JP6582272B2 - 細胞分級用チップ - Google Patents
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Description
血液試料中の細胞を水力学的に分級するためのマイクロ流路単位を、備えるチップであって、
前記マイクロ流路単位は、血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路とが平面的に展開してなるパターンを有しており、
前記副流路から前記主流路内に流れ出す液体が前記主流路を流れる細胞を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
前記押し込まれた細胞のうち無核赤血球を含む流体が前記除去流路に進入することで、血液試料から無核赤血球が除去され、
前記無核赤血球が除去されて残った細胞のうち標的細胞を含む流体が前記回収流路に進入することで血液試料から標的細胞が取得され、
前記回収流路一本ごとの前記主流路と前記回収流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量が、前記除去流路一本ごとの前記主流路と前記除去流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量に比べて大きく、
同一の前記パターンを有する前記マイクロ流路単位が高さ方向に繰り返し積層されており、
前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の入口、前記副流路の入口、前記除去流路の出口、前記回収流路の出口及び前記主流路の出口は各層を横断的に貫く柱流路によってそれぞれまとめられるように前記柱流路に接続されている、
チップ。
<2>
前記マイクロ流路単位が各層に1個ずつ設けられている、
<1>に記載のチップ。
<3>
前記チップを平面視したときに各層の前記マイクロ流路単位のパターンの向き及び位置が揃っている、
<2>に記載のチップ。
<4>
前記主流路及び前記副流路の前記入口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの上面に開口を有し、さらに
前記除去流路、前記回収流路及び前記主流路の前記出口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの下面に開口を有することで、
前記血液試料が前記チップの上面から下面に向かって前記チップを通り抜ける、
<3>に記載のチップ。
<5>
前記マイクロ流路単位を有する層が等間隔に連続的に積層されている、
<4>に記載のチップ。
<6>
前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が4〜19μmであり、
前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が20〜30μmである、
<1>に記載のチップ。
<7>
前記マイクロ流路単位において、
前記回収流路及び前記除去流路の少なくともいずれかの断面積はその下流に進むほど大きくなる、
<1>に記載のチップ。
<8>
血液試料を分画することで細胞数を尺度として標的細胞の濃縮された画分を取得するための、<4>に記載のチップの使用であって、
前記血液試料は、全血そのもの又は全血と比較した場合に細胞数を尺度として標的細胞が濃縮されていないものである、
使用。
<9>
前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の流入量が8〜25μl/分である、
<8>に記載の使用。
<10>
前記副流路が接続される前記柱流路への前記液体の単位時間当たりの流入量が、前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の単位時間当たりの流入量の1〜2倍である、
<9>に記載の使用。
<11>
前記血液試料を前記チップに注入する間に注入を待つ血液試料を攪拌するとともに、撹拌した血液試料を順次前記チップに注入する、
<8>に記載の使用。
<12>
前記血液試料が母体血の全血又はこれを単に希釈したものであり、
前記標的細胞が胎児由来有核赤血球である、
<8>に記載の使用。
<13>
<12>に記載のチップの使用に基づき有核赤血球の濃縮された画分Aを取得し、
画分Aを白血球及び核酸に対して特異的に標識するとともに、標識した前記画分A中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、白血球に対して特異的な標識により標識された血球が排除されているとともに核酸に対して特異的な標識により標識された血球が濃縮されている画分Bを取得し、
前記画分B中の血球に含まれる染色体の解析を行うことで、非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
方法。
<14>
染色体の解析が、蛍光in situハイブリダイゼーション法、次世代シークエンス法又はマイクロアレイ法による解析である<13>に記載の方法。
本実施形態において出発材料はヒトの妊婦の母体血試料である。妊婦は月経後胎齢が10週から33週であることが好ましい。月経後胎齢は最終月経初日を1日目として、満日数又は満週数で表したものである。月経後胎齢は受精後胎齢に2週を加えたものとして算出してもよい。母体血又はこれを希釈したものは血液試料の一例である。本実施形態に係るチップやその使用を母体血以外に適用することができる。以下の実施形態の説明において母体血を血液試料に置き換えてもその技術的内容を解釈してもよい。
本実施形態において、濃縮された胎児由来細胞を取得することを目的とする。以下に胎児由来細胞として母体血に含まれる有核赤血球について説明する。
本実施形態の方法により胎児由来細胞を濃縮する。胎児由来細胞の濃縮とは、母体血試料から、全血球を基準として、好ましくは全赤血球を基準として胎児由来細胞の濃縮された画分を取得することを言い、本実施形態において胎児由来細胞が濃縮されていることとは、画分中の全血球に占める胎児由来細胞の割合が向上していることを指す。好ましくは赤血球に占める有核赤血球の割合が向上していることを指す。
本実施形態の血球分離チップを用いて有核赤血球が濃縮された画分(以下、画分Aということもある)からセルソーティングにより更に有核赤血球を濃縮してもよい。
標識した画分A中の血球をセルソーティングによって選別することで有核赤血球をさらに濃縮することができる。セルソーティングでは例えば細胞を選別するために用いられる装置(セルソーター)を使用する。標識が蛍光標識であれば、セルソーティングによる選別の方法は蛍光標示式細胞分取法(FCM)でもよい。セルソーティングによる選別の方法は磁気標識による細胞分取法でもよい。本実施形態ではセルソーティングの原理及びセルソーターの機種は特に限定されない。
画分A中の血球を蛍光標識した場合は、セルソーティングとしてFACS(商標)を用いることが好ましい。またセルソーティングによる処理後も蛍光標識は残存しているので、これを有効に利用してもよい。
<採血>
本参考例および後述の実施例では適切な手続の下、母体血及び一般血の提供を受けた。母体血は、試験研究用として妊娠33週の妊婦から提供されたものである。胎児の性別は男性である。本実施例において用いられた一般血は、試験研究用として妊婦ではない人から提供されたものである。母体血及び一般血の採取は医療機関においてなされた。これらの血液は適正な管理の下、発明者らの研究室に輸送された。
母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心法で濃縮した。ここで濃縮とは、有核赤血球以外の血球を除去することである。濃縮において母体血から除去される血球は無核の赤血球であることが好ましい。濃縮において母体血から血小板も除去されることがさらに好ましい。
画分Aの血球をHoechst33342(Sigma−Aldrich製)、抗CD45-PE標識抗体(Miltenyi-Biotec製、クローン名:5B1)、及び抗CD235a-FITC標識抗体(Miltenyi-Biotec製、クローン名:REA175)で同時に染色した。染色に際して血球の架橋固定は行わなかった。染色は4℃で、10分間行った。染色後、血球の懸濁液を4℃、300Gの条件で10分間遠心することで標識された血球を回収した。
図5はHoechst33342の蛍光強度分布を示す。縦軸は血球の出現頻度を表す。横軸はHoechstの蛍光シグナルの強度を表す。ピークが二つ表れている。出現頻度が強度40〜50の間で極小となった。係る範囲で境界値を定め、これより強度の大きい血球を有核の血球と推定した。また、これより強度の小さい血球を無核の血球と推定した。
画分Bの全体に対してNucleospin Tissue XS(タカラバイオ株式会社から購入)を使用して、DNA抽出を行った。
図8に示す電気泳動像より、試料1には4〜16コピーのSRY遺伝子配列を有するDNAが含まれることが分かった。したがって、試料1には胎児由来の染色体DNAが含有されることが分かった。
<血球分離チップによる有核赤血球の濃縮>
実施例1では採血後2〜3時間経過した母体血0.3mlを使用し、有核赤血球の濃縮の図1および図2に示す血球分離チップによって行った。
15mlの母体血希釈液を上記血球分離チップで分画した結果を表1に示す。係る母体血には300μlの母体血全血が含まれた。母体血全血中には1.43×109個の血球が含まれると考えられる。全自動セルカウンターTC20を用いて測定した。分岐流路1〜4並びにフロースルー5を通過した画分の血球数は表1の通りである。
図9には上述のように染色した血球が示されている。図に示すように凝集の発生は抑えられていた。このため、血球を一細胞レベルで互いに分離可能なことが示された。本実施例において凝集が抑えられたことは染色する抗体濃度を最適化したことによると考えられる。
上記画分Bを、血球を約200個ずつ有する3つの画分に分けた。これらの画分には1〜2個の胎児由来の有核赤血球が含まれているものと期待された。
<血球分離チップによる有核赤血球の濃縮>
妊娠26週の43歳女性(胎児は男児)から提供された母体血をPBSで5倍に希釈し血球分離チップを用いて有核赤血球の濃縮を行った。約69時間経過後に希釈した母体血を用いた。
母体血から得られた画分Fr2に含まれる血球3.11×107個のうち1/8量(0.40×106個)の血球を実施例1と同様にセルソーターで選別した。Hoechst33342及びCD235aに対して陽性、かつCD45に対して陰性の血球を選別した。以上により15429個の血球を含有する画分を得た(図13、Arエリア)。
レーン5の右側には100bpのDNAラダーが示されている。
実施例2で用いた血球分離チップを図16に示すように改変して用いた。すなわち、マイクロ流路単位を有する層中に4個の前記マイクロ流路単位が形成され、前記層が10個であるものを用いて、実施例2に準じて有核赤血球を濃縮した。マイクロ流路単位を有する層中に2以上のマイクロ流路単位が形成されることで、血球分離チップ中には複数の前記マイクロ流路スタックが立ち並んでいる。入口が接続する柱流路が一本の統合柱流路として統合されている。
[1]血球分離チップを使用して血液試料中の血球を分画することで全血が数を基準として有核赤血球の濃縮された画分を取得する方法であって、前記血液試料は、血液試料それ自体、又は前記血液試料に比べて全血が数を基準として有核赤血球が濃縮されていない未漉縮試料であり、
前記血球分離チップは、前記血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路と、を有するマイクロ流路単位を備え、
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
前記押し込まれた血球のうち無核赤血球が前記除去流路に進入することで、前記血液試料から無核赤血球が除去され、
前記無核赤血球が除去されて残った血球のうち有核赤血球が前記回収流路に進入することで前記血液試料から有核赤血球が前記画分として取得され、
前記除去流路と前記回収流路の内接径が異なり、前記主流路と前記除去流路との接続部における前記除去流路の内接径が、前記主流路と前記回収流路との接続部における前記回収流路の内接径より低い数値である、方法、
[2]前記血液試料が母体血試料であり、前記有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、[1]記載の方法、
[3]前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が4〜19μmであり、
前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が20〜30μmである、[1]記載の方法、
[4]前記主流路への血液試料の1分間時間当たりの流量が0.5〜50μlである、[1]記載の方法、
[5]前記副流路の流量が、前記主流路への血液試料の1分間当たりの流量の1〜10倍である、[1]記載の方法、
[6]前記マイクロ流路単位中では各流路が平面的に配置されており、前記分離チップは前記マイクロ流路単位を有する層を2〜200個有し、
各層の有する前記マイクロ流路単位は縦方向に互いに重なり合うことでマイクロ流路ス
タックを形成しており、
前記階層流路において、各層の前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の注入口、前記副流路の注入口、前記除去流路の排出口、前記回収流路の排出口及び前記主流路の排出口は全層を貫く縦流路にそれぞれまとめて接続されている、[1]に記載の方法、
[7]前記主流路の注入口の底層はふさがり、前記主流路の排出口の最上層または最下層がふさがっている、[6]記載の方法、
[8]前記マイクロ流路単位を有する層中に2以上の前記マイクロ流路単位が形成されることで、前記血球分離チップ中には複数の前記マイクロ流路スタックが立ち並んでおり、前記注入口が接続する前記縦流路が一本の統合縦流路として統合されている、[6]記載の方法、
[9]前記血液試料を注入する間に前記血液試料を定期的に攪拌する、[1]に記載の方法、
[10]前記マイクロ流路単位において、
前記回収流路の前記内接径は前記回収流路の途中で拡大し、
前記除去流路の前記内接径は前記除去流路の途中で拡大している、
[1]に記載の方法、
[11]血球分離チップを使用して血液試料中の血球を分画することで全血が数を基準として有核赤血球の濃縮された画分Aを取得し、前記血液試料は、血液試料それ自体、又は前記血液試料に比べて全血が数を基準として有核赤血球が濃縮されていない未漉縮試料であり、
画分Aを白血球及び核酸に対して特異的に標識するとともに、標識した前記画分A中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、白血球に対して特異的な標識により標識された血が排除されているとともに核酸に対して特異的な標識により標識された血球が濃縮されている画分Bを取得し、
前記画分B中の血球に含まれる染色体の解析を行うことで、非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する方法であって、
前記血球分離チップは、前記血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路と、を有するマイクロ流路単位を備え、
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
前記押し込まれた血球のうち無核赤血球が前記除去流路に進入することで、前記血液試料から無核赤血球が除去され、
前記無核赤血球が除去されて残った血球のうち有核赤血球が前記回収流路に進入することで前記血液試料から有核赤血球が前記画分として取得され、
前記除去流路と前記回収流路の内接径が異なり、前記主流路と前記除去流路との接続部における前記除去流路の内接径が、前記主流路と前記回収流路との接続部における前記回収流路の内接径より低い数値である、方法、
[12]染色体の解析が、蛍光in situハイブリダイゼーシヨン法、次世代ゲノムシークエンス法またはマイクロアレイ法による解析である[11]記載の方法、
[13]前記血液試料が母体血試料であり、前記有核赤血球が胎児由来有核赤血球である、[11]記載の方法、
[14]前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が4〜19μmであり、
前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が20〜30μmである、[11]記載の方法、
[15]前記主流路への血液試料の1分間単位時間当たりの流量が0.5〜50μlである、[11]記載の方法、
[16]前記副流路の流量が、前記主流路への血液試料の1分間当たりの流量の1〜10倍である、[11]記載の方法、
[17]前記マイクロ流路単位中では各流路が平面的に配置されており、前記分離チップは前記マイクロ流路単位を有する層を2〜200個有し、
各層の有する前記マイクロ流路単位は縦方向に互いに重なり合うことでマイクロ流路スタックを形成しており、
前記階層流路において、各層の前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の注入口、前記副流路の注入口、前記除去流路の排出口、前記回収流路の排出口及び前記主流路の排出口は全層を貫く縦流路にそれぞれまとめて接続されている、[11]に記載の方法、
[18]前記主流路の注入口の底層はふさがり、前記主流路の排出口の最上層または最下層がふさがっている、[17]記載の方法、
[19]前記マイクロ流路単位を有する層中に2以上の前記マイクロ流路単位が形成されることで、前記血球分離チップ中には複数の前記マイクロ流路スタックが立ち並んでおり、前記注入口が接続する前記縦流路が一本の統合縦流路として統合されている、[17]記載の方法、
[20]前記血液試料を注入する間に前記血液試料を定期的に攪拌する、[11]に記載の方法、
[21]前記マイクロ流路単位において、
前記回収流路の前記内接径は前記回収流路の途中で拡大し、
前記除去流路の前記内接径は前記除去流路の途中で拡大している、
[11]に記載の方法。
22 主流路の入口をまとめる柱流路
23 副流路の入口をまとめる柱流路
24a 除去流路の出口をまとめる柱流路
24d 回収流路の出口をまとめる柱流路
25 主流路の出口をまとめる柱流路
39 顆粒
41 有核赤血球
42 無核赤血球
43 白血球
45a−f 層
46 遠心管
47 主流路
48a−c 血球
49 副流路
50 血球分離チップ
51 入口
52 主流路
53 副流路
54a−d 出口
55 出口
56a−d 流路
57 シリンジ
58 シリンジ
59a−d 分岐流路
61 入口
Fr1−5 画分
FT フロースルー
L01−L10 層
Claims (14)
- 血液試料中の細胞を水力学的に分級するためのマイクロ流路単位を、備えるチップであって、
前記マイクロ流路単位は、血液試料が流れる主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路と、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路とが平面的に展開してなるパターンを有しており、
前記副流路から前記主流路内に流れ出す液体が前記主流路を流れる細胞を前記除去流路及び前記回収流路の側に向かって押し込み、
前記押し込まれた細胞のうち無核赤血球を含む流体が前記除去流路に進入することで、血液試料から無核赤血球が除去され、
前記無核赤血球が除去されて残った細胞のうち標的細胞を含む流体が前記回収流路に進入することで血液試料から標的細胞が取得され、
前記回収流路一本ごとの前記主流路と前記回収流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量が、前記除去流路一本ごとの前記主流路と前記除去流路との間の接続部の断面における単位時間当たりの流量に比べて大きく、
同一の前記パターンを有する前記マイクロ流路単位が高さ方向に繰り返し積層されており、
前記マイクロ流路単位の有する前記主流路の入口、前記副流路の入口、前記除去流路の出口、前記回収流路の出口及び前記主流路の出口は各層を横断的に貫く柱流路によってそれぞれまとめられるように前記柱流路に接続されている、
チップ。 - 前記マイクロ流路単位が各層に1個ずつ設けられている、
請求項1に記載のチップ。 - 前記チップを平面視したときに各層の前記マイクロ流路単位のパターンの向き及び位置が揃っている、
請求項2に記載のチップ。 - 前記主流路及び前記副流路の前記入口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの上面に開口を有し、さらに
前記除去流路、前記回収流路及び前記主流路の前記出口がそれぞれ接続される前記柱流路が前記チップの下面に開口を有することで、
前記血液試料が前記チップの上面から下面に向かって前記チップを通り抜ける、
請求項3に記載のチップ。 - 前記マイクロ流路単位を有する層が等間隔に連続的に積層されている、
請求項4に記載のチップ。 - 前記主流路と前記除去流路との接続部において前記除去流路の内接径が4〜19μmであり、
前記主流路と前記回収流路との接続部において前記回収流路の内接径が20〜30μmである、
請求項1に記載のチップ。 - 前記マイクロ流路単位において、
前記回収流路及び前記除去流路の少なくともいずれかの断面積はその下流に進むほど大きくなる、
請求項1に記載のチップ。 - 血液試料を分画することで細胞数を尺度として標的細胞の濃縮された画分を取得するための、請求項4に記載のチップの使用であって、
前記血液試料は、全血そのもの又は全血と比較した場合に細胞数を尺度として標的細胞が濃縮されていないものである、
使用。 - 前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の流入量が8〜25μl/分である、
請求項8に記載の使用。 - 前記副流路が接続される前記柱流路への前記液体の単位時間当たりの流入量が、前記主流路が接続される前記柱流路への前記血液試料の単位時間当たりの流入量の1〜2倍である、
請求項9に記載の使用。 - 前記血液試料を前記チップに注入する間に注入を待つ血液試料を攪拌するとともに、撹拌した血液試料を順次前記チップに注入する、
請求項8に記載の使用。 - 前記血液試料が母体血の全血又はこれを単に希釈したものであり、
前記標的細胞が胎児由来有核赤血球である、
請求項8に記載の使用。 - 請求項12に記載のチップの使用に基づき有核赤血球の濃縮された画分Aを取得し、
画分Aを白血球及び核酸に対して特異的に標識するとともに、標識した前記画分A中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで、白血球に対して特異的な標識により標識された血球が排除されているとともに核酸に対して特異的な標識により標識された血球が濃縮されている画分Bを取得し、
前記画分B中の血球に含まれる染色体の解析を行うことで、非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
方法。 - 染色体の解析が、蛍光in situハイブリダイゼーション法、次世代シークエンス法又はマイクロアレイ法による解析である請求項13に記載の方法。
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