JP6234542B1 - 胎児細胞由来染色体ｄｎａの取得方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】母体血試料から胎児細胞由来染色体ＤＮＡを取得する方法の提供【解決手段】本発明では、ａ．母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Ａを、赤血球及び核酸に対して特異的に標識する。ｂ．標識した画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Ｂを取得する。画分Ｂ中の血球を一細胞レベルでそれぞれ分離するとともに、分離された血球の各々に対して、独立に染色体ＤＮＡの抽出処理を行うことで、一細胞レベルで区別可能な染色体ＤＮＡを各々含有する画分Ｃを取得する。ｄ．画分Ｃのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、画分Ｃの群の中から、胎児由来の染色体ＤＮＡを含有する画分Ｄを選別する。【選択図】図１

Description

本発明は母体血試料から胎児細胞由来染色体ＤＮＡを取得する方法に関する。
非侵襲的出生前遺伝学的検査（NIPT, Noninvasive prenatal genetic testing）を行うために胎児細胞由来染色体ＤＮＡを高い純度で採取する方法の開発が続けられている。胎児細胞由来染色体ＤＮＡを採取する目的のために母体血中の胎児由来の有核赤血球（NRBC, nucleated red blood cells）を濃縮する方法が試みられている。
特許文献１〜３は母体血試料中の有核赤血球を濃縮する方法を示している。特許文献１は密度勾配遠心分離法を用いる。特許文献２はマイクロ流路チップを用いる。特許文献３は磁場を用いる。
特許第５２６５８１５号公報 特許第５３１１３５６号公報 特開２００９−５１１００１号公報 特開２０１６−０６７２６８号公報 特許第４０９１１２３号公報 特表第２００７−５３０６２９号公報 特許第５８５７５３７号公報 特許第５３０８８３４号公報 特表２０１５−５１５２６３号公報 特許第５６４２５３７号公報 特開２００７−１７５６８４号公報
上出泰山、梅原永能、佐合治彦 著、「母体血中からの胎児有核赤血球の効率的回収に向けた新たな試み」、成医会、慈恵医科大学雑誌（Tokyo Jikeikai Medical Journal）、2015年、130：11-7
特許文献３の段落0164に示されるように、母体血試料をFACSで解析した場合、CD71(TFRC, Transferrin receptor protein 1)及びCD235a（GPA, Glycophorin A）陽性の有核細胞すなわち有核赤血球は、母体血由来の単核細胞の0.15%以下しか占めていない。母体血中の有核細胞は主として母体由来の白血球で占められている。
上記各濃縮方法によって得られた有核赤血球の画分中においても、なお母体由来の白血球が支配的な場合がある。このため、かかる画分から得た胎児細胞由来染色体ＤＮＡには母体由来の白血球のＤＮＡが混入する可能性がある。また母体血中には母体由来の有核赤血球も含まれる。このため、なおのこと胎児細胞由来染色体ＤＮＡを高い純度で得ることは困難である。
特許文献４では、スライドガラス上で血球の形態観察を行って有核赤血球候補の細胞を単離する方法を表している（段落0069-0070）。係る方法では密度勾配遠心分離法で濃縮した有核赤血球をスライドガラスに塗布した後、血球をメイギムザ染色している（段落0066-0068）。さらに、単離された有核赤血球候補の血球が胎児由来であるか否かを分子生物学的解析によって確認している（段落0079）。
本発明は母体血試料から胎児細胞由来染色体ＤＮＡを取得する方法を提供する。本発明は、一細胞レベルで単離された胎児由来の有核赤血球に由来する染色体ＤＮＡを取得することができる方法を提供することを目的とする。
［１］ 胎児細胞由来染色体ＤＮＡを取得するための方法であって、
ａ．母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Ａを、赤血球及び核酸に対して特異的に標識し、
ｂ．標識した前記画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Ｂを取得し、
ｃ．前記画分Ｂ中の血球を一細胞レベルでそれぞれ分離するとともに、前記分離された血球の各々に対して、独立に染色体ＤＮＡの抽出処理を行うことで、一細胞レベルで区別可能な染色体ＤＮＡを各々含有する画分Ｃを取得し、
ｄ．前記画分Ｃのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Ｃの群の中から、胎児由来の染色体ＤＮＡを含有する画分Ｄを選別する、
方法。
［２］ 前記画分Ａは、母体血試料中の血球から無核赤血球の少なくとも一部が取り除かれてなるものである、
［１］に記載の方法。
［３］ 前記画分Ａは、母体血試料中の血球を少なくともその密度及び大きさのいずれかによって分画することで取得されたものである、
［２］に記載の方法。
［４］ 前記ｃ．において、前記画分Ｂ中の各々の血球が有核赤血球の特徴を有するか否かに関わらず、前記画分Ｂ中の血球に対する一細胞レベルでの分離を、無差別に行うとともに、前記染色体ＤＮＡの抽出処理を無差別に行うことで、前記画分Ｃを取得するところ、
前記画分Ｃが無差別に取得されたものであることから、前記画分Ｄに含有される染色体ＤＮＡが有核赤血球に由来することは、前記ｄ．において当該染色体ＤＮＡが胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とする、
［３］に記載の方法。
［５］ 前記ｃ．において、
前記画分Ｂを限界希釈法で分画することで、一細胞レベルで分離された血球を各々有する画分Ｅを取得するとともに、
前記画分Ｅのそれぞれに対して、前記染色体ＤＮＡの抽出処理を行うことで前記画分Ｃを取得する、
［４］に記載の方法。
［６］ 前記画分Ｂから無差別に画分Ｆを分取し、
前記画分Ｆを撮像し、
前記画分Ｆに一細胞レベルで分離された血球の含まれることを、前記画分Ｆの像を用いて確認することで、前記画分Ｅとして前記画分Ｆが取得されたか否かを判定する、
［５］に記載の方法。
［７］ 前記画分Ａ中の血球に対して組織学的な架橋固定を行うことなく、前記標識及び前記セルソーティングを行う、
［３］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 前記ａ．において前記標識を蛍光標識によって行い、
前記ｂ．において、セルソーター内に前記画分Ａを含む液体流を作り、
前記液体流中の前記標識された血球を標的として、前記液体流と交差する方向にパルス流を発生させ、前記標識された血球を前記パルス流に乗せることで、前記標識された血球を前記液体流から分離し、
前記分離した血球を、逐次的に収集することで前記画分Ｂを生成する、
［３］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 前記ａ．において、前記画分Ａは、少なくとも母体血試料中の血球を密度又は大きさによって分画して得られた画分から、さらに免疫除去法により白血球が除去されることで得られた画分である、
［３］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］ 前記ａ．において、前記標識を蛍光標識によって行い、
前記ｂ．において蛍光標識した前記画分Ａ中の血球をセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Ｇを取得し、
前記画分Ｇ中の血球を平面チップ上に展開するとともに、前記平面チップ上から分取することで、有核赤血球の純度がさらに高められた前記画分Ｂを取得し、
前記ｃ．において、前記画分Ｂ中の血球に対する一細胞レベルでの分離を無差別に行うとともに、前記染色体ＤＮＡの抽出処理を無差別に行うことで、前記画分Ｃを取得するところ、
前記画分Ｃが無差別に取得されたものであることから、前記画分Ｄに含有される染色体ＤＮＡが有核赤血球に由来することは、前記ｄ．において当該染色体ＤＮＡが胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とする方法である、
［３］に記載の方法。
［１１］ 前記母体血試料を血球の密度又は大きさによって分画することで、前記画分Ａを取得することを含む、
［３］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ 前記母体血試料を血球分離チップで処理することで前記母体血試料を血球の大きさによって分画する、
［１１］に記載の方法。
［１３］ 前記血球分離チップは、主流路と、前記主流路に接続する除去流路と、前記除去流路よりも下流で前記主流路に接続する回収流路とを備え、
前記主流路には前記母体血試料が流れ、
前記除去流路において前記母体血試料から無核赤血球が除去されるとともに、前記回収流路において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記回収流路から前記画分Ａが取得され、
前記除去流路の内接径が１２〜１９μｍであり、
前記回収流路の内接径が２０〜３０μｍである、
［１２］に記載の方法。
［１４］ ［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法により得た前記画分Ｄ中の染色体ＤＮＡをマイクロアレイ又は配列決定法により解析し、
前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
方法。
本発明の方法では採取された染色体ＤＮＡが一細胞レベルで単離された胎児由来の有核赤血球に由来することを、染色体ＤＮＡの抽出処理の後に知ることを特徴とする。これにより、本発明では一細胞レベルで単離された胎児由来の有核赤血球に由来する染色体ＤＮＡを取得することができる。
染色体ＤＮＡの取得の流れ図である。 一細胞レベルでの分離とＤＮＡ抽出の概念図である。 限界希釈の一方式の概念図である。 一細胞レベルでの分離を行う装置の模式図である。 画分Ｄの選抜の流れ図である。 診断用データの取得を示す流れ図である。 平面チップ上での蛍光による分取の模式図である。 画分Ａの取得の流れ図である。 密度勾配積層遠心の結果の模式図である。 セルソーターの模式図である。 Hoechst33342の蛍光強度分布を示す。 母体血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。 一般血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。 増幅したＳＲＹ遺伝子配列のＤＮＡの電気泳動像である。 血球分離チップの平面図である。 血球分離チップの模式図である。 血球の染色像である。 増幅したＳＲＹ遺伝子配列のＤＮＡの電気泳動像である。
本実施形態では図１に示す工程により、胎児由来の有核赤血球に由来する染色体ＤＮＡを取得する。まず出発材料である母体血試料について説明する。
［採血］
本実施形態において出発材料はヒトの妊婦の母体血試料である。妊婦は月経後胎齢が10週から33週であることが好ましい。月経後胎齢は最終月経初日を1日目として、満日数または満週数で表したものである。月経後胎齢は受精後胎齢に2週を加えたものとして算出してもよい。
母体血試料は母体血そのものでもよい。母体血試料は、母体血に何らかの化学的、又は物理的処理を行うことで、保存やその後の処理の効率化に適するような変化を与えられた母体血でもよい。係る処理には、例えばアポトーシス阻害剤といった保存剤の添加、温度の調整、血球の沈殿を防ぐための試薬の添加、並びにエアークッションで振盪の物理的ダメージから血球を保護することが含まれるがこれらに限定されない。
本実施形態において母体血とは妊婦から採取された血液を指す。母体血は通常の医学的方法により、妊婦から採取することが出来る。採取した母体血に対してすぐに有核赤血球の濃縮を行ってもよい。また採血を行った場所から濃縮処理を行う場所に、母体血を輸送してから有核赤血球の濃縮を行ってもよい。母体血に対して所望の保存的処理を行ってもよい。
［有核赤血球］
本実施形態において、取得目標は胎児由来の有核赤血球の染色体ＤＮＡである。以下に胎児由来の有核赤血球について説明する。
本実施形態において、血球とは血液細胞を指す。血液は血球及び血漿を含有する。一説において、ヒトの血球のうち、赤血球が大部分を占め、他に白血球や血小板が占めると言われる。母体血は、胎児由来の有核赤血球を含有する。
本実施形態において有核赤血球は赤芽球であり、好ましくは細胞分裂能を喪失した赤芽球である。赤血球は造血幹細胞が分化するとともに成熟することで生じる。分化及び成熟の過程で、造血幹細胞から順に、骨髄系前駆細胞、赤血球・巨核球系前駆細胞、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、後期赤芽球系前駆細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球、及び赤血球が現われる。
赤芽球には前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、及び正染性赤芽球が含まれる。正染性赤芽球が網赤血球に分化する過程で血球中から核が失われる。正染性赤芽球は通常、細胞分裂能を喪失している。
有核赤血球は通常、骨髄中にある。しかしながら背景技術で述べたとおり、ごく微量の有核赤血球が血液中に見られる。また母体血中には、母体由来及び胎児由来の有核赤血球がごく微量見られる。母体血中においては通常、胎児由来の有核赤血球の数は、母体由来の有核赤血球の数よりも少ない。
［ａ−１．濃縮による画分Ａの取得］
工程ａ．では有核赤血球の濃縮された画分Ａを、赤血球及び核酸に対して特異的に標識する。ここで画分Ａは、母体血試料中の血球を少なくともその密度及び大きさのいずれかによって分画することで取得されたものである。以下、「ａ−１．濃縮による画分Ａの取得」及び「ａ−２．画分Ａの蛍光標識」を分けて説明する。
図１に示すステップＳ２１では、母体血試料から、全血球を基準として、好ましくは全赤血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Ａを取得する。本実施形態において有核赤血球又が濃縮されていることとは、画分中の全血球に占める有核赤血球の割合が向上していることを指す。好ましくは赤血球に占める有核赤血球の割合が向上していることを指す。
画分Ａの取得は、母体血試料中の血球を密度又は大きさによって分画することで行う。血球の密度による分画は例えば、上述の密度勾配遠心分離法によって行ってもよい。血球の大きさによる分画は例えば、上述のマイクロ流路チップのような血球分離チップによって行ってもよい。係る分画により母体血試料中の血球から無核赤血球の少なくとも一部が取り除かれた画分が得られる。
また血球の大きさによる分画は例えば、Dean flow又はDean forceを応用した方法により行ってもよい。係る方法はmicrofluidic chipshop GmbHから提供されるスパイラルソーターを用いて行ってもよい。
図１に示すステップＳ２１では、母体血試料中の血球を密度又は大きさによって分画して得られた画分に対して、さらに免疫除去法により白血球を除去してもよい。これによりさらに有核赤血球の濃縮された画分Ａを取得する。
図１に示すステップＳ２１は、以下に述べるステップＳ２２〜２６の中に組み込むことで一連の工程として、一つのラボラトリーで行ってもよい。また臨床施設で採取した母体血から、当該臨床施設で画分Ａを取得した後、画分Ａを中央ラボラトリーに輸送してもよい。中央ラボラトリーではステップＳ２１を行わずにステップＳ２２〜２６のみを行ってもよい。
［ａ−２．画分Ａの蛍光標識］
図１に示すステップＳ２２では、画分Ａを、赤血球及び核酸に対して特異的に標識する。標識（label or labeling）は磁気標識でも蛍光標識でもよく、蛍光標識が好ましい。標識は直接標識でも間接標識でもよい。間接標識はタグと二次抗体によるものでもよく、ビオチン−アビジン結合によるものでもよい。
赤血球に対して特異的な標識は赤血球の表面に特異的な標識でもよい。赤血球に対して特異的な標識は免疫標識でもよい。免疫標識は抗体による標識でもよい。免疫標識の標的抗原は糖鎖抗原でもよい。標識はCD71及びCD235a（GPA, Glycophorin A）のような赤血球に特異的な抗原に対する抗体によるものでもよい。
赤血球に対して特異的な免疫標識は未熟な赤血球に対して特異的な標識でもよい。ヘモグロビンの胚イプシロングロビン鎖のような未熟な赤血球に特徴的なペプチド鎖を標的抗原とする免疫標識でもよい。係る免疫標識用の抗体は特許文献５に記載されている。
核酸に対して特異的な標識により、有核赤血球の有する核が特異的に標識される。核酸に対して特異的な標識は染料標識でもよい。標識される核酸はＤＮＡが好ましい。染料は蛍光染料でもよい。核は蛍光染料により蛍光標識してもよい。蛍光染料はHoechst33342でもよい。
また胎児有核赤血球上に存在する表面抗原と反応するが、妊婦の赤血球細胞上の表面抗原とは反応しない抗体を用いてもよい。抗体はモノクローナル抗体でもよい。例えば特許文献６に記載の抗体、４Ｂ９でもよい。係る抗体は上記の赤血球に対して特異的な免疫標識や核酸に対して特異的な標識とともに用いてもよい。係る抗体を用いることで、核酸に対して特異的な標識に依拠せずとも、有核赤血球に対して特異的な標識を行うことが出来る。
図１に示すステップＳ２２において、赤血球に対して特異的な標識と、核酸に対して特異的な標識とは同時に行ってもよい。またいずれかの標識を先におこなってもよい。またいずれかの標識を先に行い、ステップＳ２３における分取も先に行ってもよい。その後、後に行う標識及び分取を行ってもよい。
なお上記いずれかの又は全ての標識を行う前に、画分Ａ中の血球に対して組織学的な架橋固定をしてもよい。また係る状態で下記のセルソーティングによる分画を行ってもよい。血球を架橋固定することで、血球同士が凝集することを予防できる。したがってセルソーティングによる分取が精度よくできる。後述するｄ．における分子生物学的解析の前に抽出したＤＮＡを脱架橋してもよい。
画分Ａ中の血球に対して組織学的な架橋固定を行わない状態で、下記に述べるような分画、すなわちセルソーティングによる分画を行ってもよい。これにより、後述するｄ．における分子生物学的解析における架橋固定の影響を最小化できる。
例えば、血球の架橋固定を行うことなく、核酸に特異的な標識と、赤血球特異的な免疫標識とを同時に行ってもよい。さらにこれらの標識を行った後に血球を架橋固定してもよい。さらに架橋固定された血球に対して、白血球特異的な免疫標識を行ってもよい。
［ｂ．セルソーティングによる画分Ｂの取得］
ステップＳ２３では標識した画分Ａ中の血球をセルソーティングによって選別することで画分Ｂを取得する。セルソーティングでは例えば細胞を選別するために用いられる装置（セルソーター）を使用する。標識が蛍光標識であれば、セルソーティングによる選別の方法は蛍光標示式細胞分取法（FCM）でもよい。セルソーティングによる選別の方法は磁気標識による細胞分取法でもよい。本実施形態ではセルソーティングの原理及びセルソーターの機種は特に限定されない。
一態様において、FCMはセルアナライザーに分取装置が加わったもの、一例としてセルソーターによって行う。一態様において、セルソーターは、細胞を連続的に流れる流体に乗せるとともに、細胞に対して励起光を照射して得た細胞の蛍光をもって個々の細胞の特徴を同定する。この同定はセルアナライザーの機能でもある。同定により得られた情報に基づきセルソーターは、さらに細胞を液滴に閉じ込めた状態にするとともに、特定の細胞を有する液滴を収集することで、特定の細胞を分取する。
一態様において、セルソーターは、細胞を連続的に流れる流体に乗せるとともに、細胞に対して励起光を照射して得た細胞の蛍光をもって個々の細胞の特徴を同定する。同定により得られた情報に基づき、セルソーターは、細胞を引き続き連続的に流れる流体に乗せた状態で特定の細胞を有する画分を分取する。
このような液滴を用いないセルソーターとして、後述する図１０及び特許文献７に記載のようなパルス流を分取に利用するセルソーターが知られている。また特許文献８に記載のような流体のゾル−ゲル転移を分取に利用するセルソーターが知られている。
このような液滴を用いないセルソーターは細胞を流体に乗せたまま、分取容器内に細胞を導くことが出来るので細胞が損傷しにくい。また容器に細胞を導くまでの工程において、流体を流路チップ内に閉じ込めることで、流体の飛沫による装置や環境の汚染を防止しやすい。
図１に示すステップＳ２３では赤血球に対して特異的な標識により標識された血球を取得するように血球を選別することが好ましい。有核赤血球は赤血球であるから、赤血球に対して特異的な標識により、有核赤血球を、白血球を始めとする他の血球と区別できる。
図１に示すステップＳ２３では有核の血球に対して特異的な標識により標識された血球を取得するように血球を選別することが好ましい。有核赤血球は核を有するから、核酸に対して特異的な標識により、有核赤血球を無核の赤血球を始めとする他の血球と区別できる。
図１に示すステップＳ２３では、これらの標識を組み合わせることで、有核赤血球の純度が高められた画分Ｂを取得する。赤血球に対して特異的な標識による分取と、核酸に対して特異的な標識による分取とは同時に行ってもよい。またいずれかを先におこなってもよい。例えば赤血球に対して特異的な磁気標識により選別を行った後、核酸に対して特異的な蛍光標識により選別を行うことで画分Ｂを取得してもよい。
図１に示すステップＳ２２では、追加的に画分Ａを、白血球に対して特異的に標識してもよい。白血球特異的な標識は免疫標識でもよい。係る標識はCD45のような白血球に特異的な抗原に対する標識でもよい。抗原は糖鎖抗原でもよい。ステップＳ２３では白血球に対して特異的な標識により標識された血球を除外するように血球を選別することが好ましい。
［追加的な細胞選別］
図１に示すステップＳ２１において、画分Ａ中の血球を蛍光標識した場合は、セルソーティングとしてＦＡＣＳを用いることが好ましい。またセルソーティングによる処理後も蛍光標識は残存しているので、これを有効に利用してもよい。
例えばセルソーティングで得られた１回目の画分に対してさらに追加的に蛍光を利用して細胞を分取してもよい。例えば得られた１回目の画分に対してさらにセルソーティングによる選別を繰り返して２回目以降の画分を取得してもよい。これにより最終的に上記画分Ｂを得てもよい。
［ｃ．血球の分離とＤＮＡ抽出］
工程ｃ．では画分Ｂ中の血球を一細胞レベルでそれぞれ分離する。また分離された血球の各々に対して、独立に染色体ＤＮＡの抽出処理を行う。これにより、一細胞レベルで区別可能な染色体ＤＮＡを各々含有する画分Ｃを取得する。本実施形態において、染色体ＤＮＡはゲノムＤＮＡのことを指す。
以下、「ｃ−１．一細胞レベルでの血球の分離」及び「ｃ−２．DNA抽出による画分Ｃの取得」を分けて説明する。
［ｃ−１．一細胞レベルでの血球の分離］
図１に示すステップＳ２４では、画分Ｂ中の血球を一細胞レベルでそれぞれ分離する。また画分Ｂ中の血球を一細胞レベルで互いに分離する。本実施形態において血球を一細胞レベルで分離することには、血球を一細胞ごとに分離することが含まれる。
画分Ｂ中の血球に対する一細胞レベルでの分離は、画分Ｂ中の各々の血球が有核赤血球の特徴を有するか否かに関わらず、無差別に行うことが好ましい。無差別という用語には画分Ｂを取得するまでの過程において、血球の密度及び大きさ、並びに標識に基づいて有核赤血球が濃縮されることを除外する意図は含まれない。
上述の濃縮及び細胞分取の結果、図２に示す画分Ｂ中には、細胞核４０を有する有核赤血球４１が比較的豊富に含まれる。画分Ｂには他の血球も含まれる場合がある。他の血球には、例えば無核赤血球４２や、細胞核４０を有する白血球４３が含まれる。無差別に分離するとはこれらの細胞を網羅的に一細胞レベルに分離することを意味する。
図２に示す画分Ｂ中の血球を一細胞レベルでそれぞれ分離するために、これらを各々、個別の容器４４に分配することが好ましい。係る分配により、画分Ｂをさらに分画することができる。分画は限界希釈法（limited dilution）によって行うことが好ましい。限界希釈法で分画することで、一細胞レベルで分離された血球を各々有する画分Ｅを取得することができる。限界希釈法は、血球数よりも多い画分ができるように分取体積を定めた上で、よく懸濁された画分Ｂから分取することで行ってもよい。
図２に示す容器４４と同等の容器が合計８個描かれている。容器４４の数は画分Ｂ中の血球の数、又は得ようとする画分Ｃの数に応じて適宜選択できる。容器は例えば８連チューブでもよく、また９６穴、３８４穴、及びその他の穴数のいずれかのウェルプレートでもよい。図２には画分Ｅとして画分Ｅ１、Ｅ２及びＥ４〜Ｅ８が描かれている。限界希釈法では画分Ｅ３のように、血球が含まれない画分が生じてもよい。
図２に示す容器４４への血球の分配は、上述の通り無差別に行うことが好ましい。すなわち、有核赤血球４１の分配に際して、無核赤血球４２や、白血球４３をも一細胞レベルで分配することをなんら排除しない。
本実施形態では、例えば特許文献４に記載されるような胎児有核赤血球候補細胞を、細胞の形態的情報に基づき識別することに依拠しない。またこのような候補細胞の識別に依拠して、候補細胞を一細胞単位に単離することを行わない。本実施形態の一細胞レベルにおける分離では、このような有核赤血球の同定を伴う単離の操作を行わないことが好ましい。好ましい態様において、本実施形態の方法には、セルソーティングによって得られた画分を工程ｃ−１．にて一細胞レベルに分離する工程で処理する前に、さらに血球の形態的情報に基づき血球を画分から分取するための工程が含まれない。
本実施形態では、限られた処理時間を一細胞レベルでの分離を優先して使用することが好ましい。好ましい態様において、本実施形態の方法には、上述した平面チップ上に画分を展開するとともに、蛍光により有核赤血球を同定する工程が含まれない。好ましい態様において、本実施形態の方法には、セルソーティングによって得られた画分を工程ｃ−１．にて一細胞レベルに分離する工程で処理する前に、さらに血球を画分Ｂから分取するための工程が含まれない。
上記は画分Ａや画分Ｂの一部又は全部を観察して、その中に有核赤血球が含まれることを確認することを除外するものではない。例えば画分の一部を顕微鏡観察して、形態的情報又は蛍光に基づく情報又はそれ以外の特徴に基づく情報により有核赤血球の存在を確認することで各工程の品質管理を行ってもよい。
図３は限界希釈の一方式を示している。係る方式では画分Ｂから無差別に画分Ｆを分取する。図中には係る画分Ｆとして画分Ｆ１〜３が描かれている。これらの係る画分Ｆ１〜３を撮像する。画分Ｆ１には一細胞レベルで分離された血球が含まれている。画分Ｆ２には二細胞の血球が含まれている。画分Ｆ３には血球が含まれていない。これらを、画分Ｆ１〜３の像を用いて確認する。これにより画分Ｅとして画分Ｆ１が取得される。または画像解析により画分Ｅが取得されたか否かを判定してもよい。画分Ｆ２は画分Ｂに戻してもよい。
図３に示す限界希釈の方式では、各画分が分注される際にカメラ等で実際に一細胞が分注されたか否かを判別することができる。係る方式により、より確実に一細胞レベルで血球を分離できる。また血球を持たない画分の生成を回避できる。
また図１に示すステップＳ２４は、スライドやチップ上に画分Ｂの血球を分散させたのち、これらを一細胞ずつ無差別に単離することで、行ってもよい。またステップＳ２４は、ステップＳ２３でセルソーティングを行いながら、並行して行ってもよい。すなわち、セルソーティングでは血球を含有する微量の流体が連続的に分取されるが、これらの流体を再び一つの容器に収集してまとめることはせず、血球ごとに流体を別個の容器に分注してもよい。
［ｃ−２．DNA抽出による画分Ｃの取得］
図１及び２に示すステップＳ２５ではさらに、分離された血球の各々に対して、独立に染色体ＤＮＡの抽出処理を行うことで画分Ｃを取得する。ステップＳ２４及びＳ２５を経ることで画分Ｃは、一細胞レベルで区別可能な染色体ＤＮＡを各々含有するものとなる。本実施形態において血球を一細胞レベルで区別可能な染色体ＤＮＡを有する画分には、一細胞の血球から抽出された染色体ＤＮＡを有する画分が含まれる。
図２に示すように、個々の容器４４に分取された血球を含む画分Ｅ１〜８に対して染色体ＤＮＡの抽出処理を無差別に行うことが好ましい。画分Ｂ中の各々の血球が有核赤血球の特徴を有するか否かに関わらず、抽出処理は無差別に行う。また各々の画分Ｅ中の血球が有核赤血球の特徴を有するか否かに関わらず、抽出処理は無差別に行う。無差別という用語には画分Ｂを取得するまでの過程において、血球の密度及び大きさ、並びに標識に基づいて有核赤血球が濃縮されることを除外する意図は含まれない。
抽出処理の結果、画分Ｃとして画分Ｃ１、Ｃ２及びＣ４〜８が得られる。すなわち、有核赤血球４１からの染色体ＤＮＡの抽出に際して、無核赤血球４２や、白血球４３からも染色体ＤＮＡを抽出することをなんら排除しない。また画分Ｃ３のように、血球が含まれない画分に対して染色体ＤＮＡ抽出の化学処理を行って得られた画分があってもよい。
ＤＮＡ抽出処理は一細胞レベルで各々独立に行われる。したがって、例えば画分Ｃ４や画分Ｃ７には有核赤血球４１由来の染色体ＤＮＡが含まれる。また画分Ｃ４や画分Ｃ７には、他の細胞の染色体ＤＮＡが混合されていない。画分Ｃ４や画分Ｃ７には、上述のとおり予め単離された有核赤血球から得られた染色体ＤＮＡと同等の純度の染色体ＤＮＡが含まれている。なお、ここで言う純度においては、母体由来の白血球の染色体ＤＮＡの混入の有無に着目している。
図２に示すように染色体ＤＮＡの抽出は個々の血球に対して無差別に行われる。したがって、無核赤血球４２に由来する画分Ｃ１、Ｃ５及びＣ８には染色体ＤＮＡが含まれていない。白血球４３に由来する画分Ｃ２及びＣ６には白血球の染色体ＤＮＡが含まれている。画分Ｅ３に血球が元々存在していないことから画分Ｃ３には染色体ＤＮＡは含まれていない。
本実施形態の方法はこれらのような非効率な作業を許容する。このように無差別に細胞の分離とＤＮＡ抽出を行うことで、有核赤血球の同定を伴う単離の操作に依存せずとも有核赤血球の染色体ＤＮＡを取得できる。このため、一連の工程の全体として効率化がなされる。
本実施形態の工程ｃ．では、次の三点に留意する。一点目として、図２に示す８個の画分Ｃのうち、画分Ｃ４や画分Ｃ７に有核赤血球に由来する染色体ＤＮＡが含まれている事実それ自体は、本実施形態の方法の実施者にとって、工程ｃ．ではまだ明らかになっていないことが許容される。なぜなら、本実施形態の方法では有核赤血球を形態的情報に基づき単離することを行うことは必須ではないからである。さらにいえば画分Ｃが上述の通り無差別に取得されたものであるからである。
二点目として、図２に示すいずれかの画分Ｃ中に有核赤血球に由来する染色体ＤＮＡが取得されたことは後述するｄ．において分子生物学的解析を行うことで事後的に推定される。通常、母体血に混入する胎児細胞は胎児の有核赤血球であることから、染色体ＤＮＡが胎児由来であることが判明することで、上記が推定される
三点目として、図２に示す画分Ｃ４や画分Ｃ７に含まれる染色体ＤＮＡが母親の有核赤血球に由来するのか、胎児の有核赤血球に由来するのかは本実施形態の方法の実施者にとって、工程ｃ．ではまだ明らかになっていないことが許容される。なぜなら、先の工程において、母親の有核赤血球と、胎児の有核赤血球とを区別する手段を用いることは必須ではないからである。染色体ＤＮＡが胎児に由来することは、後述するｄ．において分子生物学的解析を行うことで事後的に判明する。
図２に示す容器４４の代わりに例えば、図４に示す装置７４を用いてもよい、装置７４は流路７５、捕捉構造７６及び反応構造７７を有する。複数の捕捉構造７６が流路７５に沿って連続的に配置されている。個々の捕捉構造７６には反応構造７７が付随している。
図４に示す装置７４では、各捕捉構造７６に細胞７８を分配することで、細胞７８を一細胞レベルで互いに分離する。しかしながら、捕捉構造７６に捕捉された細胞７８を含む画分は特定の容器に分取されない。全ての又は所望の数の細胞７８を捕捉構造７６に捕捉した後、捕捉した細胞７８を溶解し、反応構造７７に向かって溶解物を押し流すことで細胞を処理する。反応構造７７内では細胞の処理として染色体ＤＮＡの抽出及び以下に述べる全ゲノム増幅の反応を行ってもよい。
図４に示す装置７４として特許文献９に開示されるマイクロ流体デバイスを用いてもよい。またマイクロ流体デバイスとして、フリューダイム社から提供されるC1 Single-Cell Auto Prep Array IFCを用いてもよい。
［ｄ．DNA解析による画分Ｄの選抜］
図１及び図２に示すステップＳ２６では、画分Ｃのそれぞれに対して分子生物学的解析を行う。これにより画分Ｃの群の中から、胎児由来の染色体ＤＮＡを含有する画分Ｄを選別する。図２に示すように画分Ｄは母親由来の染色体ＭのＤＮＡのコピーに加えて父親由来の染色体ＰのＤＮＡのコピーを含有する。胎児が男性である場合にはＹ染色体とＸ染色体とは対ではあるが、相同染色体になっていない。
図５には図１及び２に示すステップＳ２６の好適な例が示されている。ステップＳ２８では、画分Ｃの染色体ＤＮＡに対して全ゲノム増幅を行う。全ゲノム増幅の方法としてはMALBAC（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles）に代表されるPCR法、MDA（Multiple strand Displacement Amplification）及びDOP-POP-PCR（Degenerate Oligonucleotide-primed PCR）を用いることが出来る。なかでも全ゲノム領域に渡って増幅の偏りが小さいことからMALBACが好ましい。
全ゲノム増幅により、画分Ｃには染色体ＤＮＡのコピーが豊富に含まれるものとなる。以下、特に言及した場合を除き、染色体ＤＮＡのコピーも、染色体ＤＮＡと称するものとする。
図５に示すステップＳ２９では、分子生物学的な解析を行う。これにより各画分Ｃの染色体ＤＮＡが母体由来であるか胎児由来であるかを区別する。係る区別に際し、以下の点に留意し得る。
本実施形態において、母体由来の染色体と、母親由来の染色体とは区別される。母体由来の染色体は、もっぱら母体の体細胞に由来する。母体由来の一対の染色体においては、一対の内のいずれの染色体も母体に由来する。
本実施形態において母親由来の染色体とは母親の生殖細胞に由来する染色体を意味する。特に言及しない限り母親由来の染色体は、胎児に由来する染色体を指すものとする。係る染色体は父親由来の染色体と相同染色体を形成する。
母体と母親が一致する場合、母親由来の染色体のＤＮＡ配列は、母体由来の染色体のＤＮＡ配列と共通する。なお胎児が母体の卵子ではなく他の女性に由来する卵子に由来するとしても本実施形態の方法を適用できる。
図５に示すステップＳ２９における分子生物学的な解析としてはＳＴＲ（Short Tandem Repeat）解析が好ましい。ＳＴＲ（Short Tandem Repeat）解析では、父親由来の配列と母親由来の配列とを区別できる。胎児由来のＤＮＡには母親由来でないＳＴＲが含まれている。このため、胎児の性別に依らず、染色体ＤＮＡが胎児由来であることを同定できる。
胎児が男性であることが分かっている場合には、Ｙ染色体特異的な配列に基づく解析を行ってもよい。男性である胎児由来のＤＮＡには母親由来でないＹ染色体が含まれている。このため、染色体ＤＮＡが胎児由来であることを同定できる。
図５に示すステップＳ３０では、上述の分子生物学的な解析結果に基づき、いずれの画分Ｃが胎児に由来するかを確認する。これにより画分Ｃから画分Ｄを選抜することができる。
図５に示すステップＳ３０では、画分Ｄが有核赤血球に由来することを完全に確認することは必須ではない。ステップＳ３０ではすでに血球の形態的情報が失われている。ステップＳ２３において有核赤血球の純度が高められているので、画分Ｄは、確率論的に有核赤血球に由来することが推定される。
図１〜図５に示す一連の工程により、一細胞レベルで単離された胎児由来の有核赤血球に由来する染色体ＤＮＡを含有する画分Ｄを取得することができる。係る染色体ＤＮＡを出生前診断に供するため、図６に示す処理を行う。
なお一般的に出生前検査や出生前診断の用語には非確定検査も含まれる場合がある。また本実施形態により得られる染色体ＤＮＡは確定診断のために用いられる場合がある。なぜなら本実施形態で得られる検査用のデータは胎児細胞中の染色体ＤＮＡのみから得られるものだからである。
胎児由来の染色体ＤＮＡのみを用いて得られるデータには、母体細胞由来の染色体ＤＮＡがＤＮＡ試料に混入することによるデータへの影響が極めて小さい、又は無い。なおここで言う混入の有無とは、遺伝の原理、すなわち胎児の相同染色体の半分が母親に、他の半分が父親に由来することを指すものではない。
本実施形態の方法は、例えば血漿中に含まれるDNA断片を利用した従来型のNIPTよりも確定診断に向いていると考えられる。なぜなら従来型のNIPTで用いられるＤＮＡ試料では母体細胞由来の染色体ＤＮＡと胎児細胞由来の染色体ＤＮＡが混合されているためである。
本実施形態において得られる上記染色体ＤＮＡ及びデータはNIPD（non-invasive prenatal diagnosis）に供される場合がある。本実施形態における染色体ＤＮＡ又はデータを非確定検査に用いるか、確定診断に用いるかは医師によって判断することが出来る。本実施形態によって得られる染色体ＤＮＡ及びデータに依拠した診断を確定診断とするか否かの妥当性は医学的な判断に依拠するものであり、本発明の技術的本質に影響は与えない。
DNA解析にあたり、染色体ＤＮＡの固定に用いた架橋は解除しておく必要がある。すなわち染色体ＤＮＡを脱架橋しておく。これにより、ＤＮＡ解析を効率的に進めることが出来る。また架橋を行わないことで、脱架橋反応においてＤＮＡが損傷することを防止してもよい。
［診断に供するデータの取得］
図６には、診断に供するためのデータの取得方法が示されている。ステップＳ３２において、上記画分Ｄの染色体ＤＮＡの配列情報の一部又は全部を解析する。解析は配列決定を利用して行ってもよい。配列決定はゲノムの一部又は全部に対して行ってもよい。配列決定はサンガーシーケンシングでもよくＮＧＳ（new generation sequencing）でもよい。
ＮＧＳは、Roche社から提供されるようなパイロシーケンシング、Illumina社から提供されるような合成によるシーケンシング、並びにThermo Fisher SCENTIFIC社から提供されるような、ライゲーションによるシーケンシング、及びイオン半導体シーケンシングのいずれかでもよい。
図６に示すステップＳ３２において配列情報の解析はマイクロアレイで行ってもよい。マイクロアレイはSNPマイクロアレイでもよい。本実施形態の方法では胎児由来染色体ＤＮＡの全長に渡ってコピー数の偏りなく得られる。このため、ＭＰＳ法（massively parallel sequencing）では困難な信頼性の高いSNPマイクロアレイデータを提供するのに適する。また、マイクロアレイはCGHアレイでもよい。
図６に示すステップＳ３３において、配列情報の解析結果から医師による診断に適するデータを生成する。係るデータには解析の生データの一部又は全部を含んでもよい。また適正な手続きのもとに、医学的な統計解析に適するデータを作成してもよい。
［変形例］
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。上記実施形態はヒトを対象とする方法である。本実施形態の方法はヒト以外の哺乳類に応用してもよい。
＜溶血法＞
上記実施形態では母体血試料中の血球から無核赤血球の少なくとも一部を取り除くために、血球の密度又は大きさを利用した。母体血試料中の血球を選択的に溶血することを通じて、無核赤血球を選択的に除去してもよい。これにより溶血した無核赤血球は画分中の全血球の範囲からは除外されるため、有核赤血球の濃縮された画分Ａを取得することができる。溶血は例えば塩化アンモニウム溶血剤によって血球を分散させている分散媒の浸透圧を調整することで行うことが出来る。
＜平面チップによる分取＞
図７は平面チップ上での蛍光による分取の模式図である。上述の通り、図１に示すステップＳ２３においてはセルソーティングで画分Ｂを取得した。ここでセルソーティングによる分取を補助する他の分画法として、平面チップによる分取法を追加してもよい。
まず蛍光標識した画分Ａ中の血球を上述の通りセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Ｇをまず取得する。その後、図７に示すように画分Ｇ中の血球を平面チップ６１上に展開する。さらに、赤血球及び核酸に対して特異的な標識のシグナルを発する血球６２を平面チップ６１上から分取する。これにより画分Ｇよりも有核赤血球の純度がさらに高められた画分Ｂを取得する。
係る平面チップを利用した蛍光による分取手段として、シリコン・バイオシステムズ社から提供されるDEPArray（特許文献１０）や、レアサイト社から提供されるCyteFinder及びCytePickerを使用してもよい。
上述の通り、本実施形態の方法は、平面チップを利用した分取手段によって有核赤血球であるか否かを厳密に判定することに依存しない。なお、これらの装置を用いることで、画分Ｂの取得と、画分Ｃの取得とを一体の工程として実施できる場合がある。
［実施例１］
＜採血＞
図８には図１に示すステップＳ２１の実施例が示されている。ステップＳ３５では母体血の採血を行う。本実施例では適切な手続の下、母体血及び一般血の提供を受けた。母体血は、試験研究用として妊娠３３週の妊婦から提供されたものである。胎児の性別は男性である。本実施例において用いられた一般血は、試験研究用として妊婦ではない人から提供されたものである。母体血及び一般血の採取は医療機関においてなされた。これらの血液は適正な管理の下、発明者らの研究室に輸送された。
必要な母体血の量は次のように考えられる。１０ｍｌの母体血には約３×１０１０個の血球が含まれていると考えられている。また同体積の母体血には約３６〜２１６８個の有核赤血球が含まれていると考えられている（非特許文献１）。
上記有核赤血球の割合を鑑み、出発材料となる母体血の量は０．０１〜１００ｍｌでもよい。母体血の量は０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ｍｌでもよい。本実施例では母体血２０ｍｌを出発材料として使用した。
全自動セルカウンターＴＣ２０（ＢＩＯＲＡＤ）で測定したところ、母体血１０ｍｌあたり３．１６×１０１０個の血球が含まれていた。母体血をＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）で２倍に希釈した。
次の密度勾配遠心法による濃縮の処理は、採血後、好ましくは４８時間、３６時間、より好ましくは２４時間、さらに好ましくは３時間、特に好ましくは２時間経過までに行う。採血後、処理開始までの時間が短いほど、密度勾配遠心法による濃縮の効率を高めることが出来る。本実施例では採血後２時間で処理を開始した。またアポトーシス阻害剤といった保存剤の添加によって、時間経過に伴う濃縮効率の低下を抑制できる。
＜有核赤血球の濃縮＞
図８に示すステップＳ３６及びＳ３７を通じて、母体血中の有核赤血球を二段階の密度勾配遠心法で濃縮する。ここで濃縮とは、有核赤血球以外の血球を除去することである。濃縮において母体血から除去される血球は無核の赤血球であることが好ましい。濃縮において母体血から血小板も除去されることがさらに好ましい。
図８に示すステップＳ３６及びＳ３７を通じた濃縮により画分Ａが得られる。濃縮後において、画分Ａ中における全血球に対する有核赤血球の割合は、母体血試料中における全血球に対する有核赤血球の割合よりも大きくなる。
図８に示すステップＳ３６において、母体血を密度勾配積層遠心で分画する。密度勾配積層遠心は密度勾配遠心の一種である。本実施例ではパーコール及び食塩水を用いて密度１．０８５ｇ／ｍｌ及び１．０７５ｇ／ｍｌの等張液を作成した。遠心管にこれらを順に積層した後、さらに母体血１０ｍｌを重層した。係る遠心管を２０℃、１７５０Ｇで３０分間遠心した。
図９には密度勾配積層遠心の結果の模式図が表されている。遠心管４６には上から順に、層４５ａ〜ｆが形成されている。層４５ａには血漿が濃縮されている。層４５ｂには白血球４３が濃縮されている。層４５ａ及びｂの密度は１．０７５ｇ／ｍｌよりも小さいと考えられる。層４５ｃは密度１．０７５ｇ／ｍｌの等張液の層である。
図９に示す層４５ｄには有核赤血球４１が濃縮されている。層４５ｄの密度は１．０７５ｇ／ｍｌよりも大きく、１．０８５ｇ／ｍｌよりも小さいと考えられる。層４５ｄを分取するとともに血球を洗浄することで有核赤血球を含む画分を得た。かかる画分を試料１とした。試料１中の血球数を、全自動セルカウンターＴＣ２０を用いて測定した。血球数は約９．９５×１０６個であった。
図９に示す層４５ｅは密度１．０８５ｇ／ｍｌの等張液の層である。層４５ｆには無核赤血球４２が濃縮されている。層４５ｆの密度は１．０８５ｇ／ｍｌよりも大きいと考えられる。
図８に示すステップＳ３７において、ステップＳ３６で得られた画分を高張遠心で分画してもよい（特許文献１）。高張遠心は密度勾配遠心の一種である。次に試料１の半分量を画分Ａとして用い、以下の蛍光標識のステップを行った。
＜蛍光標識＞
図１に示すステップＳ２２において画分Ａを蛍光標識する。蛍光標識された血球は、蛍光標識された血球を含む他の血球と互いに分離した状態となっていることが好ましい。本実施例では蛍光標識の条件は例えば以下の通り行うことが出来る。
まず画分Ａの血球をHoechst33342（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、抗CD45-PE標識抗体（Miltenyi-Biotec製、クローン名：5B1）、及び抗CD235a-FITC標識抗体（Miltenyi-Biotec製、クローン名：REA175）で同時に染色した。染色に際して血球の架橋固定は行わなかった。染色は４℃で、１０分間行った。染色後、血球の懸濁液を４℃、３００Ｇの条件で１０分間遠心することで標識された血球を回収した。
なお、蛍光標識の条件は、以下のように変更することもできる。例えば、まず画分Ａの血球をHoechst33342で染色してもよい。その後に血球を抗ＣＤ４５−ＰＥ標識抗体、及び抗ＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣ標識抗体で免疫染色してもよい。血球及び抗体を転倒混和させながら、室温にて抗体抗原反応を進行させてもよい。その後、血球の懸濁液にリン酸緩衝生理食塩水を加えてもよい。これにより加えた蛍光抗体の濃度を低下させることができる。その後、血球の懸濁液を２５℃、３００ｇで３分間遠心して血球を回収してもよい。
抗体の濃度は、上述の抗体の添付書類に記載される標準の使用濃度の約１/１００〜１/１０としてもよい。これにより、セルソーティングの処理におけるシグナル／ノイズ比の改善を図ることが出来る。本実施例では、抗体の希釈に際し、抗CD45-PE標識抗体と緩衝液との間の体積の比（希釈率）を1：10とした。また、抗CD235a-FITC標識抗体と緩衝液との間の体積の比（希釈率）を1：1099とした。
図１に示すステップＳ２３において、セルソーティングで画分Ａをさらに分画する。セルソーターとして図１０の模式図に示すセルソーターを用いた。係るセルソーターは血球を蛍光検出するものである。
まず図１０に示す主流路４７内に蛍光標識された画分Ａを含む定常的な液体流を作る。液体流中の血球４８ａに励起光を投射して蛍光により標識のシグナルの有無を検出する。副流路４９は主流路４７と交差する。血球４８ａは主流路４７と副流路４９との交差点に向かって流れる。
図１０に示す血球４８ｂはシグナルの検出された血球である。係る血球は主流路４７内を流れて来て交差点に入る。副流路４９では液体流と交差する方向にパルス流を生じることが出来る。上述のシグナルに基づき、血球４８ｂを標的としてパルス流を発生させる。
図１０に示す血球４８ｂを副流路４９のパルス流に乗せることで、血球４８ｂを主流路４７の液体流から分離する。分離した血球４８ｂを、逐次的に収集する。これにより収集された４８ｂからなる画分Ｂが生成される。
図１０において、シグナルの無かった又は弱かった血球４８ｃに対してはパルス流が付与されない。血球４８ｃは主流路４７内をそのまま液体流に乗って流れていく。
係るセルソーターについては特許文献７に詳細が説明されている。また本実施例ではオンチップ・バイオテクノロジーから提供されるセルソーターを使用した（セルソーターの型式：Ｏｎ-ｃｈｉｐ−Ｓｏｒｔ ＭＳ６）。本実施例では細胞選別のためのセルソーターの動作条件は以下の通りであった。
＜セルソーティングによる分析＞
図１１はHoechst33342の蛍光強度分布を示す。縦軸は血球の出現頻度を表す。横軸はHoechstの蛍光シグナルの強度を表す。ピークが二つ表れている。出現頻度が強度４０〜５０の間で極小となった。係る範囲で境界値を定め、これより強度の大きい血球を有核の血球と推定した。また、これより強度の小さい血球を無核の血球と推定した。
図１２は母体血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。図１３は一般血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。縦軸は抗CD235a抗体に結合したFITC（fluorescein isothiocyanate）の発光のシグナルの強度を表す。横軸は抗CD45抗体に結合したPE（phycoerythrin）の発光のシグナルの強度を表す。
図１２及び図１３におけるＡｒ１は、ＣＤ２３５ａ−ＦＩＴＣのシグナルが強く表れた集団を表す。Ａｒ２は、ＣＤ４５で標識された白血球の集団を表す。
母体血の結果と一般血の結果との比較により、母体血では、一般血に比べてＡｒ１に属する血球の数が多いことが分かった。
図１２において、Ａｒ１の内、FITC（fluorescein isothiocyanate）の発光のシグナルの強度が１×１０３より大きいものを有核赤血球の候補とした。これは、予備実験においてバックグラウンドノイズ、すなわち白血球のＦＩＴＣの発光のシグナル強度が１×１０３以下であったことによる。上記の条件検討を元に有核赤血球の候補を含む画分Ｂをセルソーティングで取得した。
＜分子生物学的解析＞
画分Ｂの全体に対してNucleospin Tissue XSを使用して、DNA抽出を行った。一細胞レベルでの分離を行ってからDNA抽出を行うこともできる。また一細胞レベルで分離した細胞から得たDNAに対して全ゲノム増幅を行うこともできる。全ゲノム増幅は例えばYikon Genomics社から提供されるMALBACを用いて行うことが出来る。
本実施例ではDNA抽出で得られたDNAを鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応ではEx-Taq polymeraseを使用した。図１４は分子生物学的解析の結果を表す。図１４に示される電気泳動像の内レーン１〜１１はＳＲＹ遺伝子配列に対するPCRによる270bp長の増幅産物を表す。鋳型は以下の通りである。
レーン１の左側には200bpのDNAラダーが示されている。
レーン１：ヒト男性の標準ＤＮＡ、２００コピー。
レーン２：ヒト女性の標準ＤＮＡ、２００コピー。
レーン３：ヒト男性の標準ＤＮＡ、０コピー。
レーン４：ヒト男性の標準ＤＮＡ、１コピー。
レーン５：ヒト男性の標準ＤＮＡ、４コピー。
レーン６：ヒト男性の標準ＤＮＡ、８コピー。
レーン７：ヒト男性の標準ＤＮＡ、１６コピー。
レーン８：ヒト男性の標準ＤＮＡ、６４コピー。
レーン９：ヒト男性の標準ＤＮＡ、１００コピー。
レーン１０：試料１
図１４に示す電気泳動像より、試料１には４〜１６コピーのＳＲＹ遺伝子配列を有するＤＮＡが含まれることが分かった。したがって、試料１には胎児由来の染色体ＤＮＡが含有されることが分かった。
［実施例２］
本実施例では妊娠３３週の妊婦から採取した血液を利用した。胎児の性別は男性であった。
＜血球分離チップによる母体血の濃縮＞
実施例２では母体血０．３ｍｌを使用し、その濃縮の工程を血球分離チップによって行った。血球分離チップとしては例えば特許文献１１に記載のものを使用することが出来る。血球分離チップは細胞の大きさを基準として母体試料中の血球を分画する。
図１５に血球分離チップの一例として血球分離チップ５０の平面図を示す。血球分離チップ５０は入口５１、主流路５２、副流路５３並びに出口５４ａ−ｄ及び５５を有する。主流路５２は入口５１の出口５５に向かって順に流路５６ａ〜ｄを有する。流路５６ａ〜ｄは入口５１から出口５５まで一つながりとなっている。
図１５に示す入口５１は母体血を入れたシリンジ５７と接続される。シリンジ５７からは、所定の流量で母体血を入口５１に送る。母体血は入口５１を経由して流路５６aに入る。濃縮の開始時において母体血は採血後２〜３時間経過していた。
母体血は予め希釈しておくことが好ましい。希釈率は２〜５００倍とすることが出来る。本実施例では希釈率を５０倍とした。希釈はリン酸緩衝生理食塩水で行う。母体血希釈液の単位時間当たりの流量を１〜１０００μｌ／分とすることが出来る。本実施例では２５μｌ／分とした。血球分離チップによる分画は１０時間行った。一回の分画で例えば１５ｍｌの母体血希釈液を処理できる。
図１５に示す血球分離チップ５０は副流路５３を有する。副流路５３はシリンジ５８と接続されている。シリンジ５８にはＰＢＳを入れられている。シリンジ５８内に圧力をかけることでＰＢＳは副流路５３を通じて流路５６ｂに流入する。
図１５に示す分岐流路５９ａ−ｄはいずれも主流路５２から分岐する流路である。流路５６ｃ中において、上流側から順に分岐流路５９ａ，ｂ，ｃ及びｄがこの順で主流路５２から分岐する。
図１５に示す分岐流路５９ａ−ｄはいずれも主流路５２から分岐する細流路を複数個有する。各細流路は主流路５２の上流から下流に向かって並ぶ。分岐流路５９ａ−ｄはそれぞれ出口５４ａ−ｄに達する。分岐流路５９ａ−ｄ中の各細流路はそれぞれ出口５４ａ−ｄの手前で合流する。流路５６ｄは出口５５に達する。
図１６には、血球分離チップ５０による、血球の分別の過程を模式的に表している。図１５に示したように分岐流路５９ａ−ｄはそれぞれ複数の細流路を有する。図１６中では説明を簡単にするため、各分岐流路５９ａ−ｄにはそれぞれ細流路が一本ずつ示されている。
図１６に示す主流路５２の上流から母体血が流れてくる。母体血は血球を大量に含んでいる。血球は流路５６ｂに達する。一方、副流路５３を流れてきたＰＢＳは、主流路５２を流れる血球を、主流路５２の側方から押し込む。流路５６ｂ-ｃにおいて、分岐流路５９ａ−ｄ側に血球が押しやられる。
図１６に示す流路５６aにおいて、主流路５２の副流路５３と対向する側には分岐流路５９ａ−ｄが配置されている。分岐流路５９ａ−ｄのそれぞれが有する細流路の内接径は、これらの並ぶ順に大きくなる。ここで内接径は細流路の直交断面における内接円の直径である。本実施例では、分岐流路５９ａ−ｄの細流路の内接径はそれぞれ８、１２、１５及び２５μｍである。本実施例において細流路の断面は四角である。細流路の断面は他の多角形でも円でもよい。
図１５及び１６に示す血球分離チップ５０では分岐流路を４個設けた。分岐流路の数は２以上であれば特に限定されない。例えば分岐流路を少なくとも２個としてもよい。係る２個の分岐流路のうち、上流の細流路の内接径は１２〜１９μｍでもよい。上流の細流路の内接径は１３、１４、１５、１６、１７、及び１８μｍのいずれかでもよい。本実施例の分岐流路５９ｃがこれに当てはまる。分岐流路５９ｃは無核赤血球の除去流路と言える。
また下流の細流路の内接径は２０〜３０μｍでもよい。下流の細流路の内接径は２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び２９μｍのいずれかでもよい。本実施例の分岐流路５９ｄがこれに当てはまる。分岐流路５９ｄは有核赤血球の回収流路と言える。
図１６に示す分岐流路５９ａ−ｄには副流路５３によって押しやられた血球が流れ込む。各分岐流路に流れ込む血球の径は、その分岐流路の細流路の内接径よりもやや小さい。図中には分岐流路５９ａの細流路の内接径よりもやや小さい血球として顆粒３９が示されている。顆粒３９は出口５４ａに至る。図中には分岐流路５９ｂ，ｃの細流路の内接径よりもやや小さい血球として無核赤血球４２が示されている。無核赤血球４２は出口５４ｂ，ｃに至る。
有核赤血球の径の大きさは１１〜１３μｍと考えられる。図中には分岐流路５９ｄの細流路の内接径よりもやや小さい血球として有核赤血球４１が示されている。さらに白血球４３が示されている。有核赤血球４１及び白血球４３は出口５４ｄに至る。
図１６に示す分岐流路５９ａ−ｄに取り込まれなかった血球はフロースルー（FT）として、血漿とともに流路５６ｄを通過するとともに、図１５に示す出口５５に至る。例えば凝集した血球などがフロースルーに含まれる。出口５４ａ−ｄ及び出口５５には流体を受け止めるリザーバーがそれぞれ設けられる。
図１６に示す出口５４ａ−ｄに接続された各リザーバーには画分Ｆｒ１−４がそれぞれ分取される。フロースルーは画分Ｆｒ５として図１５に示す出口５５に接続されたリザーバーに分取される。以上により、血球分離チップ５０は大きさによって血球を分画できる。また血球分離チップは篩として機能するので、画分Ｆｒ１−４には各細流路の径を上回る大きさの粒子が含まれない。したがってＦｒ４に凝集した血球が混入することを防止できる。
血球の大きさを利用した濃縮方法には、密度を利用した方法に比べて利点がある。一つは血球の密度に対する採血後の経過時間による影響は大きいが、血球の大きさに対する影響は小さい点である。これは採血する場所が、血球を分画処理する場所から遠くても本実施例の方法を実施しやすいことを表す。他の一つは、大きさによる分画は、例えば上記血球分離チップの操作のように、容易な操作で行うことが可能な点である。
＜実際の分画＞
１５ｍｌの母体血希釈液を上記血球分離チップで分画した結果を表１に示す。係る母体血には３００μｌの母体血全血が含まれる。母体血全血中には１．４３×１０9個の血球が含まれると考えられる。全自動セルカウンターＴＣ２０を用いて測定した。分岐流路１及び２並びにフロースルー３を通過した画分の血球数は表１の通りである。
表１に示される画分Ｆｒ４中の血球は3.29×107個であった。密度勾配積層遠心の結果も考慮すると、係る画分には有核赤血球及び白血球に相当する血球が含まれていると解される。画分Ｆｒ４を上述の画分Ａとして用いて、セルソーティングによる解析を行った。
実施例１の密度勾配遠心法では、遠心管中に浮遊する画分を採取する必要があった。これに対して血球分離チップを用いた本実施例では、血球分離チップ自身が画分Ａを分取することが出来る。したがって、画分Ａを得るための濃縮の操作を簡便にすることができる。
＜セルソーティングによる画分Ｂの分取＞
画分Ｂの分取は実施例１と同様に行った。まず画分Ａに対してHoechst33342及びPE修飾抗CD45抗体による染色を行った。染色は細胞に対して架橋固定を含む固定処理をせずに行った。次にFITC修飾抗CD235a抗体による染色を行った。抗体の濃度は実施例１と同様に最適化した。
画分Ｆｒ４の3.29×107個の血球をオンチップ社のセルソーターで選別した。Hoechst33342及びCD235aに対して陽性、かつCD45に対して陰性の血球を選別した。CD45陰性の選択は、CD45抗体ビーズを用いたアフィニティー精製で免疫学的除去により行ってもよい。以上により661個の血球を含有する画分Ｂを得た。
＜一細胞レベルでの分離＞
図１７には上述のように染色した血球が示されている。図に示すように凝集の発生は抑えられていた。このため、血球を一細胞レベルで互いに分離可能なことが示された。本実施例において凝集が抑えられたことは染色する抗体濃度を最適化したことによると考えられる。
＜染色体ＤＮＡの抽出＞
上記画分Ｂを、血球を約200個ずつ有する3つの画分に分けた。これらの画分には１〜２個の胎児由来の有核赤血球が含まれているものと期待される。
各画分に対して、染色体ＤＮＡの抽出を行った。染色体ＤＮＡに対してMALBAC（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles）法による全ゲノム増幅を行った。これにより胎児由来のY染色体が増幅され、後の工程でSRY遺伝子の検出を容易にすることができた。増幅された染色体ＤＮＡを鋳型として、SRY遺伝子配列特異的にＰＣＲ増幅を行った。SRY遺伝子のＰＣＲ産物の電気泳動層を図１８に示す。鋳型は以下の通りである。
レーン１の左側には200bpのDNAラダーが示されている。
レーン１：蒸留水。
レーン２：ヒト男性の標準ＤＮＡ、20ｎｇ。
レーン３：ヒト女性の標準ＤＮＡ、20ｎｇ。
レーン４：MALBAC法による増幅産物１、450ｎｇ。
レーン５：MALBAC法による増幅産物２、610ｎｇ。
レーン６：MALBAC法による増幅産物３、700ｎｇ。
レーン４の増幅産物１を鋳型としたPCRにおいては、SRYのバンドが見られた。他の増幅産物を鋳型としたPCRにおいては、SRYのバンドが見られなかった。以上より、画分Ｂを分画することで、胎児由来の血球を有する画分と、有しない画分とに分けられることが分かった。また一細胞レベルで限界希釈を行うことで、一細胞レベルに分離された血球におけるSRY遺伝子の有無を同定可能なことが示唆された。
上記の新規な知見に基づけば、一細胞レベルで区別可能な染色体DNAであって、胎児由来に由来するものを取得可能なことは、当業者であれば容易に理解できると考える。すなわち、本実施例では血球を200個ずつ有する3つの画分を得たのに対して、他の方法では限界希釈法により、画分Ｂを600個以上の画分に分ければ血球を一細胞レベルで分離することができる。このような分画は、無差別に行ってもよく、また得られた小画分に１個ずつ細胞が含まれていることを確認しながら行ってもよい。また、これらの血球を一細胞レベルで有する小画分に対して、所定のＤＮＡ抽出処理及び増幅処理を行うこともできる。
一細胞分の染色体ＤＮＡには通常、両親の配偶子から得た１コピー（single copy）ずつの遺伝子又はアレル（allele）しか存在しない。しかしながらMALBAC法を始めとする全ゲノム増幅法は一細胞分の染色体ＤＮＡを鋳型として、これらの１コピーのＤＮＡ配列を増幅可能である。増幅されたＤＮＡは出生前検査又は出生前診断に必要な分子生物学的データの取得のために、好適に使用することが出来る。
［参考例：ピッキング法］
特許文献４は、いわゆるピッキング法を示している。ピッキング法では、メイギムザ染色された細胞をスライドガラス上で観察して、形態に基づき有核赤血球を単離している。係る方法では、一細胞レベルで有核赤血球が単離される。したがって白血球を含まない画分を得ることが出来る。このため、かかる画分から得た胎児細胞由来染色体ＤＮＡは純度が極めて高い。ここで言う純度においては、母体由来の細胞の染色体ＤＮＡの混入の有無に着目している。
しかしながら、特許文献４では、形態観察によって最も有核赤血球らしいとして識別された細胞、すなわち上位に順位付けがされた細胞５個がいずれも胎児由来の有核赤血球ではなかったことが示されている（段落0078）。特許文献４では、やむを得ず、次位に順位付けされた細胞５個を分子生物学的に解析し、その中から、１個の胎児由来の細胞を得ている（段落0079）。
出生前診断を行う場合、被験対象の母体血試料は言うまでもなく限られた量しか採血できない。また出生前診断を行うことのできる期間が、被験対象である妊婦ごとに限られた期間しかないことは産科医学的に明らかである。一方で血液中の胎児由来の有核赤血球の数は極めて少ない。したがって、試料の全量を限られた期間で検査することのできる方法が望まれる。言い換えれば、胎児由来の細胞の取得に失敗したことが判明した後、再度工程を繰り返すことを前提とした方法は望まれていない。
形態観察に依存した方法は、確実に有核赤血球を採取できるという点において信頼性が高い。一方で信頼性の代償として、一定の時間内に胎児由来の有核赤血球にたどり着くことについての合理的な期待が損なわれている。
また母体血中には母体由来の有核赤血球も含まれることから形態観察によって、胎児由来の有核赤血球を選別することは困難である。形態的情報に依存した胎児由来の有核赤血球候補の選別は分子生物学的な解析による裏付けられることを必須とする。
また発明者は本発明の研究の過程で、ピッキング法において、識別された有核赤血球をプレパラートから容器に細胞を移すことには操作者の十分な習熟が必要であることを見出した。また発明者は一方で、上記実施形態及び実施例のように十分に濃縮が行われた状況においては、無差別な一細胞レベルでの分子生物学的解析であっても胎児由来の有核赤血球由来の染色体ＤＮＡにたどり着けることを見出した。
以上より、上記実施形態及び実施例では有核赤血球を単離することを優先しなかった。そのかわりに、最終的に一細胞レベルで区別できる胎児由来の染色体ＤＮＡを採取することを優先した。かかる優先目標を達成するには、無差別に限界希釈法等により分画した後、無差別に分子生物学的解析を行うことが、より効率であることが分かった。
無差別な分子生物学的解析を実行するには、形態的情報に依存した方法に供する画分よりも高いレベルで有核赤血球の濃縮された画分を用意する必要がある。言い換えれば画分から他の血球を十分に除去する必要がある。さもなければ分子生物学的処理をすべき血球数が膨大になり、一細胞レベルでの分子生物学的解析に適さなくなるからである。このため、密度又は大きさによる濃縮と、セルソーティングによる濃縮とを組み合わせることで高いレベルでの有核赤血球の濃縮を実現させた。
３９ 顆粒
４０ 細胞核
４１ 有核赤血球
４２ 無核赤血球
４３ 白血球
４４ 容器
４５ａ−ｆ
４６ 遠心管
４７ 主流路
４８ａ−ｃ 血球
４９ 副流路
５０ 血球分離チップ
５１ 入口
５２ 主流路
５３ 副流路
５４ａ−ｄ 出口
５５ 出口
５６ａ−ｄ 流路
５７ シリンジ
５８ シリンジ
５９ａ−ｄ 分岐流路
６１ 平面チップ
６２ 血球
７４ 装置
７５ 流路
７６ 捕捉構造
７７ 反応構造
７８ 細胞
Ｂ 画分
Ｃ１−８ 画分
Ｄ 画分
Ｅ１−８ 画分
Ｆ１−３ 画分
Ｆｒ１−５ 画分
ＦＴ フロースルー
Ｇ 画分
Ｍ 染色体
Ｐ 染色体
Ｓ２１−２６ ステップ
Ｓ２８−３０ ステップ
Ｓ３２−３３ ステップ
Ｓ３５−３７ ステップ

Claims (12)

  1. 胎児細胞由来染色体ＤＮＡを取得するための方法であって、
    ａ．母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Ａを、赤血球及び核酸に対して特異的に標識するところ、少なくとも核酸に対する標識を蛍光標識によって行い、
    ｂ．標識した前記画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、有核赤血球の純度が高められた画分Ｂを取得するところ、少なくとも核酸に対して特異的に蛍光標識された前記画分Ａ中の血球を蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別し、
    ｃ．前記画分Ｂ中の血球を一細胞レベルでそれぞれ無差別に分離するとともに、前記分離された血球の各々に対して、無差別かつ独立に染色体ＤＮＡの抽出処理を行うことで、一細胞レベルで区別可能な染色体ＤＮＡを各々含有する画分Ｃを取得し、
    ｄ．前記画分Ｃのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Ｃの群の中から、一細胞レベルで区別可能な胎児由来の染色体ＤＮＡを含有する画分Ｄを選別する、
    方法であって、
    前記画分Ｃが無差別に取得されたものであることから、前記画分Ｄに含有される染色体ＤＮＡが一細胞レベルで分離された有核赤血球に由来することは、前記ｄ．において当該染色体ＤＮＡが胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とし、
    前記画分Ａは、母体血試料中の血球をその密度及び大きさのいずれかによって分画することで取得されたものであり、
    前記ｃ．において、前記画分Ｂを限界希釈法で分画することで、一細胞レベルで分離された血球を各々有する画分Ｅを取得するとともに、前記画分Ｅのそれぞれに対して、前記染色体ＤＮＡの抽出処理を行うことで前記画分Ｃを取得し、
    前記画分Ｂには母体由来及び胎児由来の有核赤血球が含まれている、
    方法。
  2. 前記画分Ａは、母体血試料中の血球から無核赤血球の少なくとも一部が取り除かれてなるものである、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記画分Ｂから無差別に画分Ｆを分取し、
    前記画分Ｆを撮像し、
    前記画分Ｆに一細胞レベルで分離された血球の含まれることを、前記画分Ｆの像を用いて確認することで、前記画分Ｅとして前記画分Ｆが取得されたか否かを判定する、
    請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記画分Ａ中の血球に対して組織学的な架橋固定を行うことなく、前記標識及び前記セルソーティングを行う、
    請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ａ．において前記標識を蛍光標識によって行い、
    前記ｂ．において、セルソーター内に前記画分Ａを含む液体流を作り、
    前記液体流中の前記標識された血球を標的として、前記液体流と交差する方向にパルス流を発生させ、前記標識された血球を前記パルス流に乗せることで、前記標識された血球を前記液体流から分離し、
    前記分離した血球を、逐次的に収集することで前記画分Ｂを生成する、
    請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ａ．において、前記画分Ａは、少なくとも母体血試料中の血球を密度又は大きさによって分画して得られた画分から、さらに免疫除去法により白血球が除去されることで得られた画分である、
    請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記ａ．において、前記画分Ａを、追加的に白血球に対して特異的に標識し、
    前記ｂ．において標識した前記画分Ａ中の血球をセルソーティングによって選別することで、前記白血球に対して特異的な標識により標識された血球が除外された前記画分Ｂを取得する、
    請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ａ．において、赤血球に対する標識を磁気標識によって行い、
    前記ｂ．において、前記蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングの前若しくは後に、赤血球に対して特異的に磁気標識された前記画分Ａ中の血球を磁気標識による細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別する、
    又は
    前記ａ．において、赤血球に対する標識を蛍光標識によって行い、
    前記ｂ．において、核酸及び赤血球に対して特異的に蛍光標識された前記画分Ａ中の血球を前記蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別する、
    請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記母体血試料を血球の密度又は大きさによって分画することで、前記画分Ａを取得することを含む、
    請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記母体血試料を血球分離チップで処理することで前記母体血試料を血球の大きさによって分画する、
    請求項９に記載の方法。
  11. 前記血球分離チップは、主流路と、前記主流路に接続する除去流路と、前記除去流路よりも下流で前記主流路に接続する回収流路とを備え、
    前記主流路には前記母体血試料が流れ、
    前記除去流路において前記母体血試料から無核赤血球が除去されるとともに、前記回収流路において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記回収流路から前記画分Ａが取得され、
    前記除去流路の内接径が１２〜１９μｍであり、
    前記回収流路の内接径が２０〜３０μｍである、
    請求項１０に記載の方法。
  12. 請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により得た前記画分Ｄ中の染色体ＤＮＡをマイクロアレイ又は配列決定法により解析し、
    前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
    方法。
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