ES2942508T3 - Un dispositivo microfluídico para la clasificación selectiva de espermatozoides altamente móviles y morfológicamente normales de semen no procesado - Google Patents

Abstract

Se proporciona un chip de microfluidos para la autoclasificación de espermatozoides morfológicamente normales, altamente móviles y con alta integridad de ADN a partir de una muestra de semen fresco. El chip de microfluidos de autoclasificación de esperma tiene una o más cámaras de entrada y cámaras de salida de recolección de esperma, y el centro del canal presenta varias estructuras microfabricadas en diferentes formas y orientaciones geométricas, con diferentes periodicidades y patrones, como una serie de pilares microfabricados que facilitan el transporte de los espermatozoides activos y sanos a la cámara de salida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un dispositivo microfluídico para la clasificación selectiva de espermatozoides altamente móviles y morfológicamente normales de semen no procesado

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos, dispositivos y sistemas para clasificar espermatozoides altamente móviles, morfológicamente normales y/o genéticamente normales a partir de semen no procesado.

Antecedentes de la invención

La infertilidad humana es una enfermedad mundial de proporciones epidémicas, con una estimación de 80 millones de parejas afectadas anualmente. En los países desarrollados, el 1-3% de todos los nacimientos se conciben mediante reproducción asistida, más comúnmente fertilización in vitro (FIV) e inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) [1]. Entre las causas de infertilidad, un tercio son de origen masculino y muchos de estos casos se tratan con reproducción asistida (ART) [2, 3]. Aunque son lo suficientemente potentes como para evitar la infertilidad humana, las técnicas de reproducción asistida por lo general no logran hacerlo, con tasas de nacidos vivos que promedian menos del 35% por ciclo en los EE. UU. en 2014 [4]. Además, la ART puede tener riesgos asociados para la descendencia, que incluyen: (a) mayor riesgo de anomalías en los cromosomas sexuales, (b) mayor riesgo de trastornos de la impronta genómica [5, 6], (c) un controvertido mayor riesgo de defectos congénitos, y (d) transmisión de problemas de infertilidad paterna o materna [7]. Si bien es útil para muchas parejas, la ART todavía tiene una capacidad limitada para superar la mayor parte de la infertilidad humana.

Cuando se usa ART para la infertilidad por factor masculino, los espermatozoides generalmente se procesan con técnicas tradicionales de lavado en gradiente o de natación para mejorar los espermatozoides móviles y morfológicamente normales [8-10]. Con ICSI, los espermatozoides se seleccionan para su uso por embriólogos capacitados que eligen espermatozoides individuales para la inyección de óvulos en función de las características morfológicas [7, 11]. Otros atributos de los espermatozoides que pueden afectar los resultados de la ART, como la calidad del embrión, las tasas de embarazo y aborto espontáneo, incluyen la cromatina del ADN espermático o la integridad cromosómica o los análisis mutacionales o de metiloma, y estos no se consideran en los procedimientos ICSI rutinarios [12-13]. Esto plantea la pregunta de si la técnica ICSI está eludiendo o no las barreras de selección natural importantes y consecuentes para los espermatozoides.

Actualmente, no existen formas fiables de evaluar de forma no invasiva los atributos de los espermatozoides que podrían ser particularmente relevantes para una concepción y un parto exitosos cuando se emplea ICSI. Estas deficiencias en la técnica son abordadas por la presente invención.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un método para la autoclasificación de espermatozoides relativamente móviles o morfológicamente normales con alta integridad de ADN a partir de semen crudo o sin procesar según la reivindicación 1.

La presente invención también proporciona un dispositivo para la autoclasificación de espermatozoides relativamente móviles o morfológicamente normales con alta integridad de ADN a partir de semen crudo o sin procesar según la reivindicación 2. Características ventajosas se definen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 muestra según una realización ejemplar de la invención un esquema de un chip microfluídico de clasificación de espermatozoides con estructuras periódicas. El diseño de chip PDMS de muestra mostrado se cohesiona a un sustrato de vidrio, con un ancho de canal de 1.5 mm, una longitud de 8 mm y una altura de 50 pm. En el medio del canal, las estructuras cilíndricas (de 10 pm de diámetro en esta figura) forman una distribución periódica.

FIG. 2 muestra según una realización ejemplar de la invención el método de distribución periódica simple para captura y aislamiento (SpARTAN, Simple Periodic ARray for Trapping And isolatioN) para seleccionar espermatozoides móviles y morfológicamente normales. Se dan valores de espaciado solo para fines ilustrativos.

FIG. 3 muestra una fotografía de una realización ejemplar del dispositivo microfluídico (barra de escala de 10 mm).

FIG. 4 muestra una imagen SEM de una realización ejemplar de una distribución de estructura periódica en el dispositivo (barra de escala de 50 |jm).

FIG. 5 muestra una imagen FESEM de una realización ejemplar de la distribución periódica de pilares con un espermatozoide celular (barra de escala de 20 jm).

FIG. 6 muestra un diagrama de flujo que esboza el proceso utilizado para ejecutar simulaciones para diseñar algunas realizaciones ejemplares del dispositivo.

FIG. 7 muestra trayectorias simuladas de (n = 100) espermatozoides normales en canales ejemplares con geometrías de distribución de estructura de 18*26jm (izquierda) y 26x26jm (derecha).

FIG. 8 muestra trayectorias simuladas de (n=100) espermatozoides con morfología anormal (cabezas 3 veces más grandes) en un canal con una geometría de distribución de estructura de 30*26jm. FIG. 9 muestra trayectorias simuladas de (n=100) espermatozoides con morfología anormal (cuellos doblados a 18 grados) en un canal con una geometría de distribución de estructura de 30*26jm. FIG. 10 muestra, según una realización no reivindicada de la invención, un método para medir la velocidad en línea recta y curvilínea.

FIG. 11 muestra trayectorias simuladas de (n=100) espermatozoides normales en un canal ejemplar con una geometría de distribución de estructura de 30*26jm.

FIG. 12 muestra trayectorias de espermatozoides en un canal ejemplar con una geometría de distribución de estructura de 30*26jm.

FIG. 13 muestra resultados simulados de la velocidad en línea recta (VSL) de los espermatozoides antes y después de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diversas geometrías de distribución de estructuras.

FIG. 14 muestra resultados experimentales para la velocidad en línea recta (VSL) de los espermatozoides antes y después de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diferentes valores de espaciado entre los pilares de la distribución.

FIG. 15 muestra resultados simulados de la velocidad en línea recta (VSL) de los espermatozoides antes y después de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diversas longitudes.

FIG. 16 muestra resultados experimentales de la velocidad en línea recta (VSL) de los espermatozoides antes y después de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diversas longitudes. FIG. 17 muestra resultados simulados de la velocidad en línea recta (VSL) de los espermatozoides antes y después de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diversos tiempos de incubación.

FIG. 18 muestra resultados experimentales de la velocidad en línea recta (VSL) de los espermatozoides antes y después de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diversos tiempos de incubación.

FIG. 19 muestra, según una realización no reivindicada de la invención, un resumen del método para seleccionar espermatozoides altamente móviles a partir de una muestra sin procesar.

FIG. 20 muestra resultados experimentales de la velocidad curvilínea y la tasa de recuperación de espermatozoides después de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diversas longitudes.

FIG. 21 muestra resultados experimentales de la velocidad en línea recta y la tasa de recuperación de espermatozoides antes de pasar a través de una muestra de canales ejemplares con diversos tiempos de incubación.

FIG. 22 muestra imágenes de microscopio y FESEM de espermatozoides con y sin defectos morfológicos en una realización ejemplar del dispositivo.

FIG. 23 muestra la diferencia en la prevalencia de espermatozoides con defectos morfológicos en una muestra de esperma antes y después del procesamiento con una realización ejemplar del dispositivo.

FIG. 24 muestra el porcentaje de espermatozoides con morfología normal después del procesamiento con diversos métodos, incluso con una realización ejemplar del dispositivo.

FIG. 25 muestra la madurez de los espermatozoides.

FIG. 26 muestra la diferencia en la madurez nuclear de los espermatozoides en una muestra de espermatozoides antes y después del procesamiento con una realización ejemplar del dispositivo. FIG. 27 muestra imágenes de la fragmentación del ADN en los espermatozoides.

FIG. 28 muestra la diferencia en la DFI de los espermatozoides en una muestra de espermatozoides antes y después del procesamiento con una realización ejemplar del dispositivo.

FIG. 29 muestra la diferencia en la metilación global de los espermatozoides en una muestra de espermatozoides antes y después del procesamiento con una realización ejemplar del dispositivo. FIG. 30 muestra los parámetros elegidos para la simulación SRD de espermatozoides.

FIG. 31 muestra las ecuaciones que describen la simulación de grano grueso del dispositivo y el método. FIG. 32 muestra la relación de estados que forman la simulación de grano grueso del dispositivo y el método. FIG. 33 muestra la distribución de los VSL utilizados para simular el dispositivo y el método.

Descripción detallada

Para los fines de la presente invención, se argumenta que el viaje de los espermatozoides a través del tracto reproductivo femenino, un fenómeno conservado en los mamíferos vivíparos a lo largo de millones de años de evolución y reproducción, es un "filtro" naturalmente efectivo para los espermatozoides fértiles. Los componentes físicos de esta vía se imitan in vitro utilizando un enfoque microfluídico, diseñado a través de simulaciones informáticas de múltiples escalas que incorporan la física de fluidos, y se examina cómo esta vía artificial cérvico-uterino-trompas de Falopio influye en las características descriptivas de los espermatozoides, así como medidas más sutiles, pero clínicamente relevantes, de espermatozoides fértiles, incluida la integridad del ADN y el estado del metiloma.

Además, para evitar la evaporación del medio, la(s) entrada(s) y la(s) salida(s) se pueden cubrir con un medio que no se evapora y que es inmiscible en la solución tampón. Un ejemplo de tal medio es el aceite mineral. Luego, el dispositivo se carga depositando una muestra de espermatozoides sin procesar en la(s) entrada(s), a través de un método como una pipeta. Luego, el dispositivo se incuba durante un período de tiempo prescrito, que oscila entre 5 y 120 minutos, según el dispositivo. En este punto, los espermatozoides clasificados se pueden recolectar de la(s) salida(s), nuevamente utilizando un método como una pipeta. Como prueba de concepto, se fabricó un ejemplo de dispositivo microfluídico de clasificación de espermatozoides con estructuras cilíndricas utilizando litografía blanda estándar. En resumen, se usó una capa de 50 micrómetros de grosor de fotoprotector SU-8 para recubrir una oblea de silicio de 4" y se dejó desarrollar sobre esta, creando un microcanal. Posteriormente, se fabricó un chip microfluídico de clasificación de espermatozoides usando Sylgard 184 (Dow Corning, Midland, MI, EE. UU.) en una proporción de 1:10 v/v de base versus agente de curado que se vertió en una oblea de silicio, se desgasificó y se curó a 70 grados centígrados durante 2 horas. Después del curado, las cámaras de entrada y salida se punzonaron con Acu Punch (puntas de 1.0 y 2.0 mm). El canal resultante se selló en un portaobjetos de vidrio utilizando plasma de oxígeno y se horneó a 60 grados centígrados durante 30 minutos antes de su uso. Un esquema de este dispositivo específico se muestra en la FIG. 2,y una fotografía del dispositivo real se muestra en la FIG. 3. En la FIG. 4 se muestra una imagen FESEM de las estructuras periódicas microfabricadas y en la FIG. 5 se muestra un espermatozoide dentro de esta estructura.

El propósito del presente dispositivo es clasificar espermatozoides móviles y sanos de una manera eficiente, aprovechando los efectos hidrodinámicos inducidos por las estructuras periódicas en el canal microfluídico en los espermatozoides. Como hay muchas variables involucradas, como las dimensiones y la forma de la estructura periódica, el espaciado entre los elementos de estructura, la longitud del canal, el tiempo de recolección, etc., se desarrolló un modelo computacional multiescala para optimizar el diseño del canal.

Enfoque

Dado que no está claro ni es obvio cómo se pueden elegir las características geométricas del dispositivo de autodasificación debido a la naturaleza no lineal del acoplamiento fluido-nadador y la presencia de geometrías complejas, creamos un modelo multiescala para simular el movimiento de los espermatozoides en el dispositivo. El modelo se compone de dos piezas: un modelo basado en partículas de grano fino y un modelo de grano grueso que utiliza el movimiento probabilístico a lo largo de la celosía formada por la distribución periódica. Brevemente, el modelo de grano fino utiliza la dinámica de rotación estocástica (SRD), un solvente de mesoescala basado en partículas que se ha utilizado con éxito en numerosos sistemas de materia blanda durante más de una década. En SRD, el fluido se modela en forma de grano grueso, los espermatozoides se incrustan como estructuras de cuentas y resortes y los pilares como barreras impenetrables, todas las cuales interactúan a través de interacciones hidrodinámicas en presencia de fluctuaciones térmicas. Este modelo produce trayectorias microscópicas, que luego se utilizan para entrenar un modelo reticular probabilístico basado en reglas para describir el movimiento de los espermatozoides en una geometría de pilar dada para escalas de tiempo y longitud realistas. Más específicamente, el modelo de grano grueso es un modelo de celosía de tiempo discreto con rotación. En cada etapa de tiempo, el espermatozoide tiene una probabilidad de rotar hacia la derecha o hacia la izquierda que depende de la dirección, seguida de una probabilidad de dar un paso a lo largo de la celosía. Al cargar las reglas de probabilidad producidas a partir del modelo SRD, este modelo puede replicar el comportamiento de los espermatozoides para una gran cantidad de espermatozoides y muchas etapas. La descripción general del enfoque de modelado se muestra en la FIG. 6. Para más detalles, ver más adelante la sección sobre Detalles del Enfoque de Modelado.

Resultados de la simulación sobre la velocidad y la tasa de recolección

Se construyeron varias geometrías de simulación para investigar los efectos que tienen los conjuntos periódicos de obstáculos en el comportamiento de los espermatozoides utilizando nuestro modelo multiescala. Dado que se sabe que los espermatozoides tienen interacciones hidrodinámicas con las superficies cercanas, un resultado plausible de tales interacciones es que diversas disposiciones podrían acelerar, ralentizar o redirigir los espermatozoides incidentes. Nuestras simulaciones mostraron comportamientos en los que, con un espaciado entre pilares suficientemente pequeño, el esperma se atascaría debido a la rigidez del espermatozoide simulado. Sin embargo, una vez por encima de este estrecho confinamiento, encontramos que los espermatozoides mantendrían trayectorias bastante persistentes en la geometría (véase la FIG. 7). Además, si la cuadrícula tuviera una relación de aspecto pequeña en una dimensión y una relación de aspecto grande en la otra (del orden de la longitud de los espermatozoides), los espermatozoides preferirían nadar a lo largo del eje de espaciado largo. Este efecto es, a primera vista, paradójico, ya que se esperaría ingenuamente que los espermatozoides tomen el camino de menor resistencia, es decir, los canales anchos. Sin embargo, cuando los pilares están bastante juntos, actúan de alguna manera como una pared porosa y los espermatozoides son atraídos hacia ellos. Como todos los nadadores empujadores, la geometría de natación de los espermatozoides hace que se vuelvan hacia la superficie contra la que nadan. Al interactuar con una superficie plana, esto hace que los espermatozoides la sigan. Sin embargo, cuando la superficie tiene espacios de tamaño suficiente y geometría favorable, los espermatozoides girarán adentro del espacio y nadarán a través de este. El efecto neto es la redirección de los espermatozoides.

Tener la opción de redirigir los espermatozoides nos permite dar un camino por el que los nadadores activos (espermatozoides sanos) viajarán preferentemente, mientras que los desechos y los espermatozoides muertos estarán limitados por la difusión. Esto nos permitirá fabricar dispositivos mucho más pequeños y rápidos para la separación y selección de espermatozoides sanos.

Resultados de la simulación sobre la selección morfológica

Además, estudiamos los efectos diferenciales de las geometrías de pilares en los espermatozoides con defectos morfológicos. Ejemplos de trayectorias simuladas de espermatozoides con un cuello doblado y una cabeza el doble de grande se muestran en las FIGs. 8 y 9. Como ilustran ambos casos, encontramos que los impedimentos geométricos periódicos fomentan el comportamiento de giro de los espermatozoides y, por lo tanto, los confinan de manera más efectiva que un simple canal.

Resultados experimentales

Usando las predicciones de las simulaciones como guía, fabricamos un canal microfluídico de muestra de prueba de concepto que presenta distribuciones periódicas cilíndricas de alta relación de aspecto. Más específicamente, las dimensiones del chip microfluídico fabricado son de 8 mm de largo y 1.5 mm de ancho con diámetros de cámara de entrada y salida de 1 mm y 2 mm, respectivamente. En el medio del canal, se colocan estructuras cilíndricas de 10 pm de diámetro a una distancia específica entre sí.

Se realizó análisis de clasificación de espermatozoides utilizando una muestra de semen descartada sin identificar del Laboratorio IVF, Escuela de Medicina de Stanford. Inicialmente, el chip microfluídico de clasificación de espermatozoides se llenó previamente con medio de lavado de espermatozoides y se colocó una capa delgada de aceite mineral en la parte superior de la salida de medio para evitar la evaporación del medio durante el análisis de clasificación de espermatozoides. Al depósito de entrada se añadió una muestra de semen descartado no identificado con un volumen de 0.5-2 pL (4000-6000 espermatozoides/pL) y luego se cubrió la entrada con una capa de aceite mineral. Posteriormente, el chip clasificador de espermatozoides se colocó en una incubadora a 37 °C durante 15 minutos. Finalmente, se tomaron imágenes del chip de clasificación y se analizaron mediante microscopía óptica (Carl Zeiss, Axio Vision 4.8.2. SP3) para determinar el porcentaje de espermatozoides móviles, la trayectoria de los espermatozoides y el porcentaje de recuperación en la salida.

Se midieron los parámetros cinemáticos de trayectoria de espermatozoides, tales como la motilidad de espermatozoides, la velocidad curvilínea (VCL) y la velocidad en línea recta (VSL). VCL se refiere a la distancia que cubre la cabeza del espermatozoide durante el tiempo de observación. VSL se refiere a la distancia en línea recta entre los puntos inicial y final de la trayectoria de los espermatozoides (véase las FIG.

10). El porcentaje de espermatozoides móviles se definió como la fracción de espermatozoides móviles en relación con el recuento total de espermatozoides.

Nuestros resultados experimentales y de simulación concuerdan excelentemente mostrando cómo se obtuvieron los parámetros de diseño exitosos usando simulaciones por ordenador. Las FIGs.

11 y 12 muestran trayectorias de espermatozoides experimentales in vitro y simuladas por ordenador para la periodicidad de distribución de 30*26pm. Los valores de velocidad en línea recta (VSL) se comparan en la entrada frente a la salida después de 30 minutos de incubación de la FIG. 13, las simulaciones multiescala, y experimentos de la FIG. 14, para diferentes periodicidades de distribución. La FIG. 15 muestra valores de velocidad en línea recta (VSL) obtenidos de las simulaciones multiescala de las trayectorias de espermatozoides en la entrada y la salida (después de 30 min. de incubación), para longitudes de canal variables con una periodicidad de distribución de 30*26 pm. La FIG. 16 muestra mediciones experimentales de VSL para canales con una periodicidad de distribución de 30x26 pm con longitudes variables (30 min. de incubación en la salida). La clasificación de espermatozoides para tiempos de incubación variables en la salida en comparación con el canal vacío se ilustra a través del análisis ^v S^l para la simulación de la FIG. 17, y las mediciones experimentales de la FIG. 18.

La FIG. 19 muestra ilustraciones esquemáticas del proceso de clasificación de espermatozoides: el semen se carga inicialmente en el dispositivo, se deja incubar y luego se recuperan y analizan los espermatozoides de salida, junto con imágenes microscópicas de las trayectorias de espermatozoides en la entrada, la zona de pilares y la salida. La FIG. 20 muestra mediciones experimentales de VCL en la eficiencia de recuperación de espermatozoides del chip SPARTAN con longitud de canal variable. La FIG. 21 muestra mediciones experimentales de VCL en la eficiencia de recuperación de espermatozoides del chip SPARTAN con tiempo de incubación variable.

La FIG. 22 muestra imágenes de microscopía de espermatozoides teñidos con Diff-Quick e imagen FESEM con diferentes defectos morfológicos, (i) normales, (ii) de cuello doblado y (iii) de cabeza grande (barra de escala de 10 pm). La FIG. 23 muestra semen crudo (las flechas muestran los espermatozoides anormales) y los espermatozoides clasificados usando el chip SPARTAN (barra de escala de 50 pm). La FIG. 24 muestra el análisis morfológico SK de espermatozoides procesados mediante la técnica swim-up, vacío y chips SPARTAN. Juntos, estos resultados muestran cómo el dispositivo es capaz de filtrar espermatozoides con defectos morfológicos.

La FIG. 25 muestra una imagen de microscopía de una tinción con azul de anilina ácida que muestra diferentes fases de madurez nuclear de los espermatozoides. La FIG. 26 muestra el análisis del porcentaje de madurez nuclear de los espermatozoides clasificados utilizando el chip SPARTAN en comparación con los de una muestra de semen sin procesar (n=5 muestras de semen). La FIG. 27 muestra imágenes teñidas con fluorescencia del análisis de la fragmentación de ADN espermático usando el ensayo TUNNEL. La FIG.

28 muestra el análisis del índice de fragmentación de ADN (DFI) de espermatozoides clasificados por el chip SPARTAN en comparación con los de una muestra de semen sin procesar (n = 5 muestras de semen). La FIG. 29 muestra el análisis de metilación global de espermatozoides sin clasificar y clasificados por el método SPARTAN.

Notas adicionales

Los espermatozoides se mueven más rápido dentro de las estructuras periódicas, de forma similar a un campo de flujo autoinducido. Una novedad del sistema es que las estructuras que se colocan periódicamente dentro del canal cambian la forma en que se mueven los espermatozoides. Por ejemplo, los espermatozoides con morfologías deformadas interactúan y siguen vías diferentes que los espermatozoides con morfología normal. Esto se ve facilitado por las interacciones hidrodinámicas entre los espermatozoides y las estructuras periódicas. Se observa que los espermatozoides se mueven más rápido — en comparación con sus contrapartes en la entrada o la salida --- dentro de la geometría de pilares debido a efectos que incluyen interacciones hidrodinámicas, y pueden considerarse como un campo de flujo autoinducido generado por los espermatozoides. No es obvio que los espermatozoides realmente interactúen con los impedimentos periódicos en el canal de tal manera que elijan preferiblemente caminos más estrechos. Hay evidencia de vínculos entre la calidad genética y epigenética de los espermatozoides y su morfología y motilidad, afectando así su función. El efecto neto de estas estructuras geométricas, por lo tanto, es clasificar los espermatozoides funcionales, lo cual es único y no es un resultado obvio.

También vemos en ciertas periodicidades que los espermatozoides se mueven más rápido en las áreas de impedimento periódico del canal que en el exterior. Según la geometría de los impedimentos de canal, el movimiento de cola de espermatozoide y la morfología de espermatozoide, este efecto se puede aprovechar para clasificar los espermatozoides de manera más eficaz. Se utilizan simulaciones por ordenador para desarrollar los diseños óptimos y se han utilizado para guiar los experimentos iniciales y el desarrollo de prototipos. Este es un efecto que es único y no se esperaba. Una expectativa ingenua sería que estos impedimentos periódicos ralentizarían los espermatozoides a medida que avanzan; sin embargo, encontramos que los espermatozoides se pueden acelerar o desviar en diferentes direcciones dependiendo de las especificaciones de la geometría. Esto conduce a un inesperado fenómeno de autoclasificación.

El canal fluídico utilizado en esta invención no tiene movimiento ni flujo, y el fluido del interior no se impulsa activamente. Todo el proceso de clasificación ocurre sin ningún flujo externo o fuerzas de actitud del canal. La fuente de movimiento de los espermatozoides se debe a su propia motilidad, que tiene un patrón único y varía de un espermatozoide a otro, especialmente en muestras con problemas morfológicos o clínicamente problemáticas. Este movimiento autoinducido único de los espermatozoides conduce al comportamiento de autoclasificación, que nunca antes se había informado en presencia de estructuras periódicas. Esto es especialmente llamativo dado que podemos alterar los efectos de clasificación ajustando la periodicidad y la forma de los impedimentos que colocamos frente a los espermatozoides. Estas propiedades se pueden cambiar entre diferentes grupos de filas y/o columnas para inducir capacidades de clasificación específicas. Una gama ejemplar para las periodicidades es, como hemos observado en nuestras simulaciones por ordenador, que estos efectos que permiten la clasificación son pronunciados para valores de espaciado de periodicidad en el intervalo de uno a quinientos micrómetros.

Dimensiones del dispositivo de autoclasificación

En dispositivos ejemplares, las dimensiones del dispositivo de autoclasificación y la distribución de estructuras espaciadas periódicamente podrían ser las siguientes:

• Espaciado de ancho o largo entre pilares en la distribución: 1-250 micrómetros, 5-200 micrómetros o 5-30 micrómetros.

• Altura de los pilares en una distribución: aproximadamente 50 micrómetros con un intervalo de 20 a 80 micrómetros.

• Longitud de la entrada: aproximadamente 2 mm con un alcance hasta 4 mm.

• Longitud del canal: aproximadamente 4 mm con un alcance hasta 20 mm.

• Longitud de la salida: aproximadamente 2 mm con un alcance hasta 4 mm.

Detalles del modelado

Se usó un enfoque que combinaba las fortalezas del detalle del comportamiento capturado por simulaciones de grano fino, junto con la eficiencia computacional de modelos de grano grueso. Se comenzó caracterizando el comportamiento microscópico de los espermatozoides en la geometría específica bajo consideración. Una vez que se tenían suficientes datos sobre el movimiento de los espermatozoides en esta geometría, se puede usar esa información para extrapolar rápidamente trayectorias más grandes, lo que permite examinar su comportamiento de masa durante largos períodos de tiempo.

Modelo de espermatozoides de grano fino: Se modelan los espermatozoides como una cadena de cuentas y resortes utilizando un potencial de Hooke para evitar que se estiren y se doblen. Los enlaces no rectos se logran al rotar el segundo de los segmentos que forman un enlace en el ángulo deseado de energía mínima para ese enlace [14].

Modelo de solvente: Los espermatozoides se acoplan a un solvente de mesoescala simulado utilizando una técnica conocida como dinámica de rotación estocástica (SRD). Esta técnica modela el fluido como un conjunto de partículas puntuales, procediendo en etapas de tiempo discretas, y cada etapa de tiempo consiste en dos procesos. En la primera etapa (flujo), las partículas se mueven balísticamente, mientras que en la segunda etapa (colisión), las partículas intercambian impulso con sus vecinas locales en una única colisión colectiva [15-18].

Para acoplar el modelo de espermatozoides a este solvente, las cuentas de esperma se incluyen en las colisiones colectivas, lo que les permite intercambiar impulso con el fluido. Este acoplamiento también se usa para insertar la distribución de estructura periódica en la simulación. Las estructuras de distribución consisten en partículas que se confinan para que no puedan moverse. Además, las cuentas del espermatozoide y las del obstáculo interactúan con un potencial truncado de Lennard-Jones, proporcionando una interacción repulsiva rígida que impide que el espermatozoide cruce el obstáculo y complementando las interacciones hidrodinámicas mediadas por el fluido SRD. [14] Dado que el solvente SRD tiene varias propiedades, incluida la viscosidad, que dependen de la temperatura, es necesario garantizar que la temperatura general del sistema sea constante a lo largo del tiempo. Para lograr esto, se inserta un proceso de termostato en la etapa de colisión [19]. Todos los parámetros del modelo se muestran en la FIG. 30.

Modelo de celosía de grano grueso: Para modelar un gran número de espermatozoides moviéndose a lo largo de un período de tiempo prolongado, se desarrolló un modelo de grano grueso para el movimiento de los espermatozoides a través de una celosía. Este modelo consideró que hay un número finito de direcciones a las que un espermatozoide puede estar mirando mientras viajan a través de la cuadrícula, y que su movimiento dependerá de la dirección. En cada etapa, existe la probabilidad de que el espermatozoide gire a la izquierda o a la derecha, cambiando su estado al siguiente. Esto está representado por un modelo de Markov del estado direccional de los espermatozoides. En función del estado, también existe la probabilidad de que los espermatozoides se muevan en una de las direcciones cardinales.

Se etiqueta la probabilidad de movimiento como P(i, d) y la probabilidad de rotación como Q(e,d), donde i son las direcciones {izquierda, arriba, derecha, abajo}, d es la dirección en la que mira actualmente el espermatozoide, y e es la dirección en la que mirará a continuación. La evolución del estado consiste en dos partes, como se muestra matemáticamente en la FIG. 31 y gráficamente en la FIG. 32. Las etapas de movimiento y rotación se alternan para hacer avanzar la posición del espermatozoide y la orientación direccional a través del tiempo.

Transición entre modelos: Las simulaciones SRD producen trayectorias del espermatozoide (definido por el centro de masa de la cabeza), así como su ángulo (definido como el vector que conecta el centro de masa de la cabeza y el punto de inserción del cuello), en función del tiempo. Estos datos están en unidades de los parámetros SRD. El modelo de celosía, sin embargo, requiere unidades de pilares y ciclos de cola. Para convertir esto, los datos de posición primero se desgranan en coordenadas enteras en una cuadrícula definida por los pilares. El tiempo se discretiza haciendo un promedio de bloque a un punto por ciclo de nado. Para limitar la cantidad de computación requerida para determinar las probabilidades de movimiento, la simetría del sistema se usa para contar cada trayectoria tanto como si estuviera rotada 180 grados. En otras palabras, una trayectoria en la que el espermatozoide comienza mirando hacia la izquierda y luego sube es equivalente a una en la que comienza mirando hacia la derecha y luego baja.

Sin embargo, el modelo de celosía no utiliza directamente trayectorias; necesita las probabilidades de transición para que, en cada etapa, los espermatozoides se muevan y giren. Para categorizar las diferentes direcciones a las que pueden enfrentarse los espermatozoides, se crea un histograma de la distribución de ángulos, y sus mínimos se utilizan para separar categorías. Cada categoría forma una orientación discreta que los espermatozoides pueden adoptar en el modelo de celosía. Esta trayectoria de grano grueso se utiliza luego para calcular las probabilidades de transición de movimiento y rotación. En cada etapa, se registra si el espermatozoide cambia de categoría de ángulo o de posición en la celosía. Los resultados de cada categoría se promedian en cada etapa realizada por cada espermatozoide, para obtener una distribución final de probabilidades. Estas probabilidades se utilizan luego para alimentar el modelo de celosía.

Primero, la velocidad de natación del espermatozoide se calibra frente a los resultados experimentales. Esto se hace utilizando los resultados SRD iniciales, midiendo la VSL y la VCL del espermatozoide simulado en las unidades SRD. El espaciado de pilares establece una conversión entre SRD y unidades de longitud física, y el parámetro SRD para la forma de onda de cola una conversión entre unidades SRD y ciclos de cola. Para cada espermatozoide en las pruebas de simulación de celosía, su velocidad objetivo se extrae de la distribución de velocidad medida experimentalmente como se muestra en la FIG. 33. Esta velocidad se multiplica por el tiempo de incubación de esa prueba, para obtener una distancia efectiva total. Esta longitud de camino total se multiplica luego por los micrómetros para el factor de conversión de ciclo de cola, para obtener un número total de ciclos de cola, cada uno de los cuales corresponde a una etapa de simulación de celosía, para ese espermatozoide. En este punto, la simulación puede continuar realizando esa cantidad de etapa como se ha descrito anteriormente. En cada etapa, se registra la posición de los espermatozoides y las posiciones finales se utilizan para determinar qué espermatozoides alcanzan la salida y se recolectan y cuáles no. Para los que se recolectan, se registra su velocidad y todos se promedian para producir los resultados generales.

REFERENCIAS

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[2] Turchi, P., Prevalencia, definición y clasificación de la infertilidad, en gestión clínica de la infertilidad masculina. 2015, Springer. pág. 5-11.

[3] Tasoglu, S., et al., Agotamiento de los espermatozoides que compiten en la naturaleza que imitan los canales microfluídicos durante la clasificación. Small, 2013. 9(20): pág. 3374-3384.

[4] Manipalviratn, S., A. DeCherney y J. Segars, Trastornos de impronta y tecnología de reproducción asistida. Fertility and sterility, 2009. 91(2): pág. 305-315.

[5] Maher, E.R., M. Afnan y C.L. Barratt, Riesgos epigenéticos relacionados con las tecnologías de reproducción asistida: epigenética, impronta, ART e icebergs? Human Reproduction, 2003. 18(12): pág.

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[6] Belva, F., et al., Calidad del semen de crías ICSI de adultos jóvenes: los primeros resultados. Human Reproduction, 2016.

[7] Henkel, R.R. y W.-B. Schill, Preparación de esperma para ART. Reprod Biol Endocrinol, 2003. 1(1): pág.

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[8] Mortimer, D. y S. Mortimer, Métodos de preparación de esperma para la reproducción asistida. Annals of the Academy of Medicine, Singapur, 1992. 21(4): p. 517-524.

[9] Asghar, W., et al., Selección de espermatozoides humanos funcionales con mayor integridad de ADN y menos especies reactivas de oxígeno. Advanced healthcare materials, 2014. 3(10): pág. 1671-1679.

[10] Berkovitz, A., et al., Cómo mejorar el resultado de la FIV-ICSI mediante la selección de espermatozoides. Reproductive biomedicine online, 2006. 12(5): pág. 634-638.

[11] Sivanarayana, T., et al., Ensayo de fragmentación del ADN espermático por dispersión de cromatina espermática (SCD): correlación entre la fragmentación del ADN y el resultado de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Reproductive Medicine and Biology, 2014. 13(2): pág. 87-94.

[12] Daris, B., et al., Anomalías morfológicas del esperma como indicadores de la fragmentación del ADN y la fertilización en ICSI. Archives of gynecology and obstetrics, 2010, 281(2): pág. 363-367.

[13] Mohammad, H.N.-E., et al., Efecto del daño del ADN espermático y la deficiencia de protamina espermática en la fertilización y el desarrollo del embrión después de la ICSI. Reproductive biomedicine online, 2005. 11(2): pág. 198-205.

[14] Y. Yang, J. Elgeti y G. Gompper. Phys Rev E 78, 061903 (2008).

[15] Malevanets y R. Kapral. J Chem Phys 110, 8605-8613 (1999).

[16] E. Tüzel, M. Strauss, T. Ihle y D. M. Kroll. Phys Rev E 68, 036701 (2003).

[17] E. Tüzel, T. Ihle y D. M. Kroll. Phys Rev E 74, 056702 (2006).

[18] E. Tüzel, Ph.D. Tesis, Universidad de Minnesota (2006).

[19] H. Híjar y G. Sutmann. Revisión física E 83046708 (2011).

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un método de autoclasificación de espermatozoides morfológicamente normales, relativamente móviles y con alta integridad de ADN a partir de semen crudo o sin procesar, que comprende:

(a) proporcionar un canal fluídico con una entrada en un extremo y una salida en el otro extremo, en donde una distribución de estructuras de pilares se espacian periódicamente dentro del canal fluídico, en donde el espaciado entre estructuras de pilares adyacentes oscila entre un micrómetro y 250 de micrómetros,

(b) inducir semen crudo o sin procesar que contiene espermatozoides en la entrada del canal fluídico; y

(c) recoger en la salida espermatozoides clasificados del canal fluídico, en donde los espermatozoides clasificados han sido autoclasificados por sus propios movimientos autoinducidos dentro del canal fluídico a través de sus interacciones con la distribución periódicamente espaciada de estructuras de pilares, en donde el dispositivo y la autoclasificación funcionan sin el uso de ningún flujo, fuerzas o mecanismos externos para alimentar el esperma crudo o sin procesar a través del canal fluídico, y en donde la autoclasificación produce en la salida espermatozoides de movilidad relativamente alta o morfológicamente normales con alta integridad de ADN en comparación con los espermatozoides no clasificados.

2. Un dispositivo para autoclasificar espermatozoides morfológicamente normales, relativamente móviles y con alta integridad de ADN a partir de semen crudo o sin procesar, que comprende:

un canal fluídico con una entrada en un extremo y una salida en el otro extremo, en donde el canal discurre en la dirección longitudinal del dispositivo, en donde la entrada y la salida definen dos puntos de un eje que discurre en la dirección longitudinal, en donde una distribución de estructuras de pilares se espacia periódicamente dentro del canal fluídico, en donde la longitud entre estructuras de pilares adyacentes varía de 18 a 26 micrómetros en una dirección paralela al eje y el ancho entre estructuras de pilares adyacentes varía de 26 a 30 micrómetros en una dirección en ángulo recto con el eje,

en donde la entrada se usa para la inducción del semen crudo o sin procesar al canal fluídico, en donde la salida se utiliza para la recolección de espermatozoides clasificados del canal fluídico, en donde los espermatozoides clasificados han sido autoclasificados por sus propios movimientos autoinducidos dentro del canal fluídico a través de sus interacciones con la distribución periódicamente espaciada de estructuras de pilares,

en donde el dispositivo y la autoclasificación funcionan sin el uso de ningún flujo, fuerzas o mecanismos externos para alimentar el esperma crudo o sin procesar a través del canal fluídico, y en donde la autoclasificación produce en la salida espermatozoides relativamente móviles o morfológicamente normales con alta integridad de ADN en comparación con el semen sin procesar.

3. El dispositivo de la reivindicación 2 en donde la geometría de los pilares es cilíndrica, cuadrada, rectangular, hexagonal, otros tipos de formas de prisma, o cualquier otro patrón de teselado.

4. El dispositivo de la reivindicación 2, en donde los pilares están desnudos o recubiertos con un producto químico para atraer o repeler los espermatozoides.