WO2019078277A1 - 細胞分級用チップ - Google Patents

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WO2019078277A1
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blood cells
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知大 久保
まどか 綾野
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株式会社 ＴＬ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ
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    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G01N2015/1028—

Definitions

  • the present invention relates to a cell classification chip for concentrating rare target cells in a blood sample.
  • Non-invasive prenatal genetic testing is exemplified to explain the background art of methods for concentrating rare target cells in blood samples and separating them from blood samples.
  • NIPT is one of fetal chromosome inspection methods. This test is characterized in that it does not involve puncture of the amniotic membrane.
  • NIPT is rapidly spreading throughout the world because the burden on the mother and fetus is small compared to the method involving puncture to the amniotic membrane.
  • nucleated red blood cells are a type of rare target cell.
  • Patent Document 1 describes a concentration method using a microchannel chip.
  • red blood cells and white blood cells are permeated by passing blood through a slit of 1 ⁇ m in width. Nucleated red blood cells are retained in front of the slit. The retained nucleated red blood cells are removed from the chip.
  • Patent Document 2 concentrates nucleated red blood cells with a device having a channel that deterministically guides particles based on hydraulic size, changes its magnetic property, and then applies a magnetic field to separate it.
  • hydraulic size means the effective size of a particle when it interacts with a flow, barrier structure (eg, columnar) or other particle (paragraph [0041]).
  • Patent Document 2 further identifies nucleated red blood cells by observing their cell nuclei by fluorescence in situ hybridization (FISH) with respect to a concentrated blood cell group of nucleated red blood cells. .
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • Patent No. 5311356 gazette JP, 2009-511001, A Japanese Patent Application Publication No. 2005-205387 JP 2007-175684 A Patent No. 4091123 Japanese Patent Application Publication No. 2007-530629 Patent No. 5857537 Patent No. 5308834 gazette
  • Patent Document 1 the volume of the sample solution that can be processed by the chip remains in the order of " ⁇ l". For this reason, it is considered preferable to perform separation by density gradient centrifugation etc. prior to concentration treatment with a chip (the same document, paragraph [0040]). It is considered that the chip of Patent Document 1 is not suitable for processing whole blood containing a large amount of white blood cells and non-nucleated red blood cells.
  • concentration based on hydraulic size is performed by a device. Hydrodynamic size-based enrichment is applicable to whole blood. However, further concentration is required due to the magnetic properties.
  • the test subject's maternal blood sample can, of course, collect only a limited amount. It is also obstetrically clear that the period during which prenatal diagnosis can be made is limited for each pregnant woman being tested. Furthermore, the number of fetal nucleated red blood cells in the blood is extremely low. Conventional enrichment methods can not sufficiently enrich such rare cells. Similar problems occur not only with NIPT but also when it is desired to concentrate rare target cells in whole blood. Enrichment of fetal-derived nucleated red blood cells in NIPT is a typical example.
  • An object of the present invention is to provide a means for improving the efficiency of a technique for concentrating rare target cells in whole blood by a microchannel chip for cell classification.
  • a chip comprising a microchannel unit for hydraulically classifying cells in a blood sample, comprising:
  • the microchannel unit includes a main channel through which a blood sample flows, a sub-channel connected to the side of the main channel, and a side of the main channel downstream of the sub-channel and opposite to the sub-channel.
  • It has a pattern in which a removal flow channel connected to one side and a recovery flow channel connected to the side of the main flow channel on the opposite side to the sub flow channel downstream of the removal flow channel are developed flatly Yes, Liquid flowing from the sub-flow channel into the main flow channel pushes cells flowing in the main flow channel toward the removal flow channel and the recovery flow channel, The fluid containing non-nucleated red blood cells among the pushed-in cells enters the removal flow path, whereby non-nucleated red blood cells are removed from the blood sample, Among the remaining cells from which the non-nucleated red blood cells have been removed, the fluid containing the target cells enters the recovery channel, whereby target cells are obtained from the blood sample,
  • the flow rate per unit time in the cross section of the connection between the main flow path and the collection flow path for each collection flow path is the flow rate between the main flow path and the removal flow path for each of the removal flow paths.
  • the inlet of the main channel of the microchannel unit, the inlet of the sub channel, the outlet of the removal channel, the outlet of the recovery channel, and the outlet of the main channel are columnar channels that cross through each layer. Connected to the column flow path so as to be grouped together, Chip.
  • the microchannel units are provided one by one in each layer, The chip as described in ⁇ 1>.
  • ⁇ 3> When the chip is viewed in a plan view, the direction and position of the micro-channel unit pattern of each layer are uniform. The chip as described in ⁇ 2>.
  • the pillar flow path to which the inlets of the main flow path and the sub flow path are respectively connected has an opening on the upper surface of the chip, and the outlets of the removal flow path, the recovery flow path and the main flow path are each
  • the column flow path to be connected has an opening on the lower surface of the chip,
  • the blood sample passes through the tip from the top surface of the tip to the bottom surface;
  • ⁇ 5> The layer having the microchannel unit is continuously laminated at equal intervals, The chip as described in ⁇ 4>.
  • the inscribed diameter of the removal channel is 4 to 19 ⁇ m at the connection between the main channel and the removal channel,
  • the inscribed diameter of the recovery flow channel at the connection portion between the main flow channel and the recovery flow channel is 20 to 30 ⁇ m.
  • the chip as described in ⁇ 1>. ⁇ 7> In the microchannel unit, The cross-sectional area of at least one of the recovery channel and the removal channel becomes larger as it goes downstream.
  • the chip as described in ⁇ 1>. ⁇ 8> Use of the chip according to ⁇ 4>, for obtaining a concentrated fraction of target cells as a measure of cell number by fractionating a blood sample,
  • the blood sample is one in which target cells are not enriched by measuring the number of cells when compared with whole blood itself or whole blood. use.
  • the inflow of the blood sample to the column channel to which the main channel is connected is 8 to 25 ⁇ l / min. Use as described in ⁇ 8>.
  • the inflow of the liquid per unit time to the column flow path to which the sub flow path is connected is 1 of the inflow of the blood sample to the column flow path to which the main flow path is connected per unit time ⁇ 2 times, Use as described in ⁇ 9>.
  • the blood sample is whole blood of maternal blood or a simple dilution thereof;
  • the target cells are fetal nucleated red blood cells, Use as described in ⁇ 8>.
  • a concentrated fraction A of nucleated red blood cells is obtained based on the use of the chip described in ⁇ 12>, By specifically labeling fraction A for leukocytes and nucleic acids, and sorting at least the blood cells in the labeled fraction A by cell sorting, the blood cells labeled with the leukocyte-specific label become Obtain a fraction B which has been excluded and is enriched in blood cells labeled with a label specific for nucleic acids, By analyzing the chromosomes contained in blood cells in the fraction B, data to be provided for diagnosis in noninvasive prenatal genetic testing is obtained.
  • Method. ⁇ 14> The method according to ⁇ 13>, wherein the analysis of chromosome is analysis by fluorescence in situ hybridization method, next generation sequencing method or microarray method.
  • the present invention can provide a means for improving the efficiency of a technology for concentrating rare target cells in whole blood by a microchannel chip for cell classification.
  • FIG. 1 It is a top view of a blood cell separation chip. It is a schematic diagram of a blood cell separation chip. It is a schematic diagram of a cell sorter. It is a schematic diagram of the result of density gradient lamination
  • the fluorescence intensity distribution of Hoechst 33342 is shown.
  • Figure 5 shows the fluorescence intensity distribution of immunolabeling in maternal blood.
  • the fluorescence intensity distribution of the immunolabeling in general blood is shown. It is an electrophoresis image of DNA of amplified SRY gene sequence. It is a stained image of blood cells. It is an electrophoresis image of DNA of amplified SRY gene sequence. It is a top view of a blood cell separation chip.
  • Target cells are cell types that undergo enrichment.
  • enrichment means to increase the frequency of cells by measuring the number of cells.
  • nucleated red blood cells so-called erythroblasts
  • the blood sample may be whole blood itself.
  • the blood sample may be a sample in which nucleated red blood cells are not concentrated as a measure of the cell number as compared to whole blood, a so-called unsprung sample.
  • the blood sample contains at least non-nucleated red blood cells, ie, mature red blood cells and target cells.
  • the starting material is a maternal blood sample of a human pregnant woman.
  • the pregnant woman has a post-menstrual gestational age of 10 to 33 weeks.
  • the post-menstrual gestational age is represented by the number of full days or the number of full weeks, with the first day of the last menstrual period as the first day.
  • Postmenstrual gestational age may be calculated as postnatal fertilization gestation plus two weeks.
  • Maternal blood or a dilution thereof is an example of a blood sample.
  • the chip according to the present embodiment and the use thereof can be applied to other than maternal blood.
  • maternal blood may be replaced with a blood sample or the technical content thereof may be interpreted.
  • the maternal blood sample may be maternal blood itself.
  • the maternal blood sample may be maternal blood that has been subjected to any chemical or physical treatment on the maternal blood so as to be suitable for preservation and subsequent processing efficiency.
  • treatments include, for example, the addition of preservatives such as apoptosis inhibitors, adjustment of temperature, addition of reagents to prevent sedimentation of the blood cells, and protection of the blood cells from physical damage of shaking with an air cushion. It is not limited to.
  • maternal blood refers to blood collected from a pregnant woman.
  • Maternal blood can be collected from pregnant women by conventional medical methods.
  • the collected maternal blood may be immediately enriched for nucleated red blood cells.
  • maternal blood may be transported from the place where blood collection is performed to the place where concentration processing is performed, and then nucleated red blood cells may be concentrated.
  • the maternal blood may be subjected to any desired conservative treatment.
  • Non-patent Document 1 The necessary amount of maternal blood is considered as follows. It is thought that 10 ml of maternal blood contains about 3 ⁇ 10 10 blood cells. The same volume of maternal blood is considered to contain about 36 to 2168 nucleated red blood cells (Non-patent Document 1).
  • the amount of maternal blood as a starting material may be 0.01 to 100 ml.
  • the amount of maternal blood is 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0 .3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ml may be used.
  • Fetal-derived cells In this embodiment, it is an object to obtain concentrated fetal-derived cells.
  • the nucleated red blood cells contained in maternal blood as fetal-derived cells are described below.
  • blood cells refer to blood cells.
  • Blood contains blood cells and plasma. In one theory, it is said that among human blood cells, red blood cells are the majority, and white blood cells and platelets are the other. Maternal blood contains nucleated red blood cells of fetal origin.
  • the nucleated red blood cells are erythroblasts, preferably erythroblasts that have lost cell division ability.
  • Erythrocytes are produced as hematopoietic stem cells differentiate and mature. In the process of differentiation and maturation, from hematopoietic stem cells, myeloid progenitor cells, erythrocyte / megakaryocytic precursor cells, proerythroblast precursor cells (BFU-E), late erythroblast precursor cells (CFU-E) , Pro-erythroblasts, basophil erythroblasts, polychromatic erythroblasts, orthochromatic erythroblasts, reticulocytes, and erythrocytes appear.
  • the erythroblasts include pro-erythroblasts, basophil erythroblasts, polychromatic erythroblasts, and orthochromatic erythroblasts. Nuclei are lost from blood cells in the process of differentiation of orthochromatic erythroblasts into reticulocytes. The orthochromatic erythroblasts usually lose cell division ability.
  • Nucleated red blood cells are usually in the bone marrow. However, as mentioned above, very little nucleated red blood cells are found in the blood. In maternal blood, very little nucleated red blood cells of maternal origin and of fetal origin are found. In maternal blood, the number of fetal-derived nucleated red blood cells is usually smaller than the number of maternal-derived nucleated red blood cells.
  • Fetal-derived cells are concentrated by the method of the present embodiment.
  • Enrichment of fetal-derived cells refers to obtaining a concentrated fraction of fetal-derived cells from a maternal blood sample based on whole blood cells, preferably whole blood cells, and in this embodiment, fetal-derived cells are Being concentrated means that the proportion of fetal-derived cells in total blood cells in the fraction is improved. It preferably indicates that the ratio of nucleated red blood cells to red blood cells is improved.
  • the microchannel chip may be referred to as a blood cell separation chip.
  • the blood cell separation chip can also separate floating cells other than blood cells in blood based on its three-dimensional structure.
  • the material of the chip can be selected appropriately, silicone such as PDMS is preferable.
  • the blood cell separation chip is for separating blood cells in a maternal sample on the basis of properties such as cell size, plasticity and shape.
  • the micro-channel unit pattern of the blood cell separation chip is based on the theory of hydraulic classification described in Patent Documents 3 and 4.
  • FIG. 1 shows a plan view of a blood cell separation chip 50 as an example of the blood cell separation chip.
  • the blood cell separation chip 50 has an inlet 51, a main channel 52, a secondary channel 53, and outlets 54a-d and 55.
  • the main flow channel 52 has flow channels 56 a-d in order toward the outlet 55 of the inlet 51.
  • the channels 56a to 56d are connected from the inlet 51 to the outlet 55.
  • the inlet 51 shown in FIG. 1 is connected to a syringe 57 containing maternal blood. Maternal blood is sent from the syringe 57 to the inlet 51 at a predetermined flow rate. Maternal blood enters channel 56 a via inlet 51.
  • the maternal blood can be agitated, for example, by placing the agitator in a fluid delivery container such as the syringe 57 in FIG. 1 and physically moving it under the action of an external force to dilute the blood in the container. Can be kept stirred at all times.
  • the blood cell distribution can be carried out with a constant blood cell concentration maintained for a long time without causing a bias in blood cell distribution due to sedimentation of blood cells in the container.
  • Stirring may be performed periodically. Stirring may be performed continuously. Agitation is performed on the blood sample waiting for injection on the chip, at least while injecting the blood sample on the chip. The stirred blood sample is sequentially injected into the chip.
  • Maternal blood can be diluted beforehand.
  • the dilution rate can be appropriately selected, but is preferably 2- to 500-fold, preferably 4 to 50-fold, and more preferably 5- to 10-fold. Dilutions are done with phosphate buffered saline. For example, 5 to 15 ml of maternal blood dilution can be processed in a single fraction.
  • the flow rate per unit time of the maternal blood dilution solution can be selected appropriately, it is preferably 0.1 to 500 ⁇ l / min per microchannel unit, more preferably 0.5 to 50 ⁇ l / min, and particularly preferably 1 to 25 ⁇ l / min .
  • the flow rate is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 and 24 ⁇ l / min It may be either.
  • the flow rate is the inflow of the blood sample to the main flow path.
  • the flow rate can be appropriately increased according to the number of microchannel units, but the flow rate is multiplied by the number of blood separation chips Flow rates are preferred.
  • the sub flow passage 53 is connected to the syringe 58.
  • the syringe 58 contains PBS (phosphate buffered saline). By applying pressure in the syringe 58, the PBS flows into the flow path 56b through the sub flow path 53.
  • PBS is an example, and it may be used in place of PBS as long as it is a liquid that does not easily damage cells in a blood sample due to osmotic pressure or pH.
  • the flow rate of the sub flow path 53 is preferably 1 to 10 times, more preferably 1 to 5 times, and particularly preferably 1 to 2 times the flow rate per unit time of the blood sample to the main flow path.
  • the flow rate in the sub flow channel 53 is the inflow of the liquid to the sub flow channel 53, here PBS.
  • the branch channels 59 a-d shown in FIG. 1 are all channels branched from the main channel 52.
  • the branch channels 59 a-d are located on the opposite side of the sub channel 53 across the main channel 52.
  • Each of the branch channels 59a-d shown in FIG. 1 has a plurality of narrow channels branched from the main channel 52.
  • the narrow flow channels are arranged from the upstream to the downstream of the main flow channel 52.
  • the branch channels 59a-d each reach an outlet 54a-d.
  • the narrow flow paths in the branch flow paths 59a-d merge respectively in front of the outlets 54a-d.
  • the flow path 56 d reaches the outlet 55.
  • FIG. 2 schematically shows the process of blood cell separation by the blood cell separation chip 50.
  • the branch channels 59a-d each have a plurality of narrow channels.
  • one narrow flow path is shown in each of the branch flow paths 59a-d.
  • Maternal blood flows from the upstream of the main flow path 52 shown in FIG.
  • Maternal blood contains a large amount of blood cells. Blood cells reach the flow path 56b.
  • the PBS flowing through the sub flow channel 53 pushes the blood cells flowing through the main flow channel 52 from the side of the main flow channel 52. Blood cells are pushed toward the branch flow channels 59a-d in the flow channels 56b-c. Liquid flowing in the side channel suppresses maternal blood.
  • branch flow paths 59 a-d are disposed on the side of the main flow path 52 opposite to the sub flow path 53.
  • the inscribed diameters of the narrow flow channels included in each of the branch flow channels 59a-d increase in the order in which they are arranged.
  • the inscribed diameter is the diameter of the inscribed circle in the orthogonal cross section of the narrow flow passage.
  • the inscribed diameters of the narrow flow paths of the branch flow paths 59a-d may be 8, 12, 15 and 25 ⁇ m, respectively.
  • the cross section of the narrow channel may be square, other polygonal or circular, but is preferably square.
  • branch flow channels 59a-d in FIG. 1 apply to this.
  • the number of branch channels is not particularly limited as long as it is two or more.
  • at least two branch channels may be provided.
  • the two branch channels concerned are classified into those constituted by the upstream narrow flow channel and those constituted by the downstream narrow flow channel.
  • the inscribed diameter of the upstream narrow flow path may be 4 to 19 ⁇ m, preferably 12 to 19 ⁇ m.
  • the inscribed diameter of the upstream narrow flow path may be any of 13, 14, 15, 16, 17, and 18 ⁇ m, preferably any of 14, 15, 16 ⁇ m, and more preferably 15 ⁇ m.
  • the inscribed diameter is the inscribed diameter at the connection portion between the main flow passage 52 and the narrow flow passage.
  • the cross-sectional area of the narrow channel may be larger as it goes downstream, and may be the largest at its most downstream.
  • the branch flow channel 59a in FIG. 11 applies to a branch flow channel configured by an upstream narrow flow channel.
  • the upstream narrow flow channel can be said to be a non-nucleated red blood cell removal flow channel.
  • the nonnuclear red blood cells are removed from the blood sample as nonnuclear red blood cells enter the removal flow path among the blood cells pushed in by the sub flow path.
  • the inscribed diameter of the downstream narrow flow path may be 20 to 30 ⁇ m.
  • the downstream channel may have an inscribed diameter of 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, or 29 ⁇ m, preferably 23, 24, 25, 26, or 27 ⁇ m, More preferably, it is 24, 25 or 26 ⁇ m, particularly preferably 25 ⁇ m.
  • the inscribed diameter is the inscribed diameter at the connection portion between the main flow passage 52 and the narrow flow passage.
  • the cross-sectional area of the narrow channel may be larger as it goes downstream, and may be the largest at its most downstream.
  • the branch flow channel 59 d in FIG. 11 applies to the branch flow channel configured by the downstream narrow flow channel.
  • the narrow flow path on the downstream side can be said to be a collection flow path for nucleated red blood cells. Among nucleated red blood cells remaining after removal of non-nucleated red blood cells, nucleated red blood cells enter the recovery channel, whereby nucleated red blood cells are obtained as fractions from the blood sample.
  • the blood cells pushed by the sub flow channel 53 flow into the branch flow channels 59a-d shown in FIG.
  • the diameter of blood cells flowing into each branch channel is slightly smaller than the inscribed diameter of the narrow channel of the branch channel.
  • the granules 39 are shown as blood cells slightly smaller than the inscribed diameter of the narrow flow channels of the branch flow channels 59a.
  • the granules 39 lead to the outlet 54a.
  • non-nucleated red blood cells 42 are shown as blood cells slightly smaller than the inscribed diameter of the narrow flow paths of the branch flow paths 59b and c.
  • the non-nucleated red blood cells 42 reach the outlets 54b, c.
  • nucleated red blood cells 41 are shown as blood cells slightly smaller than the inscribed diameter of the narrow flow paths of the branch flow paths 59d. Furthermore, white blood cells 43 are shown. The nucleated red blood cells 41 and the white blood cells 43 reach the outlet 54d.
  • Blood cells not taken into the branch flow channels 59a-d shown in FIG. 2 pass through the flow channel 56d together with plasma as flow-through (FT) and reach the outlet 55 shown in FIG.
  • FT flow-through
  • aggregated blood cells are included in the flow-through.
  • the outlets 54a-d and 55 are respectively provided with reservoirs for receiving fluid.
  • Fractions Fr 1-4 are collected in each of the reservoirs connected to the outlets 54 a-d shown in FIG. The flow through is dispensed as a fraction Fr5 in a reservoir connected to the outlet 55 shown in FIG.
  • the blood cell separation chip of the present embodiment may include a plurality of microchannel units.
  • the microchannel unit has a pattern. In the pattern, as shown in FIG. 2, the main flow path 52, the sub flow path 53, the removal flow paths 59a-c, and the recovery flow path 59d are developed in a planar manner.
  • the chip 20 shown in FIG. 12 is a multilayer chip having ten layers from layer L01 to layer L10. Each layer has a microchannel unit.
  • the topmost layer in the chip 20 is the lid for the topmost layer, layer L01.
  • the layers L01 to L10 are continuously stacked at equal intervals. In the drawing, the distance between the layer L01 and the layer L03 is large. However, this is only a representation method for making it easy to see the pattern shape of a microchannel unit in the figure. The same applies between layer L09 and layer L10.
  • the number of layers of the chip 20 is an example.
  • the chip 20 has 2 to 200, preferably 5 to 50, more preferably 5 to 20, particularly preferably 8 to 10 layers having microchannel units.
  • the number of layers may be 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19.
  • the inlet of the main channel, the inlet of the sub channel, the outlet of the removal channel, the outlet of the recovery channel, and the outlet of the main channel of the microchannel unit of each layer are individually connected to the respective layers. It may be done. As shown in FIG. 12, these inlets and outlets may be collectively connected to a column flow passage which passes through each layer. The column flow path may penetrate all the layers.
  • the pillar flow passage 22 and the pillar flow passage 23 have an opening on the top surface of the chip.
  • the column flow passage 22 is connected to the inlet 51 of the main flow passage.
  • the column flow passage 23 is connected to the inlet 61 of the sub flow passage.
  • the pillar flow passage 24a, the pillar flow passage 24d and the pillar flow passage 25 have openings in the lower surface of the chip.
  • the column flow passage 24a is connected to the outlet 54a of the removal flow passage.
  • the column flow path 24d is connected to the outlet 54d of the recovery flow path.
  • the column flow path 25 is connected to the outlet 55 of the recovery flow path.
  • the blood sample passes through the tip 20 from the top to the bottom of the tip 20,
  • the microchannel units included in each layer vertically overlap each other to form a microchannel stack, and the inlets of the main channels included in the microchannel units of each layer, the sub-channels
  • the inlet, the outlet of the removal channel, the outlet of the recovery channel, and the outlet of the main channel are collectively connected to a pillar channel penetrating the respective layers, the bottom layer of the inlet of the main channel is blocked.
  • One of the outlets of the main flow path may be closed.
  • the top or bottom layer of the outlet of the main channel may be closed.
  • the blood cell separation chip may have a plurality of the microchannel units in one layer.
  • the layer may have 1 to 200, preferably 5 to 50, more preferably 10 to 20.
  • the inlet of the main channel, the inlet of the sub-channel, and the outlet of the main channel of the microchannel unit of each layer may be connected for each microchannel unit, or are collectively connected to a plurality of microchannel units It may be done. It is preferable that the direction and position of the micro-channel unit pattern of each layer be uniform when the chip is viewed in plan.
  • the flow rate of the blood sample per unit time can be appropriately selected.
  • the flow rate is preferably 0.8 to 500 ⁇ l / min, more preferably 4 to 200 ⁇ l / min, and particularly preferably 8 to 25 ⁇ l / min, per microchannel unit.
  • the flow rates are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 and 24 ⁇ l / l. It may be any of the minutes.
  • the flow rate is the inflow of the blood sample to the column flow path.
  • the flow rate per unit time of the liquid introduced into the column channel of the sub-channel is as follows: You may The flow rate is preferably 1 to 10 times, more preferably 1 to 5 times, and particularly preferably 1 to 2 times the flow rate per unit time of the blood sample introduced into the column flow path of the main flow path.
  • the flow rate may be 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 or 1.9 times.
  • the liquid may be PBS.
  • the concentration method of the present embodiment has an advantage over the method using density.
  • One is that although the influence of the elapsed time after blood collection on blood cell density is large, the influence on blood cell size is small. This means that the place where blood is collected is easy to carry out the method of the present embodiment even if it is far from the place where blood cells are fractionated.
  • fractionation by size can be performed with easy operation, such as the operation of the blood cell separation chip, for example.
  • the nucleated red blood cells may be further concentrated by cell sorting from a fraction in which nucleated red blood cells are concentrated (hereinafter sometimes referred to as fraction A) using the blood cell separation chip of the present embodiment.
  • Fraction A is specifically labeled at least for white blood cells and nucleic acids. It may be specifically labeled to erythrocytes.
  • the label (lavel or laveling) may be a magnetic label or a fluorescent label, preferably a fluorescent label.
  • the label may be a direct label or an indirect label. Indirect labeling may be by tag and secondary antibody, or by biotin-avidin conjugation.
  • the leukocyte specific label may be an immuno label.
  • a label may be a label for a leukocyte-specific antigen such as CD45.
  • the antigen may be a carbohydrate antigen.
  • the label specific to red blood cells may be a label specific to the surface of red blood cells.
  • the label specific for red blood cells may be an immunolabel.
  • the immunolabeling may be labeling with an antibody.
  • the target antigen for immunolabeling may be a carbohydrate antigen.
  • the label may be by an antibody to an antigen specific for erythrocytes such as CD71 and CD235a (GPA, Glycophorin A).
  • the immunolabeling specific for red blood cells may be a label specific for immature red blood cells. It may be an immunolabeling using as a target antigen a peptide chain that is characteristic of immature red blood cells such as embryonic epsilon globin chain of hemoglobin. Such an antibody for immunolabeling is described in Patent Document 5.
  • the specific label for nucleic acid specifically labels the nucleus of nucleated red blood cells.
  • the label specific for the nucleic acid may be a dye label.
  • the nucleic acid to be labeled is preferably DNA.
  • the dye may be a fluorescent dye.
  • the nuclei may be fluorescently labeled with a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye may be Hoechst 33342.
  • an antibody that reacts with surface antigens present on fetal nucleated red blood cells but does not react with surface antigens on red blood cells of a pregnant woman may be used.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • the antibody described in Patent Document 6 may be 4B9.
  • Such antibodies may be used together with the above-described immunolabeling specific for erythrocytes and a label specific for nucleic acids. By using such an antibody, it is possible to perform specific labeling on nucleated red blood cells without relying on specific labels for nucleic acids.
  • Histological cross-linking may be performed on the blood cells in fraction A before any of the above-mentioned labeling. Alternatively, cross-linking may be performed prior to all labeling. Moreover, you may fractionate by the following cell sorting in the state which concerns. By cross-linking and fixing blood cells, aggregation of blood cells can be prevented. Therefore, sorting by cell sorting can be performed with high accuracy.
  • fractionation as described below that is, the fractionation by cell sorting may be performed without performing histological cross-linking on the blood cells in fraction A.
  • a nucleic acid-specific label and an erythrocyte-specific immunolabeling may be simultaneously performed without cross-linking fixation of blood cells.
  • blood cells may be cross-linked and fixed after the labeling.
  • leukocyte-specific immunolabeling may be performed on cross-linked fixed blood cells.
  • Nucleated red blood cells can be further concentrated by sorting the blood cells in the labeled fraction A by cell sorting.
  • Cell sorting uses, for example, an apparatus (cell sorter) used to sort cells. If the label is a fluorescent label, the method of sorting by cell sorting may be fluorescence activated cell sorting (FCM). The method of sorting by cell sorting may be cell sorting by magnetic labeling. In the present embodiment, the principle of cell sorting and the type of cell sorter are not particularly limited.
  • the FCM is performed by a cell analyzer to which a sorting device is added, for example, a cell sorter.
  • the cell sorter places the cells in a continuously flowing fluid and identifies the characteristics of the individual cells by the fluorescence of the cells obtained by irradiating the cells with excitation light. This identification is also a function of the cell analyzer. Based on the information obtained by the identification, the cell sorter further keeps the cells in a state of being entrapped in droplets, and separates particular cells by collecting droplets having particular cells.
  • the cell sorter places the cells in a continuously flowing fluid and identifies the characteristics of the individual cells by the fluorescence of the cells obtained by irradiating the cells with excitation light. Based on the information obtained by the identification, the cell sorter separates a fraction having specific cells while the cells are continuously placed in a flowing fluid.
  • the cell sorter which does not use such droplets can lead the cells into the sorting container while the cells are placed in the fluid, so the cells are less likely to be damaged. Further, in the process of introducing the cells into the container, by confining the fluid in the flow path chip, it is easy to prevent the contamination of the device and the environment due to the fluid droplet.
  • nucleated red blood cells are red blood cells
  • nucleated red blood cells can be distinguished from other blood cells including white blood cells by a label specific to red blood cells.
  • Leukocytes labeled with a specific label for leukocytes may be excluded from fraction A.
  • nucleated red blood cells have a nucleus, they can distinguish nucleated red blood cells from other blood cells including non-nucleated red blood cells by labeling specific to nucleic acid.
  • fraction B In cell sorting, these labels are combined to obtain a fraction in which the purity of nucleated red blood cells is enhanced. Sorting with a label specific to erythrocytes and sorting with a label specific to nucleic acids may be performed simultaneously. Alternatively, either may be done first. For example, fraction B may be obtained by performing sorting with a magnetic label specific to red blood cells and then sorting with a fluorescent label specific to nucleic acids.
  • cells may be sorted using fluorescence in addition to the first fraction obtained by cell sorting.
  • the sorting by cell sorting may be further repeated on the obtained first fraction to obtain the second and subsequent fractions.
  • the fraction B may be finally obtained by this.
  • nucleated red blood cells can be concentrated from blood samples efficiently and in a short time.
  • maternal blood when maternal blood is used as a blood sample, it is possible to concentrate fetal nucleated red blood cells in a short time.
  • the nuclear genome of fetal-derived nucleated red blood cells may be analyzed by any of fluorescence in situ hybridization (FISH, Fluorescence in situ hybridization), Next Generation Sequencing (NGS) and microarray method.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • NGS Next Generation Sequencing
  • microarray method By analysis, data on the number of chromosomes, the structure of chromosomes and the nucleotide sequence of nuclear genomic DNA can be obtained. Such data can be used to test or diagnose fetal chromosomal disease. Such a test is a non-invasive prenatal genetic test.
  • an oligonucleotide probe labeled with a fluorescent substance, an enzyme or the like is used to hybridize with a target gene, and then the expression analysis of the target gene is performed by detecting the probe. is there.
  • those labeled with a fluorescent substance are called fluorescence in situ hybridization methods. Diagnostic data can be obtained by fluorescence in situ hybridization. Diagnostic data can be used to determine the presence or absence of chromosomal aberrations or microdefects such as Down's syndrome, Edwards syndrome, 22q 11.2 deficiency syndrome.
  • Data for diagnosis may be obtained by analyzing concentrated nucleated red blood cells by in situ hybridization method. For example, by performing FISH using a fluorescent probe based on a DNA sequence specific to chromosome 21, it is possible to obtain data to be used for diagnosis of Down's syndrome.
  • the next-generation sequencing method reads the base sequence of DNA at high speed.
  • Data for diagnosis can be obtained by reading the nucleotide sequence of nuclear genomic DNA contained in the enriched fetal-derived nucleated red blood cells by NGS. Diagnostic data can help determine the presence or absence of chromosomal aberrations or microdefects such as Down's syndrome, Edwards syndrome, and 22q 11.2 deficiency syndrome.
  • Data for diagnosis may be obtained by analyzing nuclear genomic DNA of fetal origin nucleated red blood cells by a microarray method.
  • the microarray method is performed by hybridizing each genomic DNA or its amplified DNA to which a fluorescent label or the like has been applied to a minute spot on a substrate.
  • a synthetic DNA having a gene sequence is previously adsorbed to the spot. Diagnostic data can help determine the presence or absence of chromosomal aberrations or microdefects such as Down's syndrome, Edwards syndrome, and 22q 11.2 deficiency syndrome.
  • the method of the present embodiment can efficiently concentrate nucleated red blood cells. Therefore, the method of the present embodiment is suitable for preparing fetal-derived nucleated red blood cells used for these analysis means.
  • concentration means removing blood cells other than nucleated red blood cells. It is preferable that the blood cells removed from maternal blood upon concentration be non-nucleated red blood cells. More preferably, platelets are also removed from maternal blood upon concentration.
  • Concentrated fraction A of nucleated red blood cells was obtained by density gradient stacking centrifugation. After concentration, the ratio of nucleated red blood cells to total blood cells in fraction A will be greater than the ratio of nucleated red blood cells to total blood cells in the maternal blood sample.
  • Fractionation by density gradient stacking centrifugation was performed as follows. Percoll and saline were used to make isotonic solutions with densities of 1.085 g / ml and 1.075 g / ml. After sequentially stacking them in a centrifuge tube, 10 ml of maternal blood was further overlaid. The centrifuge tube was centrifuged at 1750 G at 20 ° C. for 30 minutes.
  • FIG. 1 The schematic diagram of the result of density gradient lamination
  • Layers 45a to 45f are formed on the centrifugal tube 46 in order from the top.
  • the layer 45a is enriched in plasma.
  • the white blood cells 43 are concentrated in the layer 45 b.
  • the density of layers 45a and b is considered to be less than 1.075 g / ml.
  • Layer 45c is a layer of an isotonic solution with a density of 1.075 g / ml.
  • Nucleated red blood cells 41 are concentrated in the layer 45d shown in FIG.
  • the density of layer 45d is believed to be greater than 1.075 g / ml and less than 1.085 g / ml.
  • the layer 45d was separated and the blood cells were washed to obtain a fraction containing nucleated red blood cells. This fraction was designated as sample 1.
  • the number of blood cells in sample 1 was measured using a fully automatic cell counter TC20. The blood cell count was about 9.95 ⁇ 10 6 .
  • the layer 45e shown in FIG. 4 is a layer of an isotonic solution with a density of 1.085 g / ml.
  • the density of layer 45f is considered to be greater than 1.085 g / ml.
  • the blood cells of fraction A are Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich), anti-CD45-PE labeled antibody (Miltenyi-Biotec, clone: 5B1), and anti-CD235a-FITC labeled antibody (Miltenyi-Biotec, clone: REA175) At the same time. At the time of staining, cross-linking fixation of blood cells was not performed. The staining was performed at 4 ° C. for 10 minutes. After staining, the labeled blood cells were recovered by centrifuging the blood cell suspension at 4 ° C. and 300 G for 10 minutes.
  • the volume ratio (dilution ratio) between the anti-CD45-PE labeled antibody and the buffer was 1:10. Also, the volume ratio (dilution ratio) between the anti-CD235a-FITC labeled antibody and the buffer was set to 1: 1099.
  • Fraction A was further fractionated by cell sorting.
  • the cell sorter shown in the schematic view of FIG. 4 was used as the cell sorter.
  • the cell sorter concerned detects fluorescence of blood cells.
  • a steady liquid flow including the fluorescently labeled fraction A is produced in the main flow path 47 shown in FIG.
  • the excitation light is projected to the blood cells 48a in the liquid flow to detect the presence or absence of the signal of the label by fluorescence.
  • the sub flow passage 49 intersects with the main flow passage 47. Blood cells 48 a flow toward the intersection of the main flow path 47 and the sub flow path 49.
  • Blood cells 48b shown in FIG. 4 are blood cells in which a signal is detected.
  • the blood cells flow in the main channel 47 and enter the intersection.
  • a pulse flow can be generated in the direction intersecting the liquid flow. Based on the above signals, pulse flow is generated targeting the blood cell 48b.
  • Blood cells 48 b are separated from the liquid flow of the main flow channel 47 by placing the blood cells 48 b shown in FIG. 4 in the pulse flow of the sub flow channel 49. Separated blood cells 48b are collected sequentially. This produces a fraction B of 48b collected.
  • Patent Document 7 The details of the cell sorter are described in Patent Document 7.
  • a cell sorter provided by on-chip biotechnology was used (type of cell sorter: On-chip-Sort MS6).
  • the operating conditions of the cell sorter for cell sorting were as follows.
  • FIG. 5 shows the fluorescence intensity distribution of Hoechst 33342.
  • the vertical axis represents the appearance frequency of blood cells.
  • the horizontal axis represents the intensity of the Hoechst fluorescence signal. Two peaks appear. The frequency of occurrence was minimized between the intensities 40 and 50.
  • the boundary value was determined in the relevant range, and blood cells with greater intensity were estimated as nucleated blood cells. In addition, blood cells smaller in intensity than this were estimated to be non-nucleated blood cells.
  • FIG. 6 shows the fluorescence intensity distribution of immunolabeling in maternal blood.
  • FIG. 7 shows the fluorescence intensity distribution of the immunolabeling in general blood.
  • the ordinate represents the intensity of the luminescence signal of FITC (fluorescein isothiocyanate) bound to the anti-CD235a antibody.
  • the horizontal axis represents the intensity of luminescence signal of PE (phycoerythrin) bound to anti-CD45 antibody.
  • Ar1 in FIGS. 6 and 7 represents a group in which the signal of CD235a-FITC is strongly displayed.
  • Ar2 represents a population of CD45 labeled leukocytes.
  • fraction B was subjected to DNA extraction using Nucleospin Tissue XS (purchased from Takara Bio Inc.).
  • FIG. 14 shows the results of molecular biological analysis.
  • the inner lanes 1 to 11 of the electrophoresis image shown in FIG. 8 represent amplification products of 270 bp in length by PCR on the SRY gene sequence.
  • the template is as follows.
  • Lane 1 human male standard DNA, 200 copies.
  • Lane 2 human female standard DNA, 200 copies.
  • Lane 3 human male standard DNA, 0 copies.
  • Lane 4 human male standard DNA, 1 copy.
  • Lane 5 human male standard DNA, 4 copies.
  • Lane 6 human male standard DNA, 8 copies.
  • Lane 7 16 copies of human male standard DNA.
  • Lane 8 human male standard DNA, 64 copies.
  • Lane 9 human male standard DNA, 100 copies.
  • Lane 10 Sample 1 From the electrophoresis image shown in FIG. 8, it was found that sample 1 contained DNA having 4 to 16 copies of the SRY gene sequence. Therefore, it was found that sample 1 contained chromosomal DNA derived from fetus.
  • Example 1 ⁇ Concentration of nucleated red blood cells by blood cell separation chip>
  • 0.3 ml of maternal blood 2-3 hours after blood collection was used, and the concentration of nucleated red blood cells was carried out using the blood cell separation chip shown in FIGS. 1 and 2.
  • Maternal blood was diluted 50 times in advance. Dilutions were performed with phosphate buffered saline (PBS). The flow rate per unit time of maternal blood dilution solution to the main flow path and the flow rate per unit time of PBS to the side flow path were 25 ⁇ l / min per hemocytometer chip. Fractionation with a blood cell separation chip was performed for 10 hours.
  • PBS phosphate buffered saline
  • each narrow channel was 8, 12, 15 and 25 ⁇ m, respectively.
  • the cross section of the narrow channel was square.
  • Table 1 shows the results of fractionation of 15 ml of maternal blood dilution solution with the above-mentioned hemocyte separation chip.
  • Such maternal blood contained 300 ⁇ l of maternal whole blood.
  • Maternal blood whole blood is considered to contain 1.43 ⁇ 10 9 blood cells. It measured using fully automatic cell counter TC20.
  • the blood cell counts of the fractions having passed the branch flow channels 1 to 4 and the flow through 5 are as shown in Table 1.
  • the number of blood cells in the fraction Fr4 shown in Table 1 was 3.29 ⁇ 10 7 . In consideration of the results of density gradient stacking centrifugation, it is considered that such fractions contain blood cells corresponding to nucleated red blood cells and white blood cells.
  • the fraction Fr4 was used as the above-mentioned fraction A, and analysis by cell sorting was performed.
  • Fraction B was collected in the same manner as in Reference Example 1. First, Fraction A was stained with Hoechst 33342 and PE-modified anti-CD45 antibody. Staining was performed on cells without fixation including cross-linking. Next, staining with FITC modified anti-CD235a antibody was performed. The concentration of antibody was optimized as in Reference Example 1.
  • FIG. 9 shows blood cells stained as described above. As shown in the figure, the occurrence of aggregation was suppressed. For this reason, it was shown that blood cells can be separated from one another at the single cell level. The suppression of aggregation in this example is considered to be due to the optimization of the antibody concentration to be stained.
  • the fraction B was divided into three fractions each having about 200 blood cells. These fractions were expected to contain one or two fetal nucleated red blood cells.
  • chromosomal DNA Extraction of chromosomal DNA was performed to each fraction.
  • Whole genome amplification was performed on chromosomal DNA by MALBAC (Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles) method.
  • MALBAC Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles
  • PCR amplification was performed specifically for the SRY gene sequence using the amplified chromosomal DNA as a template.
  • the electrophoretic layer of the PCR product of the SRY gene is shown in FIG.
  • the template is as follows.
  • Lane 1 distilled water.
  • Lane 2 human male standard DNA, 20 ng.
  • Lane 3 human female standard DNA, 20 ng.
  • Lane 4 Amplified product by MALBAC method 1, 450 ng.
  • Lane 5 MALBAC amplified product 2, 610 ng.
  • Lane 6 3, 700 ng amplification product by MALBAC method.
  • fraction B In PCR using amplification product 1 of lane 4 as a template, a band of SRY was observed. In PCR using other amplification products as a template, no SRY band was observed. From the above, it was found that, by fractionating fraction B, it can be divided into a fraction having fetal blood cells and a fraction not having it.
  • nucleated red blood cells can be concentrated by the blood cell separation chip of this example.
  • Example 2 ⁇ Concentration of nucleated red blood cells by blood cell separation chip> Maternal blood provided from a 43-year-old woman (fetal boy) at 26 weeks of gestation was diluted 5-fold with PBS, and nucleated red blood cells were concentrated using a blood cell separation chip. Maternal blood diluted after about 69 hours was used.
  • the blood cell separation chip used is a modification of the one used in Example 1.
  • the chip used in Example 1 had four branch channels and a flow through, but in this embodiment, two chips having branch channels each having an inscribed diameter of 15 and 25 ⁇ m and a flow through ( 11, 59a, d) stacked in 10 layers, that is, each channel is disposed in a plane in a microchannel unit, the separation chip has 10 layers having microchannel units, and each layer
  • the microchannel units included in each form a microchannel stack by vertically overlapping each other, and in the hierarchical channels, the inlet of the main channel, the inlet of the sub-channel, and the removal of the microchannel unit of each layer are removed.
  • the outlet of the channel, the outlet of the recovery channel, and the outlet of the main channel are collectively connected to the column channel passing through all the layers, the bottom layer of the inlet of the main channel is closed, and one of the outlets of the main channel is closed. For what you are It was ( Figure 12).
  • the flow rate per unit time of the maternal blood dilution solution and the flow rate per unit time of PBS to the side channel were 50 ⁇ l per minute per hemocytometer chip and fractionated using a hemocytometer chip for 60 minutes.
  • the blood cell counts of the fractions having passed through branch channel 1 (Fr1), branch channel 2 (Fr2) and flow through 3 (Fr3) are as shown in Table 2.
  • the obtained fraction 2 was considered to contain 3.11 ⁇ 10 7 blood cells. It measured using fully automatic cell counter TC20.
  • the 1/8 amount of blood cells newly obtained from Fr2 was separated by a cell sorter to obtain a fraction containing 2198 blood cells (FIG. 14, Ar area).
  • Chromosomal DNA was extracted from each fraction obtained as in Example 1. Whole genome amplification was performed on the chromosomal DNA by MALBAC method. The amplified chromosomal DNA was purified by NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (purchased from Takara Bio Inc.), and a portion of this was used as a template to perform PCR amplification specifically for the SRY gene sequence. The electrophoresis image of the PCR product of the SRY gene is shown in FIG. The template is as follows.
  • Lane 1 distilled water.
  • Lane 2 20 ng of commercially available human male standard DNA.
  • Lane 3 20 ng of commercially available human female standard DNA.
  • Lane 4 10 ng of amplification product of chromosomal DNA contained in maternal blood Fr 2 by MALBAC method.
  • Lane 5 10 ng of amplification product of chromosomal DNA contained in maternal blood Fr2 by MALBAC method.
  • Example 3 The blood cell separation chip used in Example 2 was modified as shown in FIG. That is, nucleated red blood cells were concentrated according to Example 2 using four microchannel units formed in a layer having a microchannel unit and having 10 layers. By forming two or more microchannel units in the layer having microchannel units, a plurality of the microchannel stacks are arranged in the blood cell separation chip. The column flow path to which the inlet is connected is integrated as a single integrated column flow path.
  • the inscribed diameter of the branch flow channel is the same as that shown in Example 2, and the flow rate per unit time of the maternal blood dilution solution and the flow rate per unit time of PBS to the sub flow channel per minute per hemocytometer chip The volume was adjusted to 200 ⁇ l and fractionated using a blood cell separation chip for 60 minutes.
  • nucleated red blood cells could be concentrated in the same manner as described in Example 2.
  • the present invention has been described by taking nucleated red blood cells as an example of target cells.
  • the target cells may not be blood cells.
  • the target cells may, for example, be CTCs (peripheral circulating tumor cells).
  • the blood sample may be taken from a subject requiring a test for cancer, a cancer patient, or a patient who has already been treated for cancer.
  • the performance evaluation of the multilayer chip was performed as follows. As in Example 2, whole blood was fractionated using a multilayer chip in which layers having microchannel units were continuously laminated at equal intervals. Whole blood is whole blood of a general adult who is not a pregnant woman. A dilution of whole blood was fractionated. The dilution rate was 5 times.
  • the multilayer chip has the same microchannel units as described in Example 2. However, the multilayer chip used in this example is different from the multilayer chip of Example 2 in that the number of layers having microchannel units is eight. A single layer chip with the same microchannel unit was also used as a control.
  • the inflow rate of diluted blood to the column channel that collects the inlet of the main channel was 20 ⁇ l / min.
  • the diluted blood that has flowed into the multi-layered chip is divided and flows into each of the sub-flow channels in each layer.
  • the inflow rate of diluted blood to the only main channel was 20 ⁇ l / min.
  • the volume of blood processed by each chip is 600 ⁇ l.
  • the PBS was passed through the side channel to suppress the blood flow in the main channel.
  • the flow rate of PBS into the column flow channel that collects the inlets of the sub flow channels was 20 ⁇ l (weak hold down) or 40 ⁇ l (strong hold down) per minute.
  • the inflow rate of PBS into only one subchannel was 20 ⁇ l / min.
  • the PBS that has flowed into the multilayer chip is divided and flows into each of the sub-flow channels in each layer.
  • the volume of PBS introduced into each chip is 600 ⁇ l or 1,200 ⁇ l.
  • Fraction F1 was obtained from branch channel 1 (Fr1, width 15 ⁇ m, corresponding to column channel 24a in FIG. 12).
  • Fraction F2 was obtained from branch channel 2 (Fr2, width 25 ⁇ m, corresponding to column channel 24d in FIG. 12).
  • Fraction F3 was obtained from the flow through (Fr3, equivalent to 25 for the column flow path in FIG. 12). Blood cells contained in each fraction were analyzed to obtain the results shown in Table 3.
  • the number of cells (C1) collected in fractions F1 to F3 was measured with a fully automatic cell counter TC20 (BIORAD). However, the fraction F1 was diluted 400 times in advance and then the number of cells was measured. This is because the fraction F1 mainly contains a large number of mature erythrocytes after enucleation. The dilution rate may be 100 to 200 times.
  • the fraction F1 is hemolyzed. This hemolyzes the mature red blood cells in the fraction F1. Nucleated cells, including white blood cells, remain after hemolysis. Some of the remaining cells were analyzed by FCM. In fraction F2, a part of the collected cells was analyzed by FCM. Fluorescent nuclear staining was performed on the fractions F1 and F2 after hemolysis. The positive rate (p) (%) of nuclear staining was measured by FCM.
  • the number of cells (C2) remaining after the hemolysis treatment was taken as a parameter (C3).
  • the number of cells (C1) collected by the multilayer chip was used as a parameter.
  • the population (C3) was multiplied by the positive rate (p) (%) to calculate the number of nucleated cells (C4) in each fraction.
  • the distribution ratio of nucleated cells to fraction F1 and fraction F2 was determined. The sum of the distribution ratio of the fraction F1 and the fraction F2 is 100. Also, the ratio of the number of nucleated cells (C4) to the total number of cells collected by the chip is shown in the table as the fractional efficiency (%).
  • the distribution ratio of nucleated cells was 42.4: 57.6 in the monolayer chip when weak pressing (20 ⁇ l / min) was applied. On the other hand, it was 7.9: 92.1 in the multilayer chip. This result indicates that many nucleated cells are intruding into the thin branch channel 1 in the single layer chip. In the multi-layered chip, it is indicated that entry of nucleated cells into the branch channel 1 is alleviated.
  • the multilayer chip had higher accuracy of hydrodynamic classification for mature red blood cells and nucleated cells than the single layer chip.
  • fractionation was carried out by applying strong pressing (40 ⁇ l / min).
  • the positive rate (p) of fraction F2 improved to 55.3% with a single layer chip.
  • Even the multilayer chip has improved to 66.6%. This result indicates that the entry of the mature red blood cells into the branch channel 2 is alleviated by strengthening the pressing.
  • the distribution ratio of nucleated cells was 21.5: 78.5 in the monolayer chip when strong pressing (40 ⁇ l / min) was applied.
  • the multilayer chip was also 4.6: 95.4.
  • a method for obtaining a concentrated fraction of nucleated red blood cells based on the number of whole blood by fractionating blood cells in a blood sample using a blood cell separation chip wherein the blood sample is A blood sample itself, or an uncrimped sample in which the whole blood is enriched in nucleated red blood cells on the basis of the number as compared to the blood sample,
  • the blood cell separation chip includes a main flow path through which the blood sample flows, a sub flow path connected to the side of the main flow path, and a side of the main flow path downstream of the sub flow path opposite to the sub flow path.
  • a microchannel unit having a removal flow channel connected to one side and a recovery flow channel connected to the side of the main flow channel on the opposite side to the sub flow channel downstream of the removal flow channel;
  • the liquid flowing out of the sub flow channel pushes the blood cells flowing through the main flow channel toward the removal flow channel and the recovery flow channel,
  • the nonnuclear red blood cells are removed from the blood sample by nonnuclear red blood cells entering the removal channel among the pressed blood cells.
  • nucleated red blood cells enter the collection flow channel, whereby nucleated red blood cells are obtained as the fraction from the blood sample,
  • the inscribed diameters of the removal flow channel and the recovery flow channel are different, and the inscribed diameter of the removal flow channel at the connection portion between the main flow channel and the removal flow channel is the connection between the main flow channel and the recovery flow channel
  • the numerical value lower than the inscribed diameter of the recovery channel in the [2] The method according to [1], wherein the blood sample is a maternal blood sample, and the nucleated red blood cells are fetal-derived nucleated red blood cells, [3]
  • the inscribed diameter of the removal channel at the connection between the main channel and the removal channel is 4 to 19 ⁇ m,
  • an inscribed diameter of the recovery flow channel at a connection portion between the main flow channel and the recovery flow channel is 20 to 30 ⁇ m
  • [4] The method according to [1], wherein the flow rate per minute of the blood sample
  • the inscribed diameter of the recovery channel is expanded in the middle of the recovery channel
  • the inscribed diameter of the removal channel is enlarged in the middle of the removal channel
  • the method described in [1] [11] Fractionation of blood cells in a blood sample using a blood cell separation chip to obtain a concentrated fraction A of nucleated red blood cells based on the number of whole blood, the blood sample being a blood sample
  • the whole blood is an unspoiled sample in which nucleated red blood cells are not enriched on the basis of the number as compared with the blood sample itself or the blood sample,
  • fraction A specifically to white blood cells and nucleic acids and sorting blood cells in the labeled fraction A by at least cell sorting, blood labeled by white blood cells specific labeling can be obtained.
  • the blood cell separation chip includes a main flow path through which the blood sample flows, a sub flow path connected to the side of the main flow path, and a side of the main flow path downstream of the sub flow path opposite to the sub flow path.
  • a microchannel unit having a removal flow channel connected to one side and a recovery flow channel connected to the side of the main flow channel on the opposite side to the sub flow channel downstream of the removal flow channel;
  • the liquid flowing out of the sub flow channel pushes the blood cells flowing through the main flow channel toward the removal flow channel and the recovery flow channel,
  • the nonnuclear red blood cells are removed from the blood sample by nonnuclear red blood cells entering the removal channel among the pressed blood cells.
  • nucleated red blood cells enter the collection flow channel, whereby nucleated red blood cells are obtained as the fraction from the blood sample,
  • the inscribed diameters of the removal flow channel and the recovery flow channel are different, and the inscribed diameter of the removal flow channel at the connection portion between the main flow channel and the removal flow channel is the connection between the main flow channel and the recovery flow channel
  • the numerical value lower than the inscribed diameter of the recovery channel in the [12] The method according to [11], wherein the analysis of chromosome is analysis by fluorescence in situ hybridization method, next generation genome sequencing method or microarray method, [13]
  • the method according to [11], wherein the blood sample is a maternal blood sample, and the nucleated red blood cells are fetal-derived nucleated red blood cells, [14]
  • the inscribed diameter of the removal channel at the connection portion between the main channel and the removal channel is 4 to 19 ⁇ m
  • the method according to [11] wherein an inscribed diameter of the recovery

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Abstract

血液試料中の細胞を水力学的に分級するためのマイクロ流路単位を、備えるチップ（２０）。マイクロ流路単位では、副流路から主流路内に流れ出す液体が主流路を流れる細胞を除去流路及び回収流路の側に向かって押し込む。押し込まれた細胞のうち無核赤血球を含む流体が除去流路に進入することで、血液試料から無核赤血球が除去される。同一のパターンを有するマイクロ流路単位が高さ方向に繰り返し積層されている。マイクロ流路単位の有する主流路の入口（５１）、副流路の入口（６１）、除去流路の出口（５４ａ）、回収流路の出口（５４ｄ）及び主流路の出口（５５）は（Ｌ０１）から（Ｌ１０）の各層を横断的に貫く柱流路（２２、２３、２４ａ、２４ｄ及び２５）によってそれぞれまとめられるように柱流路（２２、２３、２４ａ、２４ｄ及び２５）に接続されている。

Description

細胞分級用チップ
　本発明は血液試料中の希少な標的細胞を濃縮するための細胞分級用チップに関する。
　血液試料中の希少な標的細胞を濃縮するとともに血液試料から分離する方法の背景技術を説明するにあたり非侵襲的出生前遺伝学的検査（NIPT, Noninvasive prenatal genetic testing）を例示する。NIPTは、胎児の染色体の検査法の一つである。この検査法は羊膜に対する穿刺を伴わないことが特徴である。羊膜に対する穿刺を伴う方法に比べて母体及び胎児への負担が小さいことからNIPTは世界中で急速に普及を始めている。
　NIPTの一態様として胎児の染色体を診断する手法が開発中である。そこで染色体を得るために胎児由来有核赤血球（以下、単に有核赤血球ということもある。）をマイクロ流路チップによって母体血から分離することが試みられている。有核赤血球は希少な標的細胞の一種である。
　特許文献１にはマイクロ流路チップを用いる濃縮方法が記載されている。この方法では血液を幅１μｍのスリットに通すことで赤血球と白血球を透過させる。有核赤血球はスリットの手前に滞留させる。滞留させた有核赤血球はチップから取り出す。
　特許文献２には水力学的サイズに基づいて粒子を決定論的に誘導するチャネルを具えるデバイスで有核赤血球を濃縮した後、その磁気的性質を変化させてから磁界を印加して分離することでさらに有核赤血球を濃縮する方法が示されている（段落[0083],[0202]）。ここで「水力学的サイズ」とは、流動、障壁構造（例：柱状）、あるいは他の粒子と相互作用した時の粒子の有効サイズを意味する（段落[0041]）。
　特許文献２ではさらに、有核赤血球の濃縮された血球群に対して、それらの細胞核を蛍光in situハイブリダイゼーション法（FISH, Fluorescence in situ hybridization）により観察することで有核赤血球を同定している。
特許第５３１１３５６号公報 特開２００９－５１１００１号公報 特開２００５－２０５３８７号公報 特開２００７－１７５６８４号公報 特許第４０９１１２３号公報 特表第２００７－５３０６２９号公報 特許第５８５７５３７号公報 特許第５３０８８３４号公報
上出泰山、梅原永能、左合治彦　著、「母体血中からの胎児有核赤血球の効率的回収に向けた新たな試み」、成医会、東京慈恵会医科大学雑誌（Tokyo Jikeikai Medical Journal）、2015年、130(1)：11-17
　特許文献１ではチップで処理可能な試料液の体積は「μｌ」のオーダーに留まる。このためチップでの濃縮処理に先立って密度勾配遠心分離法等による分離をすることが好ましいとされている（同文献、段落[0040]）。特許文献１のチップは白血球や無核の赤血球を大量に含む全血を処理するのに適していないと考えられる。
　特許文献２ではデバイスによって水力学的サイズに基づく濃縮を行っている。水力学的サイズに基づく濃縮は全血に適用可能である。しかしながら磁気的性質によるさらなる濃縮を必要とする。
　出生前診断を行う場合、被験対象の母体血試料は言うまでもなく限られた量しか採血できない。また出生前診断を行うことのできる期間が、被験対象である妊婦ごとに限られた期間しかないことは産科医学的に明らかである。さらに血液中の胎児由来の有核赤血球の数は極めて少ない。従来の濃縮方法ではこのような希少細胞の濃縮を十分に行うことができない。NIPTに限らず、同様の問題は全血中の希少な標的細胞を濃縮したい場合にも生じる。NIPTにおける胎児由来有核赤血球の濃縮はその典型例と言える。
　本発明は細胞分級用のマイクロ流路チップによって全血中の希少な標的細胞を濃縮する技術において、その効率の改善手段を提供することを目的とする。
＜１＞
　血液試料中の細胞を水力学的に分級するためのマイクロ流路単位を、備えるチップであって、
　前記マイクロ流路単位は、血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路とが平面的に展開してなるパターンを有しており、
　前記副流路から前記主流路内に流れ出す液体が前記主流路を流れる細胞を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
　前記押し込まれた細胞のうち無核赤血球を含む流体が前記除去流路に進入することで、血液試料から無核赤血球が除去され、
　前記無核赤血球が除去されて残った細胞のうち標的細胞を含む流体が前記回収流路に進入することで血液試料から標的細胞が取得され、
　前記回収流路一本ごとの前記主流路と前記回収流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量が、前記除去流路一本ごとの前記主流路と前記除去流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量に比べて大きく、
　同一の前記パターンを有する前記マイクロ流路単位が高さ方向に繰り返し積層されており、
　前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の入口、前記副流路の入口、前記除去流路の出口、前記回収流路の出口及び前記主流路の出口は各層を横断的に貫く柱流路によってそれぞれまとめられるように前記柱流路に接続されている、
　チップ。
＜２＞
　前記マイクロ流路単位が各層に１個ずつ設けられている、
　＜１＞に記載のチップ。
＜３＞
　前記チップを平面視したときに各層の前記マイクロ流路単位のパターンの向き及び位置が揃っている、
　＜２＞に記載のチップ。
＜４＞
　前記主流路及び前記副流路の前記入口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの上面に開口を有し、さらに
　前記除去流路、前記回収流路及び前記主流路の前記出口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの下面に開口を有することで、
　前記血液試料が前記チップの上面から下面に向かって前記チップを通り抜ける、
　＜３＞に記載のチップ。
＜５＞
　前記マイクロ流路単位を有する層が等間隔に連続的に積層されている、
　＜４＞に記載のチップ。
＜６＞
　前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が４～１９μｍであり、
　前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が２０～３０μｍである、
　＜１＞に記載のチップ。
＜７＞
　前記マイクロ流路単位において、
　前記回収流路及び前記除去流路の少なくともいずれかの断面積はその下流に進むほど大きくなる、
　＜１＞に記載のチップ。
＜８＞
　血液試料を分画することで細胞数を尺度として標的細胞の濃縮された画分を取得するための、＜４＞に記載のチップの使用であって、
　前記血液試料は、全血そのもの又は全血と比較した場合に細胞数を尺度として標的細胞が濃縮されていないものである、
　使用。
＜９＞
　前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の流入量が８～２５μｌ／分である、
　＜８＞に記載の使用。
＜１０＞
　前記副流路が接続される前記柱流路への前記液体の単位時間当たりの流入量が、前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の単位時間当たりの流入量の１～２倍である、
　＜９＞に記載の使用。
＜１１＞
　前記血液試料を前記チップに注入する間に注入を待つ血液試料を攪拌するとともに、撹拌した血液試料を順次前記チップに注入する、
　＜８＞に記載の使用。
＜１２＞
　前記血液試料が母体血の全血又はこれを単に希釈したものであり、
　前記標的細胞が胎児由来有核赤血球である、
　＜８＞に記載の使用。
＜１３＞
　＜１２＞に記載のチップの使用に基づき有核赤血球の濃縮された画分Ａを取得し、
　画分Ａを白血球及び核酸に対して特異的に標識するとともに、標識した前記画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、白血球に対して特異的な標識により標識された血球が排除されているとともに核酸に対して特異的な標識により標識された血球が濃縮されている画分Ｂを取得し、
　前記画分Ｂ中の血球に含まれる染色体の解析を行うことで、非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
　方法。
＜１４＞
　染色体の解析が、蛍光in situハイブリダイゼーション法、次世代シークエンス法又はマイクロアレイ法による解析である＜１３＞に記載の方法。
　本発明により、細胞分級用のマイクロ流路チップによって全血中の希少な標的細胞を濃縮する技術において、その効率の改善手段を提供することができる。
血球分離チップの平面図である。 血球分離チップの模式図である。 セルソーターの模式図である。 密度勾配積層遠心の結果の模式図である。 Hoechst33342の蛍光強度分布を示す。 母体血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。 一般血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。 増幅したＳＲＹ遺伝子配列のＤＮＡの電気泳動像である。 血球の染色像である。 増幅したＳＲＹ遺伝子配列のＤＮＡの電気泳動像である。 血球分離チップの平面図である。 多層型の血球分離チップの立体図である。 Ｆｒ２の免疫標識の蛍光強度分布を示す。 Ｆｒ２の免疫標識の蛍光強度分布を示す。 増幅したＳＲＹ遺伝子配列のＤＮＡの電気泳動像である。 血球分離チップの立体図である。
　本実施形態では、血液試料中の細胞を水力学的に分級するためのマイクロ流路単位を備えるチップの詳細を、特にその使用の観点から説明する。具体的にはチップを使用して血液試料中の標的細胞を濃縮する工程を例にとって説明する。標的細胞とは濃縮を受ける細胞種のことである。ここでいう濃縮とは細胞数を尺度としてその細胞の頻度を高めることをいう。本実施形態では、標的細胞の例として有核赤血球いわゆる赤芽球を濃縮する。ここで血液試料とは全血それ自体でもよい。血液試料は、全血に比べて細胞数を尺度として有核赤血球が濃縮されていない試料、いわゆる未漉縮試料でもよい。血液試料は、少なくとも無核赤血球すなわち成熟赤血球と標的細胞とを含有する。
　［採血］
　本実施形態において出発材料はヒトの妊婦の母体血試料である。妊婦は月経後胎齢が１０週から３３週であることが好ましい。月経後胎齢は最終月経初日を１日目として、満日数又は満週数で表したものである。月経後胎齢は受精後胎齢に２週を加えたものとして算出してもよい。母体血又はこれを希釈したものは血液試料の一例である。本実施形態に係るチップやその使用を母体血以外に適用することができる。以下の実施形態の説明において母体血を血液試料に置き換えてもその技術的内容を解釈してもよい。
　母体血試料は母体血そのものでもよい。母体血試料は、母体血に何らかの化学的、又は物理的処理を行うことで、保存やその後の処理の効率化に適するような変化を与えられた母体血でもよい。係る処理には、例えばアポトーシス阻害剤といった保存剤の添加、温度の調整、血球の沈殿を防ぐための試薬の添加、並びにエアークッションで振盪の物理的ダメージから血球を保護することが含まれるがこれらに限定されない。
　本実施形態において母体血とは妊婦から採取された血液を指す。母体血は通常の医学的方法により、妊婦から採取することが出来る。採取した母体血に対してすぐに有核赤血球の濃縮を行ってもよい。また採血を行った場所から濃縮処理を行う場所に、母体血を輸送してから有核赤血球の濃縮を行ってもよい。母体血に対して所望の保存的処理を行ってもよい。
　必要な母体血の量は次のように考えられる。１０ｍｌの母体血には約３×１０１０個の血球が含まれていると考えられている。また同体積の母体血には約３６～２１６８個の有核赤血球が含まれていると考えられている（非特許文献１）。
　上記有核赤血球の割合を鑑み、出発材料となる母体血の量は０．０１～１００ｍｌでもよい。母体血の量は０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ｍｌでもよい。
　［胎児由来細胞］
　本実施形態において、濃縮された胎児由来細胞を取得することを目的とする。以下に胎児由来細胞として母体血に含まれる有核赤血球について説明する。
　本実施形態において、血球とは血液細胞を指す。血液は血球及び血漿を含有する。一説において、ヒトの血球のうち、赤血球が大部分を占め、他に白血球や血小板が占めると言われる。母体血は、胎児由来の有核赤血球を含有する。
　本実施形態において有核赤血球は赤芽球であり、好ましくは細胞分裂能を喪失した赤芽球である。赤血球は造血幹細胞が分化するとともに成熟することで生じる。分化及び成熟の過程で、造血幹細胞から順に、骨髄系前駆細胞、赤血球・巨核球系前駆細胞、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ－Ｅ）、後期赤芽球系前駆細胞（ＣＦＵ－Ｅ）、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球、及び赤血球が現われる。
　赤芽球には前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、及び正染性赤芽球が含まれる。正染性赤芽球が網赤血球に分化する過程で血球中から核が失われる。正染性赤芽球は通常、細胞分裂能を喪失している。
　有核赤血球は通常、骨髄中にある。しかしながら上述したとおり、ごく微量の有核赤血球が血液中に見られる。また母体血中には、母体由来及び胎児由来の有核赤血球がごく微量見られる。母体血中においては通常、胎児由来の有核赤血球の数は、母体由来の有核赤血球の数よりも少ない。
　［有核赤血球の濃縮］
　本実施形態の方法により胎児由来細胞を濃縮する。胎児由来細胞の濃縮とは、母体血試料から、全血球を基準として、好ましくは全赤血球を基準として胎児由来細胞の濃縮された画分を取得することを言い、本実施形態において胎児由来細胞が濃縮されていることとは、画分中の全血球に占める胎児由来細胞の割合が向上していることを指す。好ましくは赤血球に占める有核赤血球の割合が向上していることを指す。
　胎児由来細胞の濃縮された画分の取得は、マイクロ流路チップを用いて行う。以下、マイクロ流路チップを血球分離チップということもある。ただしこれは便宜的な名称である。血球分離チップはその立体的構造に基づき血中の血球以外の浮遊細胞を分離することもできる。チップの材質は適宜選択できるがＰＤＭＳなどのシリコーンが好ましい。
　血球分離チップは細胞の大きさ、可塑性および形状などの性質を基準として母体試料中の血球を分画するものである。血球分離チップの有するマイクロ流路単位のパターンは特許文献３及び特許文献４に記載の水力学的分級の理論に基づいている。
　図１に血球分離チップの一例として血球分離チップ５０の平面図を示す。血球分離チップ５０は入口５１、主流路５２、副流路５３並びに出口５４ａ－ｄ及び５５を有する。主流路５２は入口５１の出口５５に向かって順に流路５６ａ～ｄを有する。流路５６ａ～ｄは入口５１から出口５５まで一つながりとなっている。
　図１に示す入口５１は母体血を入れたシリンジ５７と接続される。シリンジ５７からは、所定の流量で母体血を入口５１に送る。母体血は入口５１を経由して流路５６aに入る。
　母体血は攪拌することが出来、例えば、図１におけるシリンジ５７のような送液容器の中に撹拌子を入れ、それを外部の力の作用で物理的に動かすことにより、容器内の希釈血液が常に攪拌された状態を保つことができる。これにより、血球の容器内での沈降による血球分布の偏りが生じることなく、従って長時間一定の血球濃度を保ったまま送液できる。撹拌は定期的に行ってもよい。撹拌は連続的に行ってもよい。撹拌は少なくとも血液試料をチップに注入する間に、チップへの注入を待つ血液試料に対して行う。撹拌した血液試料を順次前記チップに注入する。
　母体血は予め希釈しておくことが出来る。希釈率は適宜選択できるが、２～５００倍が好ましく、４～５０倍が好ましく、５～１０倍が好ましい。希釈はリン酸緩衝生理食塩水で行う。一回の分画で例えば５～１５ｍｌの母体血希釈液を処理できる。
　母体血希釈液の単位時間当たりの流量は適宜選択できるが、マイクロ流路単位あたり０．１～５００μｌ／分が好ましく、０．５～５０μｌ／分がさらに好ましく、１～２５μｌ／分が特に好ましい。流量は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４μｌ／分のいずれかでもよい。流量とは主流路への血液試料の流入量である。
　後述のように、複数マイクロ流路単位を有する血球分離チップを用いる場合には、流量はマイクロ流路単位の数に応じて適宜増加させることが出来るが、前記流量に血液分離チップの個数を乗じた流量が好ましい。
　図１に示す血球分離チップ５０は副流路５３を有する。副流路５３はシリンジ５８と接続されている。シリンジ５８にはＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）が入れられている。シリンジ５８内に圧力をかけることでＰＢＳは副流路５３を通じて流路５６ｂに流入する。ＰＢＳは例であり、血液試料中の細胞に対して浸透圧やｐＨによるダメージを与えにくい液体であればＰＢＳに代えて使用できる。
　副流路５３の流量は、主流路への血液試料の単位時間当たりの流量の１～１０倍が好ましく、１～５倍がさらに好ましく、１～２倍が特に好ましい。副流路５３における流量とは副流路５３への液体、ここではＰＢＳの流入量である。
　図１に示す分岐流路５９ａ－ｄはいずれも主流路５２から分岐する流路である。流路５６ｃ中において、上流側から順に分岐流路５９ａ，ｂ，ｃ及びｄがこの順で主流路５２から分岐する。分岐流路５９ａ－ｄは主流路５２を挟んで副流路５３の反対側に位置する。
　図１に示す分岐流路５９ａ－ｄはいずれも主流路５２から分岐する細流路を複数個有する。各細流路は主流路５２の上流から下流に向かって並ぶ。分岐流路５９ａ－ｄはそれぞれ出口５４ａ－ｄに達する。分岐流路５９ａ－ｄ中の各細流路はそれぞれ出口５４ａ－ｄの手前で合流する。流路５６ｄは出口５５に達する。
　図２には、血球分離チップ５０による、血球の分別の過程を模式的に表している。図１に示したように分岐流路５９ａ－ｄはそれぞれ複数の細流路を有する。図２中では説明を簡単にするため、各分岐流路５９ａ－ｄにはそれぞれ細流路が一本ずつ示されている。
　図２に示す主流路５２の上流から母体血が流れてくる。母体血は血球を大量に含んでいる。血球は流路５６ｂに達する。一方、副流路５３を流れてきたＰＢＳは、主流路５２を流れる血球を、主流路５２の側方から押し込む。流路５６ｂ-ｃにおいて、分岐流路５９ａ－ｄ側に血球が押しやられる。副流路を流れる液体は母体血を押さえつける。
　図２に示す流路５６aにおいて、主流路５２の副流路５３と対向する側には分岐流路５９ａ－ｄが配置されている。分岐流路５９ａ－ｄのそれぞれが有する細流路の内接径は、これらの並ぶ順に大きくなる。ここで内接径は細流路の直交断面における内接円の直径である。例えば、分岐流路５９ａ－ｄの細流路の内接径はそれぞれ８、１２、１５及び２５μｍであってもよい。細流路の断面は四角形、他の多角形でも円形でもよいが、四角形が好ましい。
　図１及び２に示す血球分離チップ５０では分岐流路を４個設けた。図１における分岐流路５９ａ－ｄがこれに当てはまる。
　分岐流路の数は２以上であれば特に限定されない。例えば分岐流路を少なくとも２個としてもよい。係る２個の分岐流路は上流側の細流路で構成されるものと下流側の細流路で構成されるものに分類される。上流の細流路の内接径は４～１９μｍでもよく、１２～１９μｍが好ましい。上流の細流路の内接径は１３、１４、１５、１６、１７、及び１８μｍのいずれかでもよいが、好ましくは１４，１５，１６μｍのいずれか、より好ましくは１５μｍである。内接径は主流路５２と細流路との接続部における内接径である。細流路の断面積はその下流に進むほど大きくなってもよく、その最下流で最も大きくなってもよい。図１１における分岐流路５９ａが上流側の細流路で構成された分岐流路に当てはまる。上流側の細流路は無核赤血球の除去流路と言える。副流路により押し込まれた血球のうち無核赤血球が除去流路に進入することで、血液試料から無核赤血球が除去される。
　また下流の細流路の内接径は２０～３０μｍでもよい。下流の細流路の内接径は２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び２９μｍのいずれかでもよいが、好ましくは２３，２４，２５，２６，２７μｍのいずれか、さらに好ましくは２４，２５，２６μｍのいずれか、特に好ましくは２５μｍである。内接径は主流路５２と細流路との接続部における内接径である。細流路の断面積はその下流に進むほど大きくなってもよく、その最下流で最も大きくなってもよい。図１１における分岐流路５９ｄが下流側の細流路で構成された分岐流路に当てはまる。下流側の細流路は有核赤血球の回収流路と言える。無核赤血球が除去されて残った血球のうち有核赤血球が回収流路に進入することで血液試料から有核赤血球が画分として取得される。
　図２に示す分岐流路５９ａ－ｄには副流路５３によって押しやられた血球が流れ込む。各分岐流路に流れ込む血球の径は、その分岐流路の細流路の内接径よりもやや小さい。図中には分岐流路５９ａの細流路の内接径よりもやや小さい血球として顆粒３９が示されている。顆粒３９は出口５４ａに至る。図中には分岐流路５９ｂ，ｃの細流路の内接径よりもやや小さい血球として無核赤血球４２が示されている。無核赤血球４２は出口５４ｂ，ｃに至る。
　有核赤血球の径の大きさは１１～１３μｍと考えられる。図中には分岐流路５９ｄの細流路の内接径よりもやや小さい血球として有核赤血球４１が示されている。さらに白血球４３が示されている。有核赤血球４１及び白血球４３は出口５４ｄに至る。
　図２に示す分岐流路５９ａ－ｄに取り込まれなかった血球はフロースルー（FT）として、血漿とともに流路５６ｄを通過するとともに、図１５に示す出口５５に至る。例えば凝集した血球などがフロースルーに含まれる。出口５４ａ－ｄ及び出口５５には流体を受け止めるリザーバーがそれぞれ設けられる。
　図２に示す出口５４ａ－ｄに接続された各リザーバーには画分Ｆｒ１－４がそれぞれ分取される。フロースルーは画分Ｆｒ５として図１に示す出口５５に接続されたリザーバーに分取される。
　本実施形態の血球分離チップには複数のマイクロ流路単位が含まれていてもよい。マイクロ流路単位はパターンを有している。パターンは、図２に示すように主流路５２と、副流路５３と、除去流路５９ａ－ｃと、回収流路５９ｄとが平面的に展開してなる。
　図１２に示すチップ２０は層Ｌ０１から層Ｌ１０までの１０層を有する多層チップである。各層はマイクロ流路単位を有する。チップ２０中の最も上の層は、最も上の層である層Ｌ０１に対する蓋である。層Ｌ０１～Ｌ１０は等間隔に連続的に積層されている。図中では層Ｌ０１から層Ｌ０３における間隔が大きくなっている。しかしながら、これは図中においてマイクロ流路単位のパターン形状を見やすくするための表現手法に過ぎない。層Ｌ０９と層Ｌ１０との間において同様である。チップ２０の層数は例示である。チップ２０はマイクロ流路単位を有する層を２～２００個、好ましくは５～５０個、さらに好ましくは５～２０個、特に好ましくは８～１０個有する。層数は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８及び１９個のいずれかでもよい。
　各層の前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の入口、前記副流路の入口、前記除去流路の出口、前記回収流路の出口及び前記主流路の出口は、それぞれの層に個別に接続されていてもよい。図１２に示すようにこれらの入口及び出口は各層を横断的に貫く柱流路にそれぞれまとめて接続されていてもよい。柱流路は全層を貫いていてもよい。
　図１２において柱流路２２及び柱流路２３がチップの上面に開口を有する。柱流路２２は主流路の入口５１に接続する。柱流路２３は副流路の入口６１に接続する。さらに柱流路２４ａ、柱流路２４ｄ及び柱流路２５がチップの下面に開口を有する。柱流路２４ａは除去流路の出口５４ａに接続する。柱流路２４ｄは回収流路の出口５４ｄに接続する。柱流路２５は回収流路の出口５５に接続する。血液試料はチップ２０の上面から下面に向かってチップ２０を通り抜ける、
　図１２に示すように各層の有する前記マイクロ流路単位は縦方向に互いに重なり合うことでマイクロ流路スタックを形成させ、各層の前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の入口、前記副流路の入口、前記除去流路の出口、前記回収流路の出口及び前記主流路の出口が各層を横断的に貫く柱流路にそれぞれまとめて接続されている場合は、主流路の入口の底層はふさがっていてもよく、主流路の出口の一方がふさがっていてもよい。主流路の出口の最上層又は最下層がふさがっていてもよい。
　血球分離チップは前記マイクロ流路単位を一層の中に複数有していてもよい。その場合、その層は１～２００個、好ましくは５～５０個、さらに好ましくは１０～２０個有していてもよい。
　各層のマイクロ流路単位の有する主流路の入口、副流路の入口、及び主流路の出口は、マイクロ流路単位ごとに接続されていてもよいし、複数のマイクロ流路単位にまとめて接続されていてもよい。チップを平面視したときに各層のマイクロ流路単位のパターンの向き及び位置が揃っていることが好ましい。
　各層のマイクロ流路単位の有する主流路の入口が一本の柱流路にまとめられている場合、単位時間当たりの血液試料の流量は適宜選択できる。流量はマイクロ流路単位あたり０．８～５００μｌ／分が好ましく、４～２００μｌ／分がさらに好ましく、８～２５μｌ／分が特に好ましい。流量は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４μｌ／分のいずれかでもよい。流量とは柱流路への血液試料の流入量である。
　また各層のマイクロ流路単位の有する副流路の入口が一本の柱流路にまとめられている場合、副流路の柱流路に導入される液体の単位時間当たりの流量を次のようにしてもよい。当該流量は、主流路の柱流路に導入される血液試料の単位時間当たりの流量の１～１０倍が好ましく、１～５倍がさらに好ましく、１～２倍が特に好ましい。当該流量は１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９倍のいずれかでもよい。液体はＰＢＳでもよい。
　本実施形態の濃縮方法には、密度を利用した方法に比べて利点がある。一つは血球の密度に対する採血後の経過時間による影響は大きいが、血球の大きさに対する影響は小さい点である。これは採血する場所が、血球を分画処理する場所から遠くても本実施例の方法を実施しやすいことを表す。他の一つは、大きさによる分画は、例えば上記血球分離チップの操作のように、容易な操作で行うことが可能な点である。
　［画分Ａの蛍光標識］
　本実施形態の血球分離チップを用いて有核赤血球が濃縮された画分（以下、画分Aということもある）からセルソーティングにより更に有核赤血球を濃縮してもよい。
　画分Aを、少なくとも白血球及び核酸に対して特異的に標識する。赤血球に対して特異的に標識してもよい。標識（lavel or laveling）は磁気標識でも蛍光標識でもよく、蛍光標識が好ましい。標識は直接標識でも間接標識でもよい。間接標識はタグと二次抗体によるものでもよく、ビオチン－アビジン結合によるものでもよい。
　白血球特異的な標識は免疫標識でもよい。係る標識はCD45のような白血球に特異的な抗原に対する標識でもよい。抗原は糖鎖抗原でもよい。
　赤血球に対して特異的な標識は赤血球の表面に特異的な標識でもよい。赤血球に対して特異的な標識は免疫標識でもよい。免疫標識は抗体による標識でもよい。免疫標識の標的抗原は糖鎖抗原でもよい。標識はCD71及びCD235a（GPA, Glycophorin A）のような赤血球に特異的な抗原に対する抗体によるものでもよい。
　赤血球に対して特異的な免疫標識は未熟な赤血球に対して特異的な標識でもよい。ヘモグロビンの胚イプシロングロビン鎖のような未熟な赤血球に特徴的なペプチド鎖を標的抗原とする免疫標識でもよい。係る免疫標識用の抗体は特許文献５に記載されている。
　核酸に対して特異的な標識により、有核赤血球の有する核が特異的に標識される。核酸に対して特異的な標識は染料標識でもよい。標識される核酸はＤＮＡが好ましい。染料は蛍光染料でもよい。核は蛍光染料により蛍光標識してもよい。蛍光染料はHoechst33342でもよい。
　また胎児有核赤血球上に存在する表面抗原と反応するが、妊婦の赤血球細胞上の表面抗原とは反応しない抗体を用いてもよい。抗体はモノクローナル抗体でもよい。例えば特許文献６に記載の抗体、４Ｂ９でもよい。係る抗体は上記の赤血球に対して特異的な免疫標識や核酸に対して特異的な標識とともに用いてもよい。係る抗体を用いることで、核酸に対して特異的な標識に依拠せずとも、有核赤血球に対して特異的な標識を行うことが出来る。
　なお上記いずれかの標識を行う前に、画分Ａ中の血球に対して組織学的な架橋固定をしてもよい。あるいは全ての標識を行う前に架橋固定を行ってもよい。また係る状態で下記のセルソーティングによる分画を行ってもよい。血球を架橋固定することで、血球同士が凝集することを予防できる。したがってセルソーティングによる分取が精度よくできる。
　画分Ａ中の血球に対して組織学的な架橋固定を行わない状態で、下記に述べるような分画、すなわちセルソーティングによる分画を行ってもよい。
　例えば、血球の架橋固定を行うことなく、核酸に特異的な標識と、赤血球特異的な免疫標識とを同時に行ってもよい。さらにこれらの標識を行った後に血球を架橋固定してもよい。さらに架橋固定された血球に対して、白血球特異的な免疫標識を行ってもよい。
　［セルソーティングによる有核赤血球のさらなる濃縮］
　標識した画分Ａ中の血球をセルソーティングによって選別することで有核赤血球をさらに濃縮することができる。セルソーティングでは例えば細胞を選別するために用いられる装置（セルソーター）を使用する。標識が蛍光標識であれば、セルソーティングによる選別の方法は蛍光標示式細胞分取法（FCM）でもよい。セルソーティングによる選別の方法は磁気標識による細胞分取法でもよい。本実施形態ではセルソーティングの原理及びセルソーターの機種は特に限定されない。
　一態様において、FCMはセルアナライザーに分取装置が加わったもの、一例としてセルソーターによって行う。一態様において、セルソーターは、細胞を連続的に流れる流体に乗せるとともに、細胞に対して励起光を照射して得た細胞の蛍光をもって個々の細胞の特徴を同定する。この同定はセルアナライザーの機能でもある。同定により得られた情報に基づきセルソーターは、さらに細胞を液滴に閉じ込めた状態にするとともに、特定の細胞を有する液滴を収集することで、特定の細胞を分取する。
　一態様において、セルソーターは、細胞を連続的に流れる流体に乗せるとともに、細胞に対して励起光を照射して得た細胞の蛍光をもって個々の細胞の特徴を同定する。同定により得られた情報に基づき、セルソーターは、細胞を引き続き連続的に流れる流体に乗せた状態で特定の細胞を有する画分を分取する。
　このような液滴を用いないセルソーターとして、後述する図３及び特許文献７に記載のようなパルス流を分取に利用するセルソーターが知られている。また特許文献８に記載のような流体のゾル－ゲル転移を分取に利用するセルソーターが知られている。
　このような液滴を用いないセルソーターは細胞を流体に乗せたまま、分取容器内に細胞を導くことが出来るので細胞が損傷しにくい。また容器に細胞を導くまでの工程において、流体を流路チップ内に閉じ込めることで、流体の飛沫による装置や環境の汚染を防止しやすい。
　セルソーティングでは赤血球に対して特異的な標識により標識された血球を取得するように血球を選別することが好ましい。有核赤血球は赤血球であるから、赤血球に対して特異的な標識により、有核赤血球を、白血球を始めとする他の血球と区別できる。白血球に対して特異的な標識により標識された白血球を画分Ａから排除してもよい。
　セルソーティングでは有核の血球に対して特異的な標識により標識された血球を取得するように血球を選別することが好ましい。有核赤血球は核を有するから、核酸に対して特異的な標識により、有核赤血球を無核の赤血球を始めとする他の血球と区別できる。
　セルソーティングでは、これらの標識を組み合わせることで、有核赤血球の純度が高められた画分を取得する。赤血球に対して特異的な標識による分取と、核酸に対して特異的な標識による分取とは同時に行ってもよい。またいずれかを先におこなってもよい。例えば赤血球に対して特異的な磁気標識により選別を行った後、核酸に対して特異的な蛍光標識により選別を行うことで画分Ｂを取得してもよい。
　［追加的な細胞選別］
　画分Ａ中の血球を蛍光標識した場合は、セルソーティングとしてＦＡＣＳ（商標）を用いることが好ましい。またセルソーティングによる処理後も蛍光標識は残存しているので、これを有効に利用してもよい。
　例えばセルソーティングで得られた１回目の画分に対してさらに追加的に蛍光を利用して細胞を分取してもよい。例えば得られた１回目の画分に対してさらにセルソーティングによる選別を繰り返して２回目以降の画分を取得してもよい。これにより最終的に上記画分Ｂを得てもよい。
［診断用のデータの提供］
　本実施形態の方法により血液試料から効率的に、また短時間のうちに有核赤血球を濃縮することができる。特に、血液試料として母体血を用いた場合、短時間のうちに胎児由来有核赤血球を濃縮することができる。胎児由来有核赤血球の核ゲノムを蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH, Fluorescence in situ hybridization）、次世代シークエンス法（NGS, Next generation sequencing）及びマイクロアレイ法のいずれかで解析してもよい。解析により、染色体の数、染色体の構造及び核ゲノムＤＮＡの塩基配列に関するデータを取得できる。かかるデータを胎児の染色体疾患の検査又は診断をするために用いることができる。かかる検査は非侵襲的出生前遺伝学的検査である。
　in situハイブリダイゼーション法は、蛍光物質や酵素などで標識したオリゴヌクレオチドプローブを用い、目的の遺伝子とハイブリダイゼーションさせたのち、当該プローブを検出することにより、目的とする遺伝子の発現解析を行うものである。そのうち蛍光物質で標識するものを蛍光in situハイブリダイゼーション法と呼ばれる。蛍光in situハイブリダイゼーション法により診断用のデータを取得できる。診断用のデータは染色体数的異常や微小欠損症、例えばダウン症、エドワーズ症候群、22q11.2欠損症候群の有無を判定するのに役立つ。
　濃縮された有核赤血球をin situハイブリダイゼーション法で解析することで診断用のデータを得てもよい。例えば、２１番染色体に特異的なＤＮＡ配列を元にした蛍光プローブを用いてFISHを行うことでダウン症の診断に供するデータを取得することができる。
　次世代シークエンス法はＤＮＡの塩基配列を高速で読み取るものである。濃縮された胎児由来有核赤血球に含まれる核ゲノムＤＮＡの塩基配列をNGSで読み取ることで、診断用のデータを得ることができる。診断用のデータは染色体数的異常や微小欠損症、例えばダウン症、エドワーズ症候群、及び22q11.2欠損症候群の有無を判定するのに役立つ。
　胎児由来有核赤血球の核ゲノムＤＮＡをマイクロアレイ法により解析することで診断用のデータを得てもよい。マイクロアレイ法は、基板上の微小なスポットに対して、各ゲノムＤＮＡ又はその増幅ＤＮＡに蛍光標識などを施したものをハイブリダイズさせることで行う。スポットには遺伝子配列を有する合成ＤＮＡが予め吸着されている。診断用のデータは染色体数的異常や微小欠損症、例えばダウン症、エドワーズ症候群、及び22q11.2欠損症候群の有無を判定するのに役立つ。
　胎児由来有核赤血球中の染色体の半分は母体と同一の染色体である。このためFISH、NGS及びマイクロアレイ法での解析にあたりバックグラウンドの母体染色体配列のシグナルの影響が大きい。一方で母体血に含まれる有核赤血球の量は非常に少ない。一方で本実施形態の方法は有核赤血球を効率よく濃縮することができる。したがって本実施形態の方法はこれらの解析手段に用いる胎児由来有核赤血球を調製するのに適する。
以下、本実施形態を実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を限定的に解釈するためのものではない。
　［参考例１］
　＜採血＞
　本参考例および後述の実施例では適切な手続の下、母体血及び一般血の提供を受けた。母体血は、試験研究用として妊娠３３週の妊婦から提供されたものである。胎児の性別は男性である。本実施例において用いられた一般血は、試験研究用として妊婦ではない人から提供されたものである。母体血及び一般血の採取は医療機関においてなされた。これらの血液は適正な管理の下、発明者らの研究室に輸送された。
　本参考例では母体血２０ｍｌを出発材料として使用し、採血後２時間で処理を開始した。
　全自動セルカウンターＴＣ２０（ＢＩＯＲＡＤ）で測定したところ、母体血１０ｍｌには３．１６×１０１０個の血球が含まれていた。母体血をＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）で２倍に希釈した。
　＜有核赤血球の濃縮＞
　母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心法で濃縮した。ここで濃縮とは、有核赤血球以外の血球を除去することである。濃縮において母体血から除去される血球は無核の赤血球であることが好ましい。濃縮において母体血から血小板も除去されることがさらに好ましい。
　密度勾配積層遠心により有核赤血球の濃縮された画分Ａが得られた。濃縮後において、画分Ａ中における全血球に対する有核赤血球の割合は、母体血試料中における全血球に対する有核赤血球の割合よりも大きくなる。
　密度勾配積層遠心による分画は以下のように行った。パーコール及び食塩水を用いて密度１．０８５ｇ／ｍｌ及び１．０７５ｇ／ｍｌの等張液を作成した。遠心管にこれらを順に積層した後、さらに母体血１０ｍｌを重層した。係る遠心管を２０℃、１７５０Ｇで３０分間遠心した。
　図４に密度勾配積層遠心の結果の模式図が表されている。遠心管４６には上から順に、層４５ａ～ｆが形成されている。層４５ａには血漿が濃縮されている。層４５ｂには白血球４３が濃縮されている。層４５ａ及びｂの密度は１．０７５ｇ／ｍｌよりも小さいと考えられる。層４５ｃは密度１．０７５ｇ／ｍｌの等張液の層である。
　図４に示す層４５ｄには有核赤血球４１が濃縮されている。層４５ｄの密度は１．０７５ｇ／ｍｌよりも大きく、１．０８５ｇ／ｍｌよりも小さいと考えられる。層４５ｄを分取するとともに血球を洗浄することで有核赤血球を含む画分を得た。かかる画分を試料１とした。試料１中の血球数を、全自動セルカウンターＴＣ２０を用いて測定した。血球数は約９．９５×１０６個であった。
　図４に示す層４５ｅは密度１．０８５ｇ／ｍｌの等張液の層である。層４５ｆには無核赤血球４２が濃縮されている。層４５ｆの密度は１．０８５ｇ／ｍｌよりも大きいと考えられる。
　試料１の半分量を画分Ａとして用い、以下の蛍光標識のステップを行った。
　＜蛍光標識＞
　画分Ａの血球をHoechst33342（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）、抗CD45-PE標識抗体（Miltenyi-Biotec製、クローン名：5B1）、及び抗CD235a-FITC標識抗体（Miltenyi-Biotec製、クローン名：REA175）で同時に染色した。染色に際して血球の架橋固定は行わなかった。染色は４℃で、１０分間行った。染色後、血球の懸濁液を４℃、３００Ｇの条件で１０分間遠心することで標識された血球を回収した。
　抗体の希釈に際し、抗CD45-PE標識抗体と緩衝液との間の体積の比（希釈率）を1：10とした。また、抗CD235a-FITC標識抗体と緩衝液との間の体積の比（希釈率）を1：1099とした。
　セルソーティングで画分Ａをさらに分画した。セルソーターとして図４の模式図に示すセルソーターを用いた。係るセルソーターは血球を蛍光検出するものである。
　まず図４に示す主流路４７内に蛍光標識された画分Ａを含む定常的な液体流を作る。液体流中の血球４８ａに励起光を投射して蛍光により標識のシグナルの有無を検出する。副流路４９は主流路４７と交差する。血球４８ａは主流路４７と副流路４９との交差点に向かって流れる。
　図４に示す血球４８ｂはシグナルの検出された血球である。係る血球は主流路４７内を流れて来て交差点に入る。副流路４９では液体流と交差する方向にパルス流を生じることが出来る。上述のシグナルに基づき、血球４８ｂを標的としてパルス流を発生させる。
　図４に示す血球４８ｂを副流路４９のパルス流に乗せることで、血球４８ｂを主流路４７の液体流から分離する。分離した血球４８ｂを、逐次的に収集する。これにより収集された４８ｂからなる画分Ｂが生成される。
　図４において、シグナルの無かった又は弱かった血球４８ｃに対してはパルス流が付与されない。血球４８ｃは主流路４７内をそのまま液体流に乗って流れていく。
　係るセルソーターについては特許文献７に詳細が説明されている。また本実施例ではオンチップ・バイオテクノロジーから提供されるセルソーターを使用した（セルソーターの型式：Ｏｎ-ｃｈｉｐ－Ｓｏｒｔ　ＭＳ６）。本参考例では細胞選別のためのセルソーターの動作条件は以下の通りであった。
　＜セルソーティングによる分析＞
　図５はHoechst33342の蛍光強度分布を示す。縦軸は血球の出現頻度を表す。横軸はHoechstの蛍光シグナルの強度を表す。ピークが二つ表れている。出現頻度が強度４０～５０の間で極小となった。係る範囲で境界値を定め、これより強度の大きい血球を有核の血球と推定した。また、これより強度の小さい血球を無核の血球と推定した。
　図６は母体血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。図７は一般血における免疫標識の蛍光強度分布を示す。縦軸は抗CD235a抗体に結合したFITC（fluorescein isothiocyanate）の発光のシグナルの強度を表す。横軸は抗CD45抗体に結合したPE（phycoerythrin）の発光のシグナルの強度を表す。
　図６及び図７におけるＡｒ１は、ＣＤ２３５ａ－ＦＩＴＣのシグナルが強く表れた集団を表す。Ａｒ２は、ＣＤ４５で標識された白血球の集団を表す。
　母体血の結果と一般血の結果との比較により、母体血では、一般血に比べてＡｒ１に属する血球の数が多いことが分かった。
　図６において、Ａｒ１の内、FITC（fluorescein isothiocyanate）の発光のシグナルの強度が１×１０３より大きいものを有核赤血球の候補とした。これは、予備実験においてバックグラウンドノイズ、すなわち白血球のＦＩＴＣの発光のシグナル強度が１×１０３以下であったことによる。
　＜分子生物学的解析＞
　画分Ｂの全体に対してNucleospin Tissue XS（タカラバイオ株式会社から購入）を使用して、DNA抽出を行った。
　本実施例ではDNA抽出で得られたDNAを鋳型としてPCR反応を行った。PCR反応ではEx-Taq polymeraseを使用した。図１４は分子生物学的解析の結果を表す。図８に示される電気泳動像の内レーン１～１１はＳＲＹ遺伝子配列に対するPCRによる270bp長の増幅産物を表す。鋳型は以下の通りである。
　レーン１の左側には200bpのDNAラダーが示されている。
　レーン１：ヒト男性の標準ＤＮＡ、２００コピー。
　レーン２：ヒト女性の標準ＤＮＡ、２００コピー。
　レーン３：ヒト男性の標準ＤＮＡ、０コピー。
　レーン４：ヒト男性の標準ＤＮＡ、１コピー。
　レーン５：ヒト男性の標準ＤＮＡ、４コピー。
　レーン６：ヒト男性の標準ＤＮＡ、８コピー。
　レーン７：ヒト男性の標準ＤＮＡ、１６コピー。
　レーン８：ヒト男性の標準ＤＮＡ、６４コピー。
　レーン９：ヒト男性の標準ＤＮＡ、１００コピー。
　レーン１０：試料１
　図８に示す電気泳動像より、試料１には４～１６コピーのＳＲＹ遺伝子配列を有するＤＮＡが含まれることが分かった。したがって、試料１には胎児由来の染色体ＤＮＡが含有されることが分かった。
　［実施例１］
　＜血球分離チップによる有核赤血球の濃縮＞
　実施例１では採血後２～３時間経過した母体血０．３ｍｌを使用し、有核赤血球の濃縮の図１および図２に示す血球分離チップによって行った。
　母体血は予め５０倍に希釈した。希釈はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で行った。主流路への母体血希釈液の単位時間当たりの流量および副流路へのＰＢＳの単位時間当たりの流量を血球分離チップ当たり２５μｌ／分とした。血球分離チップによる分画は１０時間行った。
　本実施例では、図２における分岐流路を４個設け（５９ａ－ｄ）、それぞれの細流路の内接径はそれぞれ８、１２、１５及び２５μｍであった。本実施例において細流路の断面は四角であった。
　＜分画＞
　１５ｍｌの母体血希釈液を上記血球分離チップで分画した結果を表１に示す。係る母体血には３００μｌの母体血全血が含まれた。母体血全血中には１．４３×１０9個の血球が含まれると考えられる。全自動セルカウンターＴＣ２０を用いて測定した。分岐流路１～４並びにフロースルー５を通過した画分の血球数は表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示される画分Ｆｒ４中の血球は3.29×107個であった。密度勾配積層遠心の結果も考慮すると、係る画分には有核赤血球及び白血球に相当する血球が含まれていると解される。画分Ｆｒ４を上述の画分Ａとして用いて、セルソーティングによる解析を行った。
　画分Ｂの分取は参考例１と同様に行った。まず画分Ａに対してHoechst33342及びPE修飾抗CD45抗体による染色を行った。染色は細胞に対して架橋固定を含む固定処理をせずに行った。次にFITC修飾抗CD235a抗体による染色を行った。抗体の濃度は参考例１と同様に最適化した。
　画分Ｆｒ４の3.29×107個の血球をオンチップ社のセルソーターで選別した。Hoechst33342及びCD235aに対して陽性、かつCD45に対して陰性の血球を選別した。以上により661個の血球を含有する画分を得た。
　＜一細胞レベルでの分離＞
　図９には上述のように染色した血球が示されている。図に示すように凝集の発生は抑えられていた。このため、血球を一細胞レベルで互いに分離可能なことが示された。本実施例において凝集が抑えられたことは染色する抗体濃度を最適化したことによると考えられる。
　＜染色体ＤＮＡの抽出＞
　上記画分Ｂを、血球を約200個ずつ有する3つの画分に分けた。これらの画分には１～２個の胎児由来の有核赤血球が含まれているものと期待された。
　各画分に対して、染色体ＤＮＡの抽出を行った。染色体ＤＮＡに対してMALBAC（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles）法による全ゲノム増幅を行った。これにより胎児由来のY染色体が増幅され、後の工程でSRY遺伝子の検出を容易にすることができた。増幅された染色体ＤＮＡを鋳型として、SRY遺伝子配列特異的にＰＣＲ増幅を行った。SRY遺伝子のＰＣＲ産物の電気泳動層を図１０に示す。鋳型は以下の通りである。
　レーン１の左側には200bpのDNAラダーが示されている。
　レーン１：蒸留水。
　レーン２：ヒト男性の標準ＤＮＡ、20ｎｇ。
　レーン３：ヒト女性の標準ＤＮＡ、20ｎｇ。
　レーン４：MALBAC法による増幅産物１、450ｎｇ。
　レーン５：MALBAC法による増幅産物２、610ｎｇ。
　レーン６：MALBAC法による増幅産物３、700ｎｇ。
　レーン４の増幅産物１を鋳型としたPCRにおいては、SRYのバンドが見られた。他の増幅産物を鋳型としたPCRにおいては、SRYのバンドが見られなかった。以上より、画分Ｂを分画することで、胎児由来の血球を有する画分と、有しない画分とに分けられることが分かった。
　以上の事から、本実施例の血球分離チップにより有核赤血球を濃縮できることが確認された。
　［実施例２］
　＜血球分離チップによる有核赤血球の濃縮＞
　妊娠２６週の４３歳女性（胎児は男児）から提供された母体血をＰＢＳで５倍に希釈し血球分離チップを用いて有核赤血球の濃縮を行った。約６９時間経過後に希釈した母体血を用いた。
　用いた血球分離チップは実施例１で用いたものを改変したものである。実施例１で用いたチップは分岐流路を４つとフロースルーを備えていたが、本実施例では、内接径はそれぞれ１５及び２５μｍである分岐流路を２つとフロースルーを備えたもの（図１１、５９ａ、ｄ）を１０層重ねたもの、すなわちマイクロ流路単位中では各流路が平面的に配置されており、分離チップはマイクロ流路単位を有する層を１０個有し、各層の有する前記マイクロ流路単位は縦方向に互いに重なり合うことでマイクロ流路スタックを形成しており、階層流路において、各層のマイクロ流路単位の有する主流路の入口、副流路の入口、除去流路の出口、回収流路の出口及び主流路の出口は全層を貫く柱流路にそれぞれまとめて接続されていて、主流路の入口の底層はふさがり、前記主流路の出口の一方がふさがっているものを用いた（図１２）。
　母体血希釈液の単位時間当たりの流量および副流路へのＰＢＳの単位時間当たりの流量を血球分離チップあたり毎分５０μｌとし、６０分間血球分離チップを用いて分画した。分岐流路１（Ｆｒ１）、分岐流路２（Ｆｒ２）およびフロースルー３（Ｆｒ３）を通過した画分の血球数は表２の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　得られたフラクション２には３．１１×１０７個の血球が含まれると考えられた。全自動セルカウンターＴＣ２０を用いて測定した。
　＜セルソーティングによる有核赤血球濃縮の確認＞
　母体血から得られた画分Ｆｒ２に含まれる血球３．１１×１０７個のうち１／８量（０．４０×１０６個）の血球を実施例１と同様にセルソーターで選別した。Hoechst33342及びCD235aに対して陽性、かつCD45に対して陰性の血球を選別した。以上により１５４２９個の血球を含有する画分を得た（図１３、Ａｒエリア）。
　Ｆｒ２から新たに得たその１／８量の血球をセルソーターで分離し、２１９８１個の血球を含有する画分を得た（図１４、Ａｒエリア）。
　得られた各画分から実施例１と同様に染色体ＤＮＡの抽出を行った。染色体ＤＮＡに対してMALBAC法による全ゲノム増幅を行った。増幅された染色体ＤＮＡをNucleoSpin Gel and PCR Clean-up（タカラバイオ株式会社から購入）による精製後この一部を鋳型として、SRY遺伝子配列特異的にＰＣＲ増幅を行った。SRY遺伝子のＰＣＲ産物の電気泳動像を図１５に示す。鋳型は以下の通りである。
　［鋳型］
　レーン５の右側には100bpのDNAラダーが示されている。
　レーン１：蒸留水。
　レーン２：市販のヒト男性の標準ＤＮＡ、20ｎｇ。
　レーン３：市販のヒト女性の標準ＤＮＡ、20ｎｇ。
　レーン４：母体血Fr2に含まれる染色体DNAのMALBAC法による増幅産物、10ｎｇ。
　レーン５：母体血Fr2に含まれる染色体DNAのMALBAC法による増幅産物、10ｎｇ。
　母体血からFr2画分に含まれる染色体DNAのMALBAC法による増幅産物を鋳型としたPCRにおいては、SRYのバンドが見られた。他の増幅産物を鋳型としたPCRにおいては、SRYのバンドが見られなかった。以上より、血球分離チップによる６０分間の処理により胎児由来細胞を濃縮できることが分かった。
　また、参考例に示すように、密度勾配遠心法では、遠心管中に浮遊する画分を採取する必要があった。これに対して血球分離チップを用いた本実施例では、血球分離チップ自身で胎児由来細胞の濃縮された分画を分取することが出来た。
　［実施例３］
　実施例２で用いた血球分離チップを図１６に示すように改変して用いた。すなわち、マイクロ流路単位を有する層中に４個の前記マイクロ流路単位が形成され、前記層が１０個であるものを用いて、実施例２に準じて有核赤血球を濃縮した。マイクロ流路単位を有する層中に２以上のマイクロ流路単位が形成されることで、血球分離チップ中には複数の前記マイクロ流路スタックが立ち並んでいる。入口が接続する柱流路が一本の統合柱流路として統合されている。
　分岐流路の内接径は実施例２で示したものと同一であり、母体血希釈液の単位時間当たりの流量および副流路へのＰＢＳの単位時間当たりの流量を血球分離チップあたり毎分２００μｌとし、６０分間血球分離チップを用いて分画した。
　その結果、実施例２で示したのと同様に有核赤血球を濃縮することができた。
　上記の実施形態及び実施例では標的細胞として有核赤血球を例に挙げて本発明を説明した。ここで標的細胞は血球でなくてもよい。標的細胞は例えばＣＴＣ（末梢循環腫瘍細胞）でもよい。この場合、血液試料はがんの検査が必要な対象、がん患者、又はがんの治療をすでに行った患者から採取してもよい。
　［実施例４］　＜多層チップの性能評価＞
　多層チップの性能評価を以下のとおり行った。実施例２と同様に、マイクロ流路単位を有する層が等間隔に連続的に積層されている多層チップを用いて、全血を分画した。全血は妊婦ではない一般成人の全血である。全血を希釈したものを分画した。希釈率は５倍とした。
　多層チップは実施例２で説明したものと同一のマイクロ流路単位を有する。ただし、本実施例で使用した多層チップは、マイクロ流路単位を有する層が８個である点で実施例２の多層チップと異なる。また同一のマイクロ流路単位を有する単層チップを対照として使用した。
　主流路の入口をまとめる柱流路への希釈血の流入速度を毎分２０μｌとした。多層チップに流入した希釈血は各層の副流路のそれぞれに分かれて流入する。単層チップでは唯一の主流路への希釈血の流入速度を毎分２０μｌとした。各チップで分画の処理がなされた血液の体積は６００μｌである。
　上述の通り副流路にＰＢＳを通すことで、主流路の血液の流れに対する押さえつけを行った。チップ中の層の数によらず、副流路の入口をまとめる柱流路へのＰＢＳの流入速度を毎分２０μｌ（弱い押さえつけ）又は４０μｌ（強い押さえつけ）とした。単層チップでは唯一の副流路へのＰＢＳの流入速度を毎分２０μｌとした。多層チップに流入したＰＢＳは各層の副流路のそれぞれに分かれて流入する。各チップに導入されたＰＢＳの体積は６００μｌ又は１，２００μｌである。
　画分Ｆ１を分岐流路１（Ｆｒ１、幅１５μｍ、図１２の柱流路２４ａに相当）から取得した。画分Ｆ２を分岐流路２（Ｆｒ２，幅２５μｍ、図１２の柱流路２４ｄに相当）から取得した。画分Ｆ３をフロースルー（Ｆｒ３、図１２の柱流路に２５相当）から取得した。各画分に含まれる血球を分析して表３に示す結果を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　分析について説明する。画分Ｆ１からＦ３に回収された細胞数（Ｃ１）を全自動セルカウンターＴＣ２０（ＢＩＯＲＡＤ）にて測定した。ただし、画分Ｆ１は予め400倍希釈してから細胞数を測定した。これは画分Ｆ１には脱核後の成熟赤血球を主として多くの細胞が含まれているからである。希釈率は100～200倍でもよい。
　画分Ｆ１に対して溶血処理を施す。これにより、画分Ｆ１中の成熟赤血球を溶血する。白血球を初めとする有核の細胞は溶血処理後も残る。残った細胞の一部をＦＣＭで解析した。画分Ｆ２では回収された細胞の一部をＦＣＭで解析した。溶血後の画分Ｆ１と画分Ｆ２に対して蛍光核染色を行った。ＦＣＭにより核染色の陽性率（ｐ）（％）を測定した。
　画分Ｆ１の分析では溶血処理後に残った細胞数（Ｃ２）を母数（Ｃ３）とした。画分Ｆ２の分析では多層チップで回収された細胞数（Ｃ１）を母数とした。母数（Ｃ３）に陽性率（ｐ）（％）を乗じて、各画分中の有核細胞数（Ｃ４）を算出した。有核細胞数（Ｃ４）を元に、画分Ｆ１及び画分Ｆ２への有核細胞の分配比を求めた。画分Ｆ１及び画分Ｆ２の分配比の合計を１００とする。またチップで回収された全細胞数に対する有核細胞数（Ｃ４）の割合を分画効率（％）として表に示した。
　弱い押さえつけ（毎分２０μｌ）を適用したときの画分Ｆ２の陽性率（ｐ）は、単層チップで４．８６％であった。これに対して多層チップでは２８．６％であった。この結果は単層チップでは太い方の分岐流路２に対して、多くの成熟赤血球が進入していることを表している。また多層チップでは成熟赤血球の分岐流路２への進入が緩和されていることを表している。
　弱い押さえつけ（毎分２０μｌ）を適用したときの有核細胞の分配比（Ｆ１：Ｆ２）は単層チップで４２．４：５７．６であった。これに対して多層チップでは７．９：９２．１であった。この結果は単層チップでは細い方の分岐流路１に対して、多くの有核細胞が進入していることを表している。また多層チップでは有核細胞の分岐流路１への進入が緩和されていることを表している。
　上記の結果より単層チップより多層チップの方が成熟赤血球と有核細胞とに対する水力学的な分級の精度が高いことが分かった。
　さらに分級の精度を高めるために強い押さえつけ（毎分４０μｌ）を適用して分画を行った。画分Ｆ２の陽性率（ｐ）は、単層チップで５５．３％まで向上した。多層チップにても６６．６％まで向上した。この結果は押さえつけを強くすることで成熟赤血球の分岐流路２への進入が緩和されていることを表している。
　強い押さえつけ（毎分４０μｌ）を適用したときの有核細胞の分配比（Ｆ１：Ｆ２）は単層チップで２１．５：７８．５であった。多層チップでも４．６：９５．４であった。これらの結果は押さえつけを強くすることで分級の精度を高められることを表している。
　強い押さえつけ（毎分４０μｌ）を適用したときの分配比の向上は単層チップでは非常に大きいものであった。しかしながら多層チップでは分配比の大きな向上は見られなかった。これは弱い押さえつけ（毎分２０μｌ）であっても、分配比がすでに十分に画分Ｆ２側に偏っていたことによると考えられる。以上より、チップの多層化は、押さえつけの強さに依存せずに分級精度を向上させることのできる手段であることが分かった。
　この出願は、２０１７年１０月１９日に出願された日本出願特願２０１７－２０２９０７を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本発明の他の態様は以下に述べるものである。
［１］血球分離チップを使用して血液試料中の血球を分画することで全血が数を基準として有核赤血球の濃縮された画分を取得する方法であって、前記血液試料は、血液試料それ自体、又は前記血液試料に比べて全血が数を基準として有核赤血球が濃縮されていない未漉縮試料であり、
　前記血球分離チップは、前記血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路と、を有するマイクロ流路単位を備え、
　副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
　前記押し込まれた血球のうち無核赤血球が前記除去流路に進入することで、前記血液試料から無核赤血球が除去され、
　前記無核赤血球が除去されて残った血球のうち有核赤血球が前記回収流路に進入することで前記血液試料から有核赤血球が前記画分として取得され、
　前記除去流路と前記回収流路の内接径が異なり、前記主流路と前記除去流路との接続部における前記除去流路の内接径が、前記主流路と前記回収流路との接続部における前記回収流路の内接径より低い数値である、方法、
［２］前記血液試料が母体血試料であり、前記有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、［１］記載の方法、
［３］前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が４～１９μｍであり、
　前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が２０～３０μｍである、［１］記載の方法、
［４］前記主流路への血液試料の１分間時間当たりの流量が０．５～５０μｌである、［１］記載の方法、
［５］前記副流路の流量が、前記主流路への血液試料の１分間当たりの流量の１～１０倍である、［１］記載の方法、
［６］前記マイクロ流路単位中では各流路が平面的に配置されており、前記分離チップは前記マイクロ流路単位を有する層を２～２００個有し、
　各層の有する前記マイクロ流路単位は縦方向に互いに重なり合うことでマイクロ流路ス
タックを形成しており、
　前記階層流路において、各層の前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の注入口、前記副流路の注入口、前記除去流路の排出口、前記回収流路の排出口及び前記主流路の排出口は全層を貫く縦流路にそれぞれまとめて接続されている、［１］に記載の方法、
［７］前記主流路の注入口の底層はふさがり、前記主流路の排出口の最上層または最下層がふさがっている、［６］記載の方法、
［８］前記マイクロ流路単位を有する層中に２以上の前記マイクロ流路単位が形成されることで、前記血球分離チップ中には複数の前記マイクロ流路スタックが立ち並んでおり、前記注入口が接続する前記縦流路が一本の統合縦流路として統合されている、［６］記載の方法、
［９］前記血液試料を注入する間に前記血液試料を定期的に攪拌する、［１］に記載の方法、 
［１０］前記マイクロ流路単位において、
前記回収流路の前記内接径は前記回収流路の途中で拡大し、
前記除去流路の前記内接径は前記除去流路の途中で拡大している、
［１］に記載の方法、
［１１］血球分離チップを使用して血液試料中の血球を分画することで全血が数を基準として有核赤血球の濃縮された画分Ａを取得し、前記血液試料は、血液試料それ自体、又は前記血液試料に比べて全血が数を基準として有核赤血球が濃縮されていない未漉縮試料であり、
　画分Ａを白血球及び核酸に対して特異的に標識するとともに、標識した前記画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、白血球に対して特異的な標識により標識された血が排除されているとともに核酸に対して特異的な標識により標識された血球が濃縮されている画分Ｂを取得し、
　前記画分Ｂ中の血球に含まれる染色体の解析を行うことで、非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する方法であって、
　前記血球分離チップは、前記血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路と、を有するマイクロ流路単位を備え、
　副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
　前記押し込まれた血球のうち無核赤血球が前記除去流路に進入することで、前記血液試料から無核赤血球が除去され、
　前記無核赤血球が除去されて残った血球のうち有核赤血球が前記回収流路に進入することで前記血液試料から有核赤血球が前記画分として取得され、
　前記除去流路と前記回収流路の内接径が異なり、前記主流路と前記除去流路との接続部における前記除去流路の内接径が、前記主流路と前記回収流路との接続部における前記回収流路の内接径より低い数値である、方法、
［１２］染色体の解析が、蛍光in situハイブリダイゼーシヨン法、次世代ゲノムシークエンス法またはマイクロアレイ法による解析である［１１］記載の方法、
［１３］前記血液試料が母体血試料であり、前記有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、［１１］記載の方法、
［１４］前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が４～１９μｍであり、
　前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が２０～３０μｍである、［１１］記載の方法、
［１５］前記主流路への血液試料の１分間単位時間当たりの流量が０．５～５０μｌである、［１１］記載の方法、
［１６］前記副流路の流量が、前記主流路への血液試料の１分間当たりの流量の１～１０倍である、［１１］記載の方法、
［１７］前記マイクロ流路単位中では各流路が平面的に配置されており、前記分離チップは前記マイクロ流路単位を有する層を２～２００個有し、
　各層の有する前記マイクロ流路単位は縦方向に互いに重なり合うことでマイクロ流路スタックを形成しており、
　前記階層流路において、各層の前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の注入口、前記副流路の注入口、前記除去流路の排出口、前記回収流路の排出口及び前記主流路の排出口は全層を貫く縦流路にそれぞれまとめて接続されている、［１１］に記載の方法、
［１８］前記主流路の注入口の底層はふさがり、前記主流路の排出口の最上層または最下層がふさがっている、［１７］記載の方法、
［１９］前記マイクロ流路単位を有する層中に２以上の前記マイクロ流路単位が形成されることで、前記血球分離チップ中には複数の前記マイクロ流路スタックが立ち並んでおり、前記注入口が接続する前記縦流路が一本の統合縦流路として統合されている、［１７］記載の方法、
［２０］前記血液試料を注入する間に前記血液試料を定期的に攪拌する、［１１］に記載の方法、 
［２１］前記マイクロ流路単位において、
前記回収流路の前記内接径は前記回収流路の途中で拡大し、
前記除去流路の前記内接径は前記除去流路の途中で拡大している、
［１１］に記載の方法。
２０　チップ
２２　主流路の入口をまとめる柱流路
２３　副流路の入口をまとめる柱流路
２４ａ　除去流路の出口をまとめる柱流路
２４ｄ　回収流路の出口をまとめる柱流路
２５　主流路の出口をまとめる柱流路
３９　顆粒
４１　有核赤血球
４２　無核赤血球
４３　白血球
４５ａ－ｆ　層
４６　遠心管
４７　主流路
４８ａ－ｃ　血球
４９　副流路
５０　血球分離チップ
５１　入口
５２　主流路
５３　副流路
５４ａ－ｄ　出口
５５　出口
５６ａ－ｄ　流路
５７　シリンジ
５８　シリンジ
５９ａ－ｄ　分岐流路
６１　入口
Ｆｒ１－５　画分
ＦＴ　フロースルー
Ｌ０１－Ｌ１０　層

Claims (14)

  1. 　血液試料中の細胞を水力学的に分級するためのマイクロ流路単位を、備えるチップであって、
    　前記マイクロ流路単位は、血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路とが平面的に展開してなるパターンを有しており、
    　前記副流路から前記主流路内に流れ出す液体が前記主流路を流れる細胞を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
    　前記押し込まれた細胞のうち無核赤血球を含む流体が前記除去流路に進入することで、血液試料から無核赤血球が除去され、
    　前記無核赤血球が除去されて残った細胞のうち標的細胞を含む流体が前記回収流路に進入することで血液試料から標的細胞が取得され、
    　前記回収流路一本ごとの前記主流路と前記回収流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量が、前記除去流路一本ごとの前記主流路と前記除去流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量に比べて大きく、
    　同一の前記パターンを有する前記マイクロ流路単位が高さ方向に繰り返し積層されており、
    　前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の入口、前記副流路の入口、前記除去流路の出口、前記回収流路の出口及び前記主流路の出口は各層を横断的に貫く柱流路によってそれぞれまとめられるように前記柱流路に接続されている、
    　チップ。
  2. 　前記マイクロ流路単位が各層に１個ずつ設けられている、
    　請求項１に記載のチップ。
  3. 　前記チップを平面視したときに各層の前記マイクロ流路単位のパターンの向き及び位置が揃っている、
    　請求項２に記載のチップ。
  4. 　前記主流路及び前記副流路の前記入口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの上面に開口を有し、さらに
    　前記除去流路、前記回収流路及び前記主流路の前記出口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの下面に開口を有することで、
    　前記血液試料が前記チップの上面から下面に向かって前記チップを通り抜ける、
    　請求項３に記載のチップ。
  5. 　前記マイクロ流路単位を有する層が等間隔に連続的に積層されている、
    　請求項４に記載のチップ。
  6. 　前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が４～１９μｍであり、
    　前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が２０～３０μｍである、
    　請求項１に記載のチップ。
  7. 　前記マイクロ流路単位において、
    　前記回収流路及び前記除去流路の少なくともいずれかの断面積はその下流に進むほど大きくなる、
    　請求項１に記載のチップ。
  8. 　血液試料を分画することで細胞数を尺度として標的細胞の濃縮された画分を取得するための、請求項４に記載のチップの使用であって、
    　前記血液試料は、全血そのもの又は全血と比較した場合に細胞数を尺度として標的細胞が濃縮されていないものである、
    　使用。
  9. 　前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の流入量が８～２５μｌ／分である、
    　請求項８に記載の使用。
  10. 　前記副流路が接続される前記柱流路への前記液体の単位時間当たりの流入量が、前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の単位時間当たりの流入量の１～２倍である、
    　請求項９に記載の使用。
  11. 　前記血液試料を前記チップに注入する間に注入を待つ血液試料を攪拌するとともに、撹拌した血液試料を順次前記チップに注入する、
    　請求項８に記載の使用。
  12. 　前記血液試料が母体血の全血又はこれを単に希釈したものであり、
    　前記標的細胞が胎児由来有核赤血球である、
    　請求項８に記載の使用。
  13. 　請求項１２に記載のチップの使用に基づき有核赤血球の濃縮された画分Ａを取得し、
    　画分Ａを白血球及び核酸に対して特異的に標識するとともに、標識した前記画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、白血球に対して特異的な標識により標識された血球が排除されているとともに核酸に対して特異的な標識により標識された血球が濃縮されている画分Ｂを取得し、
    　前記画分Ｂ中の血球に含まれる染色体の解析を行うことで、非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
    　方法。
  14. 　染色体の解析が、蛍光in situハイブリダイゼーション法、次世代シークエンス法又はマイクロアレイ法による解析である請求項１３に記載の方法。
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