CN103797368A - 胎儿有核红细胞的检测 - Google Patents
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Abstract
一方面,本发明涉及从样本中分离胚胎有核红细胞(FNRBC)的方法,包括:使样本与特异性识别CD147的试剂接触,从而制成一种混合物;保持该混合物处于在所述试剂和样本中的CD147之间形成复合物的状态下;以及从混合物中分离所述复合物;从而从样本中分离FNRBC。在其他的实施方式中,本发明涉及检测样本中FNRBC的方法,包括:使样本与特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段接触,从而制成一种组合;保持该组合处于在所述抗体和样本中的FNRBC之间形成免疫复合物的状态下;以及检测组合中是否形成免疫复合物;其中,如果检测到免疫复合物,则在样本中存在FNRBC。另一方面,本发明进一步包括从去核的RBCs中分离FNRBCs的方法、检测产前异常和/或胎儿性别的方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞标记物用于从样本中检测、离析和/或分离至少一种胎儿有核红细胞的用途。
背景技术
产前诊断提供了有关尚未出生的胎儿的健康状况的重要信息并且包括有创伤性检查法和无创伤性检查法。Steele和Bregg在1966年利用羊膜穿刺术进行了第一次可靠的基因诊断。此后,孕早期绒膜绒毛取样(CVS)被证明是安全可靠的早期产前诊断方法。尽管二者均为创伤性技术并潜藏着胎儿流产的潜在风险,但它们仍被认为是产前诊断的金标准。因此,其正在逐渐被无创伤性产前诊断(NIPD)法(其中,将从母体循环中获得的胎儿细胞/遗传物质用于进行产前诊断)所取代。特别是,母体循环中的无细胞DNA、mRNA和胎儿细胞的识别,为NIPD用于诊断胎儿染色体病和单基因缺陷提供了可能性。然而,从母体循环中获得的胎儿遗传物质相当不足以提供关于染色体病的可靠信息。特别是,母体循环中的无细胞DNA相当不足以提供用于诊断的完整的染色体信息(例如,异倍体),且其还昂贵。另一方面,胎儿细胞是用于检测染色体异常的有希望的候选者,但其细胞数量很少。特别是,利用在母体血液中循环的胎儿细胞有望用于异倍体的检测和提供完整的胎儿遗传信息。在此,主要的限制仍在于其在母体循环中的稀缺性并且缺乏有效的分离技术。此外,这些细胞中的某些可能是从前次妊娠存留下来的,不能作为当前胎儿状态的指示。
众所周知,产前诊断能够及早识别先天性的出生缺陷及损害胎儿存活的其他危险因素,进而有助于早期介入从而避免并发症并减轻父母的担忧。目前可用的各种方法中,对于从母体循环系统中分离的人胎儿成红血球细胞(hFEs)和/或胎儿有核红细胞(FNRBCs)的诊断,会成为最可靠并且无创伤性的对策。这是由于FNRBCs具有独特的识别标志,并且其存在是当前妊娠的确切指示,因此被视为用于早期孕早期NIPD的潜在候选者。
特别是,目前的方法常规地遵循获取用于染色体和单基因病的产前诊断(例如羊膜穿刺术、绒膜绒毛取样和脐穿刺)的胎儿细胞,带有虽小而固有的流产的危险(0.5-4%)。来自孕早期母体血液中的胎儿DNA有望成为目前的产前诊断方法的无创伤性替代方案。
由于胎儿成红血球细胞的稀缺,迄今尚无法成功地识别和/或分离胎儿成红血球细胞。对于胎儿成红血球细胞的研究仅仅依靠细胞的异源培养,考虑到母体细胞和其他杂质的影响,其可能不能提供准确的信息。胎儿成红血球细胞在体外的成活率差也严重制约了对该类细胞进行进一步分析和研究的可能性。
迄今,尚无对于原始胎儿有核红细胞具有特异性的抗体。因此,需要提供胎儿有核红细胞的新的标记物。
发明内容
本发明限定在所附的独立权利要求中。本发明的一些可选择的特征限定在所附的从属权利要求中。
本发明涉及一种从样本中检测、分离和/或离析至少一种胎儿有核红细胞(FNRBC)的方法,包括:
a)用离心法在包含选自1.077-1.120g/ml的密度的密度梯度介质中处理样本;
b)使所述样本与在至少20,000的浓度下的特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段接触,从而制成一种混合物;
c)保持该混合物处于在试剂和样本中的CD147之间形成复合物的状态下;以及
d)从混合物中分离所述复合物;
从而从样本中检测、分离和/或离析FNRBC。
此处所展现的是,CD147可以是用于从样本中检测、分离和/或富集胎儿有核红细胞(FNRBC)的表面标记物。该FNRBC可以进一步分析其产前异常。因此,此处还提供用于检测FNRBC和/或获得产前诊断的无创伤性方法。
在其他的具体实施方式中,本发明涉及检测样本中FNRBC的方法,包括使样本与特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段接触,从而制成一种组合;保持该组合处于在所述抗体和样本中的FNRBC之间形成免疫复合物的状态下;以及检测其中是否形成免疫复合物;其中,如果检测到免疫复合物,则在样本中存在FNRBC。
本发明还在另一方面进一步包括检测产前异常和/或胎儿性别的方法。
附图说明
图1A-D为CD147在FNRBCs和成人去核红细胞(AARBCs)上的差速免疫细胞化学染色(differential immunocytochemical staining)的图像。(A)阴性对照(省略第一抗体);(B)抗CD147在AARBCs上弱的/不能检测的免疫染色;(C-D)抗CD147在FNRBCs和AARBCs的混合物上的免疫染色;可见,与在AARBCs上的染色相反,在FNRBCs上的染色强。
图1E为显示用Adobe Photoshop制图软件和光度柱状图计算的FNRBCs(n=450)和AARBC(n=358)的平均强度值(任意单位亮度)的盒形图,其具有显著差异(p<0.001曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)。
图2A是显示利用Dynabead、MACS或FACS的来自模型混合物的使用抗CD147抗体的FNRBC的平均(%±SEM)回收率和纯度的条形图,以Bonferroni校正ANOVA,*P<0.01和**P<0.001。
图2B为用于从标记有与FITC结合的抗CD147抗体的模型混合物中富集FNRBCs的荧光激活细胞分选(FACS)设门策略(gating strategy)的图像。(i)标记有与FITC结合的抗CD147抗体的AARBCs的侧向分散(对照)。(ii)标记有与FITC结合的抗CD147抗体的模型混合物(FNRBCs和AARBCs)的侧向分散。门控区(gated area)P2(FITC-高/SSC-高)和P3(FITC-高/SSC-低)相当于靶细胞群FNRBCs。P1门控区相当于AARBCs。P4门控区相当于碎片。
图3为利用Dynabead、MACS和FACS分离技术用抗CD147抗体从模型混合物中富集FNRBCs的离心涂片细胞的图像。(A)Dynabea分离-阳性部分,(B)Dynabead分离-阴性部分,(C)MACS分离-阳性部分,(D)MACS分离-阴性部分,(E)FACS分离-门控区P2,(F)FACS分离门控区P3。FNRBC(虚线箭头)和AARBC(实线箭头)。赖特(Wright)染色(200x)。(Olympus BX61,Pennsylvania,USA)。
图4为来自TOP前母血(pre-TOP maternal blood)的e-球蛋白阳性FNRBCs的免疫细胞化学鉴定的图像(x400)(Olympus BX61,Pennsylvania,USA)。
图5的图像为:(A)来自胎盘绒毛的FNRBCs,经赖特氏染色(Wright’sstained)(x400)(Olympus BX61,Pennsylvania,USA);(B)来自胎盘绒毛的未染色的FNRBCs;(C)来自母血的烟酸己可碱(Hoechst)染色的FNRBCs;(D)烟酸己可碱和CD45-AF488染色的母体白细胞。B-D倒置显微镜(x400)(Olympus IX70,USA)。
图6是全基因组扩增的DNA产物的凝胶电泳图。样本1-3:从TOP前母血(MB)中手工挑选的8-10个FNRBC和从胎盘绒毛中手工挑选的8-10个FNRBC(对照)的全基因组扩增(WGA)的DNA产物在1%琼脂糖凝胶电泳上分离。
图7是β-球蛋白(HBB)和男性性别决定区Y(SRY)的实时PCR扩增曲线。样本1-3:母体gDNA、胎儿gDNA及从TOP前母血中分离的FNRBC的β-球蛋白(HBB)和男性性别决定区Y(SRY)的实时PCR。
图8为显示在MACS中使用不同稀释的抗CD147抗体的细胞回收率的比较的图表。以Bonferroni校正的单向ANOVA,p>0.05。
图9为染色的图像,显示在赖特氏染色后通过形态学外观识别的FNRBCs。标记物=20μm。
图10为通过赖特氏染色识别、脱色和进行免疫细胞化学染色之后的差速免疫细胞化学染色ε-球蛋白阳性FNRBCs(e+FNRBCs)的图像。标记物=20μm。
图11为显示从TOP前母血中富集的ε-球蛋白阳性FNRBC(e+FNRBC)的aCGH的图表。A:WGA扩增的从母体单核细胞获得的母体基因组DNA,显示轮廓女性(46XX),对照。B:未扩增的胎儿基因组DNA(胎儿滋养层细胞)显示轮廓男性(46XY)。C:来自胎盘绒毛的1个e+FNRBC,经激光显微切割(LCM)和WGA,显示轮廓男性(46XY),对照。D:来自母血的1个e+FNRBC,经激光显微切割(LCM)和WGA,显示轮廓男性(46XY)。E:来自母血的3个e+FNRBC,经激光显微切割(LCM)和WGA,显示轮廓男性(46XY)。F:来自母血的5个e+FNRBC,经激光显微切割(LCM)和WGA,显示轮廓男性(46X)。
图12为显示从母血中富集FNRBCs、显微操作及下游的分子分析的工作流程示意图。A:TOP前母血(10-20ml;n=8);B:用PercollTM1.118密度梯度离心;C:CD45-WBC损耗;D:FNRBCs的CD147-阳性选择;E:用于手工拣选FNRBCs的显微操作器;F:Hoechst+/CD45AF488染色的FNRBCs(白色箭头;标记物=10μm)。
图13为用于显微操作的FNRBCs的染色图像。A:来自胎盘绒毛的FNRBCs,经赖特氏染色;B:来自胎盘绒毛的未染色FNRBCs;C:来自母血的烟酸己可碱染色的FNRBCs;D:烟酸己可碱和CD45-AF488染色的母体白细胞。标记物=10μm。
图14为显示以picogreen检测的来自绒毛和母血的10-FNRBCs经过全基因组扩增后DNA产量的图表。曼-惠特尼检验(Mann Whitney),p>0.05;*触须线(Whiskers)表示95%置信区间(CI)。
图15是显示相较于理论上的10个细胞中基因组DNA,10-FNRBCs的WGA产物的DNA水平及其倍增的图表(*)。
图16是显示从男性和女性妊娠的母血中分离的10-FNRBCs的实时PCR的DNA扩增结果的一系列图表。
图17是用于来自各个绒毛细胞和作为对照的母细胞的包含DNA的男性和女性FNRBCs的釉原蛋白(AMXY)的19QF-PCR结果。
图18是来自MB1-MB8的FNRBCs的实时和荧光定量PCR的结果和染色体组型结果。MB1-MB4:来自怀有男性胎儿的妊娠期母血的FNRBCs;MB5-MB8:来自怀有女性胎儿的妊娠期母血的FNRBCs。
图19是从母血和绒毛样本中分离的FNRBCs的荧光原位杂交(FISH)图像。a和b:显示分别从来自妊娠终止后母血样本中的母血和绒毛中分离出的FNRBCs中的男性XY(箭头)信号;c和d:显示分别从来自妊娠终止后母血样本中的母血和绒毛中分离出的FNRBCs中的女性XX(箭头)信号;e和f:显示从分别来自妊娠终止前母血样本中的母血和绒毛中分离出的
FNRBCs中的女性XX(箭头)信号;g:以LSI13/21探针FISH杂交,来自妊娠终止后的母血的FNRBC中的13号染色体(箭头)和21号染色体(箭头)的正常数目;h:在以LSI13/21探针杂交后显示3个21号染色体的信号的对照T21细胞系。
具体实施方式
为了方便,本说明书提及的书目参考文献以参考文献表的形式列出并附加在实施例之后。这些书目参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文中。
通过不定冠词“一个(a或an)”提及一种成分,并不能排除多于一种成分存在的可能性,除非上下文中清楚地要求为一种并仅有一种成分。因此,此处使用不定冠词“一个(a或an)”通常意为“至少一种”。
术语“包含(comprising)”和其变形以其非限制性意义使用时,意为在该术语之后的各项被包括在其中,但不排除没有特别提及的项目。因此,术语“包含”包括更多限定性用词"基本由…组成(consisting essentially of)"和"由…组成(consisting of)"。
此处所使用的术语“CD45阴性”指的是不表达信号或是对CD45分子/标记物的自然、重组体或合成形式呈阴性的任何细胞。可以使用本领域所知的任何免疫染色法和利用任何抗CD45试剂来确定在样本中细胞上CD45表达的存在。用抗CD45试剂染色呈阳性的任何细胞可以被排除在外,因为这些细胞可能包括CD45阳性的白细胞。
此处使用的术语“成红血球细胞(erythroblast)”指的是具有核的红细胞。特别地,成红血球细胞指的是这样一种有核前体细胞(nucleated precursorcell),网织红细胞从该有核前体细胞发育成为红细胞。“成红血球细胞”可以与“幼红细胞(normoblast)”互换使用,并且指的是有核红细胞,红细胞的直接前体。例如,成红血球细胞可以是哺乳动物起源的。特别地,成红血球细胞可以是原始或人胎儿的成红血球细胞。“成红血球细胞”或“红细胞”或“RBC”包括无核成体和胎儿红细胞。成红血球细胞的实例可以是胎儿有核红细胞(FNRBCs)。这些细胞与胎儿成红血球细胞(hFEs)相同或相似。
术语“哺乳动物”在此被定义为哺乳动物个体,特别是灵长类动物,例如人类。为了研究的目的,被试者可以是非人类。例如,被试者可以是适合在动物模型中使用的动物,比如猪、马、小鼠、大鼠、奶牛、狗、猫、牛、非人类的灵长类动物(例如黑猩猩)等等。
此处所用的术语“有核的”是指具有细胞核的细胞。可以基于本领域已知的任何核染色技术来区分有核细胞与不具有细胞核的红细胞。
此处所使用术语的“产前异常”指的是出生前的胎儿或胚胎的疾病或状态。所述的产前异常可以选自染色体病、基因病或其结合。特别地,产前异常可以非限定性地选自唐氏综合征(Down Syndrome)、爱德华兹综合征(Edwards Syndrome)、帕塔综合征(Patau Syndrome)、神经管缺陷、脊柱裂、颚裂、泰-萨克斯病(Tay Sachs Disease)、镰刀形红细胞贫血病(sickle-cellanemia)、地中海贫血病(,thalassemia)、囊性纤维病(cystic fibrosis)、脆性X染色体综合征、脊髓性肌萎缩、强直性肌营养不良、杭廷顿氏舞蹈病(Huntington’s Disease)、夏-马-图三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)、血友病、杜克(Duchenne)肌营养不良、线粒体异常(mitochondrial disorder)、遗传性多发性外生骨疣、成骨不全及其结合等等。
此处所用的术语“样本”指的是组织、细胞或组成部分(例如液体)的集合,可以包括,但不限于,母体组织、母血、脐带血、羊膜穿刺术、绒膜绒毛取样、胎儿血和/或胎儿组织/液体。特别地,胎儿组织可以是滋养层组织、胎盘组织及其结合。本发明所使用的样本可以是预先经过密度梯度纯化的,其包括,但不限于,Ficoll梯度和PercollTM梯度。
ε-球蛋白阳性(e+)胎儿有核红细胞(FNRBCs)是母血中用于孕早期无创产前诊断的理想胎儿细胞。此处描述的是e+FNRBCs上的表面抗原,其通过免疫筛选法识别,并测试其用于在模型混合物中分离这些细胞和从母血中富集e+FNRBCs的适合性。除了CD147外,大多数被测试的抗原免疫定位在FNRBCs和成体去核红细胞(AARBCs)上,其具有统计学上显著差异的表达:在FNRBCs上较强(122.46±22.21AU),而在AARBCs上弱/不能检测到(205.11±7.08AU)(P<0.05)。与Dynal系统(56.7±2.8%;P<0.01)、FACS-P2(高FITC/高SSC,12.1±4.0%;P<0.001)和FACS-P3(高FITC/低SSC,45.5±4.6%;P<0.001)相比,从模型混合物中使用MACS法,FNRBCs的平均回收率(79.7±0.7%)明显更高。使用抗CD147抗体从TOP后母血中富集的e+FNRBCs的数目比使用抗GPA抗体更高(18个细胞/15ml对12个细胞/15ml);前者用于分析的载玻片的数目减少了55%。使用抗CD147抗体,每个经分析的载玻片上孕早期e+FNRBCs的中位值回收率比使用抗GPA抗体高300%(0.53对0.18)。使用抗CD147抗体,从TOP前母血中富集的e+FNRBC的平均数(±SEM)为20.3±2.8个细胞(范围:6-46)。可以从三位怀有男性胎儿母亲的TOP前母血中分离出FNRBCs,通过用于判定胎儿性别的性别决定区Y(SRY)的聚合酶链式反应(PCR),该FNRBC确实为男性胎儿细胞。此处需要说明的是,CD147可以在FNRBCs上强表达,并且是用于非创伤性产前诊断的从母血中富集FNRBCs的标记物。
胎儿DNA的两种来源,无细胞的胎儿DNA和胎儿细胞,可以在孕早期母血中获得。前者限于检测父系遗传的疾病和21三体性,而后者更适于检测单基因疾病。在进入孕早期母体循环的胎儿细胞中,胎儿有核红细胞(FNRBC)是优选的靶细胞,因为其寿命短,从而不太可能从前次妊娠存留下来,这不同于胎儿淋巴细胞的情况(其中这种现象可能会成为误诊的基础)。孕早期FNRBC包括ε-球蛋白(e),ε-球蛋白(e)是一种理想的胎儿细胞识别符,其可为高度特异的,因为在孕早期后表达减弱。
目前,靶向细胞内的胎儿血红蛋白(HbF)的抗体被用于富集FNRBCs。然而,在某些妊娠中,HbF可以在母体AARBCs中升高。胎儿血红蛋白ζ,虽然更为特异,但具有窄的暂时性表达窗口。在富集期间,需要额外的透化作用步骤以使抗体进入脆性FNRBCs,这样会引起稀有细胞消失。
细胞表面抗原CD71、CD35、CD36、CD45、CD47和GPA最常用于从母血中富集FNRBCs。CD71是一种在所有结合铁的细胞中表达的铁传递蛋白受体,例如,活化淋巴细胞、胎儿滋养层细胞和从爆式红系集落形成单位(burst forming units-erythroid,BFU-e)到网织红细胞期的红系细胞以及母血中的定形成胎儿NRBCs(definitive foetal NRBCs)。虽然CD71在100%的胎儿定形成红血球细胞(foetal definitive erythroblasts)上和96%的母体NRBCs上呈现强阳性,但是其仅在孕前期的~68%的胎儿原始NRBCs上表达。同样地,使用CD71来富集孕前期的FNRBCs可能导致靶细胞损失。CD36在FNRBCs上不表达,而CD35和CD47在FNRBCs和AARBCs上均表达。GPA存在于所有的红细胞中而CD45不存在。
正如本文所述,利用对细胞表面抗原和商业上可得的抗体进行免疫筛选,CD147在FNRBCs上的强烈并可重复的免疫细胞化学染色,表明表面抗原CD147是一种可以用于FNRBC的免疫细胞分选(immunocell sorting)的表面抗原。CD147在整个红细胞系统发展中在红血球谱系上都有表达。表面抗原CD147显示出统计学上显著差异的表达,在FNRBCs上较强(122.46±22.21AU),而在AARBCs上弱/不能检测到(205.11±7.08AU)(P<0.05)。正如本文中所示,利用具有抗CD147的MACS作为主要的分选技术,这是因为相较于其他的技术(FACS12.1%和Dynal56.7%),其显示出从模型混合物中最有效的FNRBCs的回收率(79.7%),。
使用抗CD147抗体从TOP后母血中富集的e+FNRBCs的数目高于使用抗GPA抗体的数目(18个细胞/15ml对12个细胞/15ml);并且前者中分析用载玻片的数量大幅度减少了55%(p<0.05)。相较于抗GPA抗体,使用抗CD147抗体,每个分析载玻片的孕早期e+FNRBC的中位值回收率高出300%(0.53对0.18)
使用抗CD147抗体从TOP后母血中富集的e+FNRBCs的平均数(±SEM)为20.3±2.8个细胞(范围:6-46个细胞),每毫升母血中大约富集有1.11个e+FNRBC。
人工采集的FNRBC的胎儿DNA使用全基因扩增(WGA)技术进行扩增,证实了使用怀有男性胎儿的母体的TOP后母血的男性FNRBC的富集(n=3)。
ε-球蛋白阳性(e+)胎儿有核红细胞(FNRBCs)可以被认为是用于孕早期无创伤性产前诊断的理想胎儿细胞。然而,其在母血中稀少和缺乏特异性表面标记阻碍了其从成体去核红细胞(AARBCs)的压倒性的环境中的富集。在此描述的是,通过免疫细胞化学筛选法进行表面抗原的选择,其分离FNRBCs和AARBCs,允许从母血中富集FNRBCs用于非创伤性产前诊断。
相应地,在本发明的一个方面,提供了从(一种或多种)样本中分离FNRBCs(例如胎儿原始NRBCs(FPNRBCs);胎儿定形成NRBCs(FDNRBCs))的方法,包括:使所述样本与(一种或多种)特异性识别CD147的试剂接触,从而制成一种混合物;保持该混合物处于在所述试剂和样本中的CD147之间形成复合物的状态下;以及从混合物中分离该复合物;从而从样本中分离FNRBCs。
例如,所述的试剂可以是抗体、纳米粒子、量子点。在一个具体的方面,所述试剂为特异性结合CD147的抗体。所述抗体的实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、它们的部分(例如抗原片段)或它们的结合。
在具体实施方式中,FNRBCs为哺乳动物FNRBCs,例如灵长类(例如人类)、犬科、猫科、马科、牛科、羊属、鼠科FNRBCs等等。
在另一方面,提供了一种从样本中检测、分离和/或离析至少一种胎儿有核红细胞(FNRBC)的方法,包括:
a)用离心法在包含选自1.077-1.120g/ml的密度的密度梯度介质中处理样本;
b)使所述样本与特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段接触;
c)保持该混合物处于在所述试剂和样本中的CD147之间形成复合物的状态下;以及
d)从混合物中分离所述复合物;
从而从样本中检测、分离和/或离析FNRBC。
所述抗体或其抗原结合片段的浓度可以至少为1:20,000或1:100。特别地,浓度可为至少大于1:10,000,或者至少小于或等于1:100。通过用至少一种缓冲剂(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)等)来稀释原料来达到所述的抗体浓度。抗体的浓度可以从1:10,000-1:100范围中选择。
根据本发明的任何一个方面的方法可以包括在(b)步骤之前预处理样本的步骤。特别地,样本的处理可以包括在密度梯度介质中离心分离样本。在本发明中使用的密度梯度介质可以包括分散在可熔性凝胶中的胶体。该胶体可以赋予梯度介质所要求的密度。因此,通过改变胶体的浓度,介质的密度会相应改变。胶体的微粒性质能够使密度分离的各层固定化,当处于凝胶状态时避免一层扩散进另一层。更进一步地,胶体能够保持血细胞处于实质上非凝结的状态。赋予介质密度以用在本发明方法的任一方面中的胶体的非限定性实例可以是聚乙烯-吡咯烷酮包被的二氧化硅,例如Pharmacia制造的PercollTM,可从Sigma化学公司得到。
根据本发明的用于富集胎儿有核红细胞的密度梯度介质是高渗性的。在高渗性条件下,红细胞收缩从而变得更加密集。在此条件下,白细胞保持了不变的密度。因此,通过在高渗性介质中有选择地收缩红细胞,所述细胞的密度增加并且其在不同于白细胞的密度的梯度中保持平衡。
通过在离心混合物中加入盐,所述介质可被制作成高渗性的。用于本发明的适合的盐包括氯化钠、氯化钾、或氯化锂、或其任意混合。也可以使用商业上可得的平衡盐溶液混合物,例如,杜伯科氏(Dulbecco)磷酸缓冲盐溶液(PBS),汉克斯氏(Hanks)平衡盐溶液,Earl氏平衡盐溶液等等。
PercollTM溶液具有选自1.000-1.200g/ml范围的密度梯度。特别地,梯度可以选自1.050-1.150、1.100-1120、1.080-1.119、1.078-1.119、1.079-1.119、1.100-1.119g/ml等的范围。特别地,密度梯度可为1.118g/ml。
FNRBCs可以与样本中存在的去核红细胞(ARBCs)中分离。如果需要,可以利用例如免疫磁性分离法、流式细胞计量术或其结合,从混合物中分离免疫复合物。
正如本领域的技术人员将理解的,利用此处所描述的方法分离和/或离析的FNRBCs可以经过进一步的检测,该检测的举例包括荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)、多重配体依赖性探针扩增(multipleligand-dependent probe amplification,mpla)、短腱重复分析(short tendon repeatanalysis)、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)、基因分型、单重序列测定(single plex sequencing)、大规模平行序列测定(massivelyparallel sequencing)等,或其结合。一方面,FNRBCs的进一步检测用于性别辨别。另一方面,FNRBCs的进一步检测用于一种或多种产前异常。所述的一种或多种产前异常包括染色体病、基因病(例如,单基因病;多因子基因病),或其结合。正如本领域的技术人员将理解的,所述的异常可以在OnlineMendelian Inheritance in Man数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)中找到。所述的异常的实例包括唐氏综合征、爱德华兹综合征、帕塔综合征、神经管缺陷、脊柱裂、颚裂、泰-萨克斯病、镰刀形红细胞贫血病、地中海贫血病、囊性纤维病、脆性X染色体综合征、脊髓性肌萎缩、强直性肌营养不良、杭廷顿氏舞蹈病、夏-马-图三氏病、血友病、杜克肌营养不良、线粒体异常、遗传性多发性外生骨疣、成骨不全症及其结合等等。
在具体的方面,本发明涉及一种确定胎儿性别的方法,该方法包括使包含FNRBCs的母体样本与特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段接触,从而产生一种混合物;保持该混合物处于在所述抗体或其抗原结合片段和存在于样本中的CD147之间形成免疫复合物的状态下,从而从样本中分离FNRBCs;以及检测FNRBCs中SRY基因的存在,其中,如果存在SRY基因,则胎儿为男性,而如果不存在SRY基因,则胎儿为女性。
另一的方面,本发明涉及检测样本中的FNRBCs的方法,该方法包括使样本与特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段接触,从而制成一种组合;保持该组合处于在所述抗体和存在于样本中的FNRBC之间形成免疫复合物的状态下;以及检测组合中是否形成免疫复合物;其中,如果检测到免疫复合物,则在样本中存在FNRBCs。本发明还在另一方面进一步包括检测产前异常和/或胎儿性别的方法。
所述方法可以进一步包含一个或多个消耗步骤,其中,使样本进一步与一种或多种去除(例如结合)除了FNRBCs之外的分子的试剂(例如抗体)接触。因此,该消耗步骤可以用于去除背景噪声(例如除FNRBCs之外的细胞)。正如本领域的技术人员将理解的那样,这些分子可以然后通过被所述试剂识别而被检测到,并将其从样本中去除。例如,可以使样本与结合白细胞(WBCs)的针对CD45和/或CD14的抗体接触,从而形成免疫复合物,并且该免疫复合物可以被检测到和/或从样本中去除。去除它们的其他分子和方法对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
此外,所述方法可以进一步包括使样本与一种或多种检测细胞中的细胞核的试剂(例如,核染剂)接触。正如本领域的技术人员将理解的那样,所述的试剂包括Hoescht染剂、DAPI染剂及吖啶橙。
任何适合的生物学样本可以用于所述方法,并且包括生物流体(例如,血液、脐带血)和组织(滋养层组织、肝脏组织、胎盘)。在特定的方面,所述的样本为母体样本(从妊娠母亲获得的样本),在另一方面,所述样本为胎儿样本。在又一方面,所述的样本从孕早期、孕中期或孕晚期的母亲获得。
本发明所属技术领域的技术人员将理解,根据此处给出的方法,不需要经过过度的实验,本发明就可以实施。所述的方法、技术和化学试剂在给出的参考文献中或者来自标准生物技术和分子生物学教科书中的方案中有描述。
实施例
本领域中已知的和未特别描述的标准分子生物学技术一般遵循Sambrook和Green的分子克隆:实验指南,冷泉港实验室(第四版),纽约(2012)。
实施例1
材料和方法
从接受选择性外科终止妊娠手术(TOP)的妇女采集胎盘组织和血液样本是经过科学研究伦理审查委员会(Institutional Review Board)批准的。将血液样本收集到EDTA涂布真空采集管(EDTA coated vacutainer,Becton,Dickinson and Company,USA)中。遵循Ponnusamy等人,2008的实验方案,将FNRBCs从胎盘组织中提取出来。
用市售抗体进行FNRBCs的抗原全貌分析
在FNRBCs和AARBCs上检测针对所选定的AARBCs、其他血细胞及其前身的表面抗原的抗体的免疫反应。遵循在Ponnusamy等人,2008中描述的实验方案,使用针对下列表面抗原的抗体(在鼠中培养,除非另有说明)进行这些抗原在靶细胞上的免疫细胞化学定位:CD34、CD46、CD55、CD100、CD175s、HLA-DR、CD117(在兔中培养)(Neomarkers,Lab Vision,California,USA);CD29、CD31、CD35、CD36、CD44、CD45、CD45RB、CD47、CD59、CD81、CD99、CD108、CD147、CD164、CD222、CD235a、E-钙粘蛋白(BDPharmingen,California,USA);CD14、CD90、CD105、CD133、单羧酸转运体1(MCT1,在兔中培养)(Chemicon,California,USA);及CD233(Sigma-Aldrich,Missouri,USA);HLA-ABC(DAKO,California,USA)。简言之,在室温下将细胞离心涂片载玻片在甲醇/丙酮(v/v,1:1)中固定2分钟,用PBS漂洗并风干。在PBST(1xPBS,吐温20;Sigma,Missouri,USA)中再水化后,进行以下各处理:依次用1)在PBS中按照1:10稀释的山羊血清(Sigma)孵育2小时;用2)在PBS中按照1:100稀释的抗-人的鼠或兔IgG类抗体孵育1小时;用3)生物素化的山羊-抗-小鼠抗体或山羊-抗-兔抗体(Vector Laboratories,California,USA)孵育1小时;用4)与碱性磷酸酯酶结合的抗生物素蛋白链菌素(Vector Laboratories)孵育30分钟。所有的孵育均在室温条件下的加湿室中。孵育之间的所有洗涤均在PBST中进行5分钟。将新制成的Vector蓝底物(Vector Laboratories)加入到载玻片上并在黑暗条件下孵育10分钟。将载玻片在蒸馏水中冲洗30秒;在100%乙醇中脱水30秒;最后风干并在光学显微镜下观察(Olympus BX61,Pennsylvania,USA)。
免疫染色强度的测量
细胞表面上的各种抗体的免疫反应由其染色强度来评分。FNRBCs上强烈的免疫反应情况下,利用绘图软件Adobe Photoshop((Adobe系统)上的光度矩形图程序,计算AARBCs和FNRBCS上的染色强度。将免疫染色细胞的照片以每英寸300点通过反射扫描而数字化。确定阳性细胞中的平均像素强度(从最高至阳性细胞的五个小方格)(n=350-450个细胞),并且确定针对256灰度(任意单位,AU)的光度(亮度)水平。分析数据得到染色强度的统计学显著性(Choolani等,2003)。
掺入AARBCs的FNRBCs的模型混合物
由1x105个FNRBCs和49x105个AARBCs组成的模型混合物用于测试方案的富集效率。AARBCs由采集在EDTA涂布真空采集管(EDTA coatedBecton,Dickinson and Company,USA)中的外周小静脉血制备。使用1×PBS(1:1)稀释血样,在等体积的Ficoll–Paque(Sigma,Missouri,USA)上分层,并进行离心(B Braun Biotech International B5,Pennsylvania,USA;224x g,30分钟)。将等分试样的RBC沉淀物使用1×PBS冲洗三次,用血细胞计数器计数,以制备模型混合物。FNRBCs从胎盘组织中分离出来。
从模型混合物中的富集FNRBCs
对于从模型混合物中富集的FNRBCs的回收率和纯度,评价了三种细胞分选方案。
a.Dyna Beads法
使用Dynabead(Invitrogen公司,California,USA)分离系统从模型混合物(n=5)中富集FNRBCs,根据制造商的说明,同时进行一些修改,进行操作:简言之,细胞在50μl分选缓冲液(分选缓冲液:0.5%BSA/PBS;0.5M EDTA)中混悬并用1μg抗-CD147抗体(BD Pharmingen,California,USA)在4℃条件下孵育30分钟。将经过1×PBS冲洗两次的细胞再次在500μl分选缓冲液中混悬并用5μl经过预先冲洗的结合有Dynabeads M-450(Invitrogen公司)的山羊抗小鼠IgG在4℃条件下在缓慢上下翻滚(end-over-end)旋转下孵育30分钟。使用Dynal磁性微粒浓缩器(MPC,Invitrogen公司)来收集磁性结合细胞(magnetically bound cell)。未结合原料通过抽吸除去并转移到新管中作为阴性部分。将磁性结合细胞冲洗两次并在室温下用释放缓冲液(Flow-Comp释放缓冲液,Invitrogen公司)孵育15分钟来将细胞从磁珠上释放,并在500μl分选缓冲液中混悬。将该管再次置于MPC中2分钟,上清液作为阳性部分转移到新管中。使阳性部分和阴性部分沉淀,重悬在1×PBS中来进行细胞计数以及接着细胞离心到载玻片上(Shandon3,ThermoScientific,Massachusetts,USA)。将载玻片染色用于进一步的分析。
b.磁性活化细胞分选(MACS):
通过MACS的间接磁性标记方法(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)从模型混合物(n=5)中进行FNRBCs的阳性选择。简言之,将细胞用抗CD147(在100μl的最终孵育体积中为1:10,000,BD Pharmingen)在4℃条件下孵育30分钟,用MACS缓冲液(0.5%BSA/PBS;0.5M EDTA;500xg10分钟)冲洗,用结合有大鼠抗小鼠IgG抗体(在100μl的最终孵育体积中每107个细胞20μL,Miltenyi Biotec.)的磁性微珠在4℃条件下孵育30分钟。孵育后的样本冲洗后经过Miltenyi miniMACS磁性柱。从柱中收集阳性部分,冲洗,混悬来进行细胞计数以及接着细胞离心到载玻片上。将载玻片染色用于进一步的分析。
c.荧光激活细胞分选(FACS):
根据制造商的说明,同时进行一些修改,使用FACS Aria(Becton,Dickinson and Company,New Jersey,USA)进行从模型混合物中(n=5)富集FNRBCs的FACS:简言之,在每5分钟轻拍的情况下,用FITC结合抗人CD147抗体(10μl抗体/106个细胞;BD Pharmingen,USA)在4℃黑暗环境下孵育细胞30分钟;在FACS缓冲液(0.5%BSA/PBS;0.5M EDTA)中冲洗并分选。同种型对照染色用于消除假阳性事件。细胞在前向(FITC-高或FITC-低)和侧向分散(FITC-高/SCC-高或FITC-高/SCC-低)上被设门,使用纯AARBC样本及染色的和未染色的模型混合物建立分选门。细胞被分选到4个涂覆有5%BSA(Sigma,Missouri,USA)的15ml Eppendorf(Eppendorf,Germany)管中,并标记为P1-P4(P1-AARBC,P2-FITC-高/SCC-高,P3-FITC-高/SCC-低,P4-碎片)(附图3)。将细胞成颗粒沉淀,再次混悬到适合的容积来进行细胞计数,然后细胞离心涂片到载玻片上来确定纯度。
赖特氏染色法
将细胞离心涂片的载玻片风干并通过依次浸入含有添加剂(Aerofix添加剂,Wescor,Utah,USA)的100%甲醇(3分钟)、噻嗪蓝染色液(Wescor,Utah,USA)(3分钟)、伊红染色液(Wescor,Utah,USA)(3分钟),在蒸馏水中冲洗并风干来进行染色。
用于识别ε-球蛋白阳性FNRBCs的碱性磷酸酶免疫细胞化学
对细胞离心涂片的载玻片进行赖特氏染色以用于FNRBCs的形态识别。记录这些细胞的位置。通过将其置于100%、90%和70%的乙醇中各5分钟而使含有FNRBCs的载玻片脱色。按照Ponnusamy等人,2008中描述的方案,通过碱性磷酸酶免疫细胞化学识别ε-球蛋白阳性FNRBCs。
从母血中富集FNRBCs来比较抗CD147与抗血型糖蛋白A(anti-GPA)的效率
简言之,在妊娠终止手术操作(n=5)的5分钟内采集30ml的外周小静脉血,并将其分为两等分来检测两种MACS方案:在FNRBCs的CD45+细胞的阴性消耗/GPA阳性选择以及CD45+细胞的阴性消耗/CD147阳性选择之后,富集FNRBCs。CD45+白细胞(WBCs)的消耗在两种方案中类似:将15ml血液稀释在PBS(1:1)中,在PercollTM(ρ=1.118g/ml;GE-Healthcare,Uppsala,Sweden)上分层并进行离心分离(3000rpm,30分钟,制动停止)。收集中间层细胞,用含有0.5%BSA的1×PBS冲洗并用结合抗人CD45的微珠(20μl微珠/107个细胞;Miltenyi Biotec)在4℃下孵育30分钟,冲洗除去过量的小珠。使标记的细胞通过LD型MACS柱(Miltenyi Biotec.)。对阴性部分的细胞进行冲洗、计数和处理以在抗GPA或抗CD147MACS操作之后选择FNRBCs:对于使用抗GPA的选择,在4℃用结合抗GPA的磁珠(20μl微珠/107个细胞;Miltenyi Biotec.)孵育细胞30分钟。冲洗所孵育的细胞并用MS柱(MiltenyiBiotec.)分选。冲洗被洗脱的阳性部分(例如CD45-/GPA+)并离心涂片到载玻片上。所有的冲洗均用MACS缓冲液(0.5%BSA/PBS;0.5M EDTA)离心分离10分钟。
对于使用抗CD147的选择,使来自阴性部分的细胞经历两次连续的孵育(在4℃条件下各30分钟,每6分钟轻拍)并在分选前两次孵育之间冲洗:第一次孵育用抗CD147抗体(在1x PBS中1:1000稀释原料抗体;从每107个细胞加入稀释抗体10μl;在100μl最终孵育体积中,BD Pharmingen),以及第二次孵育用结合大鼠的抗小鼠IgG抗体(在100μl的最终孵育体积中每107个细胞40μL,Miltenyi Biotec.)的磁珠。冲洗被洗脱的阳性部分(例如CD45-/CD147+),并细胞离心涂片到载玻片上。通过赖特氏染色对FNRBCs进行形态学上的识别,并通过ε-球蛋白免疫细胞化学确认其身份。
从TOP前母血中富集FNRBCs
在手术操作前采集两批母血样本(TOP前母血样本):第一批样本(各10-20ml;n=14)在进行本文其他部分描述的FNRBCs的CD45+/CD147阳性选择的阴性消耗之后进行处理来计算载玻片上各样本的免疫染色e+FNRBCs的数目。第二批样本(各20ml;n=3),进行同样的处理来富集FNRBCs,该FNRBCs未进行细胞离心涂片但用抗CD45-AF488和烟酸己可碱染剂染色以进行手工细胞挑选。
用于手工细胞挑选的细胞染色
从母血(含有FNRBCs和AARBCs)中富集的CD147+细胞在1ml的培养基中再悬浮,并用5μl的结合荧光基团AF488(Invitrogen,USA)的抗CD45孵育1小时,并加入标记DNA的烟酸己可碱染剂(1μl原料/1ml细胞悬液,原料浓度10mg/ml;Invitrogen,USA),孵育15分钟。细胞在3000rpm条件下旋转5分钟,在培养基中再悬浮。在荧光显微镜(Olympus IX70,USA)下检查染色的细胞,所有的孵育均在37℃条件下进行。人外周血单核细胞用作染色对照,该细胞对CD45和烟酸己可碱均为阳性。
用显微操作器手工挑选烟酸己可碱染色的细胞
在显微操作器(Narishige,Japan)和倒置显微镜(Olympus IX70,USA)的帮助下,手工挑选对烟酸己可碱呈阳性和对CD45-AF488呈阴性的单个FNRBCs。染色的细胞在培养基中进行再悬浮(1-3x106个细胞/100μl的培养基)。在60mm培养皿中,100μl的抗CD45-AF488/烟酸己可碱染色细胞悬液、50μl的培养基(用于收集挑选出的细胞)及50μl的1x PBS(用于冲洗细胞)作为单独的小滴装载。内径为20μm的微量移液管(Origio,USA)置于染色细胞悬液小滴中。识别出烟酸己可碱阳性和CD45-AF488阴性的FNRBCs,将其手工挑选出来,并在转移到PCR管之前,将其连续转移到含有培养基和1xPBS的小滴中,在-20℃条件下贮藏以用于进一步分析。培养基包含Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM,Invitrogen Gibco,USA)+30%胎牛血清(FBS,Biochrom AG,Germany)+1%牛血清白蛋白(BSA,Invitrogen Gibco,USA)+10-4mol/lβ-巯基乙醇(Invitrogen Gibco,USA)+100μg/ml铁饱和转铁蛋白(Sigma-Aldrich,USA)+1%抗生素抗霉菌素(Invitrogen Gibco,USA)。
全基因组扩增(WGA)
使用PicoplexTMWGA试剂盒(Rubicon Genomics,MI,USA)中的7μl细胞提取缓冲液将手工挑选的细胞溶解。使用试剂盒中提供的ExtractionCocktail通过75℃孵育10分钟,接着95℃孵育4分钟,将DNA提取出来。使用PicoplexTMWGA试剂盒(Rubicon Genomics)进行WGA,根据厂商建议扩增16个循环。全部的扩增DNA的样本的质量和数量在进行PCR之前通过凝胶电泳进行评价。来自母体和胎盘细胞的CD45+细胞中的DNA也被提取出来。
用于胎儿性别确定的实时PCR
用PE Applied Biosystems7000型测序仪(Applied Biosystems,CA,US)进行实时PCR分析。分析内源对照β-球蛋白(HBB)和胎儿性别确定的男性性别决定区Y(SRY)。使用下列SRY和HBB引物和探针(AIT Biotech,Singapore):SRY正向,5’-TGG CGA TTA AGT CAA ATT CGC-3’(SEQ IDNO:1);SRY反向,5’-CCC CCT AGT ACC CTG ACA ATG TAT T-3(SEQ IDNO:2)’;SRY探针,5’-(6-FAM)AGC AGT AGA GCA GTC AGG GAG GCAGA(TAMRA)(SEQ ID NO:3);HBB正向,5’-GTG CAC CTG ACT CCT GAGGAG A-3’(SEQ ID NO:4);HBB反向,5’-CCT TGA TAC CAA CCT GCCCAG-3’(SEQ ID NO:5);HBB探针,5’-(VIC)AAG GTG AAC GTG GAT GAAGTT GGT GG(TAMRA)-3’(SEQ ID NO:6)。将已知起始浓度的商业男性基因组DNA(Promega,Madison,USA)连续稀释(5倍)来生成HBB和SRY的标准曲线。在同一测定中,样本和标准品在三份中分离。每一个PCR在三份中包括水空白作为扩增阴性对照。使用TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)在25μl的反应体积中建立反应。SRY和HBB引物在450nM的终浓度中使用以及探针在225nM的终浓度中使用。3微升的WGA产物和60ng的基因组DNA用于扩增。SRY和HBB的热循环以在50℃孵育2min开始,以使尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)发生作用,接着进行在95℃10分钟的第一次变性步骤,然后是95℃15秒和60℃1分钟的55个循环。
统计数值
用SPSS统计软件(SPSS公司,USA)和GraphPad(GraphPad软件公司,USA),以Bonferroni校正后的ANOVA、Wilcoxon符号秩次检验或曼-怀二氏检验,确定统计学差异。
结果
从经历终止妊娠(TOP)的患者获得的胎盘绒毛中提取FNRBCs。通过免疫细胞化学(ICC)来研究在FNRBCs和AARBCs上的31个选定的表面抗原的免疫定位:CD147(Basigin)显示不同细胞类型之间的差异表达。抗CD147抗体用于从模型混合物(FNRBC 1x105个细胞:AARBC49x105个细胞;n=5)中富集FNRBCs,用免疫磁性(磁激活细胞拣选法(MACS)和Dynal系统)和流式细胞计数(FACS)分离方法对回收率进行评价。用抗CD45抗体和抗CD147抗体在DGC/MACS之后从15ml的TOP后母血(n=5)中富集FNRBCs;该方案还与用抗GPA磁珠代替抗CD147作为对比。用形态学和免疫学(e-球蛋白)方法鉴定富集的FNRBCs。计算来自母血的e+FNRBCs的回收率。使用抗CD147从20ml TOP前母血(n=14)中富集FNRBC,并用形态学和免疫学(e-球蛋白)方法鉴定。作为原理验证,从怀有男性的母体内获得20ml TOP前母血(n=3),正如通过SRY基因的聚合酶链反应(PCR)显示于此的,所富集的FNRBCs确实是胎儿细胞。
免疫细胞化学筛选显示表面抗原CD147具有统计学上显著的差异表达,在FNRBCs(122.46±22.21AU)上强,在AARBCs(205.11±7.08AU)上弱/不能检测到。与其他技术相比(FACS12.1%和Dynal56.7%),MACS从模型混合物中回收了79.7%的FNRBCs,并且相对于其他两种技术(13%),所分离混合物的纯度最高的是FACS(64.9%)。使用抗CD147抗体从TOP后母血中富集的e+FNRBCs的数目高于用抗GPA抗体的(16个细胞/15ml对12个细胞/15ml);并且前者用于分析的载玻片的数目大幅度减少55%(p<0.05)。使用抗CD147抗体,相对于抗GPA抗体,每个分析载玻片,妊娠的前三个月的e+FNRBCs回收率中间值高300%(0.53对0.18)。使用抗CD147抗体从TOP前母血中富集的e+FNRBCs的数目的中间值(±SD)为20±3个细胞(范围:6-46个细胞),并且每毫升母血约富集1.16个e+FNRBC。使用单细胞全基因组扩增(WGA)技术扩增来自FNRBCs的胎儿DNA,并且证实了男性FNRBC从怀有男性胎儿(n=3)的母亲的TOP前母血中的富集。
结论
不管目前侵入性的胎儿检测的精确性,唐氏综合症的发生率仍然大约为在1000个出生中为1个。这是由于侵入性检测用于少数妊娠,高龄孕妇(>35岁)。由于在既定胎儿中医源性并发症的风险大于唐氏综合症的发生率,虽然4/5的唐氏综合症婴儿出生于35岁以下的母亲,但是未给他们提供侵入性检测。非创伤性产前诊断(NIPD)能够消除对侵入性胎儿检测的需要。
使用自动化的显微操作、激光捕获显微镜检查系统以及与阵列CGH技术结合的单细胞全基因组扩增的下游分析有可能分离并分析从百万有核母体细胞中回收的少至1个FNRBC的胎儿DNA。因此,并非不可想象的是,从正在进行的整倍体妊娠的母血中富集的很小数目的胎儿细胞(~20个细胞)可能足够进行非创伤性的产前诊断。
目前用于分离FNRBC的方案是耗时耗力的,并且同时分离大量的无核成体红细胞导致纯度低。通过方案中各个步骤的自动操作可以克服上述限制。
在多个步骤的富集方案中,尤其是在第一步密度梯度离心,FNRBCs常常损失。使用微流体分离装置,从大量的母体AARBCs背景中分离FNRBCs是可能的。与新加坡生物工程和纳米技术研究所(Institute of Bioengineeringand Nanotechnology Singapore)合作,已检测了该分离装置。基于FNRBCs和AARBCs的物理性质(例如大小和变形性)发展微流体装置的应用来分离两种不同类型的细胞,FNRBCs和AARBCs。基于硅的叉流式微过滤设备在0.3mL/分钟的流速下从模型混合物中回收74%的FNRBC,损耗一半的AARBCs。这表明在刚过一小时的时间内可以处理20ml的母血。然而,该微流体装置的回收效率可以通过结合纳米图形化的表面和随后涂覆特定的细胞黏附分子而进一步被提高。在表面上涂覆有特定的细胞黏附分子的新的微流体设计显示出提升的分离时间和捕获细胞的比率。
对FNRBC进行手工载玻片扫描严重依赖于观察者。扫描载玻片的持续时间取决于观察者的效率,易受观察者过失的影响。使用如MetaFer(MetaSystems,Altlussheim,Germany)、IMSTAR Pathfinder(Paris,France)和Ikoniscope(Ikonysis,Connecticut,USA)的平台,可以实现该过程的自动化。例如MetaFer系统能够通过结合标记物和荧光染料的形态学自动成像。MetaFer系统平台是高处理量的,因为其用高清晰度的CCD摄影机和自动载玻片装载器进行快速扫描(6-15分钟/载玻片)。自动载玻片装载器具有读取80个载玻片的能力,其能够自动和无监管地将高达十个8片规格的架装载到扫描台上。
使用由加上定制软件的市售菌落挑选仪组成的自动平台,可以筛选并分析从母血中获得的FNRBC。Choi说明了该自动化方法识别和分离靶细胞的效用,达到了100%的选择率和专一性。Long和同事们设计并检验了一种在亮视野显微镜检查中用于细胞识别的有效算法,其避免了用户使用昂贵的荧光探针并受到可利用的荧光通道的数量的限制。
Huang等人(2008)用结合了用于基于大小的细胞分离的微流体芯片(CSM)和用于基于血红蛋白的细胞分离的磁性装置(HE)的微流体系统,从58名孕妇的外周血中富集FNRBCs。该微流体系统能够富集每毫升母血平均37.44个FNRBC(范围:0.37–274.36FNRBC/mL)。CSM/HE系统在2-6小时内能够处理5-20毫升的母体全血。
Kilpatrick等人(2004)和Seppo等人(2008)利用特别用于胎儿细胞的识别和分析的Ikoniscope机器人显微镜检查平台。用两种基本途径研究母体循环内的胎儿细胞的检测;基于FISH的扫描和基于抗体的扫描。在前一种情况中,根据在男性胎儿妊娠中存在的Y染色体来识别胎儿细胞,后者则基于胎儿血红蛋白的表达来识别胎儿细胞。在来自男性妊娠的29个样本的27个中识别出了胎儿细胞。通过允许每周24小时/7天的无监管处理和操作的自动载玻片/盒输送器将多达175个载玻片供给到镜台。
FNRBCs和AARBCs表面上的蛋白质糖基化显示出了差异。通过差示植物凝血素结合选择(大豆凝集素,SBA),这种差异用于细胞分离。Kitagawa等人(2004)凭借从1mL的母血中回收平均6.57+/-7.12个细胞,论证了SBA用于胎儿NRBCs富集的有效性。在相似的研究中,Shinya等人(2004)用SBA分离、显微操作和PCR分析识别了全部七例的胎儿基因。
在此说明的是,CD147在原始FNRBCs上表达强,并且是一种用于无创伤性产前诊断的从母血中富集FNRBCs的标记物。相应的,此处提供用于获取、分选和/或分离FNRBCs的改良的方法
表1.基于FNRBCs和AARBCs上31种抗原的免疫细胞化学染色的平均强度分级
*所有的免疫染色FNRBCs和AARBCs的有代表性的显微照片转换成256灰度(0=黑色以及256=白色)。用Adobe Photoshop制图软件和亮度直方图计算强度值(任意单位,AU)。187.3AU的平均强度值(范围:185.2-189.2AU,n=5)用于作为代表背景染色的截止值。记录每种抗原的FNRBCs和AARCs的平均强度并分级:平均值≥187.3AU的视为未染色(-),187.2-109.9AU为低强度染色(+),≤110.0AU为高强度染色(++)以及细胞的部分染色(±)。
aWilcox符号秩检验P<0.05
表2.在MACS中使用CD147和抗GPA从TOP后母血中富集e+FNRBCs的比较
母亲年龄 | 平均(±SEM):28.4±2.3岁(范围:18-48岁) |
在top时胎儿胎龄 | 平均(±SEM):8.9±0.2周 |
处理的血液的总体积 | 275ml(平均18.3ml,中位数20ml) |
富集的全部e+FNRBC | 304(范围:6-46个细胞/样本) |
e+FNRBC/样本 | 中位数(±SD):20.3±2.8 |
e+FNRBC/ml | 1.11个细胞/ml |
表3.从TOP前母血中富集FNRBCs(n=15)
实施例2
样本
使用人类样本的伦理批准
用于本研究的人类组织和血液样本的采集经新加坡国立保健集团国立大学医院科学研究伦理审查委员会(the Institutional Review Board,NationalUniversity Hospital,National Healthcare Group,Singapore)批准。所有的研究参与者均签署了人的样本的采集和使用的知情同意书。
妊娠的头三个月的胎盘组织
从接受选择性(由于社会原因)终止妊娠外科手术(TOP)的妇女采集孕早期胎盘组织(7+6到10+4周)。通过超声测量胎儿的顶臀长度来判断胎龄。胎盘组织采集自受孕产物内并直接置于含有PBS溶液的无菌容器中。分开地,一小部分胎盘组织被送去作核型分析。
来自接受选择性TOP的妊娠妇女的外周血
TOP前血液样本
在手术操作前从接受选择性TOP的妇女采集外周血样本(10-20ml)到EDTA涂敷真空采集管(Becton,Dickinson and Company,USA)中。
TOP后血液样本
在手术操作完成的5分钟内从接受选择性TOP的妇女采集外周血样本(10-30ml)到EDTA涂敷真空采集管(Becton,Dickinson and Company,USA)中。
来自非妊娠志愿者的外周血
从健康男性和非妊娠女性志愿者采集外周血样本(20ml)到EDTA涂敷真空采集管(Becton,Dickinson and Company,USA)中。
方法
从胎盘组织中分离FNRBCs
将胎盘绒毛从邻近的蜕膜仔细解剖分离,用PBS冲洗两次(First BASE,新加坡)来去除母血污染。将洁净的绒毛切碎,在45ml含有胰蛋白酶(GibcoInvitrogen公司,California,USA)、HBSS(Gibco Invitrogen)、1M HEPES(GibcoInvitrogen)的滋养层消化缓冲液中,37℃条件下适度摇晃孵育20分钟。添加5ml胎牛血清(Sigma-Aldrich,Missouri,USA)终止胰蛋白酶活性,经过70μm细胞过滤器(Becton,Dickinson and Company,New Jersey,USA)过滤,获得单细胞悬浮液,然后将其在室温下在2095×g(Beckman Allegra X-15R,Beckman Coulter,California,USA)离心10分钟。细胞沉淀在5ml的PBS中再次悬浮,在PercollTM1083(GE Healthcare Bio-sciences,Uppsala,Sweden)上分层,在2095×g离心20分钟制动停止。将含有FNRBCs的沉淀用PBS冲洗两次,再次悬浮。
细胞计数
用PBS稀释细胞样本,将10μl置于Neubauer血球细胞计数器(Sigma-Aldrich)上。在显微镜(Olympus BX61,Pennsylvania,USA)下对细胞进行计数。观察4个独立的区域,确定细胞的平均数,N/1mm2(0.1μl体积),计算在原始样本中的细胞浓度(N x稀释度x104/ml)。
细胞离心涂片载玻片的制备
将多达5x104个细胞悬浮在300μl0.5%BSA/PBS(w/v),装载进细胞离心涂片室内,细胞离心涂片机(Thermo Scientific Shandon4Cytospin,Leicestershire,英格兰)内,在载玻片上以500rpm离心5分钟。风干载玻片,立即处理或-20℃条件下贮存在箔和石蜡膜中。将使用抗CD147抗体从母血中富集并显微操作到载玻片上的FNRBCs在700rpm离心5分钟。
通过形态学和免疫细胞细胞化学识别FNRBCs
·赖特氏染色法
将细胞离心涂片的载玻片风干并通过依次浸入含有添加剂(Aerofix添加剂,Wescor,Utah,USA)的100%甲醇(3分钟)、伊红染色液(Wescor)(3分钟)、噻嗪染色液(Wescor)(3分钟)、在蒸馏水中冲洗并风干来进行赖特氏染色。
·胎儿有核红细胞(FNRBCs)的识别
对细胞离心涂片载玻片进行赖特氏染色,用于FNRBCs的形态鉴定。记录这些细胞的位置。通过将其置于100%、90%和70%的乙醇中各5分钟,使含有FNRBCs的载玻片脱色。通过碱性磷酸酶免疫细胞化学证实ε-球蛋白阳性FNRBCs(e+FNRBCs)。在室温下将载玻片在甲醇/丙酮(v/v,1:1)中固定2分钟,用PBS漂洗并风干。在PBST(1xPBS,吐温20;Sigma,Missouri,USA)中再水化作用后,依次用1)在PBS中按照1:10稀释的山羊血清(Sigma)孵育2小时;用2)在PBS中按照1:100稀释的小鼠IgG抗-人ε-球蛋白抗体(Fitzgerald Industries,Massachusetts,USA)在4℃条件下孵育过夜;用3)生物素化的山羊-抗-小鼠抗体(Vector Laboratories)孵育1小时;用4)与碱性磷酸酯酶(Vector Laboratories)结合的抗生物素蛋白链菌素孵育30分钟。所有的孵育均在室温条件下的加湿室中。孵育之间的所有洗涤均在PBST中进行5分钟。将新制成的Vector蓝底物(Vector Laboratories)加入到载玻片上并在黑暗条件下孵育10分钟。载玻片在蒸馏水中冲洗30秒;在100%的乙醇中脱水30秒;最后风干。在光学显微镜(Olympus BX61)下观察载玻片。
密度梯度离心
·PercollTM1118的制备
在市场上购买PercollTM(GE Pharmacia),密度梯度为1.130g/ml。通过用1.5M NaCl(ρ=1.058g/ml)(PercollTM Methodology and Applications2ndEdition,Amersham Pharmacia Biotech,UK)稀释,从该原液制备PercollTM梯度1.083和1.118。根据以下公式制备PercollTM梯度:
其中
V0=PercollTM原液的体积(1.130g/ml)
V=以ml表示的最终的工作溶液的体积
ρ=以g/ml表示的最终的工作溶液的要求的密度
ρ0=以g/ml表示的PercollTM原液的的密度(1.130g/ml)
ρ’=1.5M NaCl的密度(1.058g/ml)
1.5M NaCl补充到最终的工作溶液的体积
·PercollTM1118密度的测量
用Densito30PX密度计(Mettler Toledo,Ohio,USA)进行密度的测量,并且通过添加1.5M NaCl达到1.118g/ml梯度。
·离心分离
母血在PBS中以1:3稀释,在15ml Falcon管(BD Biosciences)中于等体积的PercollTM1118上逐渐分层(母血:PBS:密度梯度1:3:1)。将样本在20℃以2095×g(Beckman Coulter)离心30分钟制动停止。从中间层收集细胞。
用于MACS的抗CD147抗体浓度的滴定
为了确定用于从模型混合物中分离FNRBCs的最佳的抗CD147抗体浓度,制备FNRBCs和成体RBCs的模型混合物(1x105FNRBCs掺入49x105成体RBCs)。用在PBS中以1:100、1:1,000、1:10,000和1:20,000稀释的抗体进行抗CD147的滴定。模型混合物(n=3)依次用用磁珠标记的不同的抗体制品和第二抗体孵育,通过MACS系统分离。用血细胞计数器对从阳性部分和阴性部分收集的细胞进行计数,并将其细胞离心涂片到载玻片上。
从终止妊娠前的母血中富集ε-球蛋白阳性FNRBCs(e+FNRBCs)
采集TOP前母血(10-20ml;n=20),然后在FNRBCs的CD45+细胞的阴性损耗和CD147阳性选择之后进行处理。简言之,将20ml血液在PBS(1:3)中稀释,在PercollTM1118(GE-Healthcare)上分层并进行离心分离。收集中间层细胞,用含有0.5%BSA的1×PBS冲洗并用结合至抗人CD45的微珠(20μl微珠/107细胞;Miltenyi)在4℃下孵育30分钟,冲洗除去过量的小珠。标记的细胞通过LD型MACS柱(Miltenyi)。冲洗阴性部分的细胞,计数并经过两次连续的孵育(在4℃条件下各30分钟,每6分钟轻拍)并在分选前上两次孵育之间进行冲洗:第一次孵育用抗CD147抗体(原料抗体在1x PBS中以1:1000稀释;从每107个细胞加入稀释抗体10μl;在100μl最终孵育体积中,BD Pharmingen),第二次孵育用结合至大鼠抗小鼠IgG抗体(在100μl的最终孵育体积中每107个细胞40μL,Miltenyi Biotec.)的磁微珠。冲洗被洗脱的阳性部分(即,CD45-/CD147+),并将其细胞离心涂片到载玻片上。通过赖特氏染色进行FNRBCs形态学鉴定,并通过ε-球蛋白免疫细胞化学来证实其身份。将细胞离心涂片到载玻片上。对载玻片进行赖特氏染色并进行形态学观察。识别含有FNRBCs的载玻片,脱色用于ε-球蛋白免疫细胞化学。
从终止妊娠前的母血中富集FNRBCs和在显微操作器协助下的FNRBCs手工细胞挑选
采集TOP前母血(10-20ml;n=8),在上述的FNRBCs的CD45+细胞的阴性损耗和CD147阳性选择之后进行处理,来富集FNRBCs,用于在显微操作器协助下的手工细胞挑选。根据上文所述,对来自CD147+部分的细胞进行染色,并进行在显微操作器协助下的FNRBCs的手工细胞挑选。
用于在显微操作器协助下的手工细胞挑选的从母血中富集的CD147+细胞的荧光染色
从母血(含有FNRBCs和AARBCs)中富集的CD147+细胞在1ml的培养基1中再悬浮,并用5μl的结合至荧光基团AF488(Invitrogen)的抗CD45孵育1小时,加入DNA标记烟酸己可碱染剂(1μl原液/1ml细胞悬液,原液浓度10mg/ml;Invitrogen,USA),孵育30分钟。细胞在3000rpm条件下旋转5分钟,在培养基中再悬浮。在荧光显微镜(Olympus IX70)下检查染色的细胞。所有的孵育均在37℃条件下进行。人外周血单核细胞用作染色对照,该细胞对CD45-AF488和烟酸己可碱均为阳性。1培养基:Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(Invitrogen Gibco)+30%胎牛血清(Biochrom AG,Germany)+1%牛血清白蛋白(Invitrogen Gibco)+10-4mol/lβ-巯基乙醇(Invitrogen Gibco)+100μg/ml铁饱和转铁蛋白(Sigma-Aldrich)+1%抗生素抗霉菌素(InvitrogenGibco)。
使用显微操作器进行烟酸己可碱染色细胞的手工分离
用显微操作器(Narishige,Japan)和倒置显微镜(Olympus IX70),挑选出烟酸己可碱阳性和CD45-AF488阴性的单个FNRBCs。染色的细胞在培养基中进行再悬浮(1-3x106个细胞/100μl的培养基)。在60mm培养皿中,100μl的CD45-AF488/烟酸己可碱染色细胞悬液、50μl的培养基(用于收集挑选出的细胞)及50μl的1x PBS(用于冲洗细胞)作为单独的小滴装载。内径为20μm的微量移液管(Origio,USA)置于染色细胞悬液小滴中。识别出烟酸己可碱阳性和CD45-AF488阴性的FNRBCs,将其手工挑选出来,并在转移到PCR管之前,将其连续转移到含有培养基和1x PBS的小滴中,在-20℃条件下贮藏以用于全基因组扩增。
全基因组扩增(WGA)
使用SureplexTMWGA试剂盒(BlueGnome,Cambridge,England)中的3μl细胞提取缓冲液将手工挑选的细胞溶解。使用试剂盒中提供的ExtractionCocktail通过75℃孵育10分钟,接着95℃孵育4分钟,将DNA提取出来。使用SureplexTM WGA试剂盒(Rubicon Genomics)进行WGA,根据厂商建议扩增16个循环。在进行PCR之前,通过测定来评价全部的扩增DNA样本的质量和数量。
用在TE中的2μg/mL原液标准(Promega,Wisconsin,USA)制成DNA标准曲线。根据下表4中的稀释度制成从1ng/mL到1μg/mL的五点标准曲线。将(Promega)加入到在96孔微孔板中的工作用液中,充分混合并在室温下避光孵育5分钟。在96孔微孔板中样本DNA各自在TE中稀释至100μl的最终体积。将100μl加入到样本孔中。混合物在黑暗条件下孵育5分钟,用DTX800/880多模检测器(Beckman Coulter)测量荧光。
表4.为从1ng/mL到1μg/mL的五点标准曲线准备的稀释度
来自母体CD45+细胞和胎盘组织的DNA提取物
将DNA提取物溶液(1M Tris-HCl pH8.0,0.5MEDTA,无菌水,蛋白酶K,10%SDS)加入到母体CD45+细胞/切碎的胎盘组织并在50℃条件孵育过夜。将上清液转移到新管中,加入等体积的苯酚:氯仿(Invitrogen)。将溶液涡旋直至呈乳状,在2095x g条件下离心分离10分钟。将上清液收集到新管中,加入等体积的异丙醇。将管轻柔倒置,直到DNA线可见。DNA线用70%乙醇在13,000rpm条件下清洗2分钟两次,并晾干。DNA在100μl TE缓冲液中重悬。
用于胎儿性别确定的实时PCR
用PE Applied Biosystems7000型测序仪(Applied Biosystems,California,USA)实现实时PCR分析。分析内源对照β-球蛋白(HBB)和确定胎儿性别的男性性别决定区Y(SRY)。使用以下的SRY和HBB引物和探针(AIT Biotech,Singapore):SRY-正向,5’-TGG CGA TTA AGT CAA ATTCGC-3’(SEQ ID NO:1);SRY-反向,5’-CCC CCT AGT ACC CTG ACA ATGTAT T-3(SEQ ID NO:2)’;SRY-探针,5’-(6-FAM)AGC AGT AGA GCA GTCAGG GAG GCA GA(TAMRA)(SEQ ID NO:3);HBB-正向,5’-GTG CAC CTGACT CCT GAG GAG A-3’(SEQ ID NO:4);HBB-反向,5’-CCT TGA TACCAA CCT GCC CAG-3’(SEQ ID NO:5);HBB-探针,5’-(VIC)AAG GTG AACGTG GAT GAA GTT GGT GG(TAMRA)-3’(SEQ ID NO:6)。将已知起始浓度的商业男性基因组DNA(Promega)连续稀释(5倍)来生成HBB和SRY的标准曲线。在同一测定中,样本和标准品在平行进行三份。对于每一个PCR,在三份中包括水空白作为扩增阴性对照。使用TaqMan Universal PCR MasterMix(Applied Biosystems)设置在25μl的反应体积中建立反应。SRY和HBB引物在450nM的终浓度中使用以及探针分别在225nM的最终浓度中使用。3微升的WGA产物和60ng的基因组DNA用于扩增。SRY和HBB的热循环都以在50℃孵育2min开始,以使尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)发生作用,接着进行在95℃10分钟的第一次变性步骤,然后是95℃15秒和60℃1分钟的55个循环。
用于釉原蛋白(AMXY)的荧光定量PCR
用于AMXY短串联重复(STR)标记的QF-PCR分析在25μl反应体积中进行,该反应体积含有5ng基因组DNA或3μl(WGA产物)、0.1-0.4μM的各个荧光标记物或未标记引物(AIT Biotech)和1x PCR multiplex mastermix(Qiagen,Hilden,Germany)。在95℃变性作用2分钟前,将一微升扩增的等位片段与9.5μl甲酰胺和0.5μl Genescan-500Rox(6-羧基-X-若丹明)(Applied Biosystems)在96孔反应板的尺寸标准混合并在4℃冷却2分钟,以用于使用ABI Prism310遗传分析器(Applied Biosystems)的毛细管电泳和使用GeneScan分析软件版本3.1(Applied Biosystems)的分析。
从母血中显微操作的FNRBCs的荧光原位杂交(FISH)
将来自CD147分选的母血和相应的绒毛(对照)的FNRBCs显微操作到用金刚石划线器预先标记来标示位置的载玻片上。每个在载玻片上加载FNRBCs(范围:8-15个FNRBCs)。在开始FISH步骤前,将载玻片在700rpm条件下细胞离心5分钟并在光学显微镜下观察以确认FNRBCs的位置和数目。通过在60℃干热仪(thermal block)上逐滴加入Carnoys固定剂(3:1甲醇:乙酸)将FNRBCs固定。将载玻片浸入到2x柠檬酸钠缓冲盐水(SSC;3MNaCl,0.3M柠檬酸钠,pH7.0)并在37℃条件下孵育30分钟。然后,用在10mM HCl中稀释的胃蛋白酶(0.005%),将载玻片在37℃条件下孵育13分钟。将载玻片在室温条件下用1x PBS冲洗5分钟。将载玻片置于1%福尔马林的固定液中,在室温条件下孵育5分钟,并用1x PBS再次冲洗。通过将载玻片在室温下连续置于逐步增加的乙醇浓度(70%,85%,100%)中各一分钟,将其脱水。将载玻片在含有70%甲酰胺(pH7)的变性溶液中孵育5分钟。将载玻片置于冰冷的70%乙醇中,接着用90%和100%乙醇脱水。Vysis CEP光谱橙X和光谱Y绿探针(Vysis AneuVysion Multicolor DNA Probe Kit,Abbott Laboratories,Abbott Park,Illinois,USA)应用于所有的样本中。CEP探针与杂交缓冲液(在2×SSC中50%甲酰胺和10%硫酸葡聚糖,pH7.0)以2:3的比率混合。在每个载玻片中加入三微升探针。直接使用LSI探针。在载玻片上盖上盖玻片并用石蜡膜密封。将靶DNA在原位杂交区(MJ Research,Waltham,USA)上在75℃条件下变性7分钟,接着在37℃条件下杂交16h。去掉盖玻片,然后用0.4x SSC/0.3%(NP)-40在73℃冲洗2分钟并用2xSSC/0.1%(NP)-40在室温下冲洗2分钟进行杂交后冲洗。将载玻片在室温下风干,然后用6μl DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚)作为复染剂封片。将22mm的盖玻片装载上以使DAPI均匀涂布,然后用指甲油密封。在落射荧光显微镜(BX51,Olympus America Inc.,Center Valley,PA,USA)内的单带通和双带通滤波器组(DAPI,绿色,橙色,浅绿色)(Abbott Laboratories)下目测荧光信号并计数,该显微镜配有摄影机(Applied Imaging,Grand Rapids,MI,USA)用于捕获图像。使用FISHView,2.0EXPO(ASI,Carlsbad,USA)捕获图像。
统计数值
使用的参数统计:平均值、标准差(SD)、样本量(n)、标准误差(SE)、均数的标准误差(SEM)、95%置信区间(CI)、单向方差分析(ANOVA)及Bonferroni校正后分析。对于非参数统计,使用Wilcoxon符号秩次检验、曼-怀二氏“U”检验和线性回归分析。使用的SPSS统计软件(SPSS Inc.USA)和GraphPad(GraphPad Software Inc.,California,USA)用于数据的统计分析。
结果
用于MACS细胞分选的CD147抗体的稀释度的测定
CD147抗体结合至FNRBCs和成体RBCs。抗CD147抗体与成体RBCs的结合是可变的,尽管通常弱于FNRBCs。因此,进行抗体滴定实验来确定所需的抗体最佳浓度。选择用于将来实验的最佳抗体稀释度的标准:1)在CD147阳性部分(CD147+)中FNRBCs的最大回收率,2)在阴性部分(CD147-)中FNRBCs的最小回收率,以及3)来自阳性部分(CD147+)的成体RBCs的最大损耗。
对于1:100的抗体浓度,FNRBCs从CD147+部分和CD147-部分的平均回收率分别为94.0±1.6%(SD=2.8)和1.0±0.1%(SD=0.3)(图8)。CD147+部分中的成体RBCs的平均回收率为97±1.3%(SD=2.2),成体RBCs只有3%的损耗(图8)。对于1:1,000的抗体浓度,FNRBCs从CD147+部分和CD147-部分的平均回收率分别为90±4.4%(SD=7.7)和1.0±0.3%(SD=0.6)。成体RBCs从CD147+部分的损耗为5%,平均回收率为95±2.5%(SD=4.4)(图8)。对于1:10,000的抗体浓度,FNRBCs从CD147+部分和CD147-部分的平均回收率分别为79.6±5.2%(SD=9.0)和6.4±1.0%(SD=1.8)。成体RBCs从CD147+部分的平均回收率为11.3±4.8(SD=8.4),导致成体RBCs的损耗为88.7%(图8)。对于1:20,000的抗体浓度,FNRBCs从CD147+部分和CD147-部分的平均回收率分别为65±4.0%(SD=7.0)和22.3±6.8%(SD=11.8)。来自CD147+部分的成体RBCs的损耗为87.1%(12.9±1.6%SD=2.7),与1:10,000相似(图8)。
在测试的四组抗体浓度中,1:10,000的抗体浓度的结果是令人满意的。1:10,000的浓度满足三个标准:FNRBCs在CD147+中的最大回收率,FNRBCs在CD147-中的最小回收率,以及成体RBCs在CD147+中的最大损耗。对于成体RBCs,抗体浓度1:10,000和1:20,000具有相似的损耗率,然而,FNRBCs从CD147+部分的回收率在1:20,000中更低。因此,FNRBCs在其表面表达更高量的CD147抗原(图1),即使使用稀释的抗体浓度(1:10,000),也允许抗CD147抗体更顺利更容易结合存在于FNRBCs的CD147表面抗原。在成体RBCs中,表面抗原CD147的表达比FNRBCs中的低得多(图1),因此,不太可能结合抗CD147抗体。
在终止妊娠(TOP)操作之前采集的母血中富集e+FNRBCs
为了确定用抗CD147抗体的方案是否能够从在孕前期终止妊娠获得的母血样本中富集胎儿前成红细胞(FNRBCs),在选择性妊娠终止操作之前立即采集外周血(15-20ml;n=20),并立刻处理。用PBS1:3稀释上述血液,在PercollTM1118上分层并离心。收集中间层,进行CD45+细胞的阴性损耗/细胞的CD147阳性选择。将细胞经细胞离心涂片到载玻片上。对载玻片进行赖特氏染色用于FNRBCs的形态学识别。将具有鉴定出FNRBCs的载玻片脱色并进行免疫细胞化学方法以在这些细胞中识别ε-球蛋白。激光捕获ε阳性FNRBCs(1、3、5个e+FNRBCs),显微切割并弹射进入PCR管中。通过全基因组扩增技术扩增细胞,进行阵列比较基因组杂交。
对经细胞离心涂片到载玻片上的细胞进行赖特氏染色并以形态学识别FNRBCs(图9)。将含有FNRBCs的载玻片脱色,用于识别ε-球蛋白的免疫细胞化学方法显示FNRBCs源于胎儿(图10)。e+FNRBCs的平均回收率为每个样本25.1±22.9(表5)。在所有的样本中都回收到e+FNRBCs,其范围在1-105个细胞;在9±0.8周平均胎龄获得的母血中,每ml母血获得大约1.32个e+FNRBCs(表5)。来自怀有具有46,XXX异常胎儿(如之后通过染色体组型分析所证实的)的一种母血样本具有更高数目的e+FNRBCs(55个e+FNRBCs对在整倍体情况下的19个e+FNRBCs;p>0.05)。另一个具有最高数目的e+FNRBCs(105个细胞)的样本具有正常的染色体组型,然而,除了全血细胞计数表明小红细胞浅色性贫血之外,对母体临床史更近距离的观察没有显示任何临床原因。这可能引起胎儿通过有核红细胞的快速生成发动对慢性缺氧的生理反应。
表5密度梯度离心之后e+FNRBCs的富集和从TOP前母血(n=20)中的CD45/CD147分选。
*具有贫血症和异常胎儿69,XXX临床史的患者
**排除来自具有贫血症和异常胎儿46,XXX临床史的患者的e+FNRBCs
这些e+FNRBCs可以被激光捕获显微切割,并进行用于基因诊断的阵列CGH。从具有男性胎儿的妊娠中得到的TOP前母血样本中获得CD147+富集的ε-球蛋白阳性FNRBCs的初步数据(图11)。激光显微切割(LCM)所述e+FNRBCs并弹射至PCR管中。来自这些细胞(1,3,5FNRBCs)的DNA材料通过全基因组扩增(WGA)分别扩增,并进行基于微点阵的比较基因组杂交(aCGH)。通过XY信号的存在,1、3和5个FNRBCs的阵列轮廓证实细胞源于胎儿(图11D,E,F)。
在全部样本中都实现了e+FNRBCs的稳定富集和识别。这些数据显示FNRBCs存在于孕早期母血内,使用胞内抗血红蛋白-ε单克隆抗体通过免疫表型分析证实其身份。其余的具有从母血中富集FNRBCs,然而用于证实FNRBCs的身份的方法主要是基于形态学,不证实胎儿身份。每ml母血1-1.3个e+FNRBCs的回收率与之前的用其他策略证实胎儿身份的早期报告一致。从母血样本富集e+FNRBCs也尝试了其他方法,这些方法具有不一致的回收率。
在20个样本中,检测到一个具有69,XXX的胎儿的异常妊娠(之后通过染色体组型证实)。从三倍体怀孕的母血中富集总共55个e+FNRBCs,高于正常妊娠中每个样本中19个e+FNRBCs的平均值。据报道,在非整倍体妊娠中,胎儿细胞在母体血液循环中更多。在胚胎中染色体异常或胎盘膜异常存在的情况下,这将间接地增加胎儿细胞的运输进入母血。
可以激光捕获显微切割这些e+FNRBCs,并进行用于基因诊断的阵列CGH。初步结果是有前景的;然而,为了在提供诊断服务前使基因预测(geneticcalls)容易且精确,需要进一步的优化以减少信噪比。
从孕早期终止妊娠前母血中富集FNRBCs,用显微操作器手动收集和下游的分子分析
为了确定用抗CD147抗体的方案是否能够从在孕早期终止妊娠获得的母血样本中富集胎儿前成红细胞(FNRBCs),且是源于胎儿的,在选择性妊娠终止处理之前立即采取外周血(10-20ml;n=8),并立刻处理。用PBS1:3稀释上述血液,在PercollTM1118上分层并离心。收集中间层,进行CD45+细胞的阴性损耗/细胞的CD147阳性选择。来自CD147+部分的细胞用Hoechst和CD45-AF488染色,并用显微操作器进行人工拣选(图12)。在可能时,FNRBCs被分为10个细胞的组。
结果显示,基于核染色(Hoechst+)的存在、表面抗原CD45(CD45-AF488-)的不存在和形态学,能够区分FNRBCs与CD147+部分中的其他有核细胞。通过荧光染色法识别从TOP前母血样本(n=8)中富集的FNRBCs。在形态学上,FNRBCs具有更高的细胞质:核的比率(图13A),并且当在溶液中荧光染色时,能够识别FNRBCs并用显微操作器手工挑选用于转移到PCR管中(图12E):FNRBCs为CD45-阴性和在荧光显微镜下Hoechst染色(蓝色)(在图13C中显示为灰色)。单核WBCs对于抗CD45-AF488和Hoechst染色均呈阳性(图13D)。
该方法回收了平均53±17.3个FNRBCs(范围:8-151个细胞)(表6)。在每个连续的样本中都回收了细胞,并且在8.7±0.9周平均胎龄的情况下,每ml母血中得到约2.7个FNRBCs(表6)。除了一个具有3号染色体三体性(39FNRBCs)以外,所有的胎儿具有正常的染色体组型。两个样本具有比预期更高的FNRBCs数目,分别为103和151,然而,尚未发现明显的临床原因来解释在这两种情况下从母血中获得的高数目的FNRBCs。
表6密度梯度离心后富集FNRBCs和从TOP前母血(n=8)中的CD45/CD147分选。
在所有8个母血样本中都观察到FNRBC(Hoechst+/CD45-AF488-)的稳定富集和显微操作。通过荧光染色和显微操作,每ml母血回收平均2.7个FNRBCs(范围:8-151个细胞/样本)。其余的报道使用显微操作成功回收FNRBCs,大多数具有类似于上述数据的回收率。另一个利用使用ε血红蛋白识别的显微操作细胞的报道在91%的这些案例中通过QF-PCR确认了性别。显微操作还用于收集胎儿细胞来诊断异常妊娠,包括杜克肌营养不良、恒河猴血型阳性(rhesus D)和血红蛋白病变(haemog lobino pathies)。从7ml的母血中获得平均3.2个胎儿细胞(每个样本1-7个细胞)来诊断杜克肌营养不良。使用从4例终止妊娠后母血中分离的细胞(1.8个FNRBCs/ml母血)诊断恒河猴血型阳性。其他的回收平均1.4个FNRBCs/ml母血(每个样本7-22个细胞)来诊断血红蛋白病变,例如镰刀形红细胞贫血病和β-地中海贫血。
在本研究中,通过在8个母血样本中显微操作收集的FNRBCs(烟酸己可碱+/CD45-AF488-)用于进一步确定其源于胎儿。
从母血中富集的显微操作FNRBCs的胎儿来源的证实
A.全基因组扩增
基于形态学和核染剂(烟酸己可碱)在抗CD147抗体分离后显微操作器辅助拣选从母血中富集的FNRBCs。为了验证操作的细胞确实是源于胎儿,需要事先扩增FNRBC遗传物质以用于下游的分子分析。FNRBCs的全基因组扩增并评价扩增物质的产量。
将用上述方案获得的FNRBCs收集在每个管中10个FNRBCs的组中。进行FNRBC样本(n=8)的全基因组扩增和扩增后DNA产量的picogreen测量。将该产量与从绒毛组织(对照)手工挑选的10个FNRBCs的DNA扩增相比较。
结果显示,来自母血的10-FRNBCs的平均DNA产量为5.9±0.8μg(平均值±SEM)(SD=2.4;95%CI3.9–7.9)(图14),比存在于理论上计算的10个细胞中基因组DNA的产量高89x103倍(图15)。来自绒毛的10-FNRBCs的平均DNA产量为6.7±0.5μg(平均值±SEM)(SD=1.5;95%CI5.5–7.9),比存在于理论上计算的10个细胞中基因组DNA的产量增加了101x103倍(图15)。尽管来自从绒毛获得的10-FNRBCs的平均DNA产量高于来自母血的产量,但尚未见到观察到显著性差异(p>0.05)(图14)。
从母血中手工挑选的FNRBCs的全基因组扩增之后的DNA产量可以与从绒毛(用作对照)挑选的FNRBCs的DNA产量相媲美。全基因组扩增使遗传物质的量增加大约90倍,因此确保下游的分子分析。
B.用于确定胎儿性别的实时聚合酶链式反应(PCR)
为了用男性性别决定区Y(SRY)通过实时PCR确定从母血中富集的显微操作FNRBCs的胎儿起源,用3μl来自FNRBCs的WGA扩增的DNA进行用于SRY和人β-球蛋白(HBB,内源性对照)的实时PCR(n=8)。作为对照,在每个实验中也分析了来自从绒毛中手工拣选的FNRBCs扩增的DNA、胎儿基因组DNA(从滋养层组织提取)、母体基因组DNA(从CD45+WBCs提取)、男性基因组DNA和女性基因组DNA。
结果显示,经遗传验证,获得的FNRBCs源于胎儿。通过用于SRY的实时PCR证实了从怀有男性胎儿的妊娠中富集的FNRBCs(75%),而通过不存在SRY和存在HBB确定了从怀有女性胎儿的妊娠中富集的FNRBCs(100%)(图16,表7)。准确地预测了8例中7例的胎儿性别(图18,表8)。
表7从怀有男性和女性胎儿的妊娠中的母血中富集的FNRBCs中SRY和HBB的存在。
除了一例外,用抗CD147抗体富集和显微操作的FNRBCs证实为源于胎儿。通过来自怀有男性的四个样本中的一个的FNRBCs的实时PCR的SRY扩增是不成功的,虽然通过定量荧光PCR(QF-PCR)显示AMELY基因(釉原蛋白Y)存在于相同的样本中,表明是男性。这可能是由于少量DNA的PCR所特有的等位基因撤除(ADO)的问题。ADO的准确起因尚不明确。ADO最有可能在靶分子实现扩增前,在初级PCR的最初循环中发生。有人建议,ADO可能来自:1)次适度的PCR条件,2)不完全的细胞溶解,3)DNA双链的未完全分离;4)DNA链断裂,5)制备期间DNA损伤或损坏,6)引物和Taq聚合酶限制接触靶基因序列(G/C富集区)降低了变性效率,用于诊断β-细胞贫血的从母血中分离的FNRBCs的PCR成功率观察到<40%,可能是由这些细胞的自然凋亡和稠核引起。单细胞扩增具有高的ADO发生率,一些研究者建议为了实现100%的扩增效率以及ADO发生率接近0,最小需要三个细胞。
C.用于釉原蛋白(AMXY)的定量荧光PCR
为了利用釉原蛋白(AMXY)胎儿性别鉴定通过定量荧光PCR确定从母血中回收的显微操作FNRBCs是源于胎儿的。釉原蛋白基因是位于Xp22.1-Xp22.3(AMELX)和Yp11.2(AMELY)上的单拷贝基因。AMELX提供103bp扩增子,而AMELY产生108bp扩增子。在从FNRBCs扩增的DNA上进行用于釉原蛋白(AMXY)的QF-PCR(n=8)。作为对照,分析从绒毛中手工挑选的FNRBCs和母体基因组DNA扩增的DNA。
结果显示,通过QF-PCR分析,经遗传证实,取得的FNRBCs源自胎儿。从怀有男性胎儿的母血中获得的男性胎儿细胞通过釉原蛋白(AMXY)上的两个等位基因(103和108)被证实,然而,从怀有女性胎儿的母血中获得的女性胎儿细胞通过AMXY的单等位基因(103)被确定(图17)。在MB2和MB4中(从怀有男性胎儿的母血中获得的FNRBCs),只有108等位基因(AMELY基因)被扩增,观察到AMELX的等位基因撤除。然而,所有8例的性别均被准确预测(图18)。
表8来自母血的用于FNRBCs的釉原蛋白的QF-PCR
用抗CD146抗体富集和显微操作的FNRBCs的QF-PCR分析能够证明细胞属于胎儿,并且通过染色体组型确定各自的性别。在8例中的两例中,看到了ADO,同时在男性胎儿中扩增AMELX失败,然而,AMELY基因在这两例中成功地扩增,证明了其性别为男性。
D.来自母血中的显微操作FNRBCs的荧光原位杂交(FISH)
为了进行来自母血中的显微操作FNRBCs的荧光原位杂交(FISH),测试从6个终止妊娠(TOP)后母血和1个终止妊娠(TOP)前母血中的显微操作FNRBCs。将相应的绒毛FNRBC显微操作到载玻片上作为对照。
结果显示,在全部的TOP后和TOP前样本中,至少一个FNRBC中观察到CEP XY信号。每个样本中的阳性信号的数目不同(图9)。FISH信号显示在图19中。
表9在来自终止妊娠后和终止妊娠前的母血的显微操作FNRBCs的FISH的总结
°MB79–在载玻片上加载10个细胞,但只有2个细胞在FISH后被定位,并且二者都为阳性FISH信号。
*MB84–10个细胞被加载到载玻片上,但只有2个细胞在FISH后被定位。两个中的一个显示出清晰的FISH信号。
结论
抗147抗体显示了其可以用于稳定地从母血中富集e+FNRBCs,并且FNRBCs能够可靠地被识别和收集以用于通过WGA扩增,并且适合用于通过实时PCR和定量荧光PCR进行基因诊断。来自母血的显微操作FNRBCs还显示可以被修饰用于荧光原位杂交技术分析。综合以上的结果,说明抗CD147抗体用于从母血中富集FNRBCs以进行孕早期无创伤产前诊断的潜在用途。
此处引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导通过引用的方式以其整体并入本发明中。
尽管本发明参照实施例做了特别的展示和说明,应当理解,对于本领域的技术人员来说,在不背离所附的权利要求所包含的本发明的保护范围的情况下,做出形式上和细节上的改变是显而易见的。
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Claims (26)
1.一种从样本中检测、分离和/或离析至少一种胎儿有核红细胞(FNRBC)的方法,包括:
a)用离心法在包含选自1.077-1.120g/ml的密度的密度梯度介质中处理样本;
b)使样本与在至少1:20,000的浓度下的特异性结合CD147的抗体或其抗原结合片段接触,从而制成一种混合物;
c)保持该混合物处于在所述试剂和样本中的CD147之间形成复合物的状态下;以及
d)从混合物中分离所述复合物;
从而从样本中检测、分离和/或离析FNRBC。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述抗体或其抗原结合片段的浓度选自至少1:10,000、至少1:1000和1:100。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述密度梯度介质包括PercollTM溶液。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述的PercollTM溶液具有1.118g/ml的密度梯度。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其结合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,利用免疫磁性分离法、流式细胞计量术或其结合,从所述混合物中分离免疫复合物。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述样本是母血、母体组织、脐带血或其结合。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述的母体组织是滋养层组织、肝脏组织、胎盘组织或其结合。
9.根据权利要求7所述的方法,其中,每毫升母血中分离出大约1.16个e+FNRBCs。
10.根据权利要求7所述的方法,其进一步包括使所述母血与特异性结合至少一种白细胞上的至少一种标记物的抗体或其抗原结合片段接触。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述标记物为CD45、CD14或其结合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括使所述样本与核染剂接触。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述核染剂为烟酸己可碱染剂、DAPI染剂、吖啶橙或其结合。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,从免疫复合物中进一步分离所述FNRBC。
15.根据权利要求14所述的方法,其中,从免疫复合物中分离所述FNRBC包括将所述免疫复合物置于低pH。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,进一步检测所述FNRBC用于性别辨别。
17.根据权利要求16所述的方法,其中,用于性别辨别的检测是确定SRY基因的存在,其中,如果存在SRY基因,则胎儿为男性,而如果不存在SRY基因,则胎儿为女性。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,使用全基因组扩增和实时聚合酶链式反应(PCR)检测SRY基因。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,进一步检测所述FNRBC用于至少一种产前异常。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,所述的产前异常选自染色体病、基因病或其结合。
21.根据权利要求20所述的方法,其中,所述的产前异常选自唐氏综合征、爱德华兹综合征、帕塔综合征、神经管缺陷、脊柱裂、颚裂、泰-萨克斯病、镰刀形红细胞贫血病、地中海贫血病、囊性纤维病、脆性X染色体综合征、脊髓性肌萎缩、肌强直性营养不良、杭廷顿氏舞蹈病、夏-马-图三氏病、血友病、杜克肌营养不良、线粒体异常、遗传性多发性外生骨疣、成骨不全症及其结合。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述的FNRBCs用荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链反应(PCR)、多重配体依赖性探针扩增(mpla)、短腱重复分析、阵列比较基因组杂交(CGH)、基因分型、单重序列测定、大规模平行序列测定或其结合进行进一步的检测。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述的FNRBCs来自孕早期、孕中期或孕晚期的母亲。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述FNRBCs为人FNBRCs。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述样本包含至少一种去核红细胞(ARBC)。
26.根据权利要求25所述的方法,其中,所述ARBC为成体去核RBC(AARBC)。
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