tipo Matrigel™, los trofoblastos fetales podrán adherirse a, entrar y penetrar la barrera y podrán ser segregados de otras células de la población que no pueden adherirse a, entrar o penetrar la barrera. De esta manera, la segregación de citotrofoblastos fetales de otras células y materiales presentes en la sangre materna se puede efectuar con base en dos propiedades de las células y materiales (es decir, la capacidad para pasar a través del aparato descrito aquí e interacciones con una barrera de matriz de tipo membrana basal). Asimismo, dicho aparato se puede usar para segregar citotrofoblastos fetales que son capaces de interactuar con o penetrar a través de dicha barrera desde citotrofoblastos fetales que han perdido (o nunca tuvieron) dichas capacidades.

La membrana u otra barrera 81 puede ser parte del aparato descrito aquí y, combinado con el aparato después de que se realiza la segregación de partículas usando el aparato, o se puede usar por separado del aparato antes o después de que la segregación de partículas se realiza usando el aparato. En una modalidad preferida, la membrana u otra barrera 81 está situada junto a una porción del hueco 1 1 en la cual partículas deseadas se prevé que permanezcan después de la segregación de partículas realizada usando el aparato. En esta modalidad, una primera población de partículas puede ser segregada como se describe aquí, penetrando una segunda población de partículas (v.gr., partículas capaces de atravesar el primer conducto 51 , pero incapaces de entrar al segundo conducto 52) que incluye partículas deseadas.

Si la membrana u otra barrera 81 están situadas junto a una porción del hueco 11 que contiene la segunda población de partículas, entonces esas partículas pueden ser segregadas en virtud de su capacidad diferencial para interactuar con la membrana u otra barrera 81. A manera de ejemplo, si la membrana u otra barrera 81 incluyen un material (v.gr., un anticuerpo monoclonal) que se une específicamente con un subconjunto de partículas en la segunda población, entonces el subconjunto puede ser segregado de otras partículas en la población. De manera similar, a manera de ejemplo, si un subconjunto de partículas en la segunda población es capaz de pasar a través de la membrana u otra barrera 81 , entonces el subconjunto puede ser segregado de otras partículas en la segunda población que no son capaces de pasar a través de la membrana u otra barrera 81.

Cuando una cara de la membrana u otra barrera 81 se une a una porción de hueco 11 , la cara opuesta de la membrana u otra barrera 81 puede unirse a un segundo hueco o un segundo material. El segundo hueco o segundo material, opcionalmente, puede incluir uno o más ingredientes que interactúan con (v.gr., se unen a o son consumidos por) partículas que cruzan la membrana u otra barrera 81. A manera de ejemplo, en un aparato para segregar poblaciones de células, el aparato puede incluir una membrana semipermeable que selectivamente permite que un subconjunto de células pase a través del mismo, con una cara de la membrana unida al hueco 11 del aparato en un lugar donde las células del subconjunto se espera que aparezcan y la otra cara de la membrana unida a un segundo hueco que contiene un medio de crecimiento para soportar el metabolismo y/o proliferación de células. Alternativamente, o adicionalmente, el segundo hueco puede contener un segundo material que se une específicamente con células de un segundo tipo, de tal manera que cuando las células del tipo seleccionado cruzan la membrana, se unen con el segundo material y tienden a no volver a cruzar la membrana. El paso de células u otras partículas a través de la membrana u otra barrera 81 puede ser mediado por flujo de fluido a través de la membrana u otra barrera 81 , por motilidad de las células o partículas, por gravedad, por difusión, o de otra manera.

Materiales y métodos de construcción La identidad del material(es) usado para construir el cuerpo 10 y la cubierta 12 no son críticos, excepto que deben ser suficientemente rígidos para que las partes mantengan sus formas, y no se deformen o rompan sustancialmente, durante el funcionamiento del aparato como se describe aquí. En donde los materiales deformables se usan, la deformación esperada bajo condiciones de operación se debe tomar en cuenta cuando se diseña el tamaño y formas de las partes. Ejemplos de materiales adecuados incluyen vidrios, polímeros sólidos tales como politetrafluoroetilenos y resinas epóxicas, y minerales cristalinos tales como silicio. El cuerpo 10, cubierta 12, elemento de separación 14 y otros componentes descritos aquí se pueden formar a partir de un material diferente, si se desea. Preferiblemente, todas las partes se forman del mismo material, por lo que los efectos de, por ejemplo, temperatura, sobre la expansión y contracción de las partes es similar para todas las partes.

Puede ser benéfico observar el movimiento, estado, o comportamiento de las partículas en el aparato. En tales casos, por lo menos uno del cuerpo 10 y la cubierta 12 debe ser construido de un material que facilite la observación de las partículas en el aparato ensamblado. A manera de ejemplo, muchos vidrios son transparentes a longitudes de onda de luz en la región del espectro óptico que es visible al ojo humano. La construcción de una o más partes del aparato de dicho vidrio permite a un operador inspeccionar visualmente partículas en el hueco (v.gr., acumulación de partículas en el primer conducto 51 ) durante el funcionamiento del aparato.

La identidad de los materiales usados para construir el elemento de separación 14 tampoco es crítica, excepto que debe ser suficientemente rígido para que el elemento de separación 14 mantenga su forma y no se deforme o rompa sustancialmente, durante el funcionamiento del aparato como se describe aquí.

La selección de materiales usados para construcción del aparato y sus partes puede estar influida por la naturaleza de las partículas que han de ser segregadas en el mismo. La naturaleza de las partículas también puede influir en decisiones referentes a que, si acaso, tratamientos de superficie pueden ser apropiados para modular la interacción de partículas con superficies que puedan encontrar dentro del dispositivo. Por ejemplo, si las partículas han de ser segregadas dentro del dispositivo sin unión o adherencia sustancial al dispositivo, entonces los materiales y/o tratamientos de superficie se deben seleccionador para reducir o eliminar la probabilidad de unión de partículas a la superficie. Alternativamente, una o más superficies del dispositivo (v.gr., la superficie amplia 31 del primer paso 61 ) se puede tratar de tal manera que las partículas (o tipos particulares de partículas dentro de una población mixta de partículas) se adhiere a, o se una con la superficie(s). A manera de ejemplo, se sabe que las células biológicas expresan una variedad de proteínas sobre su superficie, y los anticuerpos que específicamente se unen a una superficie de un tipo seleccionado pueden ser generados por métodos conocidos. Si los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína expresada sobre la superficie de células de un tipo particular son fijadas a una superficie en el conducto escalonado, la unión de las células del tipo particular con los anticuerpos se puede esperar que inhiba o detenga el paso de las células más allá de la superficie en el aparato, incrementando la segregación de esas células de las células que no expresan la proteína sobre su superficie (y a las cuales los anticuerpos no se pueden unir).

Dispositivos de desplazamiento de fluido La selección de métodos para construir el aparato puede ser influenciada por el tamaño de las partículas que han de ser separadas en el mismo. El método particular utilizado para construir el aparato y sus partes no es crítico. Una amplia variedad de métodos para formar partes que tienen formas y conformaciones que son exactas a la escala de mieras y nanómetros son conocidos. Por ejemplo, cualquiera de una variedad de métodos de micro-maquinado conocidos se puede usar. Ejemplos de dichos métodos de micro-maquinado incluyen procesos de deposición de película, tales como revestimiento centrífugo y deposición de vapor químico, fabricación con láser y técnicas de fotolitografía tales como procesos de UV o de rayos X, métodos de maquinación de precisión, o métodos de ataque químico que se pueden realizar ya sea por procesos químicos en húmedo o procesos de plasma. (Véase, por ejemplo, Manz et al., 1991 , Trends in Analytical Chemistry, 10:144-149). Alternativamente, las partes pueden ser moldeadas, en vez de ser maquinadas, usando cualquiera de una variedad de métodos de moldeo conocidos. Una amplia variedad de métodos de formación y maquinado de partes para usarse a una escala macroscópica son conocidos, tales como corte, tallado, moldeo, grabado, soldadura y colado.

El cuerpo 10, cubierta 2, y elemento de separación 14 pueden ser construidos por separado y ensamblados para formar el aparato y dicho ensamble lo puede realizar el fabricante o el usuario del aparato. Alternativamente, el elemento de separación 14 se puede construir como una parte integral de uno de la cubierta 12 o el cuerpo 10. En una modalidad, una cubierta individual 12 está hecha capaz de sellar un hueco 11 formado con cualquiera de una variedad de cuerpos 10 (v.gr., cada uno teniendo un elemento de separación 14 en el hueco 11 del cuerpo 10, los diversos elementos de separación 14 teniendo diferentes propiedades, tales como alturas de escalón diferentes).

Partículas segregables El aparato segrega partículas con base en la capacidad de varias partículas para atravesar el primer y segundo conductos del aparato descrito aquí. Las partículas que no pueden ser segregadas usando el aparato incluyen partículas vivas tales como células animales o vegetales, bacterias o protozoarios, o partículas no vivas. El aparato descrito aquí se puede usar para segregar partículas más grandes (v.gr., granos de cereales, heces de roedores, burbujas de gas y esferas) y partículas más pequeñas (v.gr., organelos subcelulares, virus y partículas y minerales precipitadas).

Los atributos de las partículas que afectan su capacidad para atravesar el primer y segundo conductos del aparato descrito aquí incluyen el tamaño, forma, propiedades de superficie y capacidad de deformación de las partículas.

Un revolvimiento de partículas aleatoriamente en un fluido expulsará un volumen de exclusión igual al volumen de una esfera que tiene un diámetro igual a la dimensión más larga de la partícula. Por lo tanto, una esfera rígida que tiene un diámetro de 1 miera, una partícula rígida en forma de disco aleatoriamente revolvente que tiene un diámetro de 1 miera y un espesor de 0.2 mieras y una partícula rígida en forma de bastón aleatoriamente revolvente que tiene una longitud de 1 miera y un diámetro de 0.1 miera expulsará un volumen de exclusión igual. Ignorando los efectos de dichas propiedades, cada una de estas partículas será capaz de atravesar un conducto que tenga un diámetro estrecho mayor que 1 miera. Las partículas en forma de disco y en forma de bastón podrán atravesar el conducto que tenga el diámetro estrecho menor que 1 miera y mayor que 0.2 mieras. Las partículas en forma de bastón podrán atravesar un conducto que tenga un diámetro estrecho menor que 0.2 mieras y mayor que 0.1 mieras. La capacidad de análogos no rígidos (es decir, deformable) de estas partículas para atravesar uno de estos conductos (y la velocidad a la cual puede ocurrir dicho paso) depende del grado y extensión de capacidad de deformación de las partículas y la extensión a la cual las partículas necesitan deformarse para ajustarse dentro del conducto. Además, las propiedades de superficie de las partículas y las superficies que definen el paso pueden afectar la velocidad a la cual las partículas atraviesan el conducto, y pueden evitar que ocurra dicho paso (v.gr., si la partícula se une ávidamente con la superficie del conducto o si las superficies de conducto y la partícula se repelen unas a otras).

En modalidades importantes, las partículas que son separadas son células biológicas presentes en una población mixta de células (es decir, una suspensión de células que incluye células de múltiples tipos). La selección de dimensiones estrechas apropiadas para el primero y segundo conductos del aparato descrito aquí permite la segregación de células biológicas basadas en su tamaño, forma, propiedades de superficie, capacidad de deformación o alguna combinación de estas propiedades. Ejemplos de células biológicas que se pueden separar usando el aparato descrito aquí incluyen células fetales que circulan en la sangre materna, células madre embrionarias (en sangre materna o células madre embrionarias propias del individuo), células madre adultas, células tumorales, bacterias y otros patógenos, y células del sistema inmunológico (v.gr., varios glóbulos blancos tales como células T, células B, neutrófilos, macrófagos y monocitos). Esos métodos se pueden usar para segregar mezclas de células de estos tipos. Los métodos descritos aquí se pueden usar para segregar organelos subcelulares (v.gr., núcleos, cloroplastos, y mitocondrias) también.

En otra modalidad importante, el aparato se usa para aislar agentes de enfermedades infecciosas (v.gr., bacterias o virus) u otros patógenos (v.gr., protozoarios o parásitos) de una muestra. En estas modalidades, el aparato se puede usar para propósitos de diagnóstico, tales como análisis de una muestra biológica obtenida de un sujeto a fin de determinar si el sujeto está infectado con un agente infeccioso. En otro ejemplo de estas modalidades, una muestra tal como una muestra de agua o un producto o ingrediente alimenticio se puede evaluar usando un aparato descrito aquí para evaluar la muestra directamente, o un fluido con el cual la muestra está en contacto, para la presencia de un patógeno que, si es ingerido por un sujeto, contribuiría a la probabilidad de que el sujeto desarrollara una enfermedad u otra condición.

Por ejemplo, las células madre se pueden segregar de otras células presentes en la sangre materna o en la sangre placentaria. Dicha sangre incluye una variedad de células, incluyendo células madre, glóbulos rojos y plaquetas. Como se describe aquí en el ejemplo 5, la sangre preferiblemente se recolecta corriente arriba de lechos capilares cuando las células que se buscan tienen un tamaño (es decir, diámetro > 8 - 10 mieras) que excede el diámetro normal de los capilares. Por lo tanto, la sangre arterial (v.gr., sangre tomada de la arteria hepática común) o un fluido derivado de dicha sangre pre-capilar (v.gr., exudados y secreciones pulmonares y bronquiales, o fluidos que los contienen, tales como fluidos de lavado bronquial) es una fuente preferida para células grandes tales como trofoblastos fetales y células madre. Las células madre humanas tienden a presentar un volumen de exclusión igual a una esfera que tiene un diámetro de aproximadamente 12 mieras. Los glóbulos rojos humanos tienden a presentar un volumen de exclusión igual a una esfera que tiene un diámetro de aproximadamente 5.5 mieras. Las plaquetas humanas tienden a presentar un volumen de exclusión igual a una esfera que tiene un diámetro de aproximadamente 1 miera. Ignorando la capacidad de deformación y los efectos de propiedad de superficie, las células madre, pero no los glóbulos rojos o plaquetas serán excluidos de un conducto que tenga una dimensión estrecha del orden de 4 a 8 mieras. Las células madre provistas a la región de entrada 15 de un aparato descrito aquí con un segundo conducto 52 que tiene una dimensión estrecha de 4 a 8 mieras generalmente no pasará a la región de salida 17 del aparato, aunque las glóbulos rojos y plaquetas sí lo harán. Si la dimensión estrecha del primer conducto 51 es mayor que aproximadamente 12 mieras (v.gr., si la dimensión estrecha del primer conducto 51 es 18 mieras), entonces las células madre, glóbulos rojos y plaquetas atravesarán el primer conducto 51. Si la sangre materna o placentaria se provee a la región de entrada 15 de un aparato descrito aquí con un primer conducto 51 que tiene una dimensión estrecha de 18 mieras y con un segundo conducto 52 que tiene una dimensión estrecha de <8 mieras, y la sangre se hace pasar a través de un conducto escalonado del aparato, entones los glóbulos rojos y plaquetas pasarán a través del aparato (es decir, a través del primer y segundo conductos a la región de salida 17), mientras que las células madre serán retenidas corriente arriba del segundo conducto 52. Si un aparato configurado como el ilustrado en las figuras 1A-1 B se usa (es decir, en donde no interviene un conducto o cámara entre el primero y segundo conductos), las células madre se acumularán en el primer conducto 51. El conducto de fluido libre de células adicional a través del aparato después del paso de la sangre tenderá a incrementar la proporción de glóbulos rojos y plaquetas que son segregados de las células madre. El retroflujo del aparato (es decir, con flujo de fluido que ocurre en la dirección de la región de salida 17, a través del conducto escalonado, hacia la región de entrada 15) puede lavar las células madre del aparato hacia la región de entrada 15, una vez que pueden ser recuperadas.

Las partículas dentro del conducto escalonado son sometidas a esfuerzo cortante, fuerzas de compresión y otras fuerzas que actúan sobre las mismas por un fluido que fluye a través del conducto. Si las partículas (v.gr., células biológicas) que presentan diferente resistencia a la deformación, compresión, estallamiento, lisis o rompimiento (es decir, cualquier característica que altere la velocidad o capacidad de la partícula para atravesar uno o ambos del primero y segundo conductos) están presentes, las diferencias en respuesta de las partículas al flujo de fluido se puede usar para afectar de manera diferencial el paso (o no paso) de las partículas a través del conducto escalonado. A manera de ejemplo, en una mezcla de tipos de células que incluyen células que son lisadas fácilmente bajo esfuerzo cortante de fluido y células sustancialmente del mismo tamaño que no son sustancialmente lisadas bajo esfuerzo cortante de fluido, estos dos tipos de células pueden ser separadas de otras partículas bajo condiciones de flujo de fluido relativamente bajo (es decir, flujo suficientemente bajo que unas cuantas o ninguna célula es lisada). Después de dicha separación, la velocidad de flujo de fluido puede ser incrementada para generar suficiente esfuerzo cortante de fluido dentro de por lo menos una porción del conducto escalonado que las células del primer tipo, pero no células del segundo tipo, se lisarán, dando como resultado primeros productos de lisis de tipo celular en el efluente de la región de salida y células del segundo tipo retenidas dentro del aparato.

Dispositivos de desplazamiento de fluido El aparato descrito aquí puede ser operado al proveer partículas a la región de entrada 15 del hueco 11 del aparato y permitir que las partículas se muevan a través de fluido presente en la región de entrada 15, el conducto escalonado, y la región de salida 17, dicho movimiento siendo atribuido a motilidad intrínseca de las células o a establecimiento pasivo de partículas no móviles bajo la influencia de la gravedad. En el último caso, el aparato necesitará ser orientado de tal manera que la gravedad tienda a causar que partículas que son más densas que el fluido "caigan" de la región de entrada 15, a través del conducto escalonado, y hacia la región de salida 17 o, para partículas que son menos densas que el fluido, para causar que las partículas se "eleven" de la región de entrada 15, a través del conducto escalonado, hacia la región de salida 17.

De forma más general, el aparato descrito aquí es operado conectando fluidamente un depósito que contiene un fluido (v.gr., una suspensión que contiene partículas o un fluido libre de partículas) u otro dispositivo de desplazamiento de fluido tal como una bomba en la región de entrada 15. El flujo de fluido a través del aparato se logra introduciendo fluido en la región de entrada 15 del aparato, al retirar continuamente el fluido de la región de salida 17 del aparato, o ambos. El fluido introducido en la región de entrada 15 desplaza el fluido ya presente dentro del hueco 11 e induce emisión de fluido desde el interior del hueco 1 1 hacia la región de salida 17 o a través de un puerto de salida 18 que comunica a manera de fluido con la región de salida 17. A medida que las partículas atraviesan el pasaje escalonado del aparato, emergerán del mismo hacia la región de salida 17. Dichas partículas pueden ser recuperadas del fluido que se acumula dentro de la región de salida 17 o un depósito que comunica a manera de fluido con el mismo o de fluido que es retirado del puerto de salida 18 que comunica a manera de fluido con la región de salida 17. Las partículas que son incapaces de atravesar ya sea el primer conducto 51 o el segundo conducto 52 del aparato durante el flujo de fluido a través del aparato serán retenidas dentro del aparato y pueden ser recuperadas del mismo.

La identidad del dispositivo de desplazamiento de fluido que se usa para proveer flujo de fluido a la región de entrada 15 no es crítica. El dispositivo de desplazamiento de fluido puede ser simplemente un depósito que contenga fluido que se permite que drene, bajo la influencia de la gravedad, a través del aparato por medio de una conexión de fluido entre el depósito y un puerto de entrada 16 que comunica a manera de fluido con la región de entrada. Una bomba mecánica puede suministrar fluido al puerto de entrada 16 por medio de una conexión de fluido sellada entre la salida de la bomba y el puerto de entrada 16. El fluido suministrado por la bomba desplaza al fluido presente en la región de entrada 15 del aparato hacia el conducto escalonado y por lo tanto hacia la región de salida 17, desde la cual el fluido desplazado puede ser retirado, recolectado o emitido. Alternativamente, una bomba mecánica puede retirar fluido, a manera de una conexión de fluido sellada, de un puerto de salida 18 en comunicación de fluido con la región de salida 7 del aparato. El retiro de fluido de la región de salida 17 reduce la presión del fluido en la región de salida 17, induciendo desplazamiento de fluido desde el pasaje escalonado adjunto del aparato en la región de salida 17 y de la región de entrada 15 hacia el conducto escalonado.

El desplazamiento positivo de fluido en el hueco 11 del aparato (v.gr., inducido al bombear fluido hacia la región de entrada 15) incrementa la presión de fluido dentro del hueco. La presión de fluido incrementada puede alterar las dimensiones del aparato (v.gr., al inducir flexión o desplazamiento de partes del aparato), la dimensión de partículas dentro del aparato (v.gr., partículas llenas de gas deformables tenderán a disminuir en tamaño a medida que la presión de fluido circundante se incrementa), o ambos. Más aún, pulsando o de otra manera variando la presión de fluido se puede inducir cambios transitorios en el flujo de fluido localizado dentro del aparato.

Variaciones de flujo localizadas transitorias pueden ser benéficas. Por ejemplo, partículas que son incapaces de entrar al primer o segundo conducto del conducto escalonado puede ser impulsado contra la extensión del conducto corriente arriba, bloqueando el flujo de fluido a través de la porción del conducto ocluido por la partícula. Variaciones transitorias en el flujo de fluido en el punto de oclusión del conducto por la partícula puede impulsar de manera alterna la partícula contra la abertura del conducto y impulsar la partícula en alejamiento de la abertura, aliviando así temporalmente la oclusión y permitiendo el flujo de fluido a través de la porción previamente ocluida del conducto.

Pulsaciones de fluido u otros cambios de flujo rápido pueden inducir esfuerzos cortantes en el fluido y bajo partículas suspendidas en el fluido, y partículas pueden ser dañadas por esfuerzo cortante. El daño de partículas (v.gr., lisis de células biológicas) se puede reducir al disminuir el esfuerzo cortante dentro del fluido y sus causas. Aparte de modificaciones en la geometría de los canales de fluido del aparato descrito en otra parte en esta descripción, alteraciones en los tipos y características de los dispositivos de desplazamiento de fluido conectados con el aparato pueden incrementar o reducir los esfuerzos cortantes dentro del fluido. A manera de ejemplo, bombas que suministran fluido a una velocidad volumétrica relativamente constante (es decir, en vez de una velocidad volumétrica más pulsátil, como con muchas bombas peristálticas) puede reducir el esfuerzo cortante del fluido inducido por impulsos de marea en presión de fluido dentro del aparato. A manera de ejemplo, además, bombas que suministran fluido a una presión relativamente constante (es decir, bombas que monitorean la presión de fluido dentro del torrente de salida de la bomba y que ajustan la velocidad de flujo volumétrica de acuerdo con ello para mantener una presión constante) puede reducir esfuerzos cortantes de fluido que de otra manera se acumularían como porciones del primer y/o segundo conducto del conducto escalonado siendo ocluido con partículas o fluidos si la velocidad de flujo volumétrica no fuera ajustada de acuerdo a ello. Un ejemplo de una bomba adecuada para mover fluido a través del aparato es una bomba de jeringa de pulso bajo. Dicha bomba puede incluir un mecanismo de agitación, que puede ser útil para evitar que las partículas se sedimenten durante el funcionamiento del aparato.

El desplazamiento negativo del fluido desde el interior del hueco 11 (v.gr., inducido por el retiro de fluido de la región de salida 17) reduce la presión de fluido dentro del hueco 1 1 y puede inducir dificultades similares, incluyendo deformación y desplazamiento de partes del aparato y variaciones de flujo transitorias. El desplazamiento negativo de fluido desde el hueco 1 1 también puede inducir formación de burbujas dentro del fluido en el aparato, y las burbujas pueden alterar el funcionamiento del aparato (v.gr., al ocluir el flujo de fluido a través de una porción de un conducto o al inducir efectos relacionados con la tensión superficial sobre partículas en el aparato). La formación de burbujas por lo tanto se debe evitar. El desplazamiento de fluido positivo del fluido dentro del hueco 11 del aparato es preferido por esta razón.

En una variación, el fluido es desplazado a través del aparato por la aplicación de "fuerza" centrífuga a un depósito que contiene fluido en comunicación de fluido con la región de entrada 15 del aparato. La "fuerza" centrífuga es generada haciendo girar el depósito alrededor de un eje, y la conservación de momento angular de fluido impulsa el fluido en alejamiento del eje de rotación. Esta "fuerza" se puede usar para desplazar el fluido del hueco 1 1 del aparato al conectar en forma fluida la salida del depósito con la región de entrada 15 del aparato. A manera de ejemplo, un aparato centrífugamente operable puede incluir, en una disposición lineal desde una posición próxima al eje de rotación hacia una posición distal al eje de rotación, un depósito de fluido, la región de entrada 15 del hueco 11 , el conducto escalonado, y la región de salida 17 del hueco 1 1. El fluido del depósito es impulsado por "fuerza" centrifuga hacia la región de entrada 15, a través del conducto escalonado (el primer conducto 51 siendo ubicado proximal al eje de rotación en relación con el segundo conducto 52), y por lo tanto a la región de salida 17, que puede incluir un segundo depósito para recolectar fluido que ha pasado a través del aparato. Partículas incapaces de atravesar el segundo conducto 52 permanecerán dentro del hueco 1 1 después de que algo o todo el fluido en el depósito de fluido ha pasado a través del aparato.

Confirmación del ensamble del aparato En muchas aplicaciones, dimensiones significativas de canales de fluido del aparato descrito aquí tienen tolerancia relativamente limitada. Es decir, el funcionamiento apropiado del aparato puede depender de las dimensiones de mantenimiento de los canales de fluido dentro de un intervalo relativamente estrecho (es decir, del orden de mieras a décimas de nanómetros). Debido a que el aparato incluye por lo menos una cubierta 12 y un cuerpo 10 que son ensamblados para producir un dispositivo operable y debido a que, durante el funcionamiento, la presión de fluido interno positiva es ejercida dentro del aparato que tendería a separar la cubierta 12 y el cuerpo 10, algunos medios de sujeción o sostén de otro tipo del cuerpo 10 y cubierta 12 en su posición ensamblada se utiliza usualmente. Presiones inducidas por sujeción o soporte de otro tipo de la cubierta 12 y el cuerpo 10 en sus posiciones ensambladas pueden inducir deformación de las partes de la cubierta 12 o el cuerpo 10, alterando potencialmente las dimensiones significativas de las partes. Es importante detectar dicha deformación cuando ocurre.

La descripción incluye un método de confirmación de ensamble apropiado del aparato descrito en la presente El método es ilustrado para un aparato que incluye un cuerpo 10 que define un hueco 11 y una cubierta 12 que cubre al hueco 11 y tiene una superficie plana opuesta a la cara que cubre el hueco 11. Sin embargo, sustancialmente el mismo método se puede usar para detectar deformación en una parte de otras configuraciones incluyendo una superficie plana sobre la cara de una parte en la cual se ha de detectar deformación. A fin de confirmar el ensamble apropiado del aparato, el cuerpo 10 y la cubierta 12 son ensamblados, incluyendo todas las abrazaderas, soportes u otros dispositivos que ejercen presión sobre cualquier porción del cuerpo 10 o cubierta 12. Opcionalmente, un fluido libre de partículas es seguido a través del aparato en la presión operante que se ha de usar. La superficie plana de la cubierta 12 es iluminada con radiación. El patrón de interferencia de radiación reflejado o refractado por la superficie plana de la cubierta 12 es examinado. El patrón de interferencia indica el lugar y la extensión de doblez en la cubierta y permite confirmación, por ejemplo, de si la variación en las distancias entre la cara de la cubierta 12 que define el hueco 11 y las paredes del hueco 11 definidas por el cuerpo 10 están dentro de la tolerancia apropiada.

El aparato puede incluir una variedad de indicadores visuales que confirman ensamble apropiado del aparato. Un indicador visual es una característica del cuerpo o cubierta que tiene una apariencia cuando el aparato es ensamblado de manera apropiada, y una apariencia diferente cuando el aparato no es ensamblado de manera apropiada. Sustancialmente cualquier fenómeno visualmente observable puede servir como el indicador visual. Como se indicó anteriormente, patrones de interferencia que indican deformación de una parte del aparato se pueden usar. La alineación de líneas trazadas, pintadas o inscritas sobre partes coincidentes puede servir como un indicador visual de ensamble apropiado.

Uso del aparato El aparato se puede usar para segregar partículas, tales como células biológicas, que son suspendidas en una muestra de fluido. La muestra de fluido es introducida en la región de entrada 15 del hueco 11. Partículas en la muestra se mueven de la región de entrada 15 hacia un conducto escalonado definido por el elemento de separación 14 y por lo menos uno del cuerpo 10 y la cubierta 12. El movimiento de las partículas dentro del aparato ocurre en virtud de la motilídad inherente de las partículas (v.gr., para células biológicas móviles), por asentamiento mediado por densidad o elevación de partículas a través del fluido dentro del aparato, o en respuesta al flujo de fluido volumétrico que es inducido dentro del aparato. El conducto escalonado incluye un primer conducto 51 que está limitado por un primer escalón 61 del elemento de separación 14. El primer conducto 51 tiene una dimensión estrecha (es decir, la distancia entre la superficie del primer escalón 61 y la cara opuesta del cuerpo 10 y/o cubierta 12), y algunas partículas pueden ser incapaces de entrar al primer conducto 51 debido a su tamaño (tomando en cuenta la capacidad de deformación de la partícula). Las partículas que también pueden atravesar el primer conducto 51 continúan moviéndose a lo largo del conducto escalonado a un segundo conducto 52 que está limitado por un segundo escalón 62 del elemento de separación 14. El segundo conducto 52 tiene una dimensión estrecha (es decir, la distancia entre la superficie del segundo escalón 62 y la cara opuesta del cuerpo 10 y/o cubierta 12) que es más estrecha que la dimensión estrecha del primer conducto 51 , y algunas partículas pueden ser incapaces de entrar al segundo conducto 52 debido a su tamaño (tomando en cuenta la capacidad de deformación de la partícula). Las partículas que son capaces de atravesar tanto el primer conducto 51 como el segundo conducto 52 continúan moviéndose a lo largo del conducto escalonado hasta la región de salida 17 del hueco 1 1. El aparato por lo tanto segrega partículas incapaces de entrar al primer conducto 51 , partículas incapaces de atravesar el primer conducto 51 , pero incapaces de entrar al segundo conducto 52, y partículas capaces de atravesar tanto el primer conducto 51 como el segundo conducto 52. Estas poblaciones de partículas puede ser recuperadas por separado, ya que las partículas pueden ser capaces de entrar, pero no atravesar (durante el período de operación) uno del primer y segundo conductos. Alternativamente o además, el efluente recuperado de la región de salida del aparato puede ser recuperado. En una modalidad, las partículas incapaces de atravesar una o ambos de primer y segundo conductos pueden ser lisadas o de otra manera degradadas (es decir, para permitir que los productos de lisis o degradación pasen a través del dispositivo) antes de recuperar el efluente.

Aparatos múltiples pueden ser operados al mismo tiempo (es decir, simultáneamente), con la misma muestra de fluido aplicada a la región de interés 15 de cada aparato. Los aparatos múltiples pueden tener una región de entrada común 15 o un depósito corriente arriba común que comunica fluidamente con cada una de las regiones de entrada 15. No importa si los aparatos paralelos múltiples comparten el mismo cuerpo 10, la misma cubierta 12 o ambos. Una pluralidad de aparatos discretos pueden ser operados independientemente, desde luego. En una modalidad, una pluralidad de aparatos son agrupados, unidos o prensados entre sí para formar una masa (v.gr., un bloque de obleas, cada oblea actuando como un cuerpo 10 para un aparato en una cara de la oblea y una cubierta 12 para un aparato adyacente en la cara opuesta de la oblea) que tiene las regiones de entrada 15 (o canales de fluido que comunican fluidamente con las regiones de entrada 15) en un extremo de la masa. Una muestra de fluido que incluye partículas se puede aplicar al extremo de la masa, y la muestra de fluido por lo tanto se puede proveer a la región de entrada 15 de cada aparato de la masa. El flujo de fluido puede ser inducido a través de todos los aparatos de la masa proveyendo fluido al mismo extremo de la masa bajo presión (v.gr., usando una bomba). Esta disposición permite el escalamiento ascendente del aparato y métodos descritos aquí sin re-elaborar mediante ingeniería o rediseñar los componentes del aparato. En vez de ello, el número de obleas simplemente puede ser incrementado para acomodar el número anticipado de partículas.

Partículas y células obtenidas usando el aparato y métodos descritos aquí se pueden usar para cualquiera de una amplia variedad de propósitos adicionales. Además, para muchos de esos propósitos, no es necesario aislar partículas que puedan permanecer dentro del aparato después de su operación para propósitos de segregación. A manera de ejemplo, en muchos casos, la interacción de células biológicas intactas o componentes las células biológicas con reactivos (v.gr., anticuerpos, sustratos de enzima, ácidos nucleicos potencialmente complementarios y nutrientes) se pueden observar también para células que permanecen dentro del aparato ya que esas interacciones se pueden observar para células recuperadas del aparato. Además, los canales de fluido presentes dentro del aparato pueden facilitar el suministro de dichos reactivos a las células que permanecen dentro del aparato. Por lo tanto, el aparato se puede usar para segregar células y posteriormente, como un recipiente de reacción para observar interacciones de células con varios reactivos.

Cuando el aparato se usa para contener fluidos que incluyen células biológicas, los fluidos preferiblemente se deben seleccionar para tener una osmolaridad suficiente para mantener la integridad de las células biológicas. Si la viabilidad u otras funciones biológicas de las células se consideran importantes, entonces los fluidos también debe seleccionarse para mantener las funciones biológicas deseadas.

El aparato que tiene partículas que permanecen dentro del mismo también se puede usar como un contenedor para almacenar, mantener o poner en contacto reactivos con las partículas. A manera de ejemplo, el aparato se puede usar para segregar dentro del aparato bacterias que aparecen en una muestra (v.gr., una muestra de fluido con la cual un alimenticio tal como huevo de gallina es lavado). Después de segregar las bacterias dentro del aparato, se puede proveer medio de crecimiento al hueco 1 1 del aparato para estimular la supervivencia y multiplicación de las bacterias. Indicadores (v.gr., anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno bacteriano particular o a un reactivo que es metabolizable sólo por bacterias nocivas) se pueden proveer al hueco y su interacción con las células en el mismo se pueden observar. Dicho ejemplo es útil para el análisis de contaminación de alimentos con bacterias patógenas.

Edad de las muestras de sangre Aunque se usa el aparato descrito aquí, se descubrió que las características de flujo de la sangre y células sanguíneas en el aparato son significativamente alteradas con el tiempo. Se cree que la degeneración de las células sanguíneas empieza poco después de que la muestra de sangre es extraída, y los efectos de la degeneración empiezan a comprometer la efectividad de la segregación efectuada por el aparato descrito aquí después de varias horas. Esto se puede deber, por lo menos en parte, a la falta de oxígeno, nutrientes, exposición a fragmentos de glóbulos blancos que se pueden adherir a las superficies del aparato, o exposición a enzimas liberadas por glóbulos blancos lisados. Las células sanguíneas tienden a volverse inestables y están más sujetas a lisis cuando pasan a través del aparato aproximadamente seis a ocho horas después de que se extrae la muestra de sangre. Se vuelve más difícil segregar de manera efectiva las células en una muestra de sangre aproximadamente 10-12 horas después de que se extrae la muestra. Las muestras de sangre preferiblemente se deben usar no más de seis horas después de que son extraídas, y no más de aproximadamente 12 horas de ser extraídas.

En manipulaciones adicionales de muestras de sangre de más de ocho horas, se vuelve evidente que los cambios observados en las muestras de sangre no eran específicos para el aparato y el método descritos aquí, sino más bien son un fenómeno más general que puede ser relevante para una amplia variedad de análisis realizados usando muestras de sangre. En cualquier análisis que implica el paso de sangre o células sanguíneas a través de un conducto relativamente estrecho (es decir, de 100 mieras o menos), parece ser ventajoso realizar el análisis usando una muestra de sangre obtenida de un sujeto menos de doce horas antes del análisis, y preferiblemente menos de diez, menos de ocho o menos de siete horas antes del análisis. Debido a que el aparato descrito aquí se puede operar convenientemente por un operador que tiene relativamente poca experiencia, el aparato se puede usar para analizar una muestra de sangre en un tiempo muy cercano al tiempo que la sangre se obtiene de un sujeto, tal como dentro de consultorio médico o en un laboratorio de flebotomía.

EJEMPLOS El tema de esta descripción se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proveen para el propósito de ilustración únicamente y el tema no se limita a estos ejemplos, sino más bien abarca todas las variaciones que son evidentes como resultado de la enseñanza provista aquí.

EJEMPLO 1 Separación de células fetales de la sangre materna Un aparato del tipo descrito aquí se usó para separar células nucleadas grandes tipo fetal de otras células en una muestra de 1 mililitro de sangre materna.

El aparato de policarbonato se construyó usando un procedimiento de colado de resina epóxica conocido e incluyó un cuerpo 10 que tenía un elemento de separación integral 14 en cada uno de ocho canales definidos por el cuerpo 10. Otros materiales aceptables para esta aplicación incluyen copolímeros de olefina cíclicos y polímero de ciclo-olefina de polipropileno El elemento de separación tenía seis escalones que definían conductos dispuestos en serie en un conducto escalonado, los conductos teniendo dimensiones estrechas de 10, 7, 5, 4, 3 y 2 mieras respectivamente. Cada escalón (y conducto) tenía una longitud de 1 milímetro. Un cubreobjetos estándar sujetado al cuerpo 10 se usó como una cubierta 12. Porciones del cuerpo 10 entre los conductos escalonados discretos sirvieron como soportes 20. La cubierta 12 se unió al cuerpo 10 usando adhesivo de hule de silicón.

A fin de estimular la sangre materna, una muestra de sangre de un feto masculino se obtuvo y se mezcló con sangre obtenida de una mujer. Esta mezcla fue heparinizada usando un procedimiento estándar y refrigerada durante la noche. Otros anticoagulantes, tales como EDTA de potasio, son también adecuados para esta aplicación. La muestra se llevó a temperatura ambiente y se inyectó en la región de entrada 15 de una pluralidad de canales usando una jeringa. Después de que la muestra pasó a través del aparato, el aparato se observó bajo un microscopio. Células grandes (es decir, células más grandes que las células sanguíneas normales) que parecieron ser de origen fetal se observó que habían sido atrapadas como varias posiciones dentro de los conductos escalonados.

Las células grandes se adhirieron a la cubierta de vidrio centrifugando brevemente el aparato ensamblado. Después de la centrifugación, la cubierta 12 fue removida del cuerpo 10 y las células se adheridas a la cubierta 12 fueron fijadas por fijación de Carnoy usando una mezcla de 3:1 de metanol:ácido acético. Las células después fueron procesadas con un protocolo de hibridación in situ de fluorescencia estándar (FISH) para detección de cromosomas X e Y usando un kit comercialmente disponible.

Señales fluorescentes que representaban la hibridación de la sonda FISH a secuencias específicas de sitio en los cromosomas X e Y se observaron en el cubreobjetos, indicando que las células fetales masculinas (es decir, que contenían cromosoma Y) habían sido segregadas de la muestra de sangre usando el aparato. Por lo menos algunas de las células grandes se observó que eran polinucleadas, lo que sugirió un origen trofoblástico.

Células trofoblásticas fetales se creyó que eran eliminadas de la sangre materna con relativa rapidez después de cesar el embarazo, a diferencia de otros tipos de células fetales que pueden producirse en sangre materna (v.gr., células madre fetales primitivas). Debido a que las células trofoblásticas de embarazos previos no es probable que persistan en la sangre de las mujeres, la segregación de células trofoblásticas fetales puede ser más informativa con respecto al estado del feto actual de la mujer que la segregación de otros tipos de células fetales (incluyendo aquellos que pueden haber persistido de embarazos previos, conocidos o desconocidos para la mujer).

EJEMPLO 2 La evaluación del ensamble de un aparato descrito aquí se puede lograr al observar la luz reflejada, refractada o tanto reflejada como refractada del aparato bajo iluminación. La figura 5 es una imagen en color que ilustra el patrón de luz observado en un aparato ensamblado de manera apropiada.

El aparato mostrado en la figura 5 está formado de un cuerpo de plástico que tienen un elemento de separación integral con el mismo y que tiene una cubierta de vidrio plana aplicada al mismo. Un conducto escalonado es definido por la cubierta en la cara superior (aquí) del conducto escalonado y por el elemento de separación en la cara inferior (aquí) del conducto escalonado. Nueve soportes se extienden sustancialmente a la longitud entera del elemento de separación, desde la región de entrada (en la dirección de la flecha mostrada en la figura cinco) a la región de salida, dividiendo el conducto escalonado en 10 canales de flujo separados. El elemento de separación tiene ocho porciones planas esencialmente paralelas a la cubierta, las porciones planas (escalones) definiendo distancias de 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, y 5.4 mieras desde la superficie de la cubierta que define el conducto escalonado.

Luz fluorescente fue emitida desde una fuente a un ángulo de iluminación aproximadamente perpendicular a y directamente por arriba de la cubierta. La figura 5 muestra la imagen observada por un observador colocado con una línea de visualización a aproximadamente 30-45° a la cubierta. Se puede ver que un patrón de tipo "tablero de ajedrez" de luz se observa, como se muestra en la figura 5. Sin estar limitado por alguna teoría en particular de operación, se cree que la luz reflejada desde la superficie superior (es decir, fuera del conducto escalonado) de la cubierta, se combina con la luz reflejada por la superficie inferior de la cubierta, la luz reflejada por porciones planas del elemento de separación o alguna combinación de estas para producir los colores en la figura 5. Independientemente del origen o explicación de las variaciones de luz, un patrón de luz correspondiente al patrón de elementos de separación y soportes se observa cuando el aparato es ensamblado de manera apropiada. Deformaciones en la cubierta o cuerpo, distorsionan el patrón de tablero de ajedrez, tal como los rectángulos correspondientes a las porciones planas del elemento de separación aparecen ladeadas o curvas.

EJEMPLO 3 Aislamiento de células fetales de muestra de vellosidades coriónicas humanas En los experimentos descritos en este ejemplo, un aparato del tipo descrito en esta solitud se usó para segregar células fetales de una mezcla de células adultas y fetales que estaban presentes en la muestra de vellosidades coriónicas (CV) obtenida de una mujer embarazada que se sabía que portaba un feto masculino.

El aparato usado en los experimentos descritos en este ejemplo fue un cásete de dos piezas que tenía un cuerpo fabricado de policarbonato usando un procedimiento de moldeo de micro-inyección, y una cubierta de vidrio, el cuerpo teniendo una separación en el mismo que define múltiples escalones entre el elemento de separación y la cubierta, como se muestra en la figura 6. El cuerpo y la cubierta del cásete definen un hueco que tiene una región de entrada y una región de salida. Las regiones de entrada y salida estaban en comunicación de fluido una con otra por medio de una región de separación. La región de separación incluía un segmento plano (es decir, un conducto relativamente amplio) en donde la distancia mínima entre el cuerpo y la cubierta era de 4.0 mieras y la distancia máxima entre el cuerpo y la cubierta era de 5.4 mieras. Las distancias de cubierta a escalón para los ocho escalones eran (en la dirección de flujo de fluido) 5.4 mieras, 5.2 mieras, 5.0 mieras, 4.8 mieras, 4.6 mieras, 4.4 mieras, 4.2 mieras, y 4.0 mieras, como se muestra en la figura 6. La longitud de la región de separación en la dirección de flujo de fluido (es decir la distancia de izquierda a derecha, de la estructura de ocho escalones mostrada en la figura 6) era de 20 milímetros, y cada uno de los ocho escalones dentro de la región de separación tenía una longitud, en la dirección de fluido, de 2.8 milímetros. La anchura de la región de separación (es decir, la distancia que la estructura de ocho escalones mostrada en la figura 6 se extendía en la dimensión perpendicular a la vista plana, mostrada en la figura 6) era de 24 milímetros. El volumen interno total del hueco del aparato ensamblado fue de aproximadamente 12.2 microlitros, con el volumen de la región de separación del hueco (es decir, la porción entre la cubierta y el elemento de separación escalonado) siendo de aproximadamente 2.2 microlitros y los volúmenes combinados de la región de entrada y salida siendo de aproximadamente 10 microlitros. Este modelo de cásete fue designado D3v2.

En una modalidad alternativa, un aparato similar se puede usar, el aparato definiendo sustancialmente sólo en que las distancias de cubierta a escalón para 8 escalones son (en la dirección de flujo de fluido 4.4 mieras, 4.2 mieras, 4.0 mieras, 3.8 mieras, 3.6 mieras, 3.4 mieras, 3.2 mieras, y 3.0 mieras. Este modelo de cásete se designa D2V3.

Durante las operaciones de flujo de fluido, el cásete estaba contenido dentro de un soporte diseñado para propósito que sirvió para sujetar el cásete y asegurar que la cubierta de vidrio coincidiera con el cuerpo del cásete de una manera que evitara la fuga de cualquier líquido del cásete. La construcción precisa del soporte no fue critica, y sirvió para aplicar presión uniformemente a las partes del cásete suficientemente para obtenerlas y evitar fugas debido ya sea a presión de fluido positiva o negativa dentro del cásete, en relación con la presión atmosférica. Para los experimentos descritos en este ejemplo, el soporte fue construido de dos partes de metal que tenían accesorios para ajustar la fuerza con la cual las pastes metálicas y las partes del cásete intercaladas sobre los mismos se mantenían juntas. Una de las partes de metal definieron "ventana" (véase figura 5) que correspondió aproximadamente a la región de hueco entre el cuerpo y la cubierta, a y a través del cual se podían hacer observaciones visuales de células dentro del hueco. La otra parte de metal era sustancialmente sólida, excepto que incluía agujeros alineados con los puertos de entrada y salida para acomodar conexiones para proveer fluido y retirar fluido del hueco dentro del cásete.

El flujo de fluido a través del cásete se logró usando un abomba de jeringa Hamilton PSD3 equipada con una jeringa de 1.25 mililitros. La bomba fue controlada por software usando una aplicación que corría en una caja de herramientas de control de instrumentos MatLab™. El sistema también incluye un sensor de presión que permitió que la presión de fluido dentro del cásete fuera constantemente monitoreada. Los conductos de fluido y accesorios con los cuales los componentes del sistema se conectaron se seleccionaron para acomodar presiones anticipadas, pero su identidad no fue crítica. Sustancialmente, se pueden usar cualesquiera conductos de fluido y accesorio.

Las sondas moleculares usadas en estos estudios se obtuvieron de Abbott Molecular y consistieron de una sonda CEP® X Spectrum Orange™ (que proveía una señal de fluorescencia roja de los cromosomas X en células tratadas con el reactivo) y CEP® X Spectrum Green™ (que proveía una señal de fluorescencia verde de los cromosomas Y en células tratadas con el reactivo). Todos los otros reactivos fueron de grado suficiente para evitar hibridación de grado no específica.

Una muestra de CV fue recibida en un tubo de plástico de tapa roscada de 15 mililitros que contenía piezas de tejido en aproximadamente 5 mililitros de solución salina regulada en su pH con fosfato modificada por Dulbecco (DMPBS; 0.90 milimolar CaCI2; 0.49 milimolar MgCI2, 2.7 milimolar KCI, 1.47 milimolar KH2P04, 138 milimolar NaCI, y 8.06 milimolar Na2HP04 pH 7.2) en la cual las células de la muestra de tejido fueron suspendidas. La suspensión de células fue aspirada, dejando los fragmentos de tejidos sólidos en el fondo del tubo (el volumen de material que quedaba en el tubo fue menor de 0.25 mililitros). El aspirado se puso en un tubo de plástico con tapa roscada de 15 mililitros y se centrifugó a 3,000 rpm (aprox. 1 ,500 x g) durante 5 minutos. Después de la centrifugación y remoción del sobrenadante, aproximadamente 0.1 mililitro de células empacadas quedó en el tubo. Aproximadamente 2 mililitros de DMPBS se añadieron al tubo y los componentes se mezclaron usando un mezclador de tipo remolino suficiente para re-suspender las células comprimidas. La muestra de células re-suspendidas se almacenó a 4°C durante aproximadamente 1 hora.

Una muestra de las células re-suspendidas se diseminó sobre un cubreobjetos de microscopio estándar, teñido con colorante de Whght-Giemsa y se examinó a una amplificación de 400 x bajo iluminación con luz blanca. La preparación teñida mostró la presencia de células trofoblásticas (fetales) en la muestra. Se creyó que otras células que se observaron en la muestra eran neutrófilos (glóbulos blancos nucleados) y glóbulos rojos. Observaciones de células trofoblásticas fetales y otras células en la muestra por este método revelaron que las células trofoblásticas fueron significativamente más grandes que la mayoría de otras células en la muestra.

Una alícuota de 1.25 mililitros de células suspendidas se hicieron pasar a través del cásete D3v2 mediante la aplicación de la región de entrada, usando el aparato de bomba de jeringa descrito anteriormente. Antes de la aplicación de la muestra, el cásete había sido cebado previamente por el paso de una cantidad de DMPBS. Esta muestra se hizo pasar a una velocidad de flujo de fluido de 0.025 mililitros por minuto a través del cásete. Durante el paso de la muestra, la presión en el sistema fluido se monitoreo y se observó que variaba dentro del intervalo de 0.3233-0.4780 kg/cm2 manométricos.

Después de que la muestra había pasado a través del cásete, tres alícuotas de 0.1 mililitro de una solución fijadora (metanol: ácido acético en una relación de 3:1) se hizo pasar a través del cásete. Se dejó transcurrir un período de 10 minutos entre los pasos de solución de fijación. El cásete y contenedor se enfriaron mediante la aplicación de agua con hielo al aparato durante el procedimiento descrito en este párrafo. Los pasos de procedimiento se realizaron a temperatura ambiente (aproximadamente 20 grados centígrados).

Después de la fijación, el cásete se secó aplicando un vacío a la región de salida, que efectuó la remoción de todo el fluido del hueco en el cásete. El cásete se almacenó durante la noche a 4°C. Después de almacenarse, el cásete se observó microscópicamente a una amplificación de 100 x. varias células nucleadas que tenían un diámetro mayor que aproximadamente 20 mieras se observaron en la región de separación, algunas dentro de la región de entrada, y otras en el primer escalón de separación en la región de separación del cásete. No se observaron células que tenían un diámetro mayor que aproximadamente 20 µ?? corriente abajo del primer escalón de separación en la región de separación del cásete.

El cásete fue desensamblado y la cubierta de vidrio fue removida y procesada usando un protocolo de FISH estándar. La cubierta se examinó usando un microscopio de fluorescencia equipado con una platina controlada por computadora acoplada con un algoritmo de detección automatizado. La cubierta también se tiñó con DAPI para permitir la visualización de núcleos intactos. (Es decir, confirmo la captura de células). La tinción con FISH y DAPI se realizaron como se proveyó en el kit comercial obtenido de Abbott Molecular (Chicago, IL).

El examen de la cubierta teñida con DAPI y FISH indicó una abundancia de células nucleadas sobre la cubierta de vidrio. La mayoría de las células fueron observadas en un área relativamente pequeña en la porción del cásete correspondiente a los escalones que tenían distancias de cubierta a escalón de 4.2 y 4.4 mieras. Estas células parecieron ser estiradas o deformadas de otra manera. Las células masculinas (es decir células que generaron señales fluorescentes correspondientes a la presencia tanto de un cromosoma X como de un cromosoma Y) estaban presentes. Los inventores de la presente concluyen que estas células se originaron del feto masculino de la mujer embarazada. Las células femeninas (es decir, células que generaron señales fluorescentes correspondientes a la presencia de un cromosoma X, pero que carecían de cualquier señal fluorescente correspondiente a la presencia de un cromosoma Y) también se detectaron. Los inventores de la presente concluyeron que estas células se originaron de la mujer embarazada, más que su feto masculino. De las células detectadas, ninguna mostró un núcleo multi-lobulado, del cual los inventores de la presente concluyen que las células que fueron capturadas no eran glóbulos blancos.

EJEMPLO 4 Aislamiento de células fetales de muestras de sangre materna En los experimentos descritos en este ejemplo, un aparato del tipo descrito en esta solicitud se usó para segregar células fetales de una muestra de sangre obtenida de la circulación de una mujer embarazada que se sabía que portaba un feto masculino.

El aparato usado en el experimento descrito en este ejemplo fue el cásete D3v2 descrito en el ejemplo 3, operado como se describe en ese ejemplo. Las sondas moleculares y procedimientos de tinción que se usaron fueron los mismos descritos en el ejemplo 3.

La sangre se recolecto en pares de alícuotas de aproximadamente 5 mililitros por punción venosa de cada una de las 22 mujeres embarazadas que se sabía (por imagen de ultrasonido) que portaban un feto masculino. La edad gestacional de los fetos estaba dentro del intervalo de 17 semanas, 6 días y 29 semanas, 6 días, con la edad gestacional promedio siendo de 21 semanas, 5 días y la edad mediana siendo de 20 semanas, 2 días. Cada muestra de sangre fue recolectada en un tubo de 5 mililitros y fue almacenada en un baño de hielo hasta que se preparó para aplicarse al cásete. El tiempo que transcurrió entre la recolección de la muestra y la preparación de la muestra fue menor de 1 hora.

En algunos casos, la misma muestra se hizo pasar a través de dos casetes, uno de los cuales fue subsiguientemente teñido usando reactivos de FISH y el otro de los cuales fue teñido usando reactivo de Wright-Giemsa. Esto permitió la comparación de resultados histológicos (células teñidas con Wright-Giemsa) obtenidos por procedimientos de FISH. en otros casos, muestras de sangre duplicadas de un solo paciente se hicieron pasar a través de casetes separados, a fin de confirmar la capacidad de reproducción de los resultados.

Las muestras de sangre se hicieron pasar a través del cásete aspirando la muestra de sangre del paciente hacia la jeringa de Hamilton en preparación para bombeo a través del cásete. Las muestras de sangre de 1.25 mililitros se bombearon a través de casetes individuales a una velocidad de flujo de 0.025 mililitros por minuto. La presión en el sistema de fluido se monitoreo con el paso de la muestra de sangre, y se observó para variar dentro del intervalo de 0.4921-0.6327 kg/cm2 manométricos.

Después del paso de la muestra de sangre a través del cásete, 1.25 mililitros de solución salina regulada en su pH con fosfato modificado por Dulbecco se hizo pasar a través del cásete en la misma dirección y a la misma velocidad de flujo que el flujo de la muestra para remover cualquier material residual de la muestra, distinto de las células retenidas en el cásete. Después de este procedimiento de lavado, tres alícuotas de 0.1 mililitros del fijador se hicieron pasar a través del cásete a 0.025 mililitros por minuto. Un periodo de 10 minutos se dejó transcurrir entre los pasos de fijador. El cásete y el soporte se enfriaron mediante la aplicación de agua con hielo en el aparato durante el paso de las alícuotas de fijador y los períodos intermedios.

Después de los pasos de fijador, los casetes se trataron en una de dos formas. Algunos casetes tenían el fijador removido inmediatamente después del paso (por el paso de aire filtrado a través del cásete hasta que el cásete estaba libre de gotas de fijador), se almacenaron durante la noche a 4°C y se trataron con FISH después de almacenarse durante la noche. Otros casetes se almacenaron a 4°C con el fijador retenido dentro del cásete hasta que se habían acumulado 4 o más casetes, tiempo en el cual el fijador fue removido, los casetes fueron almacenados durante la noche a 4°C, y los casetes fueron tratados con FISH después del almacenamiento durante la noche. El tratamiento con FISH permitió la remoción de la cubierta y el procesamiento usando CEP® X Spectrum Orange™ CEP® Y Spectrum Green™ como se describe en el ejemplo 3. Se usó DAPI como un contracolorante y para demostrar la presencia de un núcleo intacto.

Después de la tinción, la cubierta de vidrio que tenia las células teñidas unidas a la misma se examinaron usando un microscopio fluorescente ya sea manualmente o usando una platina controlada por computadora acoplada con un algoritmo de detección automatizado.

Para algunos casetes, las células fijadas en la cubierta se tiñeron sólo con colorante de Wright-Giemsa para examinar los tipos y distribución de células capturadas dentro del cásete.

Los resultados obtenidos de los experimentos en este ejemplo se describen ahora.

Muestras de sangre materna obtenida de 22 mujeres embarazadas se hizo pasar a través de 38 casetes. Veintiséis (26) casetes fueron procesados usando procedimientos de FISH/DAPI descritos aquí y 12 casetes fueron teñidos sólo con Wrigth-Giemsa. De los 26 casetes usados para FISH se encontró que 12 eran adecuados para análisis y 4 no hibridaron correctamente o no absorbieron el contracolorante, indicando que se fiaron de manera inapropiada.

De los 12 casetes que fueron adecuados para análisis, 3 proveyeron una señal masculino-positiva cuando aproximadamente 12.5% del área de cobertura total fue escudriñada usando el microscopio automatizado y algoritmo. Debido a preocupaciones acerca del rigor del sistema automatizado, algunos casetes fueron re-escudriñados manualmente. El reescudriñamiento del cásete revelo la aparición de células de señal masculino-positivas en cada uno de los 12 casetes, con entre 1 y 1 1 células masculinas detectadas en las placas individuales (los números de células masculinas detectadas en cada una de las 12 placas fueron 1 , 2, 2, 2, 2, 3, 3, 3, 3, 4, 8, y 1 1). De estas células masculinas, la mayoría (64%) fueron detectadas en la porción de la cubierta del cásete correspondiente a los escalones que tenían distancias de cubierta a escalón de 4.0, 4.2 y 4.4 mieras. Aproximadamente 36% de las células masculinas se detectaron en la porción de la cubierta de cásete correspondiente a los escalones que tenían distancias de cubierta a escalón de 4.6, 4.8, 5.0, 5.2 y 5.4 mieras.

La figura 7 provee un "mapa" relativo del lugar de cada una de las células identificadas que proveen una señal positiva para una célula fetal masculina. La mayoría de las células identificadas están en la salida o porción de salida del cásete con algunas de las células en el área de entrada. Esto índica que el cásete es capaz de capturar células fetales y no permite su paso.

Los resultados de un cásete indicaron que 1 1 células fetales (es decir, células que presentaron señales fluorescentes indicativas de la presencia de cromosomas X e Y en sus núcleos) fueron capturadas, ya que había menos de aproximadamente 300 células femeninas adultas (que se cree que eran principalmente glóbulos blancos.

Doce casetes fueron teñidos con colorante Wrigth-Giemsa para examinar la morfología de las células capturadas. Estos casetes no se usaron para análisis FISH y fueron observadas sólo por microscopía óptica. 2 de estos casetes se proveyeron a un experto en glóbulos blancos nucleados (un inmunólogo de trasplante) quien no informó en cuanto a la naturaleza de la muestra que se había aplicado a los casetes. Este experto opinó que las células capturadas incluyeron una banda irregular y predominantemente "células epitelioides" que tenían granulocitos y células mononucleares entremezcladas con las mismas. Aunque la morfología cistológica de estas células fue descrita por el experto como de tipo epitelial, se creía que eran trofoblastos u otras células grandes. En vista del hecho de que al inmunólogo no se le dijo que esperara que los trofoblastos fetales pudieran estar entre las células observadas. Se sabía que los trofoblastos fetales eran células epiteliales que invaden los vasos sanguíneos maternos en la placenta.

Las células de tipo trofoblasto fetales fueron observadas en la porción de la cubierta del cásete correspondiente a los escalones que tenían distancias de cubierta a escalón de 4.0, 4.2y 4.4 mieras en donde la mayoría de las células que proveyeron una señal para cromosomas X e Y se encontraron. La frecuencia estimada de estas células de tipo trofoblasto fue mucho más alta que la que se esperaría para células cancerosas circulante o para otras células de morfología similar en sangre normal. Esta observación indica que el cásete captura células que normalmente no son observadas (o son observadas sólo en números muy bajos) en circulación humana.

El examen de los casetes usados para los experimentos descritos en este ejemplo indica que el cásete típicamente capturó entre aproximadamente 200 a 4000 células de cada muestra de 1.25 mi de sangre materna. Es evidente de las observaciones de las células capturadas que por lo menos algunas de las células capturadas eran células de origen fetal. Sin embargo, es igualmente evidente que los casetes son capaces de capturar una variedad de otras células de la sangre de muestras de sangre. Estas otras células incluyen glóbulos blancos. El análisis de las posiciones de las cuales las células son capturadas en los casetes usados en estos experimentos reveló que las células fueron capturadas principalmente en 3 regiones distintas. Aproximadamente 30-35% de las células fueron capturadas en la porción del cásete en la cual los escalones que tenían distancias de cubierta a escalón de 5.2 a 5.4 mieras ocurrió. Aproximadamente 25% de las células fueron capturadas en la porción del cásete en la cual los escalones que tenían distancias de cubierta a escalón de 4.0, 4.2 y 4.4 mieras ocurrió. El resto de las células capturadas fueron capturadas en porciones del cásete correspondiente a los escalones intermedios (es decir, aquellos que tenían distancias de cubierta a escalón de 5.0, 4.8 y 4.6 mieras).

Bajo las condiciones usadas en estos experimentos se observó que los neutrófilos capturados (que gemelamente tenían un diámetro de células de aproximadamente 9-10 mieras), fueron capaces de migrar más allá a lo largo de la cámara de separación del cásete en la dirección de flujo de fluido que los monocitos (que gemelamente tenían un diámetro de células de aproximadamente 10-30 mieras), que fueron más frecuentemente retenidos más cerca del lado corriente arriba de la cámara de separación. Estas observaciones indican que el aparato descrito en esta solicitud se puede usar tanto para segregar células fetales de células de sangre materna como para segregar diferentes tipos de células de sangre materna. La observación de que monocitos (relativamente más grandes) tienden a ser más frecuentemente capturados más cerca de la porción corriente arriba de la cámara de separación que los neutrófilos (relativamente más pequeños) soporta la contención de que la capacidad de las células para atravesar la cámara de separación es inversamente dependiente del tamaño. Por lo tanto, estas observaciones indican que los resultados pueden ser extrapolados más allá de las células de la sangre para predecir que las células, ya sean células de la sangre o no (y partículas distintas de la sangre) pueden ser segregados por tamaño usando un aparato tal como aquellos descritos aquí.

Otra observación interesante que se hizo en los experimentos descritos en este ejemplo se refiere a retención preferencial dentro del cásete de monocitos sobre neutrófilos, en relación con sus frecuencias relativas de ocurrencia en la sangre. Las poblaciones de neutrófilos y monocitos dentro de una muestra de sangre normal están generalmente en el intervalo de 50-70% y 2-8%, respectivamente. Es decir, en sangre normal, los neutrófilos tienden a superar a los monocitos en un orden de magnitud o más. Sin embargo, en los experimentos descritos en este ejemplo, la relación de neutrófilos:monocitos fue más cercana (55-65):(35-45). La relación de neutrófilos:monocitos es más alta (1.03:1 en el lado corriente arriba de la cámara de separación y 1.67:1 en el lado corriente abajo) en muestras obtenidas usando los dispositivos descritos aquí quela relación que ocurre en sangre normal (aproximadamente 50:1). Estos resultados indican que el aparato descrito en esta solicitud, por lo menos cuando es configurado como se describe en este ejemplo, captura monocitos de manera más eficiente que captura neutrófilos.

Suponiendo que hay entre 4 y 10 millones de glóbulos blancos dentro de un mililitro de sangre materna, los experimentos descritos en este ejemplo demuestran que el uso del cásete descrito aquí eliminó sustancialmente todos los glóbulos rojos, plaquetas y plasma, y más de 99% de todos los glóbulos blancos nucleados, de una muestra de 1.25 mi de sangre materna, mientras retuvo acervos aparentemente segregables de varias células de interés potencial, incluyendo células fetales. Se supone que hay aproximadamente 2.5-6.25 x 1016 células en una muestra de 1.25 mi de sangre, entonces los resultados descritos en este ejemplo demuestran que el funcionamiento del aparato descrito aquí dio por resultado el paso a través del cásete de esencialmente todas las células, ya que el cásete capturó sólo 553 ± 316 (media + error estándar de la media para una N de 6) mientras aún retuvo células de interés. Este grado de separación de células específico es remarcable - una purificación de aproximadamente 1014 veces, incluso ignorando la segregación de partículas dentro de la región de separación.

Los resultados de los experimentos descritos en este ejemplo demuestran que los casetes descritos en este ejemplo son capaces de acomodar el paso de la sangre a través de un espacio estrecho, definido en una dirección en mieras. En los dispositivos descritos en este ejemplo, la presión de fluido y otras características que pueden alterar la integridad celular y obstruir potencialmente conductos estrechos debido al "empaquetamiento" de células no causó esos efectos en las muestras de sangre que se usaron. La coagulación de la sangre tampoco se observó. Sin estar limitado por alguna teoría de operación particular, se cree que los casetes descritos en este ejemplo proveen una distancia apropiada dentro del cásete para mantener suficiente espacio para permitir el paso de todos los glóbulos rojos, plaquetas y la mayoría de los glóbulos blancos mientras proveen un proceso de selección de separación dependiente del tamaño o diámetro de las partículas.

Los estudios descritos en este ejemplo definieron condiciones de flujo suficientes para el paso de 1.25 mi de sangre a través del cásete con daño mínimo a las células y sin coagulación. Además, el paso de la muestra de sangre se logró en menos de una hora, usando sólo una sola unidad de separación. Este tiempo de separación de células es sustancialmente más corto del que se logra usando otros métodos de separación de células y es suficiente para suministrar subpoblaciones definidas de células sanguíneas dentro de períodos clínicamente y comercialmente relevantes. Estos métodos rápidos y los aparatos usados para realizarlos permiten la recolección de poblaciones de células de interés de diagnóstico, ya sea para diagnóstico fetal prenatal u otras aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas o de investigación. La capacidad para capturar una célula fetal entera, mientras también se permite que la vasta mayoría de otras células pase a través del cásete, puede proveer una muestra genética fetal completa para análisis y detección de anormalidades genéticas, por ejemplo. Estos datos también demuestran que el material capturado por el dispositivo es adecuado para usarse en protocolos de diagnóstico molecular.

El cásete y los métodos descritos en este ejemplo proveen una herramienta valiosa para la selección de células y otras partículas de interés biológico para aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación general en donde es importante ya sea enriquecer una muestra de células o partículas para análisis u obtener una población pura para análisis. Las aplicaciones en genética, análisis fenotípico, análisis epigenético son áreas que pudieran beneficiarse de estos procesos de aislamiento.

EJEMPLO 5 Aislamiento de células fetales a partir de muestras de sangre arterial materna Se cree que los trofoblastos fetales humanos presentan un diámetro generalmente en el intervalo de 14.3 a 30 mieras. El lumen de capilaridades de mamífero puede mostrar un diámetro significativamente más pequeño, del orden de 15 mieras o menor (véase, v.gr., Wang et al., 2007, Exp. Eye Res. 84:108-1 17, en el cual las microesferas que tiene un diámetro >8 mieras administradas a la sangre arterial se observó que no volvían a entrar a la circulación sistémica; Maxwell et al., 1985, Heart Circ. Physiol. 248 (2): H217-H224 de manera similar observaron un límite de tamaño de aproximadamente 9 mieras para microesferas administradas por vía arterial que pasan a través de la circulación capilar intestinal).

En vista de estas observaciones, se determinó que los trofoblastos fetales (y células similarmente grandes) in vivo se concentraran selectivamente sobre el lado arterial de los lechos capilares sistémicos. De esto se desprende la determinación de que los fluidos que están del lado arterial de los capilares sanguíneos son fuentes particularmente adecuadas de trofoblastos fetales. Dichos fluidos pueden incluir sangre arterial, especialmente sangre arterial extraída (con respecto al flujo de sangre fisiológico) de lechos capilares. Estos fluidos también pueden incluir fluidos derivados de sangre arterial antes del paso de la sangre arterial a través de los capilares (v.gr., secreciones pulmonares o bronquiales) u otros conductos estrechos (v.gr., sangre en la arteria hepática común).

Las observaciones descritas en este ejemplo también indican que números significativos de trofoblastos fetales (y células similarmente grandes) se puede esperar que se acumulen en lechos capilares, especialmente en el lado arterial de dichos lechos capilares. La sangre tomada inmediatamente corriente arriba de los lechos capilares se puede esperar que sea relativamente enriquecida en trofoblastos fetales (y células similarmente grandes).

En vista de la rareza relativa de trofoblastos fetales en la circulación materna, la recolección de trofoblastos fetales de lugares del cuerpo en los cuales son enriquecidas puede hacer la diferencia entre la detección y no detección de dichas células. Por lo tanto, las observaciones en este ejemplo sugieren que la obtención de muestras de sangre arterial materna, fluidos derivados de sangre arterial (es decir, antes de que dicha sangre pase a través de los capilares), o sangre materna recolectada inmediatamente corriente arriba de los lechos capilares puede mejorar la probabilidad de que los trofoblastos fetales (y células similarmente grandes) puedan ser recolectadas de dichas muestras, en relación con las muestras de sangre venosa.

EJEMPLO 6 Uso de un marcador de superficie celular para trofoblastos fetales Otros han reportado que el glicoesfingolípido designado globósido ocurre sobre la superficie de los trofoblastos fetales y un número limitado de otras células, y el globósido actúa como el receptor para el parvovirus humano B19. La proteína de cápside VP2 de B19 se une específicamente con globósido de superficie celular. Wegner et al., 2004, Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 12:69-78. Wegner et al., han reportado que cápsides de B19 vacías se unen específicamente con células de trofoblasto vellosas humanas.

Otros han reportado que B19 no se une a globósido solo, sino que más bien se une a un complejo de uno o más glicoesfingolípidos y/u otras moléculas. Kaufmann et al., 2005, Virology 332: 189-198. Independientemente de la identidad exacta de la entrada con la cual B19 y sus proteínas de cápside se unen, B19 y sus proteínas de cápside se unen a trofoblastos fetales humanos y parecen requerir la ocurrencia de globósido en las membranas de esos trofoblastos para dicha unión. Por lo tanto, B19, sus cápsides y proteínas de cápside, y otros agentes de unión a globósido se pueden usar para identificar y segregar trofoblastos fetales humanos de otras células humanas (incluyendo de células humanas que ocurren en la sangre de madres embarazadas y previamente embarazadas).

El globósido es ampliamente expresado en humanos, evidentemente, sólo una porción pequeña de la población humana no expresa globósido en sus células eritroides. La expresión del globósido se ha reportado que es más alta en trofoblastos de fetos humanos en el primer trimestre de desarrollo. Por lo tanto, el globósido se puede usar como un marcador para identificar trofoblastos fetales y la intensidad de expresión de globósido por una célula se puede usar como un indicador de la etapa de desarrollo en la cual el trofoblasto separado del feto, con trofobastos de etapa relativamente temprana que expresan relativamente globósido a un nivel más alto (o densidad de superficie celular) que los trofoblastos de etapa posterior.

En relación con métodos de hibridación in situ fluorescentes que identifican trofoblastos fetales por hibridación con material cromosómico (es decir, del cual sólo una a varias copias existen por célula), métodos de detección celular que implican detección de globósido pueden tener relaciones de señal a ruido significativamente mayores, en vista de la ocurrencia de múltiples moléculas de globósido sobre la superficie de las células. Más aún, la correlación de expresión de globósido con etapa temprana de desarrollo de trofoblasto fetal permite la selección de segregación de células basadas en la intensidad de la expresión de globósido.

El globósido se puede usar como un marcador de superficie celular para identificar trofoblastos fetales y otras células que expresan globósido. Otras características (v.gr., tamaño y conformación de las células) se pueden usar para diferenciar trofoblastos de otras células (v.gr., células eritroides, megacariocitos, células endoteliales y cardiomiocitos fetales) que expresan globósido.

Cualquier reactivo que reaccione específicamente con o se una a globósido se puede usar para identificar células que expresan globósido, incluyendo por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido contra globósido, una proteína de cápside VP2 de parvovirus humano B19 (v.gr., proteína marcada con cromógeno, radio o biotina), cápsides de B19 vacías o virus B19 intactos. Dichos reactivos también se pueden usar como reactivos de captura, por ejemplo adhiriendo en reactivo a una superficie del dispositivo descrito aquí de tal manera que las células que expresan globósido se adhieran específicamente a esa superficie.

EJEMPLO 7 Cultivo y/o proliferación de células segregadas Los métodos y aparatos descritos aquí se pueden usar para la separación y cultivo selectivo de citotrofoblasto fetal para obtener muestra para diagnóstico prenatal no invasivo.

Los trofoblastos fetales pueden ser segregados de otras células de (por ejemplo) una muestra de sangre materna y cultivados al desencadenar primero estas células para invadir y migrar a través de una membrana porosa, dejando atrás células nucleadas maternas contaminantes que son incapaces de dicha invasión. Posteriormente, el trofoblasto fetal puede ser desencadenado para cambiar de un fenotipo invasivo a uno proliferativo usando factores que se sabe que inducen comportamiento proliferativo en estas células. Las células proliferantes se dividen e incrementan su número a un nivel deseado, tal como un número de células suficiente para satisfacer los requerimientos de sensibilidad de tecnologías analíticas existentes. Estos métodos, que implican la inducción de un cambio de un fenotipo invasivo a un fenotipo proliferativo a fin de cultivar selectivamente trofoblastos (u otras células) se pueden usar para diagnóstico prenatal no invasivo de cualquier trastorno que puede ser diagnosticado usando las células fetales cultivadas.

Para facilitar el cambio de fenotipo descrito aquí, el dispositivo de separación de partículas descrito en la presente es modificado añadiendo, en un ejemplo, una membrana porosa revestida o no revestida entre el cuerpo y la cubierta del dispositivo. El dispositivo se opera como se describe aquí para segregar células, y al realizar adicionalmente pasos para separar y amplificar células como se describe en este ejemplo, lo que explota la capacidad de las células fetales para invadir, migrar y proliferar.

El proceso de separación de células El procedimiento descrito en otra parte en la presente es modificado como sigue. El aparato descrito aquí se usa para segregar y enriquecer células fetales de una muestra (v.gr., una muestra de sangre materna) como se describe aquí. Las células segregadas están dispuestas en el hueco 1 1 entre el cuerpo 10 y la membrana 81. El fenotipo invasivo en las células fetales es inducido (v.gr., añadiendo al hueco compuestos que se sabe que inducen dicho fenotipo), que hace que las células fetales se muevan en alejamiento del hueco que contienen células maternas contaminantes a través de la membrana. Las células fetales migratorias se mueven hacia los poros 82 de la membrana 81 e invaden a través de la membrana 81 hacia un espacio de la membrana 81 y la cubierta 12. Dentro de este espacio, el fenotipo de las células fetales es nuevamente cambiado, esta vez a un fenotipo proliferativo, que hace que las células se incrementen en número. La población expandida resultante de células fetales se puede usar como, por ejemplo, para métodos de diagnóstico fetal que requieren material genético fetal. Debido a que estas células se pueden obtener de muestras que se pueden obtener de manera no invasiva del feto (v.gr., de una muestra de sangre periférica materna), estos métodos tienen una ventaja en relación con otros métodos de diagnóstico fetal en que no se requiere perturbación del feto para obtener una muestra fetal.

El aparato y métodos descritos en este ejemplo son útiles para células y partículas distintas a las células fetales también. Se pueden usar no sólo para separación de células fetales, sino también para segregación de bacterias, virus, protozoarios, organismos multicelulares, como gusanos, insectos, parásitos, partículas minerales y orgánicas, moléculas orgánicas e inorgánicas.

La membrana u otra barrera 81 pueden ser porosas o no porosas y se pueden hacer de uno o más materiales y/o revestir con uno o más materiales. El propósito de la membrana u otra barrera 81 es proveer una estructura que permita que por lo menos dos tipos de células en una población sean segregadas con base en su capacidad de por lo menos un tipo de células en la población para unirse con las mismas y/o pasar a través de la misma. Obviamente, múltiples membranas u otras barreras 81 se pueden usar (ya sea secuencialmente o en paralelo, desde el punto de ventaja de una partícula en el hueco 11) en los métodos de aparatos descritos aquí.

Antecedentes Los trofoblastos fetales son muy raros en la sangre periférica materna. Para ser útiles para la mayoría de las tecnologías analíticas existentes, las células fetales en una muestra deben ser segregadas sustancialmente de células no fetales (v.gr., maternas). Los métodos y dispositivos de recolección de células fetales actualmente disponibles con frecuencia son incapaces de producir muestras que tengan suficientes números de pureza de células fetales. Las células fetales útiles no necesitan ser células que existan en el feto correspondiente; para muchas aplicaciones, es suficiente si las células fetales son progenie de células obtenidas del feto.

Normalmente, las células fetales primarias (v.gr., citotrofoblastos en la placenta) pasan filogenéticamente a través de por lo menos dos fenotipos diferentes. En una primera etapa, los trofoblastos fetales presentan un fenotipo proliferativo en el cual crecen, se dividen y se multiplican. Posteriormente se diferencian en un fenotipo invasivo y se mueven de un lado fetal al lado materno de la placenta (es decir, invaden hacia o a través de la placenta). Se cree que los trofoblastos fetales que presentan el fenotipo migratorio invasivo son aquellos que alcanzan el torrente sanguíneo materno, v.gr., a medida que migran hacia la superficie interior (endotelial) de arterias espirales maternas.

Este proceso de cambio de fenotipo en trofoblastos fetales es desencadenado por una combinación de condiciones, incluyendo por cambios en la concentración de oxígeno, y por la aparición de moléculas de señal que causan, inducen o soportan los cambios fenotípicos. Estas condiciones y moléculas de señal se pueden usar para inducir cambio de fenotipo en trofoblastos fetales in vitro, tal como en el aparato y método descritos en la presente.

Expansión in vitro de trofoblastos fetales segregados Los métodos y aparatos descritos en este ejemplo explotan las capacidades naturales de células fetales tempranas para proliferar e invadir para el propósito de permitir la segregación y cultivo de trofoblastos fetales. Esto se logra al desencadenar primero las células de trofoblastos fetales en una muestra para invadir hacia y migrar a través de una membrana porosa (v.gr., usando métodos conocidos tales como aquellos descritos en Logan et al., 1992, Cáncer Res. 52:6001-6009 o Yang et al., 2009, J. Histochem. Cytochem. 57:605-612). Los trofoblastos invaden a través de los poros dejando atrás células nucleadas maternas contaminantes que son incapaces de dicha invasión. Los trofoblastos por lo tanto son segregados de esas células contaminantes.

Los trofoblastos fetales segregados son inducidos para cambiar del fenotipo invasivo a un fenotipo proliferativo usando factores que se sabe que inducen el comportamiento proliferativo (v.gr., uno o más de aquellos descritos en Red-Horse et al., 2004, J. Clin. Invest. 1 14:744-754; Ray et al., 2009, Placenta 30:96-100; Genbacev et al., 1997, Science 277:1669-1672; Gobble et al., 2009, Placenta 30:869-875; Truman et al., 1986, "The Effect of Substrate and Epidermal Growth Factor on Human Placental Trophoblast Cells in Culture, Springer, Berlín; Zhou et al., 2008, "Extreme Makeover: Converting One Cell into Another," Elsevier, Cambridge; U.S. Patent no. 7,244,707). Las células proliferantes se dividen e incrementan en número a un nivel seleccionado, tal como un nivel suficiente para satisfacer los requerimientos de sensibilidad de tecnologías esenciales analíticas existentes.

Las figuras 8A-8B ilustran una modalidad adecuada de la membrana de otra barrera 81. La figura 8A es una vista en elevación de una modalidad de una porción de membrana 81. La figura 8B es una vista amplificada de la porción de la sección vertical de la membrana 81 de la figura 8A tomada a lo largo del plano 8B. En esta modalidad particular, la membrana 81 es porosa y revestida sobre un lado, por lo tanto la figura 8B muestra poros 82 que se extienden a lo largo de la membrana 81 y revestimiento 83. En modalidades mostradas en las figuras 8A-8B, el revestimiento 83 es aplicado a una cara de la membrana 81 , pero no la otra cara, no se extiende hacia los poros 82 y no llena los poros 82.

La figura 9A ilustra un dispositivo que incorpora una membrana u otra barrera 81. La figura 9A es una sección vertical, tomada a lo largo del plano 9A, de un dispositivo del tipo mostrado en la figura 2A e incluye una membrana 81 interpuesta entre el cuerpo 10 y la cubierta 12. Los soportes internos 20 ayudan en el desplazamiento nivelado, uniforme, de la membrana 81 dentro del dispositivo. Los soportes internos 20 también ayudan a definir el hueco, y proveen control sobre el tamaño del hueco 11. Después de que las células son segregadas, una población de células, incluyendo trofoblastos fetales, permanecen dentro del hueco, en comunicación de fluido con la membrana 81. Un reactivo dispuesto en la membrana (v.gr., la proteína VP2 de B19) hace que los trofoblastos fetales se unan con la membrana. Las células que no se unen son removidas del hueco, por ejemplo lavándolo con un fluido que elimina dichas células. El hueco es llenado después con un medio de cultivo y con uno o más agentes capaces de inducir el fenotipo proliferativo en los trofoblastos fetales. Los trofoblastos proliferan en la membrana 81 y/o dentro del hueco 11 y pueden ser cosechados del mismo.

En otra modalidad del dispositivo parcialmente ilustrado en la figura 9A, en lugar de la cubierta 12 hay un segundo cuerpo idéntico 10 con un estructuras de soporte internas 20. Sin embargo, este segundo cuerpo es aplicado de una manera de "espejo" al otro lado de la membrana 81 , por lo que dos cuerpos congruentes idénticos están "en espejo" uno con respecto al otro en ambos lados de la membrana. Esto crea una pluralidad de huecos segregados unos de otros y hacen contacto con caras expuestas de la membrana. En esta modalidad, los huecos 1 1 en ambos lados de la membrana proveen espacio para varias especies, tales como células, moléculas, etc., para penetrar e invadir a través de la membrana desde un hueco al hueco opuesto (es decir, a través de la membrana). Por lo tanto, si la membrana está hecha de un material (v.gr., una película delgada de matriz de membrana basal) a través de la cual los trofoblastos fetales pueden migrar en su fenotipo invasivo y una población de células que incluye trofoblastos fetales invasivos ocurre en una cara de la membrana, puede ocurrir penetración (es decir invasión) de trofoblastos fetales, dando por resultado la aparición de trofoblastos fetales (pero no otras células de la población) en el hueco en el lado opuesto de la membrana. Esta modalidad también provee la oportunidad para introducir o retirar fluidos o muestras no idénticas de los huecos en lados opuestos de la membrana.

La segregación y expansión in vitro de trofoblastos fetales capaces de penetrar dentro de la membrana 81 se puede lograr como sigue, por ejemplo.

Las células fetales y otras células de tamaño similar se pueden aislar de una muestra de sangre periférica materna usando el aparato como se describe aquí (ignorando descripciones relacionadas con la membrana u otra barrera 81 ). La población segregada en tamaño de células se puede lavar con fluido para eliminar sustancialmente glóbulos rojos, plaquetas, otras células pequeñas y plasma. En este punto, por lo menos algunas de las células en la población son trofoblastos fetales, pero puede haber células maternas (v.gr., linfocitos nucleados grandes), en la población también. Sin embargo, esta población de células, que puede ser retenida dentro del hueco 1 1 del aparato, es significativamente (v.gr., 1000 veces) enriquecida para células fetales, en relación con la muestra de sangre materna original.

Un agente se añade al hueco, el agente induciendo trofoblastos fetales en la población para que presenten un fenotipo invasivo. A manera de ejemplo, el hueco puede ser suministrado con una mezcla de gases (es decir, en lugar de o por arriba del líquido en el hueco) que contenga hasta 20% de oxígeno. Este tratamiento hace que los trofoblastos fetales sean capaces de penetrar a través de una membrana 81 con la cual son puestos en contacto (v.gr., si la membrana 81 hace contacto con el hueco 1 1 , o si los trofoblastos son recuperados del hueco 11 y puestos en contacto en otra parte con la membrana 81 ). Si es necesario o deseado, el aparato (o la porción del aparato que contiene las células deseadas puede ser girado o de otra manera manipulado para estimular a las células para presentar un fenotipo invasivo. Alternativamente o adicionalmente, un agente que induce migración de trofoblastos fetales hacia el agente (v.gr., el producto de gen Smurf 2) puede ser secuestrado en el lado de la membrana 81 opuesto al lado de la membrana 81 del hueco 1 1 , induciendo así a que los trofoblastos fetales migren hacia o a través de la membrana.

Después de que los trofoblastos fetales han penetrado a través de la membrana hacia un segundo hueco o hacia un segundo material, pueden ser recolectados. Alternativamente, si un numero o concentración mayor de trofoblastos es deseado, el segundo hueco o el segundo material (u opcionalmente el aparato entero) puede ser sometido a condiciones (v.gr., concentración de oxígeno reducida o adición de factores tales como ciertas cinasas que se sabe que inducen fenotipo proliferativo) que inducen a los trofoblastos a proliferar. Independientemente de si las células son inducidas a proliferar antes de la cosecha, las células pueden ser probadas con una variedad de métodos y reactivos (v.gr., analizando sus características físicas o su capacidad para unirse con la proteína VP2 de B19 descrita aquí) para confirmar su identidad como trofoblastos fetales.

La membrana 81 descrita aquí se puede hacer, o revestir con, una formulación que se asemeje a una matriz extracelular de placenta humana, o de una matriz similar a la membrana basal reconstituida. Los productos comercialmente disponibles para hacer dichas membranas y revestimientos incluyen Matrigel (TM) (Collaborative Research, Lexington, Massachusetts); y el extracto de membrana basal Cultrex (TM; Trevigne, Inc., Gaithersburg, Maryland). Como se muestra en la figura 8B, poros que pueden correr continuamente de un lado de la membrana a otro, conectando así fluidamente las caras opuestas de la membrana unas con otras (y que conectan a manera de fluido los huecos en cada cara de la membrana). El tamaño y la forma del poro así como su revestimiento o relleno pueden depender de la aplicación particular, diseño del dispositivo y del tipo de partícula, células o molécula, etc., que es separada.

Otra modalidad de un aparato adecuado se puede describir con referencia a la figura 9A. En esta modalidad, en lugar del cuerpo 10 puede incluir o portar una capa de soporte y suministro adicional entre la membrana 81 y la cubierta 12. Esta capa, por ejemplo, puede estar hecha de plástico moldeado o extruido o hule de silicón elástico. Esta capa provee dos funciones necesarias para este dispositivo integrado. Primero, esta capa puede suministrar estructura- para proveer el conjunto de canales de suministro para circular el medio de cultivo, y también proveer espacio para la expansión de células objetivo proliferantes/dividibles. Segundo, esta capa puede proveer soporte mecánico tal como rebordes similares a las estructuras de soporte interno 20 en la figura 9A. La membrana puede ser sujetada entre estos rebordes y las estructuras de soporte 20. De esta manera, la transición de fuerza será provista desde la cubierta 12 a través de los rebordes a la membrana 81 a las estructuras de soporte 20 y al cuerpo 10, para asegurar sujeción uniforme plana y extensión de la membrana suspendida entre la cubierta y el cuerpo del dispositivo de separación.

La membrana 81 puede incluir porciones configuradas para dirigir el flujo de fluido, migración de células o ambos. En una modalidad, una membrana de revestimiento 81 de la primera capa 83 es delgada, y una segunda capa es depositada, impresa (o marcada) sobre la primera capa (es decir, en la cara opuesta la cara de la primera capa que hace contacto con la membrana 81 ) para crear rebordes elevados y depresiones (canales). La anchura de las tiras y depresiones se pueden seleccionar con base en qué tan lejos el proceso celular se esperaría que alcanzaran, por lo que las células pueden alcanzar y detectar las depresiones con sus procesos. Después migrar hacia depresiones si hay factores que las atraigan, tales como el flujo de medio en las depresiones. Alternativamente, uno o ambos del cuerpo 10 y la cubierta 12 pueden tener ranuras u otras superficies configuradas que proveen la misma funcionalidad. La membrana 81 , desde luego, puede estar configurada o cortada para ajustarse al hueco 1 1 entre el cuerpo 10 y la cubierta 1 , y puede tener agujeros o accesorios para acomodar otros elementos del aparato (v.gr., puertos de entrada y salida).

La membrana u otra barrera 81 puede tener un espesor uniforme, o el espesor puede variar. Una o ambas caras de la membrana u otra barrera 81 pueden tener una forma, tal como ranurada o moldeada en múltiples patrones repetidos, dependiendo de la aplicación particular, diseño de dispositivo, o del tipo de partícula, células o molécula que es separada. Dichas desviaciones del patrón múltiples también podrían aplicarse a cambios en el material, porosidad y revestimientos de la membrana, que pudieran corresponder o no a las variaciones estructurales y geométricas anteriormente mencionadas.

Dos membranas u otras barreras 81 que tiene una capa de matriz entre ellas se pueden usar en lugar de una sola membrana u otra barrera 81. Los bordes de membranas u otras barreras 81 pueden ser sellados entre si, creando efectivamente una bolsa plana. La matriz puede contener, por ejemplo, medio de cultivo y/o compuestos que inducen un fenotipo invasivo o proliferativo en trofoblastos fetales. A manera de ejemplo, si la matriz incluye un medio de cultivo de células y un factor capaz de inducir un fenotipo proliferativo en trofoblastos fetales, entonces los trofoblastos invasivos que entran a la matriz pueden ser convertidos al fenotipo proliferativo e inducir que proliferen en el medio de cultivo de células.

En una modalidad alternativa de métodos de segregación y proliferación selectiva de células, bacterias de un tipo seleccionado (v.gr., un patógeno humano) pueden ser segregadas de una muestra tomada de un humano e inducir para que proliferen en el aparato descrito aquí.

Las bacterias son muy pequeñas y a menudo son muy difíciles de separar en dispositivos de microfluidos. Sin embargo, las bacterias pueden ser separadas usando un aparato descrito aquí que incluye un aparato de separación de células que segrega células con base en su capacidad para pasar a través de porciones del dispositivo y que también incluye una membrana porosa interpuesta entre el hueco 1 1 del aparato y un medio que selectivamente atrae una o más bacterias de interés y/o promueve proliferación de bacterias. Si la membrana comunica a manera de fluido con un fluido en el hueco 1 1 del aparato, entonces las bacterias en el hueco pueden moverse (activamente o pasivamente) a través de la membrana y proliferar en el medio. Dicho aparato y métodos pueden ser útiles para detectar pequeños números de bacterias en una muestra (v.gr., poblaciones escasas de bacterias u otros patrones microbiológicos en muestras tales como sangre, orina, productos alimenticios, agua de desecho, etc.).

Además de incluir atrayentes o medio de cultivo en el lado de la membrana u otra barrera 81 opuesta al hueco 11 , otros aparatos o composiciones pueden estar localizados en ese espacio. A manera de ejemplo, el espacio se puede usar como un compartimiento de acción/detección, por ejemplo, llenado con gel, para electroforesis en gel de ADN. A manera de ejemplo, bacterias que han migrado hacia el gel pueden ser lisadas y sus ácidos nucleicos pueden ser separados electroforéticamente o pueden reaccionar o hibridar con otros reactivos.

La descripción de cada patente, solicitud de patente y publicación citada aquí es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Aunque el tema ha sido descrito aquí con referencia a modalidades específicas, es evidente que otras modalidades y variaciones de este tema pueden ser contempladas por otros expertos en la técnica sin apartarse de la esencia verdadera y alcance del tema. Las reivindicaciones anexas incluyen todas esas modalidades y variaciones equivalentes.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 .- Un aparato para segregar partículas, el aparato comprendiendo un cuerpo, una cubierta, un elemento de separación y una barrera, el cuerpo y la cubierta definiendo un hueco que contiene el elemento de separación, el hueco teniendo una región de entrada y una región de salida, el elemento de separación teniendo un primer escalón y un segundo escalón y definiendo un conducto escalonado que conecta fluidamente las regiones de entrada y salida, el conducto escalonado incluyendo un primer conducto limitado por el primer escalón y por lo menos uno del cuerpo y la cubierta y además incluyendo un segundo conducto limitado por el segundo escalón y por lo menos uno del cuerpo y la cubierta, el primer conducto teniendo una dimensión estrecha y conectando fluidamente el segundo conducto y la región de entrada; el segundo conducto teniendo una dimensión estrecha más estrecha que la dimensión estrecha del primer conducto; por lo que las partículas que pasan de la región de entrada a la región de salida pueden ser dimensionalmente segregadas por su capacidad para atravesar cualquiera o ambos del primer conducto y el segundo conducto, y la barrera uniéndose a una porción del hueco en el cual se presentan partículas dimensionalmente segregadas, la barrera comprendiendo un material con el cual diferentes partículas interactúan de manera diferente, por lo que las partículas dimensionalmente segregadas pueden ser además segregadas en virtud de su interacción diferencial con la barrera.

2. - El aparato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque las partículas son células suspendidas en un fluido.

3. - El aparato de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el fluido es sangre.

A.- El aparato de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las células incluyen por lo menos una de células tumorales y células madre.

5. - El aparato de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las células incluyen células fetales en sangre maternal.

6. - El aparato de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la barrera es una membrana.

7. - El aparato de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque por lo menos algunas de las células son capaces de penetrar la membrana.

8. - El aparato de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la membrana tiene poros de un tamaño definido.

9. - El aparato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la barrera comprende un anticuerpo que se une específicamente con un subconjunto de las partículas.

10. - El aparato de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el primer conducto está limitado por una superficie plana del elemento de separación que es sustancialmente paralelo a una superficie plana de uno del cuerpo y la cubierta y la anchura de la superficie plana, en la dirección perpendicular a la trayectoria de flujo de fluido volumétrico a través del primer conducto es por lo menos 1 ,000 veces la dimensión estrecha del primer conducto.

11. - El aparato de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el aparato además comprende un compartimiento limitado por la barrera y en la cara opuesta de la barrera del hueco, por lo que las células que pasan a través de la barrera entran al compartimiento.

12. - El aparato de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el compartimiento contiene un medio de crecimiento para soportar el metabolismo y/o proliferación de las células.

13. - Un método de segregación de partículas, el método comprendiendo introducir partículas suspendidas en un fluido en la región de entrada de un aparato que comprende un cuerpo, una cubierta, un elemento de separación y una barrera, el cuerpo y la cubierta definiendo un hueco que contiene el elemento de separación, teniendo una región de entrada y una región de salida, el elemento de separación teniendo un primer escalón y un segundo escalón y definiendo un conducto escalonado que conecta fluidamente las regiones de entrada y salida, el conducto escalonado incluyendo un primer conducto limitado por el primer escalón y por lo menos uno del cuerpo y la cubierta y además incluyendo un segundo conducto limitado por el segundo escalón y por lo menos uno del cuerpo y la cubierta, el primer conducto teniendo una dimensión estrecha y conectando fluidamente el segundo conducto y la región de entrada; el segundo conducto teniendo una dimensión estrecha más estrecha que la dimensión estrecha del primer conducto; y la barrera que se une a una porción del hueco, la barrera comprendiendo un material con el cual diferentes partículas interactúan de manera diferente; y recolectar partículas en la región de salida, por lo que las partículas en la región de salida han sido segregadas de otras partículas.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque las partículas son células.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el fluido es sangre.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque las células incluyen por lo menos una de células tumorales y células madre.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la barrera es una membrana.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque por lo menos algunas de las células son capaces de penetrar la membrana.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el aparato además comprende un compartimiento limitado por la barrera y en la cara opuesta de la barrera del hueco, el método comprendiendo recolectar células de la región de salida hacia el compartimiento.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el compartimiento contiene un medio de crecimiento para soportar el metabolismo y/o proliferación de las células y en donde el método además comprende mantener el aparato bajo condiciones suficientes para soportar la proliferación de las células en el compartimiento.