CN114765966A - 血液用装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的血液用装置(1)具备：管柱(50)和位于管柱(50)的下游的微细流路(20)。管柱(50)具备多孔材料作为固定相，与所述多孔材料接触后的血液在微细流路(20)中流过。血液用装置(1)的管柱(50)和微细流路(20)是作为不同的单元来提供的。管柱(50)具有连结部(55)，微细流路(20)具有入口(21a)，通过将连结部(55)和入口(21a)连结来使管柱(50)与微细流路(20)一体化后，使血液(BL)从管柱(50)流入。

Description

血液用装置
技术领域
本发明涉及血液用装置、特别是涉及血球分离用装置。本发明还涉及这些装置的使用方法。
背景技术
专利文献1中记载了通过微细流路进行的血球的分级。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/123220号
发明内容
发明要解决的问题
在使血液在微细流路中流过时，有时在微细流路中会出现堵塞。本发明的课题在于，提供适于消除堵塞的装置和其使用方法。
解决问题的方案
<1>一种血液用装置，其具备：管柱和位于所述管柱的下游的微细流路，该血液用装置中，
所述管柱具备多孔材料作为固定相，
与所述多孔材料接触后的血液在所述微细流路中流过。
<2>如<1>所述的血液用装置，其中，
所述多孔材料由颗粒构成，
所述管柱还具备能够容纳所述多孔材料的容纳部，且在处于所述容纳部的下游的、距所述微细流路较近的一侧，还具备捕捉所述多孔材料的颗粒的过滤器，
具有截取直径以下的粒径的小颗粒已被预先从所述多孔材料的颗粒中除去，所述过滤器的孔径比所述截取直径小。
<3>如<2>所述的血液用装置，其中，
所述截取直径在25μm～100μm的范围内。
<4>如<2>或<3>的任一项所述的血液用装置，其中，
所述过滤器所具有的网眼的直径在20μm～40μm的范围内，该范围小于截取直径。
<5>如<2>～<4>中的任一项所述的血液用装置，其中，
所述颗粒具有粒径分布，且其体积基准的累积分布中的中值粒径d50V为25μm～280μm，其中，所述粒径分布表示通过截取来除去所述小颗粒之前的粒径分布。
<6>如<2>～<5>中的任一项所述的血液用装置，其中，
还在处于所述容纳部的上游的、距所述微细流路较远的一侧，具备捕捉所述多孔材料的颗粒的过滤器。
<7>如<1>～<6>中的任一项所述的血液用装置，其中，
当与所述多孔材料接触后的血液在所述微细流路中流过时，所述微细流路对所述血液中的血球进行流体动力分级。
<8>如<7>所述的血液用装置，其用于分离血球，其中，
所述微细流路由平面的基片制作，该平面的基片具备：柱密集区、以及位于所述柱密集区的下游的流体动力流路，
所述管柱与所述平面的基片的正面或背面连接，
所述血液用装置还具备出口，该出口将进行了所述流体动力分级后的血球从所述微细流路排除到所述血液用装置的外部。
<9>如<1>～<8>中的任一项所述的血液用装置，其中，
所述多孔材料由颗粒构成，
所述多孔材料的颗粒具备由多糖、二氧化硅或树脂构成的多孔性的表面。
<10>一种血液用装置的使用方法，其为<1>～<9>中的任一项所述的血液用装置的使用方法，其中，所述血液用装置的所述管柱和所述微细流路是作为不同的单元提供的，所述管柱具有连结部，所述微细流路具有入口，通过将所述连结部和所述入口连结来使所述管柱与所述微细流路一体化后，使血液从所述管柱流入。
发明效果
根据本发明，可提供适于消除微细流路中的堵塞的装置和其使用方法。
附图说明
图1是血液分离用装置的示意图。
图2是管柱的主视图。
图3是多孔质的颗粒的粒径分布。
图4是血液分离用装置的正面剖面图。
图5是图4的区域V呈示的管柱的放大正面剖面图。
图6是图1的区域VI呈示的微细流路的观察像1(上段)及其概略图(下段)，且是实施例。
图7是图1的区域VII呈示的微细流路的局部俯视图。
图8是比较例1的微细流路的观察像2(上段)及其概略图(下段)。
图9是比较例2的微细流路的观察像3(上段)及其概略图(下段)。
图10是参考例的微细流路的剖面图。
具体实施方式
<1.血液分离用装置>
本发明的一个形态是具备管柱和位于所述管柱的下游的微细流路的血液分离用装置。在血液中包含细胞及血浆。在细胞中包含血球及在血液中循环的其他细胞。血液中的细胞是由各种大小的细胞混合而成的。对于细胞的大小，每种细胞类型表现独特的粒径分布。血液分离用装置是用于进行分级的装置，该分级是将血液中的细胞按其大小来进行分馏。通过使用血液分离用装置来对血液进行分级，能够获得浓缩了特定的细胞类型而成的细胞集团。分级的例子为在微细流路内进行的流体动力分级。
作为使用了血液分离用装置的分级对象的血液种类及可浓缩的细胞种类的例子如下所述。
在作为对象的血液中包含血球作为应浓缩的细胞种类。血球也可以是来自胎儿的有核红血球。所获取的血液含有来自胎儿的有核红血球。孕妇血中包含来自胎儿的有核红血球。诊断的对象者为胎儿及孕妇。使用管柱对该孕妇血进行前处理。通过使用了微细流路的分级，对来自胎儿的有核红血球进行浓缩。通过经浓缩的来自胎儿的有核红血球，获取对胎儿的诊断有用的数据。
在作为对象的血液中包含其他细胞作为应浓缩的细胞种类，该其他细胞是在血液中循环的细胞且并非血球。其也可以是循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)。所获取的血液含有CTC。例如在疑似患癌症的被检查者、癌症患者及已经接受了癌症治疗的被检查者的血液中有可能包含CTC。这些人成为诊断的对象者。使用管柱来对该血液进行前处理。通过使用了微细流路的分级来对CTC进行浓缩。与血液中是否包含CTC无关地，执行浓缩CTC所需的工序。通过经浓缩的CTC，获取对癌症的诊断有用的数据。
作为对象的血液中包含的细胞且为应浓缩的细胞种类也可以是骨髓瘤细胞。所获取的血液含有骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞例如有可能从进行了骨髓瘤的治疗的患者作为微小残留病变(minimal residual disease，MRD)而被检测出。这些人成为诊断的对象者。骨髓瘤的一例为多发性骨髓瘤。使用管柱对从这样的患者采取的血液进行前处理。通过分级对骨髓瘤细胞进行浓缩。与血液中是否包含骨髓瘤细胞无关地，执行浓缩骨髓瘤细胞所需的工序。通过经浓缩的骨髓瘤细胞，来获取对MRD的诊断有用的数据。
以下示出用于流体动力分级的装置的一例。首先，参照图1的示意图对血液分离用装置1的整体像进行说明。图1中示出了血液分离用装置1。
如图1所示，血液分离用装置1具备管柱50和微细流路20。如图1所示，也可以是，通过将若干个微细流路20重叠，构成具有多层结构的流路基片70。流路基片70也可以是仅具有1层的微细流路20的基片。以下，对流路基片70的最上层的微细流路20进行说明。对于位于流路基片70的最上层之下的层，既可以具备与以下说明的微细流路20相同的微细流路，也可以具备不同的微细流路。管柱50与微细流路20也可以构成为不同的单元。管柱50配置于微细流路20的上游侧。
如图1所示，将管柱50的一端与放入有血液BL的注入器30连结。另外，将管柱50的另一端与微细流路20的入口21a连结。管柱50至少具备多孔材料51和过滤器53a、53b。在一个形态中，管柱50用于将填充于其中的多孔材料51作为固定相，且将血液BL作为移动相来进行管柱层析。关于管柱50的细节，将使在后面使用图2进行说明。使血液多孔材料51的多孔性的表面与BL接触，与血液BL中的成分反应而进行相互作用。这样，从注入器30以规定的流量送出血液BL而通过管柱50，由此，经前处理的血液BL进入微细流路20的入口21a。
微细流路20用于分离以血球为代表的浮游细胞。图1所示的微细流路20具有微米级的流路结构。这样的微型流路结构适于血液的分级(专利文献1)。有时将具有用于血液的分级的微细流路的基片特别地称作“血球分离基片”或“流路基片”。血液BL由微细流路20分级并到达各出口22a-22c。
在图1中，微细流路20具有主流路23。主流路23的一端为入口21a。主流路23的另一端为出口22c。微细流路20还具有副流路24。副流路24的端部成为入口21b。副流路24的端部在合流部28与主流路23连接。
在图1中，主流路23从入口21a朝向出口22c依次具有流路部25a-25d。流路部25a-25d从入口21a至出口22c为止连在一起。在流路部25a与流路部25b之间存在合流部28。
在图1中，微细流路20具有支流路26a及支流路26b。支流路26a及支流路26b均为从主流路23分支的流路。从上游侧开始，支流路26a及支流路26b依次从主流路23分支。支流路26a及支流路26b的一端经由流路部25c而与主流路23连接。在流路部25c中，在与副流路24对置的一侧配置有支流路26a及支流路26b。在支流路26a及支流路26b的另一端存在出口22a及出口22b。
在图1中，支流路26a及支流路26b均具有多个从主流路23分支的细流路。各细流路沿着从主流路23的上游至下游的方向排列。各细流路分别到达出口22a及出口22b。各细流路分别在出口22a及出口22b的跟前合流。在流路部25c的下游存在流路部25d。流路部25d到达出口22c。
从注入器30以规定的流量将血液BL送至管柱50。送至管柱50的血液BL经由入口21a进入流路部25a。
在图1中，微细流路20具有副流路24。副流路24与注入器35连结。在注入器35中放入有澄清液CL。澄清液CL是不包含浮游细胞的液体。澄清液CL为不会损害血球或其他细胞的液体。澄清液CL为缓冲液。澄清液CL也可以是PBS(Phosphate-buffered saline，磷酸盐缓冲盐水)。通过对注入器35内施加压力，澄清液CL从入口21b进入副流路24。澄清液CL在副流路24中流过。澄清液CL流入流路部25b。
在各出口排出细胞悬浮液的分离液。在出口22c可获得分离液F3，在出口22b可获得分离液F2，在出口22a可获得分离液F1。分离液F1及分离液F2分别包含由流路部25c分级后的细胞。分离液F3包含通过了流路部25c的血浆。关于通过了图1的区域VII所示的流路部25b-25d的浮游细胞的分级过程的细节，将在后面使用图7进行说明。
<2.管柱的细节>
接着，参照图2对管柱50的细节进行说明。以下，图中的X、Y及Z的各轴是为了便于理解管柱50的结构功能而示出的。
在图2中示出了正面观察到的管柱50。管柱50具备管柱主体60。管柱主体60至少具备：多孔材料51、容纳多孔材料51的容纳部52、以及过滤器53a、53b。管柱50也可以还具备连结部54、55。连结部54可在注入器30上装卸。连结部55可在微细流路20的入口21a上装卸。也可以是，在过滤器53a与连结部54之间具备管部56。
以下，对各结构的细节进行说明。
<2-1.多孔材料>
多孔材料51为其表面具有多孔性的材料。换言之，在多孔材料51的表面形成有多个微细孔。多孔材料51也可以是颗粒。颗粒可以为球状。颗粒也可以为珠粒。在本说明书中，珠粒是指通过使每个各颗粒成为球状的方式形成的颗粒组。此外，多孔材料51也可以是在血液中下沉。优选地，根据需要从用作多孔材料51的颗粒中截取(cutoff)小颗粒。截取是指，从多孔材料的颗粒中预先除去具有截取直径以下的粒径的小颗粒。具体而言，可通过利用筛孔的筛选等来进行。对于多孔材料的截取的细节，将在后面的<3.>中进行说明。
与多孔材料51所具有的多孔性的表面接触的血液也可以是并未由其他液体稀释的全血。全血是指，血液并未按血液成分分离，包含血球、血浆等全部的成分。例如多孔材料51也可以与全血中包含的浮游细胞的一部分相互作用。相互作用的成分也可以是其本身造成微细流路20的堵塞的成分。相互作用的成分也可以是间接地促进微细流路20的堵塞的成分。
多孔材料也可以与血浆中包含的成分反应。例如多孔材料也可以与血浆中包含的成分相互作用。
多孔材料也可以与并非多孔质的其他材料结合。例如，也可以是，并非多孔质的颗粒通过多孔材料的涂覆而成为多孔性的颗粒。颗粒的中心也可以并非多孔性。颗粒的中心也可以为强磁性体。
多孔材料的材质也可以为多糖。多孔材料的微细孔处也可以由多糖形成。多糖也可以经交联。多糖也可以为琼脂糖、葡聚糖及烯丙基葡聚糖的某一者。多糖也可以经修饰。修饰也可以是DEAE(Diethylethanolamine，二乙基乙醇胺)修饰。另外，多孔材料的材质也可以是二氧化硅或树脂。
也可以是，颗粒状的多孔材料是可用于凝胶过滤色谱法的材料。凝胶过滤色谱法是指，移动相为水溶液的尺寸排阻色谱。另外，也可以是，这时能够分馏DNA。优选为，多孔材料相对于DNA的排除限制为45碱基对以上。多孔材料相对于DNA的排除限制可以为165碱基对以上，也可以为165碱基对以下。多孔材料相对于DNA的排除限制可以为1078以上，也可以为1078碱基对以下。
也可以是，颗粒状的多孔材料能够分馏蛋白质。多孔材料相对于蛋白质的分馏范围的下限优选为1×104Da以上。多孔材料相对于蛋白质的分馏范围的上限优选为4×106Da以上。优选为，颗粒状的多孔材料至少满足上述任一者。
<2-2.容纳部>
如图2所示，容纳部52为可容纳多孔材料51的结构。容纳部52的形状，其两端面为开口的端面，例如可设为剖面观察呈圆筒状或角筒状的中空状。例如在将容纳部52的形状设为圆筒状的情况下，由于容纳部52不具有角部，能够抑制角部处的多孔材料51及所流过的血液BL的滞留。因此，特别优选为，将容纳部52的形状设为圆筒状。在将容纳部52的形状设为剖面观察呈圆筒状的情况下，该剖面形状包含正圆、大致正圆、椭圆的任一者。
<2-3.过滤器>
过滤器53a、53b具有如下网眼结构，多孔材料的颗粒无法通过该网眼结构，但是由微细流路进行分级的血液等所希望的液体能够通过该网眼结构。即，过滤器53a、53b捕捉多孔材料的颗粒。由于具有截取直径以下的粒径的小颗粒已被预先从多孔材料的颗粒中除去，因此已排除了某些固定粒径以下的小颗粒。因此，过滤器53a、53b优选具备以下的网眼结构：该网眼结构的孔径小于多孔材料的颗粒的截取直径、即小于多孔材料的颗粒中包含的最小粒径，能够使以血球为代表的细胞通过。在此，细胞的大小例如较大者为12μm左右。因此，例如，可以使用具有以下直径的过滤器：各网眼结构为20μm～40μm的直径、特别优选为20μm的直径。即，优选网眼结构的直径均相同。由于具备该网眼结构，能够通过过滤器53a、53b抑制多孔材料的颗粒向管柱主体60的外部漏出。
在此，本说明书中的“网眼结构”是指过滤器53a、53b的孔径。网眼结构包括配置为直线纵横交叉的结构、重复配置有多边形的结构这两者。作为配置为直线纵横交叉的结构，例如包括网格状的结构。网眼结构也可以是重复配置圆形而成的结构。
如过滤器53b所示，过滤器可以配置在容纳部52的两端中的至少微细流路20的入口21a侧。即，过滤器53b可以配置在管柱50中的血液流向的下游侧。另外，过滤器53a、53b也可以配置在容纳部52的两端。即，过滤器53a、53b可以配置在管柱50中的血液流向的上游侧及下游侧这两者。也就是说，过滤器53a、53b可以配置为，完全覆盖位于容纳部52的两端面的开口端面的整个面。过滤器53a、53b的外径优选至少具有容纳部52的外径以上的直径，以完全覆盖容纳部52的开口端面的整个面。通过将过滤器53a、53b配置于容纳部52的两端面，能够在血液BL与填充于容纳部52的多孔材料51接触的同时，抑制多孔材料51向外部漏出。
<2-4.连结部>
连结部54、55是用于将管柱主体60连结至位于管柱50的上游的注入器以及位于下游的微细流路的构件。如图2所示，连结部54是可在注入器30装卸的结构。连结部55是可在微细流路20的入口21a装卸的结构。对于连结部54、55的形状，不特别地进行限定，但优选设为容易在各结构装卸的结构。例如，连结部54可以设为具备凹部的形状，该凹部嵌入至注入器30的前端的凸部的形状。
例如，连结部55可以设为具备凸部的形状，该凸部与微细流路20的入口21a的凹部对应。另外，也可以在各凸部及凹部的表面设置螺纹状的槽，使它们彼此旋转连结。通过设为这样的结构，能够可靠地连结管柱50与微细流路20，操作性得到提高。
连结部54、55的形状例如也可以设为以下结构：一旦向注入器30或入口21a进行连结时，则无法拆下。在设为不可拆下的结构的情况下，能够更可靠地进行连结，即便在对各连结部施加来自注入器30的压力的情况下，在连结部流过的血液也不容易向外部漏出。即，能够使连结部处的水密性提高。
<2-5.管部>
如图2所示，在一个形态中，在过滤器53a与连结部54之间具备管部56。管部56也可以具有挠性，例如可以使用有机硅树脂管或聚氯乙烯的管等。由于具备管部56，能够保持从送入血液的注入器至管柱主体60为止的距离。例如也可以在管部56上设置夹管阀。另外，在相对于微细流路20配置管柱50的情况下，也可以在过滤器53b与连结部55之间另外设置管部。此外，在从注入器30至管柱主体60为止的距离较短的情况下，也可以不具备管部56。在不具备管部56而具备<2-4.>所说明的连结部54的情况下，例如也可以设为在过滤器53a直接连结有连结部54的结构。
<3.多孔材料的颗粒的截取>
接着，参照图3对多孔质的颗粒的粒径分布进行说明，然后对多孔材料的颗粒的截取更详细地进行说明。截取是指，从多孔材料的颗粒中除掉小颗粒。
图3中，由体积基准的累积分布表示多孔质的颗粒的粒径分布。多孔材料的颗粒具有粒径分布。多孔材料的中值粒径d50V(Median particle size of the cumulativevolume distribution累积体积分布的中值粒径尺寸)为体积基准的累积分布中的中值粒径。在颗粒由多糖构成的情况下，以颗粒在缓冲液中膨润的状态中的粒径为基准。粒径的测定例为利用激光衍射·散射法求出的有效粒径、或利用库尔特(Coulter)法求出的球体等效粒径。
图3中，优选中值粒径d50V小于500μm。中值粒径d50V优选为25μm～280μm，更优选为25～165μm，进一步优选为45～165μm。由于中值粒径d50V处于这样的范围，能够使多孔材料的表面积适于与血液的接触。
图3中，优选为，从多孔材料的颗粒中根据需要而截取小颗粒。在一个形态中，具有截取直径CF以下的粒径的小颗粒已被预先除去。即，截取直径CF是指多孔材料的颗粒中包含的最小粒径。截取直径CF的范围为25μm～100μm。截取直径CF的范围为25～70μm，优选为40～70μm。优选为，通过利用筛孔的筛选来进行小颗粒的除去。例如也可以是，使用细胞过滤器(Cell Strainer)从多孔材料的颗粒集团中除去小颗粒。通过除去小颗粒，能够抑制混杂到血中的多孔材料中的小颗粒所导致的微细流路的堵塞。
根据微细流路的种类，进入到微细流路的多孔材料中的小颗粒平顺地从微细流路流出。在这种微细流路中，也可以不考虑小颗粒所导致的堵塞。但是，即便为这种微细流路，有时也会产生血中的某些化学成分所导致的堵塞(后述的碎屑(debris))。因此，即便对这种微细流路适用多孔材料的颗粒，也可以有效地抑制堵塞，且这与是否在多孔材料的颗粒中截取小颗粒无关。
若从原始颗粒中除去小颗粒，则原始颗粒的粒径分布发生变化。即，截取具有尺寸选择的效果。尺寸选择后，中值粒径也发生变化。为了便于理解，本说明书中，中值粒径d50V是基于通过截取而从原始颗粒中除去小颗粒之前的粒径分布的粒径的。
以上为本发明的血液分离用装置。
管柱与微细流路也可以构成为不同的单元。在使用时，能够将管柱与微细流路组合而作为一个血球分离用装置来使用。管柱与微细流路例如能够通过具备上述的凹凸结构的连结部来进行连结。另外，例如也可以通过在凹凸结构的表面具备螺纹状的槽的连结部来进行连结。
另外，也可以将管柱与微细流路构成为一体。例如也可以设为具备与微细流路的入口连结的管柱结构的结构。另外，本发明的血液分离用装置也可以设为与注入器为一体型的筒状物。并且，也可以将该筒状物与用于驱动微细流路的驱动装置连接，或者配置于驱动装置内部等来使用。
以下，参照图4～图7对使用了血液分离用装置的血液的分级过程的细节进行说明。
<4.血液的流动的概略>
以下，参照图4对血液分离用装置内部的血液的流动进行说明。图中，从正面侧对血液分离用装置进行剖面观察。中空箭头表示血液BL的一连串的流动。本例的流路基片70具有由微细流路20及与其同等的微细流路构成的8层。流路基片70的最上层由板状的片体构成，该板状的片体安装了与微细流路20的入口21a连接的入口71。入口71为将流路基片70的微细流路20的入口21a与其他微细流路的入口结合在一起的入口。流路基片70在其最下层具备与微细流路20的出口22c连接的出口72。出口72为将流路基片70的微细流路20的出口22c与其他微细流路的出口结合在一起的出口。如中空箭头所示，从注入器30送出的血液BL在管柱50中通过。对于管柱50内的血液BL的动作，将在后面使用图5进行说明。
以下，对流路基片70中的最上层的微细流路20进行说明。其他层也具备与微细流路20相同的结构。如图4所示，通过了管柱50与入口71的血液BL从入口21a进入微细流路20内。进入微细流路20中的血液BL进入主流路23，该主流路23形成于经层叠的微细流路20的各层。流路部25a具备：发挥过滤器的作用的柱密集区11、13、以及区段12、14。在图4中，柱密集区11、13由纵线的剖面线表示。对于流路部25a的细节，将在后面使用图6进行说明。也就是说，微细流路20由平面的基片所构成，该平面的基片具备：柱密集区11、13、以及位于该柱密集区11、13的下游的流体动力流路。
在图4中，通过了流路部25a的血液继续通过图1所示的流路部25b-25d。由此，微细流路20对血液中包含的浮游细胞进行分级。流路基片70中的下层的微细流路也同样地对浮游细胞进行分级。经分级的浮游细胞中的、分离液F3经由出口22c而到达前端的出口72。关于对浮游细胞进行分级的过程的细节，将在后面使用图7进行说明。
<5.管柱与血液的相互作用>
以下，参照图5，对管柱与血液的相互作用进行说明。图5是图4的区域V中所示的管柱50的放大正面剖面图。图5中示出了管柱与血液的相互作用的情形。
图5中为了简单说明，仅示出微细流路20与代表微细流路的下层的流路的微细流路80的共计2层。
图5中，以黑箭头表示血液的流动。血液BL包含：无核红血球27、有核细胞29a-29c及沉淀原因物质CC。有核细胞29a-29c分别为大小不同的细胞。沉淀原因物质CC是推测为造成微细流路20及微细流路80的堵塞(碎屑)的原因之一的物质。
如图5所示，从注入器30以规定的流量送出的血液BL在管柱50的管柱主体60中通过。如图5所示，沉淀原因物质CC在多孔材料51中通过。在此，多孔材料51与血液中包含的沉淀原因物质CC相互作用，由此使它们的沉淀性大幅降低。优选为，通过使用足够量的多孔材料51，从而使沉淀原因物质CC的沉淀性降低至几乎不形成微细流路20的凝胶状碎屑的程度。也可以是，通过多孔材料51吸附沉淀原因物质CC，从而抑制微细流路20及其他微细流路的堵塞(碎屑)的产生。另一方面，无核红血球27及有核细胞29a-29c在多孔材料51的间隙流过。因此，多孔材料51不会妨碍血球的流动。
<6.柱密集体>
通过了管柱50的血液继续通过主流路23所具备的柱密集区11。以下，参照图6，对柱密集区进行说明。
图6中示出了图1的区域VI所示的微细流路的观察像(上段)及其概略图(下段)。参照图6对柱密集区11进行说明。图6也是实施例的观察像。对于实施例，将在后面进行说明。
图6所示的柱密集区11发挥过滤器的作用。柱密集区11构成为：使血液中的杂质、例如比血球大的不溶成分无法进入柱密集区11的下游的流路部。另外，若有成为凝集块的血球，则发挥使一个一个的血球分散的作用。柱密集区11设置为横跨流路部25a中的血液的流动。血液从图中的上游即左侧向下游即右侧流过(以中空箭头表示)。柱密集区11连结流路部25a的上表面和下表面。各柱的形状并非对血液的流动造成较大阻挡的形状。即，对于各柱的形状，优选为对流体的阻挡较少的形状，例如可以设为俯视时呈圆状、椭圆状、具有流线形的水滴形状。在图6中，作为一例示出了水滴形状的柱，但不限于此。另外，柱密集区11并不会使血液的流速显著降低。
图6中，流路部25a具有区段12。区段12在柱密集区11的下游侧与柱密集区11相邻。在区段12中，柱较稀疏。流路部25a还具备柱密集区13。柱密集区13是在从柱密集区11观察的下游方向上位于柱密集区11之后的下一个柱密集区。柱密集区13的结构也可以与柱密集区11相同。
图6中，区段12由柱密集区11、柱密集区13、流路部25a的侧壁即微细流路的侧壁所包围。流路部25a还具有区段14。区段14在柱密集区13的下游侧与柱密集区13相邻。流路部25a在区段14的下游还具备柱密集区。对于附图标记15、17，在实施例中进行说明。
<7.微细流路的浮游细胞分级过程>
通过了流路部25a所具备的柱密集区11的血液中包含的浮游细胞继续在流路部25b-25d进行分级。以下，参照图7，对微细流路的浮游细胞分级过程进行说明。
图7中示出了俯视时的微细流路20。图中示意性地示出了微细流路20所进行的浮游细胞的分级过程。为了简单说明，在支流路26a中示出了10条细流路，在支流路26b中示出了3条细流路。
如图7所示，血液BL从位于流路部25b的更上游的流路部25a(图7中未图示)连续地流过。血液BL包含大量的细胞。相对于血液BL的流动，使澄清液CL的流动从血液BL的侧方与其连续地接触。由此，从主流路23的侧方将在主流路23流过的细胞连续地压入。其结果，血液BL的流动被连续地压入与澄清液CL的流动相反的一侧。在流路部25b-25c中，浮游细胞被连续地压入支流路26a及支流路26b侧，并且浮游细胞连续地流入这些支流路。
如图7所示，无核红血球27连续地流入支流路26a。在流路部25b中，对血液BL中的无核红血球27进行流体动力分级。在血液BL的流动中的未与澄清液CL的流动接触的一侧，连续地进行分级。
如图7所示，支流路26a作为无核红血球27的除去流路而发挥作用。支流路26a所具有的细流路的内接径为12μm～19μm。内接径也可以是13μm、14μm、15μm、16μm、17μm及18μm中的某一者。
如图7所示，有核细胞29a-29c连续地流入支流路26b。在位于流路部25b的下游的流路部25c中，对血液BL中的有核细胞29a-29c进行流体动力分级。在血液BL的流动中的未与澄清液CL的流动接触的一侧，连续地进行分级。特别是从支流路26b连续地获得有核细胞的细胞悬浮液。
如图7所示，支流路26b作为有核细胞29a-29c的回收流路而发挥作用。支流路26b所具有的细流路的内接径为20μm～30μm。内接径也可以是21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm及29μm中的某一者。以有核红血球为代表的有核细胞的直径的大小认为是11μm～13μm。
图7所示的支流路26a及支流路26b的各细流路的内接径为细流路的正交剖面中的内接圆的直径。细流路的剖面可以为四边形，也可以为其他多边形，也可以为圆。其他支流路中是同样的。未进入支流路26a及支流路26b的浮游细胞或血浆作为顺流(flow-through)FT而连续地在流路部25d中通过。之后，在图1中到达出口22c。例如顺流FT中包含凝集的血球等。
根据以上，能够从支流路26a回收不包含某大小以上的浮游细胞的流体。其结果，无核红血球27在此受到分级。另外，有核细胞29a及其他有核细胞在下游受到分级。
以上为使用一实施形態的血液分离用装置来进行分级的一连串的流程。
<实施例>
本实施例中，参照图6、图8及图9，对研究了管柱中的微细流路的堵塞消除效果的实施例及比较例与其效果进行说明。
本实施例的一连串的流程如以下(1)～(5)所示。
(1)对多孔质的颗粒即珠粒中包含的小颗粒进行截取。
(2)在血液中掺入(spike)荧光颗粒而获得试样血。
(3)将血液流入血液分离用装置，进行分级。
(4)分级后，回收F1-F3分馏，评价荧光颗粒的回收率。
(5)评价分级中的血球分离基片的堵塞率。
上述(1)～(3)为在实施例中进行的分级的说明。(4)为作为分级的结果所获得的数据的评价。(5)为分级中所获得的数据的评价。
(1-1.)截取
本实施例中，对多孔质的颗粒进行小颗粒的截取。本实施例中，使用珠粒的Sepharose CL-6B作为多孔质的颗粒。Sepharose为商标。Sepharose CL6B的凝胶基质(gelmatrix)为由6％交联琼脂糖构成的球状体。截取前的粒径为45μm～165μm。将1mL的珠粒放入尼龙制的细胞过滤器(FALCON、商标)。历时一晩通过搅拌器一边搅拌，一边对珠粒进行过滤。过滤所花费的时间也可以是数小时至24小时。过滤是在蒸馏水中进行的。细胞过滤器的筛孔尺寸为40μm、70μm及100μm。过滤是按各筛孔尺寸的细胞过滤器进行的。在此，对70μm筛孔的细胞过滤器的使用例进行详述。细胞过滤器的筛孔尺寸与截取直径对应。将通过截取所过滤得到的大颗粒容纳于管柱，并用于前处理。此外，筛孔尺寸越小，筛孔上过滤的颗粒的数量增加。用PBS清洗珠粒两次。
使各珠粒悬浮于与珠粒同体积的澄清液。对2mL的澄清液添加珠粒的悬浮液20μL，并将它们充分混合。澄清液是将PBS作为基质的缓冲液。将珠粒与澄清液的混合液进一步添加至澄清液中。使澄清液的一部分预先流至血球分离基片，由此在事前将血球分离基片的内部浸没于缓冲液。浸没血球分离基片的处理要进行40分钟。
(1-2.)截取直径的评价
通过显微镜对完成分级的血球分离基片敬悉观察。在将100μm的珠粒放入管柱而对血液进行了前处理的情况下，在流路部25a的内部或入口21a的附近观察到碎屑。流路因碎屑而稍微堵塞。相对于此，在以截取直径70μm及40μm的珠粒进行了前处理的情况下，并未看到碎屑。另外，历时2小时40分钟持续进行了试样血的分级，但并未看到流路的堵塞。得知为了获得对碎屑所导致的流路堵塞的抑制效果，优选将截取直径设为70μm以下。截取直径可以为60μm，也可以为50μm。
此外，即便在截取直径40μm、70μm及100μm中的任何一者的情况下，也能够通过血球分离基片来处理全量的试样血。不会有因碎屑使血球分离基片堵塞而无法分馏的试样血残留。在以下的试验中，采用截取直径70μm。
将进行截取后的珠粒容纳于管柱的容纳部。管柱中例如容纳50μL的截取直径为70μm的珠粒。
(2)对血液掺入荧光颗粒
本实施例中的“血液”是指从健康的成人采取的全血。在采取血液时所使用的采血管中，包含抑制血液凝固的柠檬酸及乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)。通过将指定量的血液采取至采血管内，在血液中自动添加适当分量的柠檬酸及乙二胺四乙酸。对采血后以4℃保存的第3天的全血掺入荧光颗粒，由此获得试样血。在此，掺入是指，微量添加细胞或细胞模仿物。“荧光颗粒”是指模仿了孕妇血中包含的微量的来自胎儿的有核红血球的球状颗粒。例如在图5中，其是与有核细胞29a-29c相当的球状颗粒。对所获得的试样血添加澄清液(将PBS设为基质的缓冲液)，且稀释至5倍。在本实施例中，将直径不同的两种荧光颗粒掺入血液。具体而言，将直径为8.42μm与直径为10μm的树脂制的荧光颗粒掺入血液。作为直径为8.42μm的荧光颗粒，使用Spherotech公司的FITC Particles(cat#F1CP-80-2)。作为10.0μm的荧光颗粒，使用Invitrogen公司的FluoSpheres(商标)聚苯乙烯微球体(polystyrene microspheres)，10μm，蓝色荧光(blue fluorescent)(365/415)。对稀释血1mL分别掺入直径为8.42μm和直径为10μm的不同直径的各荧光颗粒各60个，共计120个。此外，也可以是，在荧光颗粒的掺入后进行全血的稀释。例如，也可以是，对全血1mL分别掺入直径为8.42μm和直径为10μm的直径不同的各荧光颗粒各300个，稀释至5倍。
(3)利用血球分离基片进行的分级
将经稀释的试样血通过管柱来进行前处理，通过1层的血球分离基片进行分级，回收荧光颗粒。根据图1及图6对分级的结果进行说明，在分离液F2中可获得较多的包含淋巴球的白血球。在分离液F1中可获得较多的无核成熟红血球。此外，流入血球分离基片的细胞大部分(>99.9％)流出至分离液F1。在分离液F3无法获得较多的血球。由于荧光颗粒是类淋巴球的，因此期待包含在分离液F2中。
在实施例、比较例1及比较例2中所流过的试样血如上述(2)所述，为相同条件。将从注入器送出试样血的速度设为20μL/分钟。将从注入器送出澄清液的速度设为40μL/分钟。在分级开始后90分钟流过了1.8mL的试样血的时间点，从由F1～F3分馏荧光颗粒构成的分离液回收荧光颗粒，求出回收率。
实施例、比较例1与比较例2的不同之处在于血液分离用装置的管柱的结构。
实施例的管柱具备CL-6B珠粒及过滤器这两者。在管柱中填充有50μL的截取直径70μm的CL-6B珠粒。过滤器的网眼为网格状，且为20μm的直径。
比较例1不具备管柱。即，在比较例1中，不具备CL-6B珠粒及过滤器这两者。试样血直接导入至血球分离基片。
比较例2的管柱并未填充CL-6B珠粒。即，比较例2的管柱仅具备过滤器，不具备CL-6B珠粒。过滤器的网眼为与实施例相同的网格状，且为20μm的直径。
(4)荧光颗粒的回收率的评价
荧光颗粒的回收率可以使用以下的式1来求出。
[式1]
[荧光颗粒回收率(％)]＝(固定时间回收的荧光颗粒的数量)/(固定时间内分馏的血球所含的荧光颗粒数的期待值)*100
“固定时间回收的荧光颗粒的数量”是通过实际测定发现的荧光颗粒的数量。
上述[式1]的“固定时间内分馏的血球所含的荧光颗粒数的期待值”可以使用以下的式2来求出。
[式2]
[固定时间内分馏的血球所含的荧光颗粒数的期待值(个)]＝{(固定时间内分馏的血球数(cells))/(全血每1mL的血球数(cells/mL))}*(将荧光颗粒添加至5倍稀释血的时间点的全血每1mL的荧光颗粒的个数(个/mL))
实施例及比较例1、比较例2的荧光颗粒的回收率如以下的表1所示。
【表1】
表1.表示实施例及比较例1、比较例2的荧光颗粒的回收率。
Figure GDA0003641414250000181
关于实施例，在表1的上段示出了截取直径为70μm的CL-6B珠粒、使试样血流通90分钟时的荧光颗粒的回收率。对由F1～F3构成的分离液进行测定发现的荧光颗粒的数量为：直径为8.42μm的荧光颗粒是76个，直径为10.0μm的荧光颗粒是85个。对由分离液F1～F3构成的分离液发现的血球数为1.27×109个。添加荧光颗粒前的全血的每1mL的血球数为4.42×109个。将荧光颗粒添加至5倍稀释血的时间点的全血每1mL的荧光颗粒的个数为：直径为8.42μm的荧光颗粒是313个，直径为10μm的荧光颗粒是268个。根据以上的测定值，使用上述公式的[式1]及[式2]所求出的荧光颗粒的回收率为：直径为8.42μm的荧光颗粒是84.5％，直径为10μm的荧光颗粒是110.4％。
关于比较例1，在表1的中段示出了截取直径为70μm、使试样血流通90分钟时的荧光颗粒的回收率。对由F1～F3构成的分离液进行测定发现的荧光颗粒的数量为：直径为8.42μm的荧光颗粒是114个、直径为10.0μm的荧光颗粒是131个。对由分离液F1～F3构成的分离液发现的血球数为1.70×109个。添加荧光颗粒前的全血的每1mL的血球数为4.42×109个。将荧光颗粒添加至5倍稀释血的时间点的全血每1mL的荧光颗粒的个数为：直径为8.42μm的荧光颗粒是307个，直径为10μm的荧光颗粒是297个。根据以上的测定值，使用上述公式的[式1]及[式2]所求出的荧光颗粒的回收率为：直径为8.42μm的荧光颗粒是96.6％，直径为10μm的荧光颗粒是114.7％。
关于比较例2，在表1的下段示出了截取直径为70μm、使试样血流通90分钟时的荧光颗粒的回收率。对由F1～F3构成的分离液进行测定发现的荧光颗粒的数量为：直径为8.42μm的荧光颗粒是133个，直径为10.0μm的荧光颗粒是127个。对由分离液F1～F3构成的分离液发现的血球数为1.71×109个/mL。添加荧光颗粒前的全血的每1mL的血球数为4.42×109个。将荧光颗粒添加至5倍稀释血的时间点的全血每1mL的荧光颗粒的个数为：直径为8.42μm的荧光颗粒是313个，直径为10μm的荧光颗粒是289个。根据以上的测定值，使用上述公式的[式1]及[式2]所求出的荧光颗粒的回收率为：直径为8.42μm的荧光颗粒是109.8％，直径为10μm的荧光颗粒是114.3％。
在使用了截取直径为70μm的CL-6B珠粒的情况下，由于作为来自胎儿的有核红血球的代替所使用的荧光颗粒的回收率均为80％以上，因此判断为回收率非常高。
本实施例是作为来自胎儿的有核红血球的浓缩的模型实验来进行的。根据上述的结果，示出了使用了管柱的前处理在来自胎儿的有核红血球的浓缩中是有用的。具体而言，示出了通过抑制血球分离基片的堵塞，能够进行长时间的分级。通过使用了本实施例的血液分离用装置的方法进行长时间的分级，能够处理大量的试样血。这表示每一次的处理的来自胎儿的有核红血球的获取量大。
(5)血球分离基片的堵塞率的评价
以下，参照图6、图8及图9，对血球分离基片的堵塞率的评价进行说明。
在上述(4)结束分级前，在血液流至基片的状态下获取图1的微细流路20(血球分离基片、以下称作基片)的图像数据。对该获取的图像数据进行图像分析，由此进行堵塞率的评价。具体而言，对图1的基片的主流路23(流路部25a)进行评价。本实施例、比较例1及比较例2中的流路部25a的评价是在开始流通试样血的30分钟～90分钟后进行的。在实施例中未观察到堵塞，在比较例1及比较例2中观察到堵塞。以下，参照表示出现了堵塞的比较例1的图8，对具体的堵塞率的评价方法进行说明。
在图8中示出了比较例1中的流路部25a的观察像(上段)及其概略图(下段)。图8为图1的区域VI所示的部分的放大图。堵塞率的评价是对区段12进行的。在USB照相机(HOZAN株式会社)之下配置持续流通试样血的状态的基片。一边俯视基片一边获取观察像。通过HOZAN USB cam software对基片进行拍摄，获得图8的上段所示的图像数据。将图像数据读入ImageJ软件，并在该软件上进行分析。
在图8中，从图像数据中截取相当于区段12的区域15。将区域15中的总像素数作为区段12的总面积进行处理。通过目视来区別区域15中的碎屑部16与流动部17。碎屑部16是由以柱密集区11为起点所蓄积的碎屑所占据的。“碎屑”是指，由试样血中包含的沉淀原因物质CC(参照图5)形成的凝胶状的物质。若该碎屑进入至柱密集区11之中，则会导致柱密集区11的堵塞。血球的流动因碎屑部16而受到推挤。相对于此，在流动部17中，血球顺利地流过。
在图8中，通过目视在碎屑部16与流动部17之间画线。获得从区域15去除了碎屑部16的部分、即流动部17的像素数的总和。将其确定为流动部17的面积。从区域15的总面积减去流动部17的面积，获得碎屑部16的推定面积。将该推定面积设为碎屑面积。以百分率求出在区段12的总面积中所占的碎屑面积。将这样的值设为堵塞率。
图9中示出了比较例2中的流路部25a的观察像(上段)及其概略图(下段)。图6中示出了实施例1中的流路部25a的观察像(上段)及其概略图(下段)。
如上所述(参照(4))，比较例1、比较例2及实施例的管柱的条件如下。
比较例1不具备管柱。即，比较例1中不具备CL-6B珠粒及过滤器这两者。试样血直接导入至血球分离基片。
比较例2的管柱未填充CL-6B珠粒。即，比较例2的管柱仅具备过滤器，不具备CL-6B珠粒。过滤器的网眼为网格状，且为20μm的直径。
实施例的管柱具备CL-6B珠粒及过滤器这两者。管柱中填充有50μL的截取直径为70μm的CL-6B珠粒。过滤器的网眼为网格状，且为20μm的直径。
将实施例及比较例1、比较例2的血球分离基片的堵塞率如以下的表2所示。该堵塞率为将试样血流通了90分钟的时间点的堵塞率。
【表2】
表2.表示实施例及比较例1、比较例2的血球分离基片的堵塞率。
CL-6B珠粒 过滤器 血球分离基片的堵塞率(％)
实施例 + + 0.0
比较例1 - - 46.6
比较例2 - + 96.5
如表2所示，在不具备CL-6B珠粒及过滤器这两者的比较例1中，堵塞率为46.6％。另外，在具有仅具备过滤器且不具备CL-6B珠粒的管柱的比较例2中，堵塞率提高至96.5％，区段12几乎都被堵塞。这表示过滤器单体不能抑制堵塞。如图8及图9所示，可推测在各比较例中从柱密集区11以碎屑相连的方式出现堵塞。并且，与比较例1相比，在比较例2中提高了堵塞率，因此可认为，过滤器容易导致作为碎屑的原因的沉淀原因物质的产生。
相对于此，在管柱具备CL-6B珠粒及过滤器这两者的实施例中，未观察到碎屑，堵塞率为0.0％。根据以上结果，具备CL-6B珠粒及过滤器的管柱能够抑制碎屑的产生。因此，能够提供适于消除堵塞的血液分离用装置。并且，本实施例及各比较例中使用的血液为采血后经过了3日的血液。即便是这样的血液，也能够通过使用少量的珠粒来回收来自胎儿的有核红血球等稀少细胞。
<参考例>
图10是表示未使用管柱进行分级的情形的参考例。图10是表示在微细流路20中流入血液BL和多孔材料51的情形的局部正面剖面图。血液BL包含无核红血球27、有核细胞29a-29c及沉淀原因物质CC。多孔材料51例如与沉淀原因物质CC相互作用，具备微细流路20中的堵塞消除效果。
图10中，微细流路80为在图5所说明的下层的微细流路。微细流路80具备入口81a和主流路83。入口81a与微细流路20的入口21a相同。主流路83与微细流路20的主流路23相同。
图10中，以黑箭头表示血液的流动。血液BL经由微细流路20的入口21a而进入至主流路23。血液BL开始流过时，多孔材料51聚集在入口81a。多孔材料51不聚集在入口21a。多孔材料51不会进入主流路23或主流路83。即，血液BL开始流过时，填充在入口81a的多孔材料51与血液BL相互作用。另一方面，在入口21a处，由于未填充多孔材料51，因此有可能无法获得多孔材料51所产生的堵塞消除效果。也就是说，在与血液BL一起流入的多孔材料51的量较少的情况下，在流路基片70的上部，多孔材料51所产生的微细流路20中的堵塞消除效果有可能会产生不均。相对于此，在管柱具备CL-6B珠粒及过滤器这两者的实施例中，由于在血液BL进入主流路23之前，血液BL与CL-6B珠粒反应，因此在分级前能够除去沉淀原因物质。因此，特别是在珠粒的量较少的情况下，具备本实施例的管柱的血液分离用装置是有利的。
此外，本发明不限于上述实施方式，能够在不脱离要点的范围内适当变更。例如血球分离用装置也可以是其他血液用装置。在一例中，血液用装置具备管柱、位于管柱的下游的微细流路。管柱具备多孔材料作为固定相。与多孔材料接触后的血液在微细流路中流过。在一例中，血液用装置为血液分析装置。在微细流路内对血液进行物理性或者化学性分析。
本申请主张基于2019年10月23日提出的日本专利申请2019-192420的优先权，将其公开的全部引入本说明书中。
附图标记说明
1血球分离用装置、11柱密集区、12区段、13柱密集区、14区段、15区域、16碎屑部、17流动部、20微细流路、21a、21b入口、22a-22c出口、23主流路、25a-25d流路部、26a、26b支流路、27无核红血球、28合流部、29a-29c有核细胞、30注入器、35注入器、50管柱、51多孔材料、52容纳部、53a、53b过滤器、54连结部、55连结部、56管部、60管柱主体、70流路基片、71入口、72出口、80微细流路、81a入口、83主流路、BL血液、CC沉淀原因物质、CF截取直径、CL澄清液、F1-F3分离液。

Claims (10)

1.一种血液用装置，其具备：管柱和位于所述管柱的下游的微细流路，该血液用装置中，
所述管柱具备多孔材料作为固定相，
与所述多孔材料接触后的血液在所述微细流路中流过。
2.如权利要求1所述的血液用装置，其中，
所述多孔材料由颗粒构成，
所述管柱还具备能够容纳所述多孔材料的容纳部，且在处于所述容纳部的下游的、距所述微细流路较近的一侧，还具备捕捉所述多孔材料的颗粒的过滤器，
具有截取直径以下的粒径的小颗粒已被预先从所述多孔材料的颗粒中除去，所述过滤器的孔径比所述截取直径小。
3.如权利要求2所述的血液用装置，其中，
所述截取直径在25μm～100μm的范围内。
4.如权利要求2或3的任一项所述的血液用装置，其中，
所述过滤器所具有的网眼的直径在20μm～40μm的范围内，该范围小于截取直径。
5.如权利要求2～4中的任一项所述的血液用装置，其中，
所述颗粒具有粒径分布，且其体积基准的累积分布中的中值粒径d50V为25μm～280μm，其中，所述粒径分布表示通过截取来除去所述小颗粒之前的粒径分布。
6.如权利要求2～5中的任一项所述的血液用装置，其中，
还在处于所述容纳部的上游的、距所述微细流路较远的一侧，具备捕捉所述多孔材料的颗粒的过滤器。
7.如权利要求1～6中的任一项所述的血液用装置，其中，
当与所述多孔材料接触后的血液在所述微细流路中流过时，所述微细流路对所述血液中的血球进行流体动力分级。
8.如权利要求7所述的血液用装置，其用于分离血球，其中，
所述微细流路由平面的基片制作，该平面的基片具备：柱密集区、以及位于所述柱密集区的下游的流体动力流路，
所述管柱与所述平面的基片的正面或背面连接，
所述血液用装置还具备出口，该出口将进行了所述流体动力分级后的血球从所述微细流路排出到所述血液用装置的外部。
9.如权利要求1～8中的任一项所述的血液用装置，其中，
所述多孔材料由颗粒构成，
所述多孔材料的颗粒具备由多糖、二氧化硅或树脂构成的多孔性的表面。
10.一种血液用装置的使用方法，其为权利要求1～9中的任一项所述的血液用装置的使用方法，其中，
所述血液用装置的所述管柱和所述微细流路是作为不同的单元提供的，所述管柱具有连结部，所述微细流路具有入口，通过将所述连结部和所述入口连结来使所述管柱与所述微细流路一体化后，使血液从所述管柱流入。
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