CN106488981A - 用于诊断测试的胎儿有核红细胞(nrbcs)的制备 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种从生物样品中制备用于诊断测试的胎儿有核红细胞(NRBC)的方法。

Description

用于诊断测试的胎儿有核红细胞(NRBCS)的制备
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年5月15日提交的美国临时申请61/993,659号的权益，此处将其内容以其整体作为参考并入本文。
2.背景技术
检测胎儿可能的染色体和遗传异常的产前诊断实践使父母和看护人能够开始监测疾病或病症的倾向及早期治疗。已经建立了用于检测胎儿可能的染色体和遗传异常的产前诊断实践，从而使得父母和看护人能够作出明智的决策。在多种不具有生命危险的染色体异常(21、18、13、X、Y染色体的非整倍性)中，由21号染色体的额外拷贝的全部或部分的存在引起的唐氏综合症是精神发育迟滞最常见的遗传成因和女性寻求产前诊断的主要原因(Pierce B.Genetics：A conceptual approach(W.H.Freeman and company，2008)，第3版；Driscoll和Gross，2009，N Engl J Med.360：2556-62)。据报道，细胞遗传学异常发生率在活产婴中为约1％、在超过35岁的怀孕女性中为2％、在自发性孕早期流产中为约50％(Thompson and Thompson Genetics in Medicine，第6版，第9章)。据报道，在一百万个活产婴儿人群中单基因缺陷的发生率为约0.36％(Thompson and Thompson Genetics inMedicine，第6版，第9章)。
涉及对来自血清的PAPP-A(妊娠相关血浆蛋白-A)、游离β-Hcg(游离β-人绒膜促性腺激素)进行定量的优选孕早期筛查以及颈半透明度的超声检查，具有唐氏综合症的检测率为约90％，但以5％显著性的假阳性率为代价(Nicolaides等，2005，Ultrasound ObstetGynecol 25：221-26)。孕早期筛查研究的综合分析(Evans等，2007，Am J Obstet Gynecol196：198-05)得出结论，在实践中得到的敏感性可能显著低于(约80％～84％)报道的敏感性。
通过对由绒毛膜绒毛采样、羊膜穿刺术或脐带采样获得的胎儿组织进行核型分析可以明确检测染色体异常和单基因病。为了最小化诸如唐氏综合症等病症的风险，这些检测提供给通过一组筛察标准鉴定为具有最高胎儿染色体异常风险的的女性。这个群组通常包括孕妇年龄为35岁或以上的妊娠，和对胎儿超声检查的异常响应，和/或在妊娠的孕早期和/或孕中期期间进行的孕妇血清标志物筛察检测(Nicolaides等，2005，UltrasoundObstet Gynecol 25：221-26)。然而，这些程序是高侵入性的，要求熟练的专业人员，并有显著的胎儿损失风险(至多1％)和/或孕妇并发症(Mujezinovic等，2007，Obstet Gynecol110：687-94；Tabor等.，1986，Lancet 1：1287-93；Buscaglia等，1996，Prenat Diagn 16：375-76)。来自美国妇产科学院(American College of Obstetricians andGynecologists，ACOG)的指南建议其会员对所有预期母亲检测遗传异常(ACOG Practicebulletin Clinical Management Guidelines for Ob-Gyns，第7期，2007年1月)，这表明可安全进行胎儿遗传状态的特异性诊断的非侵入式技术未满足需求。
几十年来，对非侵入式的替代方式的搜索集中在胎儿的遗传材料分离、鉴定和后续分析上，其通常穿过胎盘屏障进入母体循环。由于1893年关于胎儿细胞检测的开创性报道及后来的对胎儿无细胞DNA和在母血中的检测的报道(参见Purwosunu等，2006，Taiwanese J.Obstet Gynecol 45(1)：10-20，表1)，两种基于分析胎儿细胞或无细胞胎儿遗传材料的有前景的方法获得了极大的关注。
“无细胞”胎儿DNA在母血中是相对丰富的，其组成孕妇血浆中的总的无细胞DNA的5％至10％(Hahn等，2011，Expert Reviews in Molecular Medicine 13：e16)。基于无细胞DNA的产前检测，随着下一代测序技术的出现变得可行，其在2011年首先在美国商业化，且目前至少四种这样的检测已商业化。迄今为止，无细胞DNA检测方法允许进行性别鉴定、非整倍性检测和父本DNA中突变的存在，但不允许进行更精确的遗传分析，诸如基因微缺失或基因微插入的检测(例如参见，Simpson，2013，Fertility and Sterility 99：1124-1134)。此外，已报道出包括假阳性的不准确的检测结果(虽然并不常见)(参见Simpson，2013，Fertility and Sterility99(4)：1124-1134；Dugo等.，2014，J Prenat Med.8(1-2)：31-35)。
与无细胞胎儿DNA或RNA相反，完整的胎儿细胞可提供对于染色体异常检测重要的完整的胎儿遗传材料，及对胎儿的遗传状态更完整的评估(Huang等，2011，J CellBiochem.112：1475-85)。许多重大的挑战阻碍了可靠的胎儿细胞分离方法的发展。分离的主要限制是母血中循环的胎儿有核细胞的数量低，估计其范围为1～2个胎儿细胞/毫升母血(Bianchi等，1997，Am J Hum Genet 61(4)：822-829)至1～2个胎儿细胞/2毫升～6毫升母血(Krabchi等，2001，Clin Genet 60：145-150)，但据报道，该数量在非整倍性妊娠中至多为至多六倍大(Krabchi等，2006，Clin Genet 69：145-154和Bianchi等.，1997，Am J HumGenet 61(4)：822-829)。就此数量而言，血液中胎儿细胞与母体细胞的比估计为1/105～1/109(参见Purwosunu等，2006，Taiwanese J.Obstet Gynecol 45(1)：10-20；Simpson，2013，Fertility and Sterility 99(4)：1124-1134)，而在1毫升母血中，对于每1～6个胎儿细胞，存在大约4.2×109～5.4×109个成人红细胞、1.16×103～8.3×103个中性粒细胞、2×105～9.5×105个单核细胞、1×106～4.8×106个淋巴细胞、1.33×108～3.33×108个血小板、至多4.5×105个嗜酸性粒细胞和至多2×105嗜碱性粒细胞(数字取自Uthman，BloodCells and the CBC，可从web2.iadfw.net/uthman/blood_cell.html获取)。
在母血中的多种胎儿细胞中(滋养层细胞、淋巴细胞、有核红细胞和造血干细胞；参见Bianchi，1999，Br J Haematol 105：574-83)，有核红细胞(NRBC)(也被称为幼红细胞)具有对于可靠的产前检测而言最为所需的特性。胎儿NRBC(fNRBC)具有有限的寿命和增殖能力(因此不能从一个妊娠坚持到另一个妊娠)，其是单核的，具有代表性的胎儿染色体的补体，并始终存在于母血中(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Kavanagh等，2010，J Chromat B 878：1905-1911；Bianchi，1999，Br J Haematol105：574-83；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35；Bianchi和Lo，2010，Genetic Disorders and theFetus：Diagnosis，Prevention and treatment，第6版，第30章，978-1000页(Milunsky和Milunsky编))。胎儿红细胞生成的研究已经鉴定了最初在卵黄囊(原始红细胞生成，产生原始幼红细胞)中发生的和随后在胎儿肝脏和骨髓(产生成熟幼红细胞)的两个不同的过程(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85)。原始幼红细胞和成熟幼红细胞均在母体循环中检测到，其中原始幼红细胞是主要的孕早期细胞类型，所述原始幼红细胞逐步被持续到分娩期的成熟类型所取代(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-235)。
关于母血中胎儿细胞最广泛的研究为多年多中心的NIFTY试验，其被设计来评估通过分离胎儿细胞来诊断胎儿异常的实用性和可行性。参与的四个中心尝试从母血中分离胎儿细胞，并用通过具有染色体-特异性探针的荧光原位杂交(FISH)分析分离的细胞(Bianchi等，2002，Prenat Diagn 22：609-615)。命名为A、B、C和D的四个中心全部使用密度梯度分离作为前期步骤以去除母体细胞，然后使用不同的方法获得胎儿细胞而用于FISH。在中心A处，在密度分离后进行细胞固定，通过使用抗-CD14和抗-CD15抗体的MACS进行阴性选择，使用抗-HbF(胎儿血红蛋白)进行FACS。在中心B处，在密度分离后进行细胞固定并使用FACS同时进行阴性选择和阳性选择，对于阳性选择使用抗-HbF抗体，对于阴性选择使用抗-CD45或抗-HbA(成人血红蛋白)。在中心C处，在密度梯度分离后，通过使用抗-CD14和抗-CD45抗体的MACS进行阴性选择，通过使用抗-CD71抗体进行FACS，并进行细胞固定。在中心D处，在密度分离后进行细胞固定，并通过使用抗-CD71抗体的MACS进行阳性选择。男性胎儿细胞中X和Y染色体的一般检测率仅为病例的41.1％，假阳性率(即，女性胎儿细胞中X和Y染色体的检测)为11.1％。非整倍性的整体检测率为74.4％，其假阳性率估计在0.6％～4.1％的范围内。参见Bianchi等，2002，Prenat Diagn 22：609-615。据说基于MACS的方法比基于FACS的方法提供了更好的恢复和检测(Bianchi和Lo，2010，Genetic Disorders and theFetus：Diagnosis，Prevention and treatment，第30章，978-1000页(Milunsky和Milunsky编))。NIFTY试验的其中一个参与者陈述所述方法“是费力的，缺乏一致的恢复性，并有一个不可接受的无信息率”。Simpson，2013，Fertility and Sterility 99(4)：1124-1134。
不得不使用多种其他方法来分离胎儿细胞，所述方法包括离心、过滤、横向位移、磁导入、凝集素-结合、双向电泳、微操作和激光捕获以及显微解剖。还使用诸如微电子机械系统(MEMS)和自动细胞富集方法等高通量方法(Kavanagh等，2010.J Chromat B 878：1905-11；Kilpatrick等，2004，J Obstet Gynecol 190：1571-81；Seppo等，2008，PrenatDiagn 28：815-21；Talasaz等，2009，PANS 106：3970-75，2009；Kumo等，2010，第十四届化学与生命科学小型化系统国际会议.2010年10月3日-7日，格罗宁根，荷兰；1583-1585页；Cheng等，2011，J Clin Lab Anal 25：1-7；Choolani等，2012，Best Practice&ResearchClinical Obstetrics and Gynaecology 26：655-667)。这些方法也提供了不一致的结果(Simpson，2013，Fertility and Sterility 99(4)：1124-1134)。
因此，仍然存在对允许对胎儿DNA进行下游遗传分析的简单可靠的胎儿细胞分离技术的需求。
3.发明内容
本公开基于分离技术的发展，其允许从其中fNRBC是极少数的混合细胞群体中富集和分离胎儿有核红细胞(fNRBC)。因此，本公开提供了高度富集fNRBC的细胞制备物及产生所述富集的细胞群体的方法。
本公开部分基于通常在液体介质中进行的阳性选择方法的应用，以从诸如母血或母血的富集fNRBC的细胞级分等生物样品中富集(及可选地分离)fNRBC。通常在四周妊娠左右开始的时间段内对母血进行取材。
通常包括一个或多个基于阳性免疫选择的步骤的阳性选择方法，可与一种或多种去除其他细胞类型的其他方法结合使用，所述其他的细胞类型例如为来自生物样品的母体淋巴细胞或红细胞。所述其他方法包括阴性选择和细胞密度分离技术。
通常，阴性选择方法需要一个或多个使用抗体的阴性免疫选择步骤，所述抗体不与fNRBC特异性结合，但与生物样品中存在的一种或多种其他细胞类型结合。
一旦制成了富集fNRBC的细胞制备，所述制备物本身可以用于诊断检测，或可以使用额外的分离技术(例如，微操作)来选择个体fNRBC以用于诊断检测。一个或多个fNRBC可以用于诸如短串联重复序列(“STR”)分析等验证技术，以验证细胞身份为胎儿细胞。
在某些方面中，本公开提供了用于制备fNRBC的方法，其包括对包含fNRBC的生物样品进行阳性选择。阳性选择优选包括阳性免疫选择，及可选地，一种或多种额外的阳性选择标准。阳性免疫选择通常包括下列步骤：(a)在液体介质中用一种或多种阳性免疫选择抗体(例如，一种、二种、三种或更多种的阳性免疫选择抗体)接触生物样品，其中相对于生物样品的一种或多种其他细胞类型，所述阳性免疫选择抗体选择性结合至fNRBC；及(b)选择结合至所述阳性免疫选择抗体的细胞。可纳入前述阳性选择步骤的阳性选择的示例性实施方式在第5.3、6、7.3和7.5节中进行描述。
在某些方面中，至少一种阳性免疫选择抗体结合fNRBC有核前体细胞的表面上存在的抗原，但不结合成人红细胞上存在的CD71或其他表面抗原。在某些实施方式中，阳性免疫选择抗体为4B9或与4B9竞争的抗体，以与fNRBC有核前体细胞表面结合。用于阳性选择的其他标志物可包括血型糖蛋白A(也被称为CD235a)、CD36、CD71、和核染料(例如，Hoechst33342、LDS751、TO-PRO、DC-Ruby、和DAPI)。可以使用多重阳性选择过程，例如，使用MACS进行阳性选择后使用FACS进行阳性选择，其各使用一种、两种、三种或甚至更多种阳性选择(例如，阳性免疫选择)试剂，所述试剂为诸如抗上文鉴定的标志物或核染料的抗体等。
阳性选择可以与阴性选择(通常为阴性免疫选择)结合使用。阴性免疫选择可包括下列步骤：(a)在液体介质中用一种或多种阴性免疫选择抗体接触生物样品，其中，相对于fNRBC，所述阴性免疫选择抗体选择性结合至生物样品中的其他细胞；及(b)选择不与所述阴性免疫选择抗体结合的细胞。可纳入前述阴性选择步骤的阴性选择的示例性实施方式在第5.3、6、7.2和7.5节中进行描述。
如果进行阴性选择，其可在阳性选择之前、之后或与阳性选择同时进行。可以使用一种或多种阴性免疫选择抗体，其优选抗一种或多种造血细胞表面标志物。示例性细胞表面标志物包括：(a)诸如CD3、CD4或CD8等T-淋巴细胞细胞表面标志物；(b)诸如CD19、CD20、或CD32等B-淋巴细胞细胞表面标志物；(c)诸如CD45等泛淋巴细胞标志物；(d)诸如CD56等NK细胞表面标志物；(e)诸如CD11c或CD23等树突细胞表面标志物；及(f)诸如CD14或CD33等巨噬细胞或单核细胞表面标志物。在特定的实施方式中，在一个、两个或更多个的阴性选择步骤中使用两种、三种、四种或甚至更多种阴性免疫选择抗体。
免疫选择步骤可以使用磁性分离，例如，使用包覆抗体的磁珠，或流式细胞术。流式细胞技术可例如通过可以具有不同程度的复杂程度的荧光激活细胞分选器的应用(诸如多色通道、低角度和钝光散射检测通道、阻抗通道等)提供准确分离。因此，本文使用的术语“流式细胞术”涵盖荧光激活细胞分选(FACS)。
为了改善fNRBC的富集，在阳性选择前可使用诸如密度分离等预富集步骤。示例性预富集过程在第5.2和7.1节中进行描述。
一旦制成了富集fNRBC的细胞制备物，所述制备物本身可以用于诊断检测，或可以使用额外的分离技术(例如，微操作、在固体表面捕获细胞)来选择个体fNRBC或fNRBC池以用于诊断检测。在某些实施方式中，额外的分离技术(例如，微操作)可利用用于富集细胞的荧光标签、fNRBC中血红蛋白的存在(通过Soret带滤光器可检测)和fNRBC的形态特征(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35)的优势。微操作的示例性方法在第5.4和7.6节中进行描述。
本公开进一步提供通过本文描述的方法制备或可得的fNRBC制备物，其包括通过本文描述的方法分离的个体fNRBC或fNRBC组。在某些实施方式中，本公开提供了包含fNRBC的通过FACS分选的细胞群体。示例性FACS分选群体在第5.5节中进行描述。
所述fNRBC可用于胎儿诊断检测，例如，用于确定多胎妊娠或胎儿异常的存在。可检测的异常的实例包括13-三体综合症、18-三体综合症、21-三体综合症、唐氏综合症、压力易感性神经病、神经纤维瘤病、阿拉吉欧综合症、软骨发育不全症、亨廷顿氏病、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、异染色性脑白质障碍症、范-瑞克林豪森氏病、结节性硬化症、强直性肌营养不良、囊性纤维化、镰状细胞疾病、泰-萨二氏病、β-地中海贫血、粘多醣贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸尿症、半乳糖血症、半乳糖激酶和半乳糖4-差向异构酶缺乏症、腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、甲基丙二酸尿症、丙酸血症、法伯病、岩藻糖苷贮积症、神经节苷脂贮积症、高歇氏病、I-细胞病、III型粘脂贮积病、尼曼-匹克病、唾液酸沉积症、沃耳曼氏病、脑肝肾综合症、胱氨酸病、凝血因子X缺陷症、共济失调性毛细血管扩张症、布洛姆氏综合症、罗伯特综合症、着色性干皮病、脆性(X)综合症、性染色体非整倍体、克莱恩费尔特综合症、特纳氏综合症、XXX综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、具有线性皮肤缺损的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色体上的睾丸决定因子、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症、莱施-奈恩综合症、安德森-费勃莱氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、(17)(p11.2p11.2)重复综合症、16p11.2缺失、16p11.2重复、线粒体缺陷、(22)(q11.2q11.2)重复综合症、猫眼综合症、猫叫综合症、Wolf-Hirschhorn综合症、Williams-Beuren综合症、Charcot-Marie-Tooth病、染色体重排、染色体缺失、Smith-Magenis综合症、腭心面综合症、迪乔治综合症、1p36缺失、普拉德-威利综合症、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、无脑畸形、神经管缺损、小头畸形、脑积水、肾缺如、Kallmann综合症、肾上腺发育不良、Angelman综合症、肾囊肿、囊性水瘤、胎儿水肿、脐膨出和腹裂、膈疝、十二指肠闭锁、骨骼发育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿症、枫糖尿病、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、肝醣贮积症、肾上腺增生、低磷酸酯酶症、胎盘类固醇硫酸酯酶缺乏症、重症联合免疫缺陷综合症、T-细胞免疫缺陷、埃勒斯-当洛斯综合症、成骨不全症、成人多囊肾疾病、范科尼氏贫血症、大疱性表皮松解症综合症、少汗型外胚层发育不良症、先天性肾变病(芬兰型)和多发性内分泌肿瘤。
诊断分析可以是核酸(例如，DNA或RNA)分析、蛋白质(例如，基于抗体的)分析、或组织学分析、或其组合。DNA分析的实例包括FISH、PCR和DNA测序分析。RNA分析的实例包括RT-PCR分析和FISH分析。为了方便得到核酸，在进行诊断检测前，可以对fNRBC进行裂解或透化。可以在微阵列上进行DNA、RNA和蛋白质分析。用于分子诊断检测的示例性技术在第5.7节中进行描述。
可在诊断分析前、伴随诊断分析或在诊断分析后通过分子验证技术来验证诊断的细胞或细胞群体的身份为胎儿细胞。示例性验证技术在第5.6节中进行描述。
在给定的妊娠过程中，本文描述的方法可以进行一次或多次，例如，用来验证特定诊断或检测妊娠中的变化或胎儿的状态。
对于实践本公开的方法有用的试剂盒在第5.8节中进行描述。
4.附图描述
图1：图1显示了fNRBC分离和下游分析的示例性工作流程。对于fNRBC的分离，优选的工作流程包括：在细胞密度梯度上从母血中分离单核细胞(如第7.1节所述)，其使用如7.3节所述(采用或不采用阴性选择，例如，可选地，7.2节中的CD45耗竭步骤)的阳性选择(例如，使用磁性激活细胞分选富集4B9阳性细胞)；并分选CD235+、核染色的4B9阳性细胞。在fNRBC富集后，例如根据本文描述的方法，基于如本申请中描述的用于下游细胞遗传学和/或分子分析的形态学或染色，可以选择个体细胞。工作流程可经调整以利用第7节概述的任何组合方案。
图2：图2显示了图1概述的工作流程的具体实施方式。
图3A-3D：图3A-3D显示了使用本文公开的方法以从母血中分离fNRBC的示例性FACS数据集。图3A显示了使用细胞光散射性质来区分细胞类型的FSC(X轴)和BSC(Y轴)的相关测量。图3B是淋巴细胞和单核细胞的亚选通。X轴表示CD235a染色，Y轴表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和CD235a PE(血型糖蛋白-a)阳性的事件。图3C是CD235a+区域的亚选通。X轴表示AF 488染色，Y轴表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和4B9AF 488阳性的事件。可以分选所述细胞以用于下游分析，例如将其直接放入用于核酸扩增的PCR管中或放在用于微操作的载玻片上。图3D显示了图3A-3C所示的在不同选通水平上进行选择的细胞的示例性分布。
图4：使用X和Y染色体杂交探针通过荧光原位杂交(FISH)并用DAPI进行复染以分析fNRBC。
图5：从具有男性胎儿的女性妊娠者的外周血中分离细胞。细胞与X和Y探针杂交并用核染料DAPI进行复染。
图6：从具有男性胎儿的女性妊娠者的外周血中分离细胞。细胞与X和Y探针杂交并用核染料DAPI进行复染。
图7A-7D：图7A显示了使用细胞的光散射性质以区分细胞类型的FSC(X轴)和BSC(Y轴)的相关测量。图7B是是淋巴细胞和单核细胞的亚选通。X轴表示CD235a染色，Y轴表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和CD235a PE(血型糖蛋白-a)阳性的事件。图7C是CD235a+区域的亚选通。X轴表示AF 488染色，Y轴表示DC-Ruby染色。右上象限包含核DC-Ruby和4B9AF 488阳性的事件。图7D是对于每个不同选通水平的统计。
图8A-8B：图8A显示了使用细胞的光散射性质以区分通过荧光激活细胞分选术(FACS)分选的4B9阴性细胞级分的细胞类型的FSC(X轴)和BSC(Y轴)的相关测量。图8B显示了来自4B9阴性细胞级分的淋巴细胞的FACS亚选通。X轴表示AF 488染色，Y轴表示DC-Ruby染色。
图9A-9B：图8A显示了使用细胞的光散射性质以区分通过荧光激活细胞分选术(FACS)分选的4B9阳性细胞级分的细胞类型的FSC(X轴)和BSC(Y轴)的相关测量。图8B显示了来自4B9阳性细胞级分的淋巴细胞的FACS亚选通。X轴表示AF 488染色，Y轴表示DC-Ruby染色。
图10A-10C：来自男性血液中胎儿肝细胞的加标混合物的STR产物的毛细管电泳。图10A显示了纯化的男性基因组DNA的FAM分析。图10B显示了来自女性胎儿肝细胞的纯化DNA的FAM分析。图10C显示了富集后，FACS分选4B9阳性级分的FAM分析。
图11A-11C：来自男性血液中胎儿肝细胞的加标混合物的STR产物的毛细管电泳。图11A显示了纯化的男性基因组DNA的VIC分析。图11B显示了来自女性胎儿肝细胞的纯化DNA的VIC分析。图11C显示了富集后，FACS分选4B9阳性级分的VIC分析。
图12A-12C：来自男性血液中胎儿肝细胞的加标混合物的STR产物的毛细管电泳。图12A显示了纯化的男性基因组DNA的NED分析。图12B显示了来自女性胎儿肝细胞的纯化DNA的NED分析。图12C显示了富集后，FACS分选4B9阳性级分的NED分析。
图13A-13C：来自男性血液中胎儿肝细胞的加标混合物的STR产物的毛细管电泳。图13A显示了纯化的男性基因组DNA的PET分析。图13B显示了来自女性胎儿肝细胞的纯化DNA的PET分析。图13C显示了富集后，FACS分选4B9阳性级分的PET分析。
图14：来自男性血液中胎儿肝细胞的加标混合物的4B9阳性级分的FAM STR产物的分离的毛细管电泳：面板显示了D10S1248标志物的两种主要的贡献等位基因(A，C)及两种次要等位基因(B，D)；D13S317标志物的两种主要的贡献等位基因(F，G)及两种次要等位基因(E)。
图15A-15D：来自从具有男性胎儿的7周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图15A和图15B各显示样品细胞的FAM分析。图15C显示了母本基因组DNA的FAM分析。图15D显示了父本基因组DNA的FAM分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。
图16A-16D：来自从具有男性胎儿的7周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图16A和图16B各显示样品细胞的VIC分析。图16C显示了母本基因组DNA的VIC分析。图16D显示了父本基因组DNA的VIC分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。
图17A-17D：来自从具有男性胎儿的7周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图17A和图17B各显示样品细胞的NED分析。图17C显示了母本基因组DNA的NED分析。图17D显示了父本基因组DNA的NED分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。通过更短的短线形成的圈注明仅在父本谱中发现的等位基因。
图18A-18D：来自从具有男性胎儿的7周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图18A和图18B各显示样品细胞的PET分析。图18C显示了母本基因组DNA的PET分析。图18D显示了父本基因组DNA的PET分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。通过更短的短线形成的圈注明仅在父本谱中发现的等位基因。
图19A-19C：来自从具有男性胎儿的9周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图19A显示了母本基因组DNA的FAM分析。图19B显示了样品细胞的FAM分析。图19C显示了父本基因组DNA的FAM分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。
图20A-20C：来自从具有男性胎儿的9周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图20A显示了母本基因组DNA的VIC分析。图20B显示了样品细胞的VIC分析。图20C显示了父本基因组DNA的VIC分析。
图21A-21C：来自从具有男性胎儿的9周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图21A显示了母本基因组DNA的NED分析。图21B显示了样品细胞的NED分析。图21C显示了父本基因组DNA的NED分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。通过更短的短线形成的圈注明仅在父本谱中发现的等位基因。
图22A-22C：来自从具有男性胎儿的9周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图22A显示了母本基因组DNA的PET分析。图22B显示了样品细胞的PET分析。图22C显示了父本基因组DNA的PET分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。通过更短的短线形成的圈注明仅在父本谱中发现的等位基因。
图23A-23D：来自从具有男性胎儿的12周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图23A显示了母本基因组DNA的FAM分析。图23B和图23C各显示了样品细胞的FAM分析。图23D显示了父本基因组DNA的FAM分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。通过更短的短线形成的圈注明仅在父本谱中发现的等位基因。
图24A-24D：来自从具有男性胎儿的12周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图24A显示了母本基因组DNA的VIC分析。图24B和图24C各显示了样品细胞的VIC分析。图24D显示了父本基因组DNA的VIC分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。
图25A-25D：来自从具有男性胎儿的12周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图25A显示了母本基因组DNA的NED分析。图25B和图25C各显示了样品细胞的NED分析。图25D显示了父本基因组DNA的NED分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。
图26A-26D：来自从具有男性胎儿的12周妊娠女性的外周血分离的4B9细胞的STR产物的毛细管电泳。图26A显示了母本基因组DNA的PET分析。图26B和图26C各显示了样品细胞的PET分析。图26D显示了父本基因组DNA的PET分析。通过交替的短线和点形成的圈注明在母本和父本谱中均发现的等位基因。通过更短的短线形成的圈注明仅在父本谱中发现的等位基因。
5.详细内容
5.1.定义
“抗体”是通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区的抗原识别位点能够特异性结合至诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等靶标的免疫球蛋白分子。本文使用的术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其任意抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链、包含抗体的融合蛋白、和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构成，其例如包括但不限于，单链(scFv)和域抗体(例如，人类、骆驼科、或鲨鱼域抗体)、大抗体、小抗体、胞内抗体、双价抗体、三价抗体、四价抗体、vNAR和双-scFv(例如参见，Hollinger和Hudson，2005，Nature Biotech 23：1126-1136)。抗体包括任何类别的抗体，诸如IgG、IgA、或IgM(或其亚类)，且不要求所述抗体必须为任何特定的类别。取决于其重链恒定域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的类别。有5种主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些某些免疫球蛋白种类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。“抗体”还包括已经过修饰来便于分选和检测的每种前述抗体/免疫球蛋白类型的任一种，例如如5.3.5节中所描述。
本文使用的抗体的“抗原结合部分”，是指保留与给定抗原(例如，靶标X)特异性结合能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段展现。结合片段的实例包括在术语“抗原结合部分”内。
“生物样品”是其中存在或怀疑存在fNRBC的样品。在具体实施方式中，所述生物样品是母血或其富集fNRBC的级分(例如，来自母本非有核红细胞已耗竭的级分)。母血通常在4周、5周、6周、8周、10周、12周、16周、20周、24周、30周或38周的妊娠时取材，或在前述实施方式的任意两个之间的时间段内进行一次或多次取材，例如，4周～38周、4周～10周、4周～16周、4周～24周、5周～16周、5周～24周、5周～38周、6周～12周、6周～16周、6周～30周、6周～20周、8周～38周等等。对于富集fNRBC，进行母血取材的最优时间段为约6周～约20周的妊娠。在此时间段内，原始胎儿红细胞和成熟胎儿红细胞均存在于母体循环中，从而将通过本公开的方法富集的fNRBC的量最大化。母血可来自单胎或多胎妊娠(例如，双胞胎、三胞胎、四胞胎)且可包括单性别(男性或女性)或两种性别的fNRBC。生物样品的其他类型为血浆、来自绒毛膜绒毛采样(CVS)活检的细胞、或来自脐带血液经皮采样的细胞，或其级分。本文使用的“生物样品”可包括在富集或分离fNRBC中使用的试剂，诸如缓冲液、抗体和核染料。
本文使用的关于抗体的“竞争”指第一抗体或其抗原结合部分，以与第二抗体或抗原结合部分的结合足够类似的方式结合至表位，这样与不存在第二抗体时的第一抗体的结合相比，在存在第二抗体时，第一抗体与其同源表位的结合结果明显减少。作为另一种选择，在存在第一抗体时，第二抗体与其表位的结合也可以是明显减少的，但并非必须如此。即在第二抗体不抑制第一抗体与其相应的表位结合的情况下，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合。然而，在每个抗体显著抑制其他抗体与其同源表位或配体的结合时，无论是以相同、更大还是更小的程度，抗体彼此之间对其相应的表位的结合被称为“交叉竞争”。竞争抗体和交叉竞争抗体均涵盖在本公开中。
“阴性选择”是指从混合细胞群体中耗竭除了靶细胞以外的细胞。阴性选择可基于靶细胞中不存在的(或在靶细胞中靶细胞检测不到的)标志物。阴性选择还可基于其他标准，例如，大小、形态学、或其他物理性质。
“阴性免疫选择”是指使用抗体耗竭细胞，例如，与除了感兴趣的靶细胞以外的一种或多种细胞类型选择性结合但不与靶细胞特异性结合的抗体。
“阴性免疫选择抗体”是可以在阴性免疫选择中使用的抗体，例如，结合至存在于除了靶细胞以外的一种或多种类型的细胞上或细胞中而在靶细胞上不存在的标志物的抗体。所述抗体与细胞表面标志物或内部标志物结合，但标志物优选为表面标志物以避免对固定的需求。
“阳性选择”是指从混合细胞群体中选择包含感兴趣的靶细胞的细胞(例如，用于富集和/或分离目的)。阳性选择可以基于靶细胞上或靶细胞内存在的标志物。在某些实施方式中，所述标志物在待分离或富集靶细胞(例如，当靶细胞是fNRBC时，母血或母血级分)的群体(例如，生物样品)中在一种或多种类型的细胞(除了靶细胞)中不存在(或在其中或其上检测不到)。在其它实施方式中，所述标志物在分离或富集靶细胞的群体中在除了感兴趣的靶细胞以外的任何类型细胞的中不存在(或在其中或其上检测不到)。阳性选择还可基于其他标准，例如，大小、形态学、或其他物理性质。
“阳性免疫选择”是指使用抗体选择细胞，例如，结合至感兴趣的靶细胞上或靶细胞中存在的标志物因而对于阳性选择有用的抗体。
“阳性免疫选择抗体”是可以在阳性免疫选择中使用的抗体，例如，结合至靶细胞上或靶细胞中存在的标志物的抗体。在某些实施方式中，所述抗体与靶细胞选择性结合，但不与其中存在靶细胞的细胞群体中存在的一种或多种其他细胞类型特异性结合。抗体可与细胞表面标志物或内部标志物结合，但所述标志物优选为表面标志物以避免对固定的需要。
对特定细胞的“选择性结合”是指抗体与混合细胞群体(例如，生物样品)中的至少一种细胞类型之中或其上存在但在所述群体中的至少一种其他类型的细胞中不存在(或在其中或其上检测不到)的标志物的特定的或优选的结合。例如，如果在含有细胞类型A、B、C、D、和E的混合细胞群体中，抗体仅与细胞类型A或细胞类型A和E特异性结合，抗体分别被称为与细胞类型A选择性结合或与细胞类型A和E选择性结合。
与抗体和其他物质的结合相比，如果抗体与靶标的结合具有更强的亲和力、亲合性、更容易结合、和/或结合时间更长，则抗体与该靶标“特异性结合”或“优先结合”。例如，与fNRBC上存在的标志物特异性或优先结合的抗体是如下的抗体：该抗体与上述标志物的结合相比该抗体和其它标志物的结合具有更强的亲和力、亲合性、更容易结合、和/或结合时间更长。特异性结合或优先结合不是必须要求(但其可以包括)排他性结合。通常(但不是必须)，提及“结合”是指优先结合(preferential binding)。
5.2.预富集
为了改善fNRBC的富集，可以在阳性和优化选择步骤前进行预富集步骤。下面描述示例性预富集过程。
密度分离是根据细胞大小、形状和密度进行细胞分离的技术。通过不同密度的分层溶液(致密端在管底部)在离心管中产生密度梯度。即使以相对低的离心速度，细胞通常在蔗糖或其他惰性碳水化合物的浅层梯度上分离。
不连续密度梯度离心通常用于从粒细胞和红细胞中分离外周血单核细胞。例如在被称为Ficoll密度分离中，全血分层在之上，然后离心。红细胞、粒细胞和部分单核细胞沉降为细胞团块，而其余的单核细胞沉降至Ficoll血浆界面。使用Ficoll的示例性密度分离过程在7.1节中进行描述。
作为另一种选择，可以聚集成人红细胞而将其从生物样品中耗竭，从而能够富集含fNRBC的单核细胞级分。如果允许抗凝血液在管中沉淀，可以在1.5小时或更长之后除去白细胞之上的红细胞沉降物，及富含白细胞的血浆层。由于红细胞结块的自发倾向，红细胞沉降比白细胞更快。通过添加聚集剂可以加速红细胞的沉降。示例性聚集剂为诸如多糖和合成聚合物等非离子型聚合物。在某些实施方式中，聚合物为分子量为60,000至500,000的葡聚糖、分子量为360,000的聚乙烯吡咯烷酮和分子量为20,000的聚氧乙烯(POE)。可以将聚集剂添加到含有生物样品的缓冲液中。
5.3.fNRBC的富集
本公开的方法限定了一种或多种用于富集和/或分离fNRBC的阳性选择过程，通常限定了至少一种使用与fNRBC结合的抗体的阳性免疫选择步骤。阳性免疫选择可以与阴性选择(例如，阴性免疫选择)结合使用以从生物样品中耗竭除fNRBC外的一种或多种细胞类型，例如，母本淋巴细胞。
为了实施阳性免疫选择，将阳性免疫选择抗体添加到生物样品中。通过进行检测分离和分析可以经验性地确定结合NRBC所需的抗体的量。细胞与抗体温育足够形成复合物的时间段，通常至少约5分钟，更通常至少约10分钟，且通常不大于1小时，更通常不大于约30分钟。
可以将生物样品与本文描述的另外的阳性选择和/或阴性选择试剂进行额外的温育，这可以同时进行或依次进行。
根据特定的抗体制备而分离标记的细胞。荧光染料标记的抗体对于FACS分离、用于免疫磁性选择、特别是高梯度磁性选择(HGMS)的磁性颗粒等是有用的。示例性磁性分离设备描述在WO 90/07380、PCT/US96/00953和EP 438,520中。
可以使用诸如超滤或微流体分离等其他自动化方法进行选择和/或阴性选择。
5.3.1.阳性选择
本公开的阳性选择试剂可以是用来将生物样品中的fNRBC与所述样品中至少一种其他类型的细胞进行区分的任何试剂。
用于fNRBC富集的优选方法是在液体介质中进行的阳性免疫选择方法的应用。通常，阳性免疫选择方法使用阳性免疫选择抗体。在某些方面中，在阳性免疫选择过程中使用多个阳性免疫选择抗体。
因此，在某些方面中，本公开提供了一种fNRBC的制备方法，其包括：使包含fNRBC的生物样品进行阳性免疫选择，所述阳性免疫选择包括以下步骤：(a)在液体介质中用阳性免疫选择抗体接触生物样品，其中相对于所述生物样品中的一种或多种其他细胞类型，所述阳性免疫选择抗体与fNRBC选择性结合；及(b)选择与所述阳性免疫选择抗体结合的细胞。
5.3.2.阳性选择标志物和抗体
fNRBC的阳性选择标志物包括血型糖蛋白A(也被称为CD235a)、“i”抗原、CD36、CD71及核标志物。当下游分析允许细胞固定(例如，FISH)时，胎儿血红蛋白可以是阳性选择标志物。
表达标志物血型糖蛋白A、“i”抗原、CD36、CD71和胎儿血红蛋白的细胞可以使用针对所述标志物的抗体进行选择(例如，分选或富集)。
与母本红细胞相反，fNRBC是有核的并可以使用诸如Hoechst 33342、LDS751、TO-PRO、DC-Ruby及DAPI等核染料进行选择。
在某些实施方式中，使用单克隆抗体4B9选择fNRBC。产生抗体4B9的杂交瘤保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zelkulturen GmbH中，其检索号为DSMACC 2666fNRBCs(参见Hollmann等的美国专利7,858,757 B2和8,563,312 B2)。在其他实施方式中，使用和4B9竞争与fNRBC表面的结合的抗体来选择fNRBC。例如，单克隆抗体4B8与4B9竞争结合至fNRBC(参见Hollmann等的美国专利7,858,757 B2和8,563,312 B2)。
可以使用Hollmann等的方法产生结合fNRBC的其他抗体。其与4B9竞争结合fNRBC的能力使用竞争检测来测试。在竞争检测的一个实例中，使用4B9抗体分离其靶抗原(例如，来自胎儿肝细胞)，该靶抗原附着到固体表面上(例如，微孔板)。将在缓冲液中连续稀释的亚饱和量的生物素化的和未标记的4B9或候选竞争抗体(“测试”抗体)的混合物添加至孔和板中，并轻轻振动温育1小时。冲洗板，将在ELISA缓冲液中稀释的HRP-结合的抗生蛋白链菌素添加至各孔和板中，温育1小时。冲洗板，通过添加底物(例如，TMB，Biofx LaboratoriesInc.，Owings Mills，Md.)来检测结合的抗体。通过加入终止缓冲液(例如，Bio FX终止试剂，Biofx Laboratories Inc.，Owings Mills，Md.)来终止反应，并使用微孔板读板器(例如，VERSAmax，Molecular Devices，Sunnyvale，Calif.)在650nm处测量吸光度。作为另一种选择，可以使用全fNRBC来代替分离抗原。在一种方法中，将1微克/毫升的结合第一荧光染料(例如，FITC)的4B9添加至含有1×105个胎儿肝细胞的微量滴定孔中。结合第二荧光染料(例如，藻红蛋白)的检测抗体以从10微克/毫升到0.001微克/毫升降低(5个1:2的连续稀释液)的浓度滴定。测量两种抗体的平均荧光强度。当检测抗体以与对照抗体相同浓度或更低的浓度添加时，如果对照抗体的MFI减少了至少50％，则认为检测抗体与4B9竞争。在某些实施方式中，MFI减少至少60％、至少70％或至少80％。竞争检测的其他形式是本领域已知的，且可以采用。
5.3.3.阴性选择
通常，本公开的阴性选择方法使用一种或多种不识别fNRBC的试剂。在某些方面中，所述试剂是阴性免疫选择抗体。
因此，阴性免疫选择可包括以下步骤：(a)在液体介质中用阴性免疫选择抗体接触生物样品，其中，相对于fNRBC，阴性免疫选择抗体选择性结合生物样品中的其他细胞；及(b)选择不与所述阴性免疫选择抗体结合的细胞。如果进行阴性选择，其可在阳性免疫选择之前、之后进行、或与阳性免疫选择同时进行。
5.3.4.阴性选择标志物和抗体
阴性选择试剂可以是用于在生物样品中将除fNRBC外的细胞与fNRBC分离的任何试剂。
所述试剂优选为与存在于母体细胞(即成熟细胞)的细胞表面上但在fNRBC细胞表面上不存在的抗原结合的抗体。在另一个实施方式中，阴性免疫选择抗体包括抗-CD45抗体。可以使用一种或多种阴性免疫选择抗体，优选为抗一种或多种造血细胞表面标志物的抗体。示例性细胞表面标志物包括：(a)诸如CD3、CD4或CD8等T-淋巴细胞细胞表面标志物；(b)诸如CD19、CD20、或CD32等B-淋巴细胞细胞表面标志物；(c)诸如CD45等泛淋巴细胞标志物；(d)诸如CD56等NK细胞表面标志物；(e)诸如CD11c或CD23等树突细胞表面标志物；及(f)诸如CD14或CD33等巨噬细胞或单核细胞细胞表面标志物。在特定的实施方式中，使用至少两种、三种、四种、或五种阴性免疫选择抗体。
5.3.5.抗体标记
方便而言，用于本公开的阳性和阴性选择过程的抗体和核染料可以是经修饰的，以允许从其他细胞类型中选择和分离fNRBC。修饰的抗体可以包括允许分选和检测的任何分子或物质，例如磁珠或荧光染料。在特定的实施方式中，抗体与比色分子、荧光部分、化学发光体部分、抗原、酶、可检测的珠(诸如磁性珠或电子致密的(例如，金)珠)或结合其他分子(例如，生物素或抗生蛋白链菌素)的分子结合。
荧光染料可以与荧光激活细胞分选器一起使用。多色分析可以与FACS一同使用，或以免疫磁性分离和流式细胞术的组合使用。多色分析对于基于多种表面抗原的细胞分离是重要的。可在多色分析中使用的荧光染料包括藻胆蛋白，例如，藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素及德克萨斯红。阴性代称表明染色水平处于或低于同种型匹配的阴性对照的亮度。暗淡(dim)代称表明染色水平在阴性染色的水平附近，但也可能比同种型匹配的对照更亮。优选地，本公开的阳性免疫选择抗体相对于fNRBC引起“明亮”代称，而相对于在存在fNRBC的生物样品(诸如母血)中可以存在的一种或多种其他细胞类型引起“阴性”或“暗淡”代称。优选地，本公开的阴性免疫选择抗体相对于在存在fNRBC的生物样品(诸如母血)中可以存在的一种或多种其他细胞类型引起“阴性”或“暗淡”代称。
在一个实施方式中，免疫选择抗体直接或间接缀合至磁性试剂，诸如超顺磁性微粒(微粒)。使用如本领域已知的多种化学连接基团获得与磁性颗粒的直接缀合。通过侧链氨基或巯基和多官能交联剂，抗体可以连接到微颗粒。用于连接实体的大量的多官能化合物是可利用的。优选的连接基团为3-(2-二硫代吡啶)丙酸N-羟基丁二酰亚胺酯(SPDP)或4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯(SMCC)，其具有在抗体上的反应性巯基和在磁性颗粒上的反应性氨基。
作为另一种选择，免疫选择抗体不直接连接到磁性颗粒上。抗体直接缀合到半抗原上，半抗原特异性的第二阶段抗体缀合到所述颗粒上。适合的半抗原包括地高辛、异羟基洋地黄毒苷、FITC、二硝基苯基、硝基苯基、抗生物素蛋白、生物素等。半抗原与蛋白质的缀合方法为本领域已知的，且用于所述结合的试剂盒可商购。
荧光标签可以包括罗丹明、镧系磷光体(lanthanide phosphor)、荧光素及其衍生物、荧光染料、GFP(GFP代表“绿色荧光蛋白”)、丹酰、伞形花内酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛及荧光胺。
酶标签可以包括辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶及过氧化物酶。
化学发光标签或化学发光体，诸如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷。
其他可检测部分包括诸如生物素、洋地黄毒苷或5-溴脱氧尿苷等分子。
在某些实施方式中，用于选择或检测免疫选择抗体不直接进行修饰，但用作一抗。可以使用例如通过附着到磁珠或荧光染料上修饰的二抗来选择或检测与一抗结合的细胞。
5.3.6.选择技术
免疫选择步骤可以使用磁性分离(例如，使用抗体涂覆的磁珠)，或流式细胞术。通过例如荧光激活细胞分选器的应用，流式细胞技术可以提供准确分离，其可具有不同的复杂程度，诸如多色通道、低角度和钝光散射检测通道、阻抗通道等。
在各个方面中，磁性分离(例如，MACS)和流式细胞术(例如，FACS)均可用于富集fRNBC。MACS和FACS中的每一种可用于阴性选择和/或阳性选择。在某些实施方式中，在使用FACS的阴性选择和/或阳性选择之前，进行使用MACS的阳性和/或阴性选择。因此，本公开提供富集fNRBC的方法，其包括以下的任意组合：(A)使用MACS的阴性选择，(B)使用MACS的阳性选择，(C)使用FACS的阴性选择；及(D)使用FACS的阳性选择。实施方式的示例性组合为：(1)A然后B然后D；(2)A然后D；(3)A然后B然后同时C+D；(4)A然后同时C+D；(5)B然后D；及(6)B然后同时C+D。前述选择步骤中的每一个可以使用一种、两种、三种或更多种试剂，例如，抗体和在阳性选择的情况下的核染料。
方便而言，抗体与标签缀合，例如，磁珠和荧光染料，以使fNRBC容易从其他细胞类型中分离。荧光染料可以与荧光激活细胞分选器一起使用。多色分析可以与FACS一起采用或者在免疫磁性分离和流式细胞术的组合中使用。多色分析对于基于多种表面抗原的细胞分离是重要的。在多色分析中可使用的荧光染料包括藻胆蛋白，例如，藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素及德克萨斯红。阴性代称表明染色水平处于或低于同种型匹配的阴性对照的亮度。暗淡(dim)代称表明染色水平在阴性染料的水平附近，但也可能比同种型匹配的对照更亮。优选地，本公开的阳性免疫选择抗体相对于fNRBC引起“明亮”代称，而相对于在存在fNRBC的生物样品(诸如母血)中可以存在的一种或多种其他细胞类型引起“阴性”或“暗淡”代称。优选地，本公开的阴性免疫选择抗体相对于在存在fNRBC的生物样品(诸如母血)中可以存在的一种或多种其他细胞类型引起“阴性”或“暗淡”代称。
在一个实施方式中，免疫选择抗体直接或间接缀合磁性试剂，诸如超顺磁性微粒(微粒)。使用如本领域已知的多种化学连接基团获得与磁性颗粒的直接缀合。通过侧链氨基或巯基和多官能交联剂，抗体可以连接到微颗粒。用于连接实体的大量的多官能化合物是可利用的。优选的连接基团为3-(2-二硫代吡啶)丙酸N-羟基丁二酰亚胺酯(SPDP)或4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸N-羟基丁二酰亚胺酯(SMCC)，其具有在抗体上的反应性巯基和在磁性颗粒上的反应性氨基。
作为另一种选择，免疫选择抗体不直接连接到磁性颗粒上。抗体直接缀合到半抗原上，而半抗原特异性的第二阶段抗体缀合到所述颗粒上。适合的半抗原包括地高辛、异羟基洋地黄毒苷、FITC、二硝基苯基、硝基苯基、抗生物素蛋白、生物素等。半抗原与蛋白质的缀合方法为本领域已知的，且用于所述缀合的试剂盒可商购。
为了实施阳性免疫选择方法，将阳性免疫选择抗体添加到生物样品中。通过进行检测分离和分析可以经验性地确定结合NRBC所需的抗体的量。细胞和抗体温育足够形成复合物的时间段，通常至少约5分钟，更通常至少约10分钟，且通常不大于1小时，更通常不大于约30分钟。
生物样品可能额外地与如本文描述的额外的阳性和/或阴性免疫选择抗体进行温育。根据特定的抗体制备分离标记的细胞。荧光染料标记的抗体对于FACS分离、用于免疫磁性选择、特别是高梯度磁性选择(HGMS)的磁性颗粒等是有用的。示例性磁性分离设备描述在WO 90/07380、PCT/US96/00953和EP 438,520中。
可以使用诸如超滤或微流体分离等其他自动化方法进行阳性免疫选择和/或阴性免疫选择。
本公开的方法优选以在液相中的一个或多个阳性免疫选择步骤和具有可溶形式(即，不固定在固体表面)的一种或多种阳性免疫选择抗体时进行。本公开的方法可以适用于包括一个或多个其中阳性和/或免疫选择抗体结合至固体表面的步骤。用于细胞捕获的固体表面上固定的4B9例如为2011年11月14日提交的美国申请13/295,532和2013年5月16日公开的US 2013/0122492中所描述，其内容以其整体作为参考并入本文。
5.4.下游分离技术
阳性选择(及可选的阴性选择)之后，可以通过在固体表面上捕获(例如，用诸如4B9等阳性免疫选择抗体或二抗来捕获阳性免疫选择抗体结合的细胞)或诸如微操作等物理技术而分离fNRBC。
附着到阳性免疫选择抗体上的可检测部分可以用于鉴定和分离胎儿NRBC。微操作可以在显微镜下进行或通过其他视觉增强或辅助进行。可以通过自动化过程或通过使用手动微操作设备进行微操作。例如，微操作可以选择或分离单个fNRBC或多个fNRBC。例如，通过微操作可以分离1个、5个、10个或20个细胞的组，并放置在1个、5个、10个或20个细胞的独立的样品管内。在某些实施方式中，通过微操作分离1组、2组、3组、4组或5组的1个～20个细胞(例如，1个～5个细胞、1个～10个细胞、5个～20个细胞、或5个～10个细胞)。
在某些实施方式中，额外的分离技术(例如，微操作)可利用用于富集细胞的荧光标签、fNRBC中血红蛋白的存在(通过Soret带通滤光器可检测)和fNRBC形态特征(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro9：227-35)。
5.5.fNRBC群体
本公开进一步提供通过本文描述的方法制备或可得的fNRBC制备。示例性制备包括包含fNRBC的细胞群体。
在某些实施方式中，通过如第6节所描述的任意工作流程从母血(例如，约4周～约38周的妊娠之间或约6周～约20周的妊娠之间提取的母血)中获得或可得的细胞群体。在某些实施方式中，对于阳性和/或阴性富集，工作流程需要密度梯度分离和流式细胞术(例如，FACS)，具有或不具有干涉MACS步骤。
在某些方面中，所述群体包含大约10个、25个、50个、100个、200个、300个、500个、或1,000个细胞或FACS“事件”，或者包含上述值的任何一对之间范围内的细胞数或FACS“事件”的群体，例如，大约25个～200个、大约50个～500个、大约10个～300个、大约50个～1,000个细胞或FACS“事件”，等等。优选至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％的细胞是fNRBC，或者至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％或至少20％FACS“事件”对应fNRBC。在某些实施方式中，群体中的fNRBC或对应fNRBC的FACS“事件”的比例在上述值的任意两个的范围内，例如，2％～20％、5％～10％、5％～20％、3％～15％等等。
fNRBC可以是原始fNRBC、成熟的fNRBC或两者的混合物。在某些实施方式中，原始和成熟fNRBC的比例是在约6周～约20周妊娠的母血中发现的比例。fNRBC可以结合了抗体，例如，本文描述的一种或多种阳性免疫选择抗体，或者无抗体。例如可以通过从细胞中去除阳性免疫选择抗体制备无抗体的fNRBC。
当从母血样品中制备fNRBC时，群体中剩余的细胞通常是一种或多种妊娠过程中在母血中存在的细胞类型。母体细胞可以与抗体结合，例如，一种或多种本文描述的阴性免疫选择抗体，或甚至与一种或多种阳性免疫选择抗体结合，或者无抗体。例如可以通过从细胞中去除结合的抗体而制备无抗体的母体细胞。
5.6.fNRBC的验证
可以采用涉及例如使用短串联重复序列(STR)分析、限制性片段长度多态性(RFLP)分析或单核苷酸多态性(SNP)分析来产生遗传谱的遗传指纹分析方法验证通过本文描述的方法分离的fNRBC为胎儿细胞。通过比较分离的细胞产生的谱与母体细胞(和可选的父本细胞)产生的谱，可以验证所分离的细胞为胎儿细胞的身份。用于产生遗传谱的适合的试剂盒可商购。例如，来自Promega的Fusion STR试剂盒及来自Affymetrix的全基因组人类SNP阵列6.0可以分别用于产生STR和SNP谱，其可以用来验证fNRBC的身份。在某些实施方式中，全基因组扩增(WGA)用于增加分析可利用的遗传材料的量。
5.7.下游分析
所述制备可以用于胎儿诊断检测，例如，用于测定多胎妊娠或胎儿异常的存在。可以用于检测的异常的实例包括13-三体综合症、18-三体综合症、21-三体综合症、唐氏综合症、压力易感性神经病、神经纤维瘤病、阿拉吉欧综合症、软骨发育不全症、亨廷顿氏病、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、异染色性脑白质障碍症、范-瑞克林豪森氏病、结节性硬化症、强直性肌营养不良、囊性纤维化、镰状细胞疾病、泰-萨二氏病、β-地中海贫血、粘多醣贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸尿症、半乳糖血症、半乳糖激酶和半乳糖4-差向异构酶缺乏症，腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、甲基丙二酸尿症、丙酸血症、法伯病、岩藻糖苷贮积症、神经节苷脂贮积症、高歇氏病、I-细胞病、III型粘脂贮积病、尼曼-匹克病、唾液酸沉积症、沃耳曼氏病、脑肝肾综合症、胱氨酸病、凝血因子X缺陷症、共济失调性毛细血管扩张症、布洛姆氏综合症、罗伯特综合症、着色性干皮病、脆性(X)综合症、性染色体非整倍体、克莱恩费尔特综合症、特纳氏综合症、XXX综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、具有线性皮肤缺损的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色体上的睾丸决定因子、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症、莱施-奈恩综合症、安德森-费勃莱氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、(17)(p11.2p11.2)重复综合症、16p11.2缺失、16p11.2重复，线粒体缺陷、(22)(q11.2q11.2)重复综合症、猫眼综合症、猫叫综合症、Wolf-Hirschhorn综合症、Williams-Beuren综合症、Charcot-Marie-Tooth病、染色体重排、染色体缺失、Smith-Magenis综合症、腭心面综合症、迪乔治综合症、1p36缺失、普拉德-威利综合症、精子缺乏(因子a)，精子缺乏(因子b)，精子缺乏(因子c)，脊柱裂、无脑畸形、神经管缺损、小头畸形、脑积水、肾缺如、Kallmann综合症、肾上腺发育不良、Angelman综合症、肾囊肿、囊性水瘤、胎儿水肿、脐膨出和腹裂、膈疝、十二指肠闭锁、骨骼发育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿症、枫糖尿病、3-甲基巴豆酰辅酶A，羧化酶缺乏症，肝醣贮积症、肾上腺增生、低磷酸酯酶症、胎盘类固醇硫酸酯酶缺乏症，重症联合免疫缺陷综合症、T-细胞免疫缺陷、埃勒斯-当洛斯综合症、成骨不全症、成人多囊肾疾病、范科尼氏贫血症、大疱性表皮松解症综合症、少汗型外胚层发育不良症、先天性肾变病(芬兰型)和多发性内分泌肿瘤。
诊断检测可以是核酸(例如，DNA或RNA)检测、蛋白质(例如，基于抗体的)检测、或组织学检测，或其组合。DNA检测的实例包括FISH、PCR和DNA测序检测。RNA检测的实例包括RT-PCR检测和FISH检测。为了方便得到核酸，在进行诊断检测前，可以对fNRBC进行裂解或透化(permeabilized)。DNA、RNA和蛋白质检测可以在微阵列上进行。下面描述例示性方法。
在某些实施方式中，可以通过全基因组扩增(WGA)扩增单个细胞或者二个以上至四个以上的细胞的组以提供足够的分析用核酸。包含5个以上胎儿NRBC的细胞组可以不使用全基因组扩增(WGA)而进行分析。WGA是指个体的细胞或细胞组的整个基因组的扩增。例如，可以使用单个细胞的遗传材料扩增基因组(即，单细胞全基因组扩增(SCWGA))。
使用来自通过本公开的方法产生的来自裂解的胎儿NRBC的染色体或核酸，通过包括荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链式反应(PCR)、多次复性环状循环扩增(MALBAC)、限制性片段长度多态性(RFLP)分析和DNA测序等多种方法中的任意一种，可检测染色体异常、单基因异常、等位基因变异和单核苷酸多态性(SNP)。PCR技术可以是简单的PCR扩增技术或定量PCR、实时PCR或逆转录PCR技术。其他有用的遗传分析技术包括阵列比较基因组杂交(CGH)和在DNA微阵列中进行分析。例如，可以在产前染色体微阵列中分析胎儿NRBC。
单倍型是共同出现的且位于染色体上相邻位置的等位基因的组合。可以在单基因座或在多基因座上发现单倍型。单倍型可以出现在整个染色体中。单倍型可以包括任意数量的重组事件。单倍型还可以涉及一组相关的单核苷酸多态性。
单核苷酸多态性(SNP)在存在从正常(例如，野生型)核苷酸序列的单核苷酸(例如，A、T、C或G)的变异时出现。例如，单核苷酸多态性可以导致等位基因变异体。已知的等位基因可通过单核苷酸多态性或通过多个核苷酸变化而限定。
限制性片段长度多态性(RFLP)是在DNA的同源序列上的差异。其可以使用特定的限制性内切酶或限制性内切酶的组合消化DNA后发现的片段长度的差异来检测。RFLP可以通过凝胶电泳或Southern印记来测定。
荧光原位杂交(FISH)是通过荧光探针结合与荧光探针互补的固定的核酸序列部分进行的。FISH可以用于出现在核酸序列在更大的核酸序列中的特定位置对RNA或DNA中的靶核酸序列进行荧光标记。例如，FISH可以用于在染色体上标记靶序列。可以使用荧光显微镜观察荧光探针。
PCR用来通过使用两个引物扩增特定核酸序列的一个或多个拷贝(即，扩增子)。PCR方法易于利用并且常用于诊断遗传性疾病。
定量PCR(qPCR)基于聚合酶链式反应(PCR)，其用于扩增并同时对核酸序列的拷贝总数或相对拷贝数进行定量。qPCR的一个实例为实时PCR。在实时PCR中，由PCR产生的核酸拷贝的数量或相对数量是实时检测的。qPCR产生的拷贝的数量或相对数量可以使用由荧光染料产生的信号检测及定量。
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是可以用于检测RNA分子或测定特定的RNA序列(例如，mRNA)表达水平的方法，其通过将RNA分子转录为DNA拷贝(cDNA)并扩增该DNA来进行。RT-PCR可以通过一步法或两步法进行。
阵列比较基因组杂交(阵列CGH)是用于测定在全基因组范围内发生的染色体拷贝数变异的微阵列技术。阵列CGH将检测基因组与正常(例如，野生型)基因组进行比较以检测甚至相对小的(例如，200个碱基对)结构变异。例如，阵列CGH可以检测缺失、扩增、断点或非整倍性。阵列CGH还可以用于检测发展癌症的倾向。
多次复性环状循环扩增(MALBAC)是一种全基因组扩增方法。MALBAC可用于单个细胞、全基因组扩增。MALBAC可以用于以拟线性模式扩增基因组并避免了优选扩增某些DNA序列。在MALBAC中，扩增子可以具有互补末端，其在扩增子中形成环，并因此防止了扩增子的指数拷贝。扩增子环可以防止扩增偏差。MALBAC可以使用单个fNRBC应用于诊断胎儿异常，或可以使用单个fNRBC用于鉴定胎儿发展癌症的倾向。
下一代测序(NGS)是一组用于检测胎儿异常的高通量测序技术。NGS(例如，大规模平行测序)使用小到单个细胞的细胞样品而对大段核酸序列或整个基因组进行测序。例如，在NGS中，可以从来自小片段(即，读出)的文库的基因组DNA(gDNA)样品中同时对很多相对小的核酸序列测序。然后对所述读出进行重组以鉴定染色体的大核酸序列或完整核酸序列。例如，在NGS中，至多500,000个测序操作可以平行运行。NGS是一种单个细胞形式的全基因组扩增(WGA)。例如，当其后进行传统PCR时，MALBAC可以用于NGS。
大规模平行信号测序(MPSS)是NGS的一个实例。MPSS识别来自17个～20个碱基对信号引物序列的mRNA转录。可以使用MPSS而对样品中的mRNA转录进行鉴定和定量(Brenner等，2000，Nature biotechnology 18(6)：630-634，2000)。
Polony测序是NGS的另一个实例。Polony测序可以用于平行读取数百万固定的DNA序列。已发现Polony测序是非常准确(低错误率)的多路测序技术(Shendure等，2004。Nature Reviews Genetics 5(5)：335-344，2004；Shendure等，2008，Nature Biotech26(10)：1135-1145)。
454焦磷酸测序是NGS的另一个实例。454焦磷酸测序使用荧光素酶来检测添加到新生DNA中的独立的核苷酸。454焦磷酸测序在油溶液中扩增包含在水滴中的DNA。每个水滴包含一个附着到引物包被的珠上的DNA模板(Vera等，2008，Molecular Ecology 17(7)：1636-1647)。
Illumina测序是NGSd的另一个实例。在Illumina测序中，DNA分子和引物附着到载玻片上。形成通过聚合酶和DNA克隆(DNA簇)扩增的DNA分子(Shendure等，2008，NatureBiotech 26(10)：1135-1145；Meyer等，2010，Cold Spr Hbr Protocols2010(6)：pdb-prot5448)。
通过寡核苷酸连接测序和检测(SOLiD测序)是NGS的另一个实例。SOLiD测序是通过连接进行测序的方法。SOLiD测序同时随机产生数千个小序列读出，并将所述DNA片段固定在固体支持物上用于测序(Shendure等，2008，Nature Biotech 26(10)：1135-1145；Meyer等，2009，New Biotechnology 25(4)：195-203)。
离子激流半导体测序是NGS的另一个实例。离子激流半导体测序是通过合成测序的方法，其在DNA聚合过程中检测氢离子的释放。将三磷酸脱氧核糖核苷酸引入含有模板DNA链的微孔以进行测序。当dNTP与先导模板核苷酸互补时，dNTP被纳入到互补DNA链中，氢离子释放(Quail等，2012，BMC Genomics 13(1)：341)。
DNA纳米球测序是NGS的另一个实例。DNA纳米球测序可以用于测定生物体的整个基因组序列，诸如，例如新发现的生物体。使用滚环复制扩增基因组DNA的小片段以形成DNA纳米球。然后通过使用荧光探针作为引导连接DNA序列(Ansorge等，2009，NewBiotechnology 25(4)：195-203；Drmanac等，2010，Science 327(5961)：78-81)。
Heliscope单分子测序是NGS的另一个实例。Heliscope单分子测序是直接测序方法，其不要求连接或PCR扩增。DNA经剪切，以poly-A尾部结尾，然后用oligo(dT)杂交到流动细胞的表面。然后可以对数十亿的分子进行平行测序(Pushkarev等，2009，NatureBiotechnology 27(9)：847-850)。
单分子实时(SMRT)测序是NGS的另一个实例。SMRT测序是一种通过合成测序的方法。DNA在被称为零模波导(ZMW)的小孔样容器中合成。附着到ZMW的底部的未经修饰的聚合酶用于对DNA与溶液中自由流动的荧光标记的核苷酸进行测序。随着核苷酸被并入DNA链，荧光标签从所述核苷酸上脱离(Flusberg等，2010，Nature methods 7(6)：461-465)。
超深度测序是指测定来自多模板拷贝的核酸序列的次数。超深度测序通过扩增相对小的可能包含罕见突变的靶核酸序列可以用于鉴定罕见的遗传突变。
DNA微阵列可以用于同时测量多个基因的表达水平。DNA微阵列还可以用于基因组的多个区域的基因分型。例如，产前染色体微阵列(CMA)可以用于检测拷贝数变化，诸如染色体中的非整倍性。产前CMA可以检测全部或部分染色的缺失或重复。
5.8.试剂盒
本公开进一步提供包括在本公开的阳性免疫选择方法中有用的一种或多种抗体的试剂盒，所述抗体如以上5.3.2节中所描述。在某些实施方式中，所述试剂盒包含抗体4B9。抗体可以附着到可检测部分，例如，生物素或荧光部分。如果抗体是生物素化的，试剂盒还可以包括抗生物素蛋白结合的检测试剂(即，抗体)。
所述试剂盒还可以包括一种或多种阴性免疫选择抗体，诸如抗以上5.3.4节中所描述的靶标的抗体。阴性免疫选择抗体优选附着到可检测部分，所述可检测部分不同于阳性免疫选择抗体所附着的可检测部分。
所述试剂盒还可以包括用于更好地选择fNRBC的核染料。
可用于使用抗体来富集fNRBC的缓冲液等是本领域众所周知的，并可以通过终端用户制备或作为试剂盒的组分提供。所述试剂盒还可以包括含有阳性对照和阴性对照组织样品的固体支撑物，例如，胎儿肝细胞作为阳性对照和/或成人血液或成人血液细胞组分作为阴性对照。
所述试剂盒还可以包括一种或多种适于胎儿细胞诊断的试剂，诸如适于进行如上文5.7节中所述的诊断方法的试剂。在示例性实施方式中，所述试剂包括引物(例如，用于PCR或测序的引物)和/或可选的探针(例如，用于检测胎儿细胞异常的探针)。
6.示例性工作流程
图1和图2示出了用于fNRBC富集和/或分离的某些示例性工作流程。本公开的方法可需要图1或图2中描述的一个完整的工作流程，或者是适合于富集或分离fNRBC的工作流程的步骤的组合。
参考图1，示例性工作流程以预富集步骤(3)起始，然后进行富集(4)。可以根据5.2节或部分7.1节中的方法进行预富集。富集可能涉及使用磁性细胞分选的阳性和/或阴性选择，例如，如5.3节、7.2节和7.3节中所描述。所得的细胞群体可以：(i)直接分选(4b)并分析(7)；(ii)进行微操作以分离个体fNRBC或fRNBC池(4a)并分析(7)；(iii)进行荧光染色(5)，进行流式细胞术(6)，直接分选(6b)并分析(7)；或者(iv)进行流式细胞术(6)，进行微操作以分离个体fNRBC或fRNBC池(6a)并分析(7)。微操作可以如7.6节中所描述来进行。分析可能涉及检验来验证fNRBC为胎儿fNRBC(例如，如5.6节中所描述)和/或下游分析，例如检验多胎妊娠或胎儿异常(例如，如5.7节中所描述)。在验证和/或下游分析前，fNRBC基因组可以进行全基因组扩增。相同的核酸样品(直接从细胞中提取或者在诸如全基因组扩增等扩增后)可用于验证和下游分析。预富集(3)和富集(4)可以使用如第7节所阐明的示例性方案组合#1至#18中的任意一种。对于涉及流式细胞术的工作流程，在流式细胞术之前富集的(例如，磁性分选的)细胞群体可以是荧光染色的，例如，如第7节中所描述。染色可以使用直接标记的免疫选择抗体和/或核染料(例如，如5.3.5节所描述)，或者被标记的二抗。在某些实施方式中，使用二抗来标记在磁性分选中使用的一抗。在某些实施方式中，一抗为4B9。在某些实施方式中，流式细胞术使用至少两种或至少三种用于选择fNRBC的试剂，例如，4B9抗体、抗-CD235a抗体和核染料中的任意两种或全部三种。如果使用阳性选择，单克隆抗体4B9可以用作阳性选择试剂。如果使用阴性选择，抗-CD45抗体可以用作阴性选择试剂。
还参考图1，另一个示例性工作流程以预富集步骤(3)起始，然后进行荧光染色(5)和流式细胞术(6)。流式细胞术后可以进行直接分选(6b)并分析(7)，或者进行微操作以分离个体fNRBC或fRNBC池(6a)并分析(7)。微操作可以如7.6节中所描述而进行。分析可能涉及检验来验证fNRBC为胎儿fNRBC(例如，如5.6节中所描述)和/或下游分析，例如检验多胎妊娠或胎儿异常(例如，如5.7节中所描述)。在验证和/或下游分析之前，fNRBC基因组可以进行全基因组扩增。相同的核酸样品(直接从细胞中提取或者在诸如全基因组扩增等扩增后)可用于验证和下游分析。在流式细胞术之前，预富集的细胞群体可以是荧光染色的，例如，如节中所描述。染色可以使用直接标记的免疫选择抗体和/或核染料(例如，如5.3.5节中所描述)，或者是经标记的二抗。在某些实施方式中，流式细胞术使用至少两种或至少三种用于选择fNRBC的试剂，例如，4B9抗体、抗-CD235a抗体和核染料中的任意两种或全部三种。
参考图2，示例性工作流程以Ficoll分离步骤起始(例如，如7.1节中所描述)，然后进行磁性细胞分选(阴性和/或阳性，例如，如5.3节、7.2节和7.3节中所描述)，然后进行(A)FISH，(B)微操作以分离个体fNRBC或fNRBC池，或(C)FACS以分选fNRBC。FACS后可进行微操作。微操作(B)可以如7.6节中所描述而进行。微操作后，所选择的fNRBC可以验证为胎儿fNRBC(例如，如5.6节中所描述)，和/或进行下游分析，例如检测多胎妊娠或胎儿异常(例如，如5.7节中所描述)。验证和/或下游分析之前，fNRBC基因组可以是进行全基因组扩增。相同的核酸样品(直接从细胞中提取的或者在诸如全基因组扩增等扩增后)可用于验证和下游分析。Ficoll分离和磁性细胞分选步骤可以使用如部分7所阐明的示例性方案组合#1至#18中的任意一种。对于需要FACS分选的工作流程，磁性分选的细胞群体可以在FACS之前进行荧光染色(例如，如第7节中所描述)。染色可以使用直接标记的免疫选择抗体和/或核染料(例如，如5.3.5节中所描述)，或标记的二抗。在某些方面中，使用二抗来标记用于FACS分析的磁性分选中使用的一抗。在某些实施方式中，所述一抗为4B9。在某些实施方式中，FACS分选使用至少两种或至少三种用于选择fNRBC的试剂，例如，4B9抗体、抗-CD235a抗体和核染料中的任意两种或全部三种。如果磁性分选用于阳性选择，单克隆抗体4B9可以用作阳性选择试剂。如果磁性分选用于阴性选择，抗-CD45抗体可以用作阴性选择试剂。
在每个涉及fNRBC分析的前述工作流程的某些实施方式中，分析fNRBC基因组的染色体拷贝数。可以通过FISH或通过定量DNA扩增对来自细胞的染色体拷贝数进行分析，例如，通过全基因组扩增或定量PCR。
7.示例性方案
使用7.1节的密度分离方案、7.2节的阴性选择方案、和/或7.3节的阳性选择方案的多种组合来从包含fNRBC和母体细胞的样品(例如，母血)中富集NRBC。例如，以下方案组合落在本公开的范围内。在富集后，对富集的NRBC可以进行荧光染色(例如，如7.4节中所描述)，以进行进一步分析。在分析之前，可以通过FACS进一步富集NRBC，例如使用图1和图2所示的工作流程。
组合#1：密度分离方案#1和阳性选择方案#1。
组合#2：密度分离方案#1和阳性选择方案#2。
组合#3：密度分离方案#2和阳性选择方案#1。
组合#4：密度分离方案#2和阳性选择方案#2。
组合#5：密度分离方案#3和阳性选择方案#1。
组合#6：密度分离方案#3和阳性选择方案#2。
组合#7：密度分离方案#1、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#1。
组合#8：密度分离方案#、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#2。
组合#9：密度分离方案#2、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#1。
组合#10：密度分离方案#2、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#2。
组合#11：密度分离方案#3、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#1。
组合#12：密度分离方案#3、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#2。
组合#13：密度分离方案#1和阳性选择方案#3。
组合#14：密度分离方案#2和阳性选择方案#3。
组合#15：密度分离方案#3和阳性选择方案#3。
组合#16：密度分离方案#1、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#3。
组合#17：密度分离方案#2、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#3。
组合#18：密度分离方案#3、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#3。
7.1.密度分离
7.1.1.密度分离方案#1
下列示例性密度分离方案#1适合于用于本公开的方法：
1.向管中放置有多孔隔板的离心管(例如，管)添加一定量的密度分离培养基。将所述管进行离心以用培养基填充多孔隔板以下的管，例如，以230×g离心1分钟。添加到管中的培养基的量应当在离心后足够填充多孔隔板以下的管部分。离心后，如果有任何残留在多孔隔板以上的培养基，弃掉任何培养基。虽然在本公开的方法中可以使用缺少多孔隔板的离心管用于密度分离，使用具有多孔隔板离心管防止了样品与培养基的混合、保持不连续的梯度并且改善分离。
2.向离心管中添加一定量的血液。处理血液，例如，用诸如含有2mM EDTA的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)等缓冲液稀释血液，可以有助于改善分离。因此，添加到离心管中的血液可以是处理过的，例如用缓冲液稀释的。
3.对所述管进行离心以在多孔隔板以上形成血浆层和富集的细胞级分，例如，以1000×g离心20分钟。
4.将多孔隔板以上的全部物质(血浆、PBMC等)转移至第二离心管。
5.向第二离心管中添加冲洗缓冲液，例如，PBS+2mM EDTA(pH 7.2)并混合。然后对第二离心管进行离心以使细胞成团，例如，以450×g离心10分钟。
6.不搅动所述团块而完全吸出上清液。
7.在冲洗缓冲液中重悬所述团块。
8.对重悬的团块进行离心以使细胞再次成团块。
9.不搅动所述团块而完全吸出上清液。
冲洗步骤5至9从所富集的细胞中去除密度分离培养基和血浆，并可以改善后续处理步骤的产率。
7.1.2.密度分离方案#2
通过对密度分离方案#1进行如下改变而提供密度分离方案#2：在步骤2后添加冲洗步骤2.1：
2.1向步骤2中添加至离心管中的包含血液的容器中添加冲洗缓冲液，然后向离心管中添加冲洗缓冲液。
此冲洗步骤2.1可以增加fNRBC的产率。
7.1.3.密度分离方案#3
通过对密度分离方案#2进行如下改变而提供密度分离方案#3：用下列步骤4代替步骤4：
4.去除离心管中的血浆层并弃掉。将多孔隔板之上剩余的液体转移至第二离心管。
在冲洗步骤5至9之前去除血浆层可以提供更纯的富集的细胞群体。
7.2.阴性选择
在本公开的某些实施方式中，对包含fNRBC和母体细胞的样品进行阴性选择以耗竭母体细胞的样品。在某些实施方式中，阴性选择采用具有结合抗-CD45抗体的微珠磁性激活细胞分选(MACS)。
7.2.1.阴性选择方案#1
下列示例性阴性选择方案#1适合于在本公开的方法中使用：
1.用MACS电泳缓冲液重悬来自密度分离方案#1至3中的任意一种的最终团块，例如，自动电泳缓冲液(Miltenyi Biotec)。
2.对样品进行离心以使细胞成团，例如，以450×g离心10分钟。
3.完全吸出上清液。
4.在MACS电泳缓冲液中重悬所述团块。
5.向样品中添加CD45微珠(即，附着到抗-CD45抗体上的微珠)，混合并温育以允许CD45微珠与母体细胞结合。
6.向样品中添加MACS电泳缓冲液并混合。然后离心样品以使细胞成团，例如，以450×g离心10分钟。完全吸出上清液。
7.在MACS电泳缓冲液中重悬所述团块。
8.根据制造商的说明书，使用MACS柱磁性分选细胞以获得CD45阴性级分和CD45阳性细胞级分。
步骤1至3从细胞中去除残留的冲洗缓冲液。冲洗步骤6从样品中去除未结合CD45微珠。
7.3.阳性选择
在本公开某些实施方式中，使用抗体4B9对包含fNRBC和母体细胞的样品进行阳性选择。
7.3.1.阳性选择方案#1
下列示例性阳性选择方案#1适合于在本公开的方法中使用：
1.如果以通过阴性选择方案#1所得的包含fNRBC的悬浮液起始，对所述悬浮液进行离心以使细胞成团，例如，以450×g离心10分钟，并完全吸出上清液。如果以来自密度分离方案#1至3的任意一种的细胞团块起始，由步骤2开始。
2.在MACS电泳缓冲液中重悬所述团块。
3.添加FcR阻断剂，例如，FcR阻断剂(Miltenyi Biotec)，并且充分混合。FcR阻断剂阻断非特异性Fc受体介导的抗体结合。
4.添加生物素化的4B9；进行温育以允许生物素化的4B9与fNRBC结合。
5.向样品中添加MACS电泳缓冲液；进行离心以使细胞成团，例如，以300×g离心10分钟。
6.完全吸出上清液。
7.向样品中添加MACS电泳缓冲液，并进行离心以使细胞成团，例如，以450×g离心10分钟。
8.完全吸出上清液。
9.在MACS电泳缓冲液中重悬所述团块。
10.向样品中添加FcR阻断剂，与阻断步骤11中的非特异性Fc受体介导的抗体结合。
11.向样品中添加抗生物素微珠；进行温育以允许微珠与生物素化的4B9结合。
12.向样品中添加MACS电泳缓冲液并混合。然后，对样品进行离心以使细胞成团，例如，以450×g离心10分钟。完全吸出上清液。
13.向样品中添加MACS电泳缓冲液。
14.根据制造商的说明书，使用MACS柱磁性分选细胞以获得4B9阳性级分和4B9阴性级分。
步骤5至8从样品中去除未结合的生物素化的4B9。冲洗步骤12从样品中去除未结合的抗-生物素微珠。
7.3.2.阳性选择方案#2
通过对阳性选择方案#1进行如下改变而提供阳性选择方案#2：用未结合的4B9代替生物素化的4B9，及用抗-IgM微珠代替抗生物素微珠。
7.3.3.阳性选择方案#3
4B9+细胞通过用未结合的4B9(IgM单克隆抗体)温育而进行选择，冲洗以去除未结合的4B9抗体，用山羊抗小鼠IgM微珠结合4B9包被的细胞，然后冲洗，重悬并对所得细胞进行离心。离心后弃去上清液，并在诸如PBS等缓冲液中重悬所述团块。
7.4.染色
在本公开的某些实施方式中，对根据本公开制备的包含fNRBC的样品进行用于可视化的荧光染色，通过例如FACS进行分选，和/或挑选分离的fNRBC。
7.4.1.染色方案#1
下列示例性染色方案#1可以用于对包含fNRBC的样品进行荧光染色：
1.对根据以上组合#1-18中任意一种所制备的4B9阳性级分进行离心以使细胞成团，例如，以400×g离心10分钟。
2.吸出上清液。
3.向样品中添加荧光预混液并进行温育，其中所述预混液包含根据上述方案中的任意一种用于检测富集的fNRBC的适合的标记的标志物，例如，抗生蛋白链菌素Alexa 488和/或山羊抗小鼠IgM Alexa 488，及核标志物(例如，Hoechst)。
4.向样品中添加缓冲液，例如，具有0.5％BSA的1×PBS，以冲洗细胞。
5.对样品进行离心以使细胞成团，例如，以400×g离心10分钟。
6.吸出上清液。
7.在适合的缓冲液(例如，1×PBS)中重悬所述团块。
7.4.2.染色方案#2
下列示例性染色方案#2也可用于对包含fNRBC的样品进行荧光染色：
1.对根据以上组合#1至18中任意一种所制备的4B9阳性级分进行离心以使细胞成团，例如，以400×g离心10分钟。
2.在缓冲液(例如，1×PBS)中重悬所述团块。
3.添加FcR阻断剂以阻断步骤4中的非特异性Fc受体介导的抗体结合。
4.向样品中添加未缀合的4B9；温育样品以使4B9能与fNRBC结合。
5.向样品中添加荧光预混液并进行温育，其中，所述预混液包含用于检测fNRBC的适合的标记的标志物，例如，CD235a-PE和/或山羊抗小鼠IgM Alexa 488、及核标志物(如DC-Ruby)。
6.向样品中添加缓冲液，例如，1×PBS，以冲洗细胞。
7.对样品进行离心以使细胞成团，例如，以300×g离心5分钟。
8.吸出上清液。
9.在适合的缓冲液(例如，1×PBS)中重悬所述团块，例如。
本领域普通技术人员可以选择在以上方案中使用的试剂的适合的体积和浓度、温度、混合时间、离心时间、离心力和具体试剂。类似地，本领域技术人员将会理解，在不改变方案的基本操作时，可以在以上方案中加入或省略冲洗步骤。
7.5.用于下游分析的制备
包含fNRBC的初始生物样品或通过任意一种上述方法步骤富集fNRBC的样品，可以进行进一步处理以富集或分离步骤fNRBC。
自动化细胞分离技术是适合的。所述技术的实例包括但不限于，荧光激活细胞分选术(FACS)、流式细胞术、超滤、微流体或两种以上这些方法的任意组合。可以使用设备制造商提供的标准程序和说明书进行FACS以进一步富集或分离fNRBC。根据本文描述的方法可以用于分离fNRBC的示例性FACS选通及所得结果数据集显示在图3和图7中。
fNRBC还可以通过诸如微操作等手动方法分离。微操作技术的应用是本领域已知的或如以下7.6节中所描述的，个体fNRBC可以经挑选和分离。
在富集后，细胞可以进行下游分析，例如，细胞基因组DNA的短串联重复序列(STR)分析、DNA指纹分析、染色体拷贝数分析，和/或用于验证胎儿细胞身份、诊断胎儿异常或疾病以及检测胎儿特征的其他方法。
7.6.通过微操作挑选细胞
将商购的微操作仪配置到倒置显微镜上以用于细胞分离。所述显微镜配备有多个物镜、荧光滤光器、照相机、监测仪、操纵杆操作的微操作仪平台。微操作由三个线性轴-X、Y、和Z方向组成。
将获自阳性选择级分并用多种抗体进行荧光染色的细胞放置到经预清洁的显微镜载玻片上，并使用毛细血管尖上的开口直径被配置为fNRBC大小的无菌毛细血管进行分离。荧光染料可以相应于识别胎儿细胞的一种或多种抗体，所述抗体选自4B9(Zimmermann等，2013，Exp Cell Res 319：2700-2707)、抗-CD34、抗-CD71、抗血型糖蛋白-A、和抗-i-抗原(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35；Calabrese等，2012，Clin Genet.82(2)：131-9)。如果细胞是固定的(例如，为了进行FISH)，可以使用据报道为具有高度特异性的原始胎儿成红细胞识别物的抗-ε球蛋白(Choolani等，2003，Mol Hum Repro 9：227-35；Choolani等，2001，Blood 98：554-7)。
在荧光染色步骤中使用的每个抗体在显微镜上对应于其具有的特定的荧光过滤器，可通过目镜观察和/或根据波长监测。
除了荧光标志物，fNRBC的选择标准可以是血红蛋白含量(通过Soret滤光器可检测)和形态学特征。原始fNRBC具有不同的形态特征：其具有高的细胞质与细胞核之比，及相对更大的尺寸(Huang等，2011，J Cell Biochem.112：1475-85；Choolani等，2003，Mol HumRepro 9：227-35)。
用微操作仪手动挑选具有期望的形态学、核与细胞的比例、及荧光染色模式的细胞，并出于下游分析目的，将其放入0.2ml的PCR管中。
描述的示例性方案是用于获得如下表1所示的包含fNRBC的富集的细胞群体。
8.实施例1：通过密度分离+MACS从母血中分离的fNRBC的FISH分析
根据密度分离方案#3和阳性选择方案#2处理获自40名5周～16周妊娠具有男性胎儿的女性的母体外周血样品，以提供包含fNRBC的磁性细胞分离“汤”(MCSS)。将细胞固定在载玻片上并使用FISH进行分析以鉴定X和Y染色体。
当在显微镜下观察载玻片时，对至少5个具有Y染色体的细胞/样品进行手动计数。随机选择40个样品中的10个样品，以测定样品中存在Y染色体的细胞的平均数量。在显微镜下扫描整个载玻片，对每个Y探针进行手动计数。对10个样品中的每一个进行fNRBC数量的计数显示在表2中。平均计得每个样品24个fNRBC。
探测X和Y染色体的样品8的细胞的显微照片显示在图4中。
使用密度分离和MACS从母血中分离的胎儿细胞的其他示例性FISH图像显示在图5和6中。
9.实施例2：胎儿肝脏中的fNRBC的特征
新鲜或冷冻的单核胎儿肝细胞获自多个不同胎龄的供体并储存在液氮中。细胞在具有相应的分析证书的被认可的IRB供体程序下通过外部来源进行处理。
获自多个供体的新鲜单核男性细胞作为阴性对照。
使用密度梯度分离处理胎儿肝脏单核细胞和男性单核细胞。在某些研究中，在其后使用MACS通过4B9对包含fNRBC的密度梯度级分进行阳性选择，MACS-分选的4B9阳性级分通过FACS进行分选。在其他研究中，通过FACS对包含fNRBC的密度梯度级分进行分选而不使用干涉MACS选择过程。在FACS分选之前，细胞使用4B9和山羊抗小鼠IgM第二抗体、抗-CD235a和DC-Ruby进行荧光染色。
FACS分选分析了不同选通区(淋巴细胞和单核细胞、CD235a+、和三阳性(DC-Ruby+、4B9+、CD235a+细胞)的事件的数量、亲本％及总％。对于两种样品类型观察到的三阳性事件如下：在分选的总事件中，胎儿肝细胞在20％～45％之间，男性细胞在0.02％～0.10％。
用对应的荧光滤光器在显微镜上分选及观察细胞。对胎儿肝脏和男性单核细胞的分析允许基于细胞形态学、核与细胞的比例及荧光染色模式对细胞进行表征，及建立FACS分选的包含fNRBC的细胞群体的质量控制措施。
10.实施例3：通过密度分离+MACS+FACS从混合细胞群体中分离的胎儿肝脏fNRBC的STR分析
此实施例证明了通过加标(spike-in)实验，本公开的方法允许fNRBC的富集。
10.1.从混合的细胞群体的富集4B9+的细胞群体的制备
在通过密度梯度离心分离单核细胞之前，将四千个女性胎儿肝细胞添加到25ml的来自无关男性受试者的正常男性血液中。
通过密度梯度离心方案#2制备PBMC。根据阳性选择方案#2，对得到的细胞群体进行阳性选择。
细胞用山羊抗小鼠IgM Alexa Flour 488和DC-Ruby进行染色，然后使用索尼SH800细胞分拣器通过荧光激活细胞分选术(FACS)分选。
图8A显示了4B9阴性细胞级分的FSC和BSC相关测量，其表明了细胞类型的区别。图8B显示了基于来自4B9阴性细胞级分的FSC相对BSC的淋巴细胞选通的细胞亚群，观察有核的和4B9细胞类型。4B9阳性细胞级分在图9A和图9B中表示。图9B表明了有核的4B9阳性细胞在右上象限。无核的4B9阳性细胞位于右下象限。
将图9B中上方选通的事件(4B9阳性：43.53％)分选入0.2ml的PCR管中，进行STR分析以鉴定位于此区域的细胞类型。
10.2.4B9+细胞级分的下游分析
4B9+级分的STR(短串联重复)分析使用针对23个STR基因座和性别特异性釉原蛋白多态性基因的基因座的荧光检测的Fusion(Promega，WI)五色试剂盒进行。
图10～13是男性基因组DNA、胎儿肝脏基因组DNA、和4B9阳性分选级分的电泳图，其显示了FAM、VIC、NED和PET标记的基因座的峰。
在图10～13(分别为FAM、VIC、NED和PET)中所示的每个通道中，产生男性基因组DNA、胎儿肝脏基因组DNA和4B9阳性级分的STR谱。
图10～13中的4B9阳性级分(底部)证明了在分离、富集和FACS分选后，分离的大部分细胞是胎儿来源的。4B9阳性级分谱由男性和胎儿肝脏谱组成；然而，主要贡献者是胎儿谱。
此混合的细胞群体的谱包含两个不同的贡献者导致的主要峰和次要峰。基于等位基因的存在和这些峰随后的高度，测定主要和次要贡献者。
图14表示来自4B9阳性级分的FAM通道的两个标志物。此时观察到标志物D10S1248包含4个等位基因(A、B、C、和D)。等位基因A和C是四个峰中最高的且是胎儿来源的，而等位基因B和D是四个峰中最低的且是男性来源的(参见图10)。标志物D13S317仅包含3个等位基因(E、F、和G)。此时男性和胎儿肝细胞在F处共享一个常见的等位基因，其导致了最高的峰。第二高的峰为来自胎儿来源的G，最低的峰为男性来源的E。因此，图14证明，胎儿谱是来自4B9阳性级分的谱的主要贡献者。
此外，图10包含性别特异性基因座釉原蛋白(AMEL)，其包含代表女性样品的单个X和代表男性样品的X和Y。4B9级分没有指示存在Y基因座，重申了大多数4B9阳性级分是胎儿细胞并且不是男性细胞。
此实施例证明，当将少量胎儿肝细胞添加到显著较大数量的男性细胞中，使用本文描述的分离和富集方法恢复的大多数细胞为胎儿细胞。
11.实施例5：通过多种方案从母血中分离的fNRBC的STR分析
11.1.通过密度分离+MACS从母血中分离的fNRBC的STR分析
根据密度分离方案#1、阴性选择方案#1、和阳性选择方案#1处理获自40名4周～14周妊娠的具有男性或女性胎儿的女性的母体外周血样品，以对每个样品提供MCSS。根据染色方案#1对样品进行染色。然后从每个MCSS中挑选4B9标记的细胞，汇集，使用用于荧光检测23个STR基因座和性别特异性釉原蛋白多态性基因的基因座的Fusion(Promega，WI)STR试剂盒进行分析以验证胎儿身份。在100％的样品中鉴定胎儿等位基因。
图15～18显示处理获自具有7周妊娠的男性胎儿的女性妊娠者的母体外周血所得的样品的STR分析。细胞在阳性选择后用山羊抗小鼠IgM AF 488、抗生蛋白链菌素488和Hoechst进行荧光染色。两组10个手动挑选的汇集的细胞用于STR分析。图15～18中所示的电泳图中四个通道中的每一个中，具有四个STR谱。从上到下的四个谱为：分离的4B9阳性级分A和B(分别)、母本基因组DNA、和父本基因组DNA。由交替的的短线和点形成的圈指示母本谱和父本谱之间共享的分离的4B9阳性级分中发现的等位基因。由更短的短线形成的圈指示仅在父本谱中发现的分离的4B9阳性级分中发现的等位基因。
11.2.通过密度分离+MACS+FACS从母血中分离的fNRBC的STR分析
11.2.1.通过密度分离方案#2、阳性选择方案#2和FACS分离fNRBC
在来自通过密度分离方案#2、阳性选择方案#2和FACS而不进行阴性选择处理的妊娠女性的母血的样品上进行STR分析。图19～22显示处理获自具有9周妊娠的男性胎儿的女性妊娠者的母体外周血所得的样品的STR分析。细胞在阳性选择后用山羊抗-小鼠IgM、CD235a、和DC-Ruby进行荧光染色，FACS分选，手动挑选，并汇集在一起进行STR分析。总共挑选8个细胞。图19～22从上到下显示三个谱：母本基因组DNA、分离的4B9阳性级分和父本基因组DNA。由交替的的短线和点形成的圈指示母本谱和父本谱之间共享的分离的4B9阳性级分中发现的等位基因。由更短的短线形成的圈指示仅在父本谱中发现的分离的4B9阳性级分中发现的等位基因。
11.2.2.通过密度分离方案#3、阳性选择方案#2、和FACS分离fNRBC
在来自通过密度分离方案#3、阳性选择方案#2和FACS而不进行阴性选择处理的妊娠雌性的母血的样品上进行STR分析。图23～26显示处理获自具有12周妊娠的男性胎儿的女性妊娠者的母体外周血所得的样品的STR分析。细胞在阳性选择后用山羊抗小鼠IgM、CD235a和DC-Ruby进行荧光染色，将其直接放入0.2ml的PCR管中用于FACS分选，进行STR分析。总共挑选35个细胞。管A-C包含10个事件，管D包含5个事件。图23～26从上到下的四个谱显示：母本基因组DNA、从4B9阳性级分分离的两个不同反应(分别是管C和D)、和父本基因组DNA。由交替的短线和点形成的圈指示母本谱和父本谱之间共享的分离的4B9阳性级分中发现的等位基因。由更短的短线形成的圈指示仅在父本谱中发现的分离的4B9阳性级分中发现的等位基因。
12.实施例6：分离的NRBCS的指纹分析
根据密度分离方案#3和阳性选择方案#2处理100个母体外周血样品以提供MCSS。根据染色方案#2对MCSS的细胞进行染色。然后通过FACS使带4B9标签的细胞与其他细胞和碎屑分离。在载玻片上分选对于DC-Ruby、CD235a、和4B9是三阳性的细胞。通过微操作挑选单个细胞并基于形态学和荧光分级。
基于它们的单核苷酸多态性谱从100个母血样品中选择总共235个细胞，用于WGA和指纹分析。母体细胞也进行WGA和指纹分析。指纹分析验证了分离自母血的235个细胞中的230个(即，97.3％的细胞)为胎儿细胞，至少一个分离自每个母血样品为确认的胎儿细胞。
13.具体实施方式
本公开通过以下具体实施方式举例说明。
1.一种胎儿有核红细胞(NRBC)的制备方法，其包括对包含fNRBC的生物样品进行阳性免疫选择，所述阳性免疫选择包括以下步骤：
(a)在液体介质中用第一抗体接触生物样品，其中，相对于其他细胞(例如，一种或多种其他细胞类型)，所述第一抗体选择性结合至生物样品中的fNRBC；及
(b)选择与所述第一抗体结合的细胞。
2.如实施方式1所述的方法，其进一步包括对所述生物样品进行阴性免疫选择，所述阴性免疫选择包括以下步骤：
(a)在液体介质中用第二抗体接触生物样品，其中，相对于fNRBC，所述第二抗体选择性结合生物样品中的其他细胞；及
(b)选择不与所述第二抗体结合的细胞。
3.如实施方式2所述的方法，其中，在阴性免疫选择之前进行阳性免疫选择。
4.如实施方式2所述的方法，其中，在阳性免疫选择之前进行阴性免疫选择。
5.如实施方式2所述的方法，其中，同时进行阳性免疫选择和阴性免疫选择。
6.如实施方式1～5中任一个实施方式所述的方法，其中，所述第一抗体结合存在于fNRBC有核前体细胞表面上的抗原，但不结合存在于成人红细胞上的CD71或其他表面抗原。
7.如实施方式6所述的方法，其中，所述第一抗体为4B9或与4B9竞争与fNRBC有核前体细胞表面的结合的抗体。
8.如实施方式1～7中任一个实施方式所述的方法，其中，使用多种第一抗体。
9.如实施方式1～8中任一个实施方式所述的方法，其中，通过自动化方法进行阳性免疫选择。
10.如实施方式9所述的方法，其中，所述自动化方法为细胞分选、超滤或微流体分离。
11.如实施方式2～10中任一个实施方式所述的方法，其中，所述第二抗体针对选自下组的细胞表面标志物：
(a)T-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地，CD3、CD4或CD8；
(b)B-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地，CD19、CD20或CD32；
(c)泛淋巴细胞标志物，可选地，CD45；
(d)NK细胞表面标志物，可选地，CD56；
(e)树突细胞表面标志物，可选地，CD11c或CD23；及
(f)巨噬细胞或单核细胞表面标志物，可选地，CD14或CD33。
12.如实施方式2～11中任一个实施方式所述的方法，其中，使用多种第二抗体。
13.如实施方式12所述的方法，其中，所述多种第二抗体包括针对以下细胞表面标志物中的至少一种、两种、三种、四种、或五种的抗体：CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD45、CD56、CD11c、CD23、CD14、CD32和CD33。
14.如实施方式2～13中任一个实施方式所述的方法，其中，使用自动化方法进行所述阴性免疫选择。
15.如实施方式11所述的方法，其中，所述自动化方法为细胞分选、超滤或微流体分离。
16.如实施方式1～15中任一个实施方式所述的方法，其进一步包括使用密度分离方法富集fNRBC。
17.如实施方式16所述的方法，其中，所述密度分离方法在所述阳性免疫选择之前进行。
18.如实施方式1～17中任一个实施方式所述的方法，其进一步包括通过微操作分离fNRBC。
19.如实施方式18所述的方法，其中，所述微操作在阳性免疫选择后进行。
20.如实施方式1～19中任一个实施方式所述的方法，其中，所述生物液体包括血液、血浆、尿液或来自绒毛膜绒毛采样(CVS)活检或经皮脐带血液采样的细胞悬浮液。
21.如实施方式20所述的方法，其中，所述生物样品包括母血。
22.如实施方式21所述的方法，其中，所述母血是来自取自约5周～约38周妊娠的妊娠受试者的母血样品。
23.一种通过如实施方式1～22中任一个实施方式所述的方法制备或可获得的fNRBC的制备物。
24.如实施方式1～22中任一个实施方式所述的方法，其进一步包括在fNRBC上进行诊断检测。
25.一种fNRBC的诊断方法，其包括在实施方式23的fNRBC制备物上进行诊断检测。
26.如实施方式24或实施方式25所述的方法，其中，所述诊断检测用来确定多胎妊娠的存在。
27.如实施方式24或实施方式25所述的方法，其中，所述诊断检测用来确定胎儿异常的存在。
28.如实施方式27所述的方法，其中，所述胎儿异常为13-三体综合症、18-三体综合症、21-三体综合症、唐氏综合症、压力易感性神经病、神经纤维瘤病、阿拉吉欧综合症、软骨发育不全症、亨廷顿氏病、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、异染色性脑白质障碍症、范-瑞克林豪森氏病、结节性硬化症、强直性肌营养不良、囊性纤维化，镰状细胞疾病、泰-萨二氏病、β-地中海贫血、粘多醣贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸尿症、半乳糖血症、半乳糖激酶和半乳糖4-差向异构酶缺乏症、腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、甲基丙二酸尿症、丙酸血症、法伯病、岩藻糖苷贮积症、神经节苷脂贮积症、高歇氏病、I-细胞病、III型粘脂贮积病、尼曼-匹克病、唾液酸沉积症、沃耳曼氏病、脑肝肾综合症、胱氨酸病、凝血因子X缺陷症、共济失调性毛细血管扩张症、布洛姆氏综合症、罗伯特综合症、着色性干皮病、脆性(X)综合症、性染色体非整倍体、Klinefelter氏综合症、特纳氏综合症、XXX综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、具有线性皮肤缺损的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色体上的睾丸决定因子、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症、莱施-奈恩综合症、安德森-费勃莱氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、(17)(p11.2p11.2)重复综合症、16p11.2缺失、16p11.2重复、线粒体缺陷、(22)(q11.2q11.2)重复综合症、猫眼综合症、猫叫综合症、Wolf-Hirschhorn综合症、Williams-Beuren综合症、Charcot-Marie-Tooth病、染色体重排、染色体缺失、Smith-Magenis综合症、腭心面综合症、迪乔治综合症、1p36缺失、普拉德-威利综合症、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、无脑畸形、神经管缺损、小头畸形、脑积水、肾缺如、Kallmann综合症、肾上腺发育不良、Angelman综合症、肾囊肿、囊性水瘤、胎儿水肿、脐膨出和腹裂、膈疝、十二指肠闭锁、骨骼发育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿症、枫糖尿病、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症，肝醣贮积症、肾上腺增生、低磷酸酯酶症、胎盘类固醇硫酸酯酶缺乏症、重症联合免疫缺陷综合症、T-细胞免疫缺陷、埃勒斯-当洛斯综合症、成骨不全症、成人多囊肾疾病、范科尼氏贫血症、大疱性表皮松解症综合症、少汗型外胚层发育不良症、先天性肾变病(芬兰型)和多发性内分泌肿瘤。
29.如实施方式24～28中任一个实施方式所述的方法，其中，所述诊断检测为核酸检测。
30.如实施方式29所述的方法，其中，所述核酸检测为DNA检测，可选地，其中DNA检测在微阵列上进行。
31.如实施方式29或实施方式30所述的方法，其中，所述核酸分析为FISH、PCR或DNA测序检测。
32.如实施方式29所述的方法，其中，所述核酸检测为RNA检测，可选地，其中RNA检测在微阵列上进行。
33.如实施方式32所述的方法，其中，所述RNA检测为RT-PCR检测或FISH检测。
34.如实施方式29～33中任一个实施方式所述的方法，其进一步包括在进行诊断测试之前，对fNRBC进行裂解或透化。
35.如实施方式24～28中任一个实施方式所述的方法，其中，所述诊断检测为蛋白质测定检测，可选地，其中所述蛋白质测定检测在微阵列上进行。
36.如实施方式35所述的方法，其中，使用抗体检测蛋白质。
37.如实施方式24～28中任一个实施方式所述的方法，其中，所述诊断检测为组织学检测。
38.一种用于诊断检测的胎儿有核红细胞(NRBC)的制备方法，所述方法包括：
(a)可选地，提供一种生物液体，其包含一个或多个其中每一个均具有胎儿细胞表面的fNRBC，及多个其中每一个均具有母体细胞表面的母体细胞；
(b)通过密度分离方法，从来自第一部分的多个母体细胞富集一个或多个fNRBC，从而产生包含所述一个或多个fNRBC和第一数量的剩余母体细胞的第一悬浮液；
(c)用结合至第一分离颗粒的第一抗体温育所述第一悬浮液，其中，在第一抗体结合第一抗原以产生第一颗粒-细胞复合物的情况下，所述第一抗体结合存在于母体细胞的母体细胞表面上但在fNRBC的胎儿细胞表面上不存在的第一抗原，从第一悬浮液中分离和去除第一颗粒-细胞复合物，从而产生包含所述一个或多个fNRBC和第二数量的剩余母体细胞的第二悬浮液；
(d)将第二抗体添加至第二悬浮液，其中，所述第二抗体结合存在于fNRBC的胎儿细胞表面上的第二抗原，其中所述第二抗原在母体细胞的表面上不存在，在第二抗体结合第二抗原以产生第二抗体-细胞复合物的情况下温育所述第二悬浮液，从第二悬浮液中分离和去除第二抗体-细胞复合物，从而产生包含所述一个或多个fNRBC的用于诊断检测的第三悬浮液。
39.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其中，所述第一抗体包括抗-CD45抗体。
40.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其中，所述第二抗体结合存在于fNRBC有核前体细胞的细胞表面上的表面抗原，但不结合存在于成人红细胞上的CD71或其他表面抗原。
41.如实施方式40所述的fNRBC的制备方法，其中，所述第二抗体为4B9。
42.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其进一步包括对fNRBC的细胞成分进行染色。
43.如实施方式42所述的fNRBC的制备方法，其中，fNRBC的细胞成分是直接或间接染色的。
44.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法。其进一步包括通过微操作分离一个或多个fNRBC。
45.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其进一步包括通过自动化分离技术分离或进一步富集fNRBC。
46.如实施方式45所述的fNRBC的制备方法，其中，所述自动化分离通过选自下组的方法进行：细胞分选、超滤和微流体分离技术。
47.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其中，fNRBC包括一个或多个原始幼红细胞。
48.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其中，fNRBC包括一个或多个成熟幼红细胞。
49.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其中，所述生物液体包括血液、血浆、尿液、或来自绒毛膜绒毛采样(CVS)活检或经皮脐带血液采样的细胞悬浮液。
50.如实施方式44所述的fNRBC的制备方法，其中，所述生物液体包括母血。
51.如实施方式50所述的fNRBC的制备方法，其中，所述母血是来自取自约5周～约38周妊娠的妊娠受试者的母血样品。
52.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其中，所述第二抗体用可检测的标签标记。
53.如实施方式52所述的fNRBC的制备方法，其中，可检测的标签包括荧光标签、酶标签、放射性同位素标签、或化学反应性连接剂。
54.如实施方式40所述的fNRBC的制备方法，其进一步包括裂解富集的fNRBC以产生包含一种或多种核酸的裂解的fNRBC，并分析所述一种或多种核酸序列，从而确定是否存在指示胎儿异常或等位基因变异体的核酸序列。
55.如实施方式40所述的fNRBC的制备方法，其进一步包括确定多胎妊娠的存在。
56.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，分析所述一种或多种核酸序列的步骤包括检测染色体异常。
57.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，所述胎儿异常包括单基因异常。
58.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，所述胎儿异常包括单核苷酸多态性(SNP)。
59.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，分析所述一种或多种核酸序列的步骤通过FISH、PCR或DNA测序进行。
60.如实施方式59所述的fNRBC的制备方法，其中，分析所述一种或多种核酸序列的步骤通过定量PCR、实时PCR或逆转录酶PCR进行。
61.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，分析一种或多种提取的核酸的步骤通过阵列比较基因组杂交(CGH)进行。
62.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，分析一种或多种提取的核酸的步骤通过多次复性环状循环扩增(MALBAC)进行。
63.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，所述胎儿异常选自由13-三体综合症、18-三体综合症、21-三体综合症、唐氏综合症、压力易感性神经病、神经纤维瘤病、阿拉吉欧综合症、软骨发育不全症，亨廷顿氏病、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、异染色性脑白质障碍症、范-瑞克林豪森氏病、结节性硬化症、强直性肌营养不良、囊性纤维化、镰状细胞疾病、泰-萨二氏病、β-地中海贫血、粘多醣贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸尿症、半乳糖血症、半乳糖激酶和半乳糖4-差向异构酶缺乏症、腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、甲基丙二酸尿症、丙酸血症、法伯病、岩藻糖苷贮积症、神经节苷脂贮积症、高歇氏病、I-细胞病、III型粘脂贮积病、尼曼-匹克病、唾液酸沉积症、沃耳曼氏病、脑肝肾综合症、胱氨酸病、凝血因子X缺陷症、共济失调性毛细血管扩张症、布洛姆氏综合症、罗伯特综合症、着色性干皮病、脆性(X)综合症、性染色体非整倍体、克莱恩费尔特综合症、特纳氏综合症、XXX综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、具有线性皮肤缺损的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色体上的睾丸决定因子、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症、莱施-奈恩综合症、安德森-费勃莱氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、(17)(p11.2p11.2)重复综合症、16p11.2缺失、16p11.2重复、线粒体缺陷、(22)(q11.2q11.2)重复综合症、猫眼综合症、猫叫综合症、Wolf-Hirschhorn综合症、Williams-Beuren综合症、Charcot-Marie-Tooth病、染色体重排、染色体缺失、Smith-Magenis综合症、腭心面综合症、迪乔治综合症、1p36缺失、普拉德-威利综合症、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、无脑畸形、神经管缺损、小头畸形、脑积水、肾缺如、Kallmann综合症、肾上腺发育不良、Angelman综合症、肾囊肿、囊性水瘤、胎儿水肿、脐膨出和腹裂、膈疝、十二指肠闭锁、骨骼发育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿症、枫糖尿病、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、肝醣贮积症、肾上腺增生、低磷酸酯酶症、胎盘类固醇硫酸酯酶缺乏症、重症联合免疫缺陷综合症、T-细胞免疫缺陷、埃勒斯-当洛斯综合症、成骨不全症、成人多囊肾疾病、范科尼氏贫血症、大疱性表皮松解症综合症、少汗型外胚层发育不良症、先天性肾变病(芬兰型)和多发性内分泌肿瘤组成的组。
64.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其进一步包括在分离的fNRBC中检测是否存在蛋白质或代谢物。
65.如实施方式38所述的fNRBC的制备方法，其进一步包括在分离的fNRBC中检测蛋白质或代谢物的水平。
66.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，分析所述一种或多种核酸的步骤包括下一代测序技术或超深度测序。
67.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，在DNA微阵列中分析所述一种或多种核酸。
68.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，在产前染色体微阵列中分析所述一种或多种核酸。
69.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，通过限制性片段长度多态性(RFLP)检测所述胎儿异常。
70.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，所述胎儿异常包括微缺失或微重复。
71.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，fNRBC包括与正常范围的端粒长度相比长度增加或减少的端粒。
72.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，分析所述一种或多种核酸的步骤包括对fNRBC的核酸的片段(stretch)进行测序。
73.如实施方式72所述的fNRBC的制备方法，其中，fNRBC的所述核酸片段是通过下一代测序技术或大规模平行测序进行测序的。
74.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，所述胎儿异常为发展癌症的倾向。
75.如实施方式54所述的fNRBC的制备方法，其中，所述癌症选自由乳腺癌、脑癌、肝癌、急性淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、腺癌、腺瘤、肾上腺癌、基底细胞癌、骨癌、支气管癌、急性或慢性淋巴细胞或粒细胞瘤、急性粒细胞性白血病、宫颈非典型增生、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、表皮样癌、胰岛细胞瘤、卡波济氏肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌瘤、恶性高钙血症、恶性黑色素瘤、马方习性瘤、尤文肉瘤、胆囊癌、胆结石瘤、骨巨细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、毛细胞肿瘤、头癌、增生、畸胎瘤、增生性角膜神经肿瘤、原位癌、肠神经节细胞瘤、髓样癌、转移性皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、恶性类癌、粘膜神经瘤、蕈状霉菌病、骨髓增生异常综合症、骨髓瘤、颈癌、神经母细胞瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、神经组织癌、甲状腺癌、局部皮肤损害、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、真性红细胞增多症、原发性脑肿瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、网状细胞肉瘤和肾母细胞瘤组成的组。
76.一种胎儿有核红细胞细胞(NRBC)的分离方法，其包括：
(a)可选地，提供一种生物液体，其包含一个或多个其中每一个均具有胎儿细胞表面的fNRBC，及多个其中每一个均具有母体细胞表面的母体细胞；
(b)通过密度分离方法，从来自第一部分的多个母体细胞富集一个或多个fNRBC，从而产生包含所述一个或多个fNRBC和第一数量的剩余母体细胞的第一悬浮液；
(c)用结合至第一可回收的颗粒的第一抗体温育所述第一悬浮液，其中，在第一抗体结合第一抗原以产生第一颗粒-细胞复合物的情况下，所述第一抗体结合存在于母体细胞的细胞表面上但在fNRBC细胞表面上不存在的第一抗原，从第一悬浮液中分离和去除第一颗粒-细胞复合物，从而产生包含所述一个或多个fNRBC和第二数量的剩余母体细胞的第二悬浮液；
(d)将结合至第二可回收的颗粒的第二抗体添加至第二悬浮液，其中，所述第二抗体结合存在于fNRBC的细胞表面上的第二抗原，其中，所述第二抗原在母体细胞的细胞表面上不存在，在第二抗体结合第二抗原以产生第二颗粒-细胞复合物的情况下温育所述第二悬浮液，从第二悬浮液中分离和去除第二颗粒-细胞复合物，从第二颗粒-细胞复合物中释放并重悬细胞，从而产生一个或多个fNRBC；及
(e)通过物理技术分离一个或多个fNRBC。
77.如实施方式76所述的胎儿有核红细胞细胞(NRBC)的分离方法，其中所述第二抗体结合存在于fNRBC有核前体细胞的细胞表面上的表面抗原，但不结合成人红细胞上存在的CD71或其他表面抗原。
78.如实施方式76所述的胎儿有核红细胞细胞(NRBC)的分离方法，其中，所述第二抗体为4B9。
79.如实施方式76所述的胎儿有核红细胞细胞(NRBC)的分离方法，其中，所述第一抗体包括抗-CD45抗体。
80.如实施方式76所述的胎儿有核红细胞细胞(NRBC)的分离方法，其进一步包括对fNRBC的细胞组分进行染色。
81.如实施方式76所述的胎儿有核红细胞细胞(NRBC)的分离方法，其中，所述物理技术为微操作。
82.一种胎儿异常的检测方法，其包括：
(a)可选地，提供一种生物液体，其包含一个或多个其中每一个均具有胎儿细胞表面的fNRBC，及多个其中每一个均具有母体细胞表面的母体细胞；
(b)通过密度分离方法，从来自第一部分的多个母体细胞富集一个或多个fNRBC，从而产生包含所述一个或多个fNRBC和第一数量的剩余母体细胞的第一悬浮液；
(c)用结合至第一可回收的颗粒的第一抗体温育所述第一悬浮液，其中，在第一抗体结合第一抗原以产生第一颗粒-细胞复合物的情况下，所述第一抗体结合存在于母体细胞的细胞表面上但在fNRBC细胞表面上不存在的第一抗原，从第一悬浮液中分离和去除第一颗粒-细胞复合物，从而产生包含所述一个或多个fNRBC和第二数量的剩余母体细胞的第二悬浮液；
(d)将结合至第二可回收的颗粒的第二抗体添加至第二悬浮液，其中，所述第二抗体结合存在于fNRBC的细胞表面上的第二抗原，其中，所述第二抗原在母体细胞的细胞表面上不存在，在第二抗体结合第二抗原以产生第二颗粒-细胞复合物的情况下温育所述第二悬浮液，其中，从第二悬浮液中分离和去除第二颗粒-细胞复合物，从第二颗粒-细胞复合物中释放并重悬细胞，从而产生包含所述一个或多个fNRBC的第三悬浮液；及
(e)对一个或多个fNRBC进行分析，从而确定存在或不存在胎儿异常。
83.如实施方式82所述的胎儿异常的检测方法，其中所述第二抗体结合fNRBC有核前体细胞的细胞表面上存在的表面抗原，但不结合成人红细胞上存在的CD71或其他表面抗原。
84.如实施方式82所述的胎儿异常的检测方法，其中，所述第二抗体为4B9。
85.如实施方式82所述的胎儿异常的检测方法，其中，所述第一抗体包括抗-CD45抗体。
86.如实施方式82所述的胎儿异常的检测方法，其进一步包括对fNRBC的细胞组分进行染色。
87.如实施方式82所述的胎儿异常的检测方法，其中所述胎儿异常选自由13-三体综合症、18-三体综合症、21-三体综合症、唐氏综合症、压力易感性神经病、神经纤维瘤病、阿拉吉欧综合症、软骨发育不全症、亨廷顿氏病、α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、异染色性脑白质障碍症、范-瑞克林豪森氏病、结节性硬化症、强直性肌营养不良、囊性纤维化、镰状细胞疾病、泰-萨二氏病、β-地中海贫血、粘多醣贮积症、苯丙酮尿症、瓜氨酸尿症、半乳糖血症、半乳糖激酶和半乳糖4-差向异构酶缺乏症、腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、甲基丙二酸尿症、丙酸血症、法伯病、岩藻糖苷贮积症、神经节苷脂贮积症、高歇氏病、I-细胞病、III型粘脂贮积病、尼曼-匹克病、唾液酸沉积症、沃耳曼氏病、脑肝肾综合症、胱氨酸病、凝血因子x缺陷症、共济失调性毛细血管扩张症、布洛姆氏综合症、罗伯特综合症、着色性干皮病、脆性(X)综合症、性染色体非整倍体、Klinefelter氏综合症、特纳氏综合症、XXX综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、具有线性皮肤缺损的小眼畸形、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、Y染色体上的睾丸决定因子、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺乏症、莱施-奈恩综合症、安德森-费勃莱氏病、血友病A、血友病B、Duchenne型肌营养不良症、Becker型肌营养不良症、(17)(p11.2p11.2)重复综合症、16p11.2缺失、16p11.2重复，线粒体缺陷、(22)(q11.2q11.2)重复综合症、猫眼综合症、猫叫综合症、Wolf-Hirschhorn综合症、Williams-Beuren综合症、Charcot-Marie-Tooth病、染色体重排、染色体缺失、Smith-Magenis综合症、腭心面综合症、迪乔治综合症、1p36缺失、普拉德-威利综合症、精子缺乏(因子a)、精子缺乏(因子b)、精子缺乏(因子c)、脊柱裂、无脑畸形、神经管缺损、小头畸形、脑积水、肾缺如、Kallmann综合症、肾上腺发育不良、Angelman综合症、肾囊肿、囊性水瘤、胎儿水肿、脐膨出和腹裂、膈疝、十二指肠闭锁、骨骼发育不良、唇裂、腭裂、精氨琥珀酸尿、克拉伯氏病、高胱氨酸尿症、枫糖尿病、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、肝醣贮积症、肾上腺增生、低磷酸酯酶症、胎盘类固醇硫酸酯酶缺乏症、重症联合免疫缺陷综合症、T-细胞免疫缺陷、埃勒斯-当洛斯综合症、成骨不全症、成人多囊肾疾病、范科尼氏贫血症、大疱性表皮松解症综合症、少汗型外胚层发育不良症、先天性肾变病(芬兰型)和多发性内分泌肿瘤组成的组。
88.一种用于富集来自生物样品的胎儿有核红细胞(fNRBC)的方法，其包括：
(a)对生物样品进行密度分离以获得包含fNRBC的细胞级分；
(b)使用至少一种fNRBC阳性选择试剂对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行磁性激活细胞分选(MACS)以获得MACS分选的细胞群体；
(c)用至少一种fNRBC阳性选择试剂对步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体中的细胞进行荧光标记以获得荧光标记的细胞群体；及
(d)通过选择fNRBC的流式细胞术对步骤(c)中所得的荧光标记的细胞群体进行分选，从而获得富集fNRBC的细胞群体；
可选地，实施方式88所述方法进一步包括步骤(e)和/或(f)：
(e)可选地，通过诸如微操作等物理方法分离个体fNRBC或fNRBC组；及
(f)可选地，验证fNRBC的胎儿身份，例如通过遗传指纹分析。
89.如实施方式88所述的方法，其中，步骤(b)使用至少一种fNRBC阳性选择试剂，步骤(c)使用至少两种fNRBC阳性选择试剂，可选地，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂与步骤(c)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂选择相同的靶标(例如，其均为抗相同靶标的抗体)。
90.如实施方式88所述的方法，其中，步骤(b)使用至少一种fNRBC阳性选择试剂，步骤(c)使用至少三种fNRBC阳性选择试剂，可选地，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂与步骤(c)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂选择相同的靶标(例如，其均为抗相同靶标的抗体)。
91.如实施方式88～90中任一个实施方式所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括单克隆抗体4B9。
92.如实施方式88～91中任一个实施方式所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括抗-CD235a抗体。
93.如实施方式88～92中任一个实施方式所述的方法，其中，步骤(c)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括单克隆抗体4B9。
94.如实施方式88～93中任一个实施方式所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括抗-CD235a抗体。
95.如实施方式88～94中任一个实施方式所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括核染料。
96.如实施方式88～95中任一个实施方式所述的方法，其进一包括进行微操作以分离个体fNRBC或fNRBC组。
97.如实施方式88～96中任一个实施方式所述的方法，其不包括阴性选择步骤。
98.如实施方式88～96中任一个实施方式所述的方法，其中，在步骤(b)之前，对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行阴性选择。
99.如实施方式88～96中任一个实施方式所述的方法，其中，在步骤(c)之前，对步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体进行阴性选择。
100.如实施方式98或实施方式99所述的方法，其中，所述阴性选择是阴性免疫选择。
101.如实施方式100所述的方法，其中，所述阴性免疫选择使用一种或多种针对选自下组的一种或多种细胞表面标志物的抗体：
(a)T-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD3、CD4或CD8；
(b)B-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD19、CD20或CD32；
(c)泛淋巴细胞标志物，可选地为CD45；
(d)NK细胞表面标志物，可选地为CD56；
(e)树突细胞表面标志物，可选地为CD11c或CD23；及
(f)巨噬细胞或单核细胞表面标志物，可选地为CD14或CD33。
102.一种富集来自生物样品的fNRBC的方法，其包括：
(a)对生物样品进行密度分离以获得包含fNRBC的细胞级分；
(b)使用至少两种fNRBC阳性选择试剂对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行MACS以获得MACS分选的细胞群体；
(c)在步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体上进行微操作以分离个体fNRBC或fNRBC组。
103.如实施方式102所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括单克隆抗体4B9。
104.如实施方式102或实施方式103所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括抗-CD235a抗体。
105.如实施方式102～104中任一个实施方式所述的方法，其不包括阴性选择步骤。
106.如实施方式102～104中任一个实施方式所述的方法，其中，在步骤(b)之前，对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行阴性选择。
107.如实施方式102～104中任一个实施方式所述的方法，其中，在步骤(c)之前，对步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体进行阴性选择。
108.如实施方式106或实施方式107所述的方法，其中，所述阴性选择是阴性免疫选择。
109.如实施方式108所述的方法，其中，所述阴性免疫选择使用一种或多种抗选自下组的一种或多种细胞表面标志物的抗体：
(a)T-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD3、CD4或CD8；
(b)B-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD19、CD20或CD32；
(c)泛淋巴细胞标志物，可选地为CD45；
(d)NK细胞表面标志物，可选地为CD56；
(e)树突细胞表面标志物，可选地为CD11c或CD23；及
(f)巨噬细胞或单核细胞表面标志物，可选地为CD14或CD33。
110.如实施方式88～109中任一个实施方式所述的方法，其中，所述生物样品是母血。
111.如实施方式110所述的方法，其中，母血在约4周～约38周的妊娠期间提取。
112.如实施方式111所述的方法，其中，母血在约6周～约20周的妊娠期间提取。
113.一种通过如实施方式88～112中任一个实施方式所述的方法获得或可得的富集fNRBC的细胞群体。
114.一种FACS分选的细胞群体，其包含从母血富集的(a)至少2个、至少5个或至少10个和/或(b)至多15个、至多25个、或至多35个fNRBC。
115.如实施方式114所述的FACS分选的细胞群体，其包含(a)至少20个、至少50个或至少100个和/或(b)至多150个、至多250个、或至多350个FACS事件。
116.如实施方式113～115中任意一种实施方式所述的细胞群体，其未经固定。
117.一种检测胎儿异常的方法，其包括对来自实施方式113～116中任一个实施方式所述的细胞群体的至少一个fNRBC进行针对胎儿异常的分析。
118.如实施方式117所述的方法，其进一步包括在进行分析之前，根据实施方式1～112中任一个实施方式所述的方法富集fNRBC。
119.如实施方式117或实施方式118所述的方法，其包括对单个fNRBC进行针对胎儿异常的分析。
120.如实施方式117或实施方式118所述的方法，其包括对fNRBC组进行针对胎儿异常的分析。
121.如实施方式119或实施方式120所述的方法，其包括在进行分析之前，进行全基因组扩增。
122.如实施方式119或实施方式120所述的方法，其包括在进行分析之前，进行基因组子集的扩增。
123.如实施方式117～122中任一个实施方式所述的方法，其中，所述分析包括定量PCR。
124.如实施方式117～122中任一个实施方式所述的方法，其中，所述分析在微阵列上进行。
125.如实施方式117～124中任一个实施方式所述的方法，其进一步包括验证所述fNRBC为胎儿细胞。
126.如实施方式125所述的方法，其中，验证包括进行短串联重复序列(STR)分析、遗传指纹分析或单核苷酸多态性(SNP)分析。
127.如实施方式125或实施方式126所述的方法，其中，验证包括将fNRBCDNA与母本DNA进行比较。
128.如实施方式125或实施方式126所述的方法，其中，验证包括将fNRBCDNA与母本和父本DNA均进行比较。
虽然示出和描述了多种具体的实施方式，但可以理解的是，在不脱离本公开的主旨和范围的情况下可以进行多种变化。
14.参考文献的引用
本申请中引用的全部公开、专利、专利申请和其他文件出于所有目的以其整体作为参考并入本文，其程度等同于单独指明将各个公开、专利、专利申请和其他文件出于所有目的通过参考并入。在本文并入的一种或多种参考文献与本公开的教导不一致的情况下，以本说明书的教导为准。

Claims (42)

1.一种用于富集来自生物样品的胎儿有核红细胞(fNRBC)的方法，其包括：
(a)对生物样品进行密度分离以获得包含fNRBC的细胞级分；
(b)使用至少一种fNRBC阳性选择试剂对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行磁性激活细胞分选(MACS)以获得MACS分选的细胞群体；
(c)用至少一种fNRBC阳性选择试剂对步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体中的细胞进行荧光标记以获得荧光标记的细胞群体；及
(d)通过流式细胞术对步骤(c)中所得的荧光标记的细胞群体进行分选以选择fNRBC，从而获得富集fNRBC的细胞群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)使用至少一种fNRBC阳性选择试剂，步骤(c)使用至少两种fNRBC阳性选择试剂。
3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)使用至少一种fNRBC阳性选择试剂，步骤(c)使用至少三种fNRBC阳性选择试剂。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括单克隆抗体4B9。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括抗-CD235a抗体。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括单克隆抗体4B9。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括抗-CD235a抗体。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括核染料。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其进一步包括进行微操作以分离个体fNRBC或fNRBC组。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其不包括阴性选择步骤。
11.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)之前，对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行阴性选择。
12.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)之前，对步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体进行阴性选择。
13.如权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述阴性选择是阴性免疫选择。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述阴性免疫选择使用一种或多种抗体，所述一种或多种抗体针对选自以下的一种或多种细胞表面标志物：
(a)T-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD3、CD4或CD8；
(b)B-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD19、CD20或CD32；
(c)泛淋巴细胞标志物，可选地为CD45；
(d)NK细胞表面标志物，可选地为CD56；
(e)树突细胞表面标志物，可选地为CD11c或CD23；及
(f)巨噬细胞或单核细胞表面标志物，可选地为CD14或CD33。
15.一种富集来自生物样品的fNRBC的方法，其包括：
(a)对生物样品进行密度分离以获得包含fNRBC的细胞级分；
(b)使用至少两种fNRBC阳性选择试剂对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行MACS以获得MACS分选的细胞群体；
(c)在步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体上进行微操作以分离个体fNRBC或fNRBC组。
16.如权利要求15所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括单克隆抗体4B9。
17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其中，步骤(b)中的至少一种fNRBC阳性选择试剂包括抗-CD235a抗体。
18.如权利要求15～17中任一项所述的方法，其不包括阴性选择步骤。
19.如权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)之前，对步骤(a)中所得的包含fNRBC的细胞级分进行阴性选择。
20.如权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)之前，对步骤(b)中所得的MACS分选的细胞群体进行阴性选择。
21.如权利要求19或权利要求20所述的方法，其中，所述阴性选择是阴性免疫选择。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述阴性免疫选择使用一种或多种抗体，所述抗体针对选自以下的一种或多种细胞表面标志物：
(a)T-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD3、CD4或CD8；
(b)B-淋巴细胞细胞表面标志物，可选地为CD19、CD20或CD32；
(c)泛淋巴细胞标志物，可选地为CD45；
(d)NK细胞表面标志物，可选地为CD56；
(e)树突细胞表面标志物，可选地为CD11c或CD23；及
(f)巨噬细胞或单核细胞表面标志物，可选地为CD14或CD33。
23.如权利要求1～22中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是母血。
24.如权利要求23所述的方法，其中，母血在约4周～约38周的妊娠之间提取。
25.如权利要求24所述的方法，其中，母血在约6周～约20周的妊娠之间提取。
26.如权利要求1～25中任一项所述的方法，其进一步包括验证至少一个fNRBC的身份为胎儿细胞。
27.一种通过如权利要求1～25中任一项所述的方法获得或能够获得的富集fNRBC的细胞群体。
28.一种FACS分选的细胞群体，其包含从母血富集的(a)至少2个、至少5个或至少10个和/或(b)至多15个、至多25个、或至多35个fNRBC。
29.如权利要求28所述的FACS分选的细胞群体，其包含(a)至少20个、至少50个或至少100个和/或(b)至多150个、至多250个、或至多350个FACS事件。
30.如权利要求27～29中任一项所述的细胞群体，其未经固定。
31.一种检测胎儿异常的方法，其包括对来自权利要求27～30中任一项所述的细胞群体的至少一个fNRBC进行针对胎儿异常的分析。
32.如权利要求31所述的方法，其进一步包括在进行所述分析之前，根据权利要求1～25中任一项所述的方法富集fNRBC。
33.如权利要求31或权利要求32所述的方法，其包括对单个fNRBC进行针对胎儿异常的分析。
34.如权利要求31或权利要求32所述的方法，其包括对fNRBC组进行针对胎儿异常的分析。
35.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其包括在进行所述分析之前，进行全基因组扩增。
36.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其包括在进行所述分析之前，进行基因组子集的扩增。
37.如权利要求31～36中任一项所述的方法，其中，所述分析包括定量PCR。
38.如权利要求31～36中任一项所述的方法，其中，所述分析在微阵列上进行。
39.如权利要求31～38中任一项所述的方法，其进一步包括验证所述fNRBC为胎儿细胞。
40.如权利要求39所述的方法，其中，验证包括进行短串联重复序列(STR)分析、遗传指纹分析或单核苷酸多态性(SNP)分析。
41.如权利要求39或权利要求40所述的方法，其中，验证包括将fNRBC DNA与母本DNA进行比较。
42.如权利要求39或权利要求40所述的方法，其中，验证包括将fNRBC DNA与母本和父本DNA均进行比较。
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