CN101446583A - 用于分选精子的微流控芯片结构及方法 - Google Patents

Abstract

一种用于分选精子的微流控芯片结构及方法，结构包括本体；本体表面有四个池，本体内有两条样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、处理液收集通道、两条样本收集通道；公共传输通道的高度为10～100微米及宽度为100～900微米，除公共传输通道外，其它通道的高度都为10～100微米及宽度都为50～500微米。方法包括步骤：用磷酸盐缓冲液冲洗各通道，用小牛血清润洗通道，吸尽各池中的液体，用精子处理液充满各通道水化；加相应的新鲜精液和精子处理液，在预定温度下恒温一定时间，吸取池中的收集液，对其中的精子进行活力、形态分析及功能评价。本发明操作容易，能减少对精子的损伤，及分选时间短、精液标本可重复利用。

Description

用于分选精子的微流控芯片结构及方法

技术领域

本发明涉及一种用于分选精子的结构及方法，更具体地说，本发明涉及一种用于分选精子的微流控芯片结构及方法。

背景技术

不孕不育一直是世界关注的研究课题之一。有报道指出，全球育龄夫妇中约有10％存在不孕不育问题，其中约有一半原因是由男性因素引起的。而在成年男性中，精子质量是影响受孕的关键因素之一。随着辅助生殖技术的普遍开展，越来越多的男性少、弱精子症患者求助于这一技术，使以前无法治疗的男性不育患者得以解决生育问题。

然而，在辅助生殖技术中重要的一步是精子的分选，而精子体外分选的方法也越来越多，传统的精子分离技术包括上游法、密度梯度离心法、泳动沉淀法、玻璃纤维过滤法、王氏管法、流式细胞术等。

上游法是常用的一项精液处理技术。利用精子的泳动能力，让活动力良好的精子通过向上泳动进入培养液层中，而死精子、细胞残片等则滞留在下层，收集上层培养液则可获得高活率的精子，从而达到优选精子的目的。该方法操作容易，获得精子的活率高，应用广泛。但处理过程中丢失精子量较多，主要用于精液质量较好和“相对正常”的精液。

密度梯度离心法可用于质量相对较差的精液。利用正常精子与畸形精子、不活动精子及其他细胞成分在浮力、密度方面存在的差异，通过梯度离心技术分离到正常的精子。此方法丢失精子少，适用于少精、弱精的分离，但死精子稍多、异物多。

泳动沉淀法是一项较为复杂的精液分离技术，使用内含一锥形体的特制玻璃或塑料管，使精子在1小时内直接从液化精液中上游到上层液中，随后再沉淀到内部的锥形管里，即上游法加一个沉淀的步骤。由于需要特殊的设备，该法很少在临床应用。

玻璃纤维过滤法是利用精子的自身运动和玻璃纤维的过滤作用，使活动精子与不动精子分离，可产生高比例的顶体完整的精子。精液处理效果与选用的玻璃纤维种类、规格等直接相关；对精子的破坏及过滤过程中玻璃纤维破碎的潜在危险，则主要取决于所用玻璃纤维的种类和过滤时冲洗的强度。

王氏管法采用了王氏管系统，王氏管系统为一平置性抗重力型长距离，多方向多角度和浓集型的精子竞争性分离纯化系统。其操作容易，不需添加任何抗生素即可获得足够数量的完全无菌的优质精子，但费用昂贵，较难在临床推广应用。

流式细胞术是近年发展起来的一种分选精子的新方法。流式细胞仪进行精子分离前，需用含有可与DNA结合的荧光素染料(Hoechst 33342)的稀释液对精液进行稀释和培养。分离时，在该系统中，稀释精液首先以极高的速度喷出，形成一个个极微小的液滴。存在于微滴中的单个精子继而受到激光照射，产生出相应的光散射信号和某种颜色的荧光信号，后者是由与DNA链定量结合的染料受到某种波长的光的激发而发射出来的。光散射信号的强弱反映精子细胞的大小、形态等；而荧光信号的强度测出该精子的DNA含量。带负电荷的X精子和带正电荷Y精子在电场中向前运行时发生定向偏转。X精子移向电场的正极，Y精子偏向负极。这样，X精子和Y精子就可被分别收集到不同的容器中而予以分离，不含精子的微滴以及类型不能被识别的模糊精子会被仪器弃掉。现已证实，分离过程会损伤精子细胞膜，从而影响精子质量。精液在分离过程中的高倍稀释，分离和分离前洗脱精浆都会降低精子质膜的稳定性而导致提前获能。由此我们可以看出流式细胞仪分析是目前为止最为有效的分选方法，但其安全性有待于对出生婴儿的发育情况的随访，另外其费用相对昂贵，因此在临床较难推广。

综上所述，上述各种分选精子的方法都存在各种不足，如在精液处理过程中需要离心处理，过多的离心步骤可能会造成精子的机械性损伤和氧自由基增加，导致精子过氧化损伤，引起精子质量降低而影响精卵结合，又如在处理少精症病人精液处理过程中大量正常形态的活动精子被丢失，以及费用昂贵等。如何解决上述问题，成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种操作容易，不需要离心处理，能够减少对精子的损伤，并且精液标本可重复利用的用于分选精子的微流控芯片结构。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种实现上述结构的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：

一种用于分选精子的微流控芯片结构，包括本体；在本体表面左侧设有样本加样池和处理液加样池，在本体表面右侧设有样本收集池和处理液收集池；在本体内设有与样本加样池分别相连的两条样本传输通道，在本体内设有与样本收集池分别相连的两条样本收集通道，在本体内还设有处理液传输通道、公共传输通道和处理液收集通道；所述样本加样池经样本传输通道连通公共传输通道，处理液加样池经处理液传输通道连通公共传输通道，所述公共传输通道经样本收集通道连通样本收集池，公共传输通道经处理液收集通道连通处理液收集池；所述样本传输通道、处理液传输通道、样本收集通道及处理液收集通道的高度都为10～100微米，样本传输通道、处理液传输通道、样本收集通道及处理液收集通道的宽度都为50～500微米，公共传输通道的高度为10～100微米及宽度为100～900微米。

所述样本传输通道、处理液传输通道、样本收集通道、处理液收集通道以及公共传输通道的高度都为50微米，样本传输通道和样本收集通道的宽度都为100微米，处理液传输通道和处理液收集通道的宽度都为300微米，公共传输通道的宽度为500微米。

所述本体由聚合物平板和封接平板叠合组成并在本体内形成封闭通道，该封闭通道由所述样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、样本收集通道以及处理液收集通道形成；所述样本加样池、处理液加样池、样本收集池以及处理液收集池设置在聚合物平板的表面。

在所述聚合物平板上设置有用于作为检测区的凹槽。

本技术方案还设有与凹槽相连接的正负压装置。

所述聚合物平板由聚二甲基硅氧烷材料制成，封接平板由石英或玻璃或聚二甲基硅氧烷材料制成。

一种用于分选精子的方法，其包括以下步骤：步骤1用磷酸盐缓冲液冲洗权利要求1所述的样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、处理液收集通道以及样本收集通道，再用含量为0.5％～1.5％的小牛血清润洗上述通道，吸尽权利要求1所述的样本加样池、处理液加样池和处理液收集池、样本收集池中的液体，然后用精子处理液充满上述通道水化3～8分钟；步骤2在所述样本加样池、处理液加样池中各加入60～100微升液化后的新鲜精液和精子处理液，在35℃～40℃的条件下恒温25～35分钟后，吸取处理液收集池中的收集液，对收集液中的精子进行活力分析、形态分析及功能评价即可。

在本技术方案的步骤1中，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗所述的样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、处理液收集通道以及样本收集通道，再用含量为1％的小牛血清润洗上述通道两次，吸尽样本加样池、处理液加样池和处理液收集池、样本收集池中的液体，然后用精子处理液充满上述通道水化5分钟；在步骤2中，在所述样本加样池、处理液加样池中各加入80微升液化后的新鲜精液和精子处理液，在37℃的条件下恒温30分钟后，吸取处理液收集池中的收集液，对收集液中的精子进行活力分析、形态分析及功能评价即可。

通过采用本发明的结构及方法，从样本加样池加入待处理的精液标本，从处理液加样池加入精液处理液，从样本收集池回收含有活动力差的精子和圆细胞的精液，从处理液收集池回收含有活动力好的精子的处理液。其中，本发明是利用平行薄层流体在微小通道里的物理现象，即不同的液流在微小的通道中，在一定条件下互不相溶而形成层流，在表面张力和粘滞力的作用下使活动能力大于一定值的精子从原液中游到另一个液流中，不活动的精子和圆细胞及精液中的其它杂质被保留在原液中，从而实现对精子活动能力的筛选，以达到收集活动力好的精子同时减少精液中的圆细胞以及其它杂质的目的，然后把分离出来的活力好的优质精子用于辅助生殖技术。故本发明操作简单，能直接在显微镜下实时观察精子的分离效果，获得足够数量的优质精子，将显著提高体外授精(IVF)和卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)的成功率。本发明不需要离心处理，减少了对精子的损伤，并且能消除不活动精子，碎片和白细胞等产生的氧化物的影响。本发明分选时间短、精液标本可以重复利用；其特别适合于辅助生殖技术中的IVF、ICSI，在精子优选中具有良好的应用前景。

在结合附图阅读本发明的实施方式的详细描述后，本发明的特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明的结构的实施例一的示意图；以及

图2是本发明的结构的实施例一的截面示意图。

具体实施方式

下面以具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，但应当说明，本发明的保护范围不仅仅限于此。

实施例一：

参阅图2。一种用于分选精子的微流控芯片结构，其包括本体1，本体1由聚合物平板(未图示)和封接平板(未图示)叠合组成。其中，聚合物平板由聚二甲基硅氧烷材料制成，封接平板由石英材料制成，当然，封接平板也可由玻璃或聚二甲基硅氧烷等制成而不影响本发明的保护范围。在聚合物平板和封接平板组成的本体1内形成封闭通道，该封闭通道由两条样本传输通道12、一条处理液传输通道14、一条公共传输通道15、一条处理液收集通道16以及两条样本收集通道18形成；样本加样池11、处理液加样池13、样本收集池19以及处理液收集池17设置在本体1的聚合物平板的表面，见图1。在聚合物平板上设置有用于作为检测区的凹槽(未图示)；一正负压装置与凹槽相连接。样本加样池11通过样本传输通道12与公共传输通道15连通，处理液加样池13通过处理液传输通道14与公共传输通道15连通，公共传输通道15通过样本收集通道18与样本收集池19连通，公共传输通道15通过处理液收集通道16与处理液收集池17连通。两个样本传输通道12、处理液传输通道14、两个样本收集通道18、处理液收集通道16以及公共传输通道15的高度为50微米；两个样本传输通道12和两个样本收集通道18的宽度都为100微米，处理液传输通道14和处理液收集通道16的宽度都为300微米；公共传输通道15的宽度为500微米。当然，样本传输通道12、处理液加样传输通道14、样本收集通道18、处理液收集通道16以及公共传输通道15的高度和宽度还可以为其它数值，而不影响本发明的保护范围。如两条样本传输通道12、处理液传输通道14、两条样本收集通道18、处理液收集通道16以及公共传输通道15的高度都为70微米；两条样本传输通道12以及两条样本收集通道18的宽度都为150微米，处理液传输通道14、处理液收集通道16的宽度都为250微米；公共传输通道15的宽度为400微米。

本实施方式使用时，从样本加样池11加入待处理的精液标本，从处理液加样池13加入精液处理液。利用平行薄层流体在微小通道里的物理现象，即不同的液流在微小的通道中，即在两个样本传输通道12、处理液加样传输通道14、公共传输通道15、处理液收集通道16以及两个样本收集通道18中，在一定条件下互不相溶而形成层流，在表面张力和粘滞力的作用下使活动能力大于一定值的精子从原液中游到另一个液流中，不活动的精子和圆细胞及精液中的其它杂质被保留在原液中，从而实现对精子活动能力的筛选。最终，从样本收集池19回收含有活动力差的精子和圆细胞的精液，从处理液收集池17回收含有活动力好的精子的处理液。

一种用于分选精子的方法，其包括以下步骤：步骤1，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗所述的样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、处理液收集通道以及样本收集通道，再用含量为1％的小牛血清润洗上述样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、处理液收集通道以及样本收集通道两次，吸尽样本加样池、处理液加样池和处理液收集池、样本收集池中的液体，然后用精子处理液充满上述通道水化5分钟；步骤2，在所述样本加样池、处理液加样池中各加入80微升液化后的新鲜精液和精子处理液，在37℃的条件下恒温30分钟后，吸取处理液收集池中的收集液，对收集液中的精子进行活力分析、形态分析及功能评价即可。.

虽然结合附图描述了本发明的实施方式，但是本领域的技术人员可以在所附权利要求的范围之内作出各种变形或修改，只要不超过本发明的权利要求所描述的保护范围，都应当在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1、一种用于分选精子的微流控芯片结构，包括本体；其特征在于：在本体表面左侧设有样本加样池和处理液加样池，在本体表面右侧设有样本收集池和处理液收集池；在本体内设有与样本加样池分别相连的两条样本传输通道，在本体内设有与样本收集池分别相连的两条样本收集通道，在本体内还设有处理液传输通道、公共传输通道和处理液收集通道；所述样本加样池经样本传输通道连通公共传输通道，处理液加样池经处理液传输通道连通公共传输通道，所述公共传输通道经样本收集通道连通样本收集池，公共传输通道经处理液收集通道连通处理液收集池；所述样本传输通道、处理液传输通道、样本收集通道及处理液收集通道的高度都为10～100微米，样本传输通道、处理液传输通道、样本收集通道及处理液收集通道的宽度都为50～500微米，公共传输通道的高度为10～100微米及宽度为100～900微米。

2、根据权利要求1所述的微流控芯片结构，其特征在于：所述样本传输通道、处理液传输通道、样本收集通道、处理液收集通道以及公共传输通道的高度都为50微米，样本传输通道和样本收集通道的宽度都为100微米，处理液传输通道和处理液收集通道的宽度都为300微米，公共传输通道的宽度为500微米。

3、根据权利要求1所述的微流控芯片结构，其特征在于：所述本体由聚合物平板和封接平板叠合组成并在本体内形成封闭通道，该封闭通道由所述样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、样本收集通道以及处理液收集通道形成；所述样本加样池、处理液加样池、样本收集池以及处理液收集池设置在聚合物平板的表面。

4、根据权利要求3所述的微流控芯片结构，其特征在于：在所述聚合物平板上设置有用于作为检测区的凹槽。

5、根据权利要求4所述的微流控芯片结构，其特征在于：还设有与凹槽相连接的正负压装置。

6、根据权利要求3所述的微流控芯片结构，其特征在于：所述聚合物平板由聚二甲基硅氧烷材料制成，封接平板由石英或玻璃或聚二甲基硅氧烷材料制成。

7、一种用于分选精子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1用磷酸盐缓冲液冲洗权利要求1所述的样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、处理液收集通道以及样本收集通道，再用含量为0.5％～1.5％的小牛血清润洗上述通道，吸尽权利要求1所述的样本加样池、处理液加样池和处理液收集池、样本收集池中的液体，然后用精子处理液充满上述通道水化3～8分钟；

步骤2在所述样本加样池、处理液加样池中各加入60～100微升液化后的新鲜精液和精子处理液，在35℃～40℃的条件下恒温25～35分钟后，吸取处理液收集池中的收集液，对收集液中的精子进行活力分析、形态分析及功能评价即可。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

在步骤1中，用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗所述的样本传输通道、处理液传输通道、公共传输通道、处理液收集通道以及样本收集通道，再用含量为1％的小牛血清润洗上述通道两次，吸尽样本加样池、处理液加样池和处理液收集池、样本收集池中的液体，然后用精子处理液充满上述通道水化5分钟；

在步骤2中，在所述样本加样池、处理液加样池中各加入80微升液化后的新鲜精液和精子处理液，在37℃的条件下恒温30分钟后，吸取处理液收集池中的收集液，对收集液中的精子进行活力分析、形态分析及功能评价即可。