CN110904254A - 一种加林疏螺旋体实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用 - Google Patents

一种加林疏螺旋体实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于病原体检测技术领域，尤其涉及一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。本发明针对加林疏螺旋体特异性的保守基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，同时采用人内源性β球蛋白管家基因作为内参基因，采用β球蛋白特异性引物和探针检测标本中内参基因DNA，利用实时荧光定量PCR技术能够更快速、准确且灵敏地检测出加林疏螺旋体，特异性强、灵敏度高，在进行病原体定性分析的同时还能进行病原体定量分析，定量线性范围好；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。

Description

一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试 剂盒、检验方法及其应用
技术领域
本发明属于病原体检测技术领域，尤其涉及一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。
背景技术
加林疏螺旋体(Borreliae garinii)属于螺旋体科、疏螺旋体菌属。加林疏螺旋体是一种人畜共患的病原体，它能通过蓖麻子硬蜱和全沟硬蜱等节肢动物叮咬后，在啮齿类动物和人之间传播。加林疏螺旋体感染人后可导致发热、寒战、肌肉疼痛、关节炎、皮肤出现皮疹，严重的可导致中枢神经系统疾病，包括剧烈头痛、脑神经麻痹、轻度截瘫和四肢瘫痪等。
但是，目前针对加林疏螺旋体的现有检测方法如细菌培养、血清中和、ELISA及免疫荧光等，均存在操作繁琐、周期长，特异性差等弊端，急切需要开发一种新的能够快速且准确对病原体进行鉴定的方法。市面上已有一种针对加林疏密螺旋体的试剂盒，但此试剂盒采用的是荧光染料方法，此方法有个非常大的缺陷，就是容易产生非特异性的扩增，特异性查。目前所有在临床使用的病原体检测试剂盒，均不是采用荧光染料法，这也说明荧光染料法不适用于病原体检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括加林疏螺旋体特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因β球蛋白特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.4-6。
如上述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测加林疏螺旋体的试剂盒中的应用。
一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。
进一步地，还包括：
阳性对照品：加林疏螺旋体标准品；
内标溶液：含β球蛋白序列的质粒溶液；
阴性对照品：RNase Free H2O。
一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测方法，包括：以样品DNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对和探针。
进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：95℃5min；95℃ 15sec、57℃45sec，45个循环。
进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，HEX荧光通道有或无扩增曲线时，判断样品为加林疏螺旋体阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，HEX荧光通道有或无扩增曲线时，重复一次实验，如果FAM荧光通道Ct还是在此范围之内或小于等于40就判断样品为加林疏螺旋体阳性，否则判断样品为加林疏螺旋体阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX荧光通道中Ct≤45时，判断样品为加林疏螺旋体阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需重新提取标本DNA和重新扩增检测。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1、本发明提供了加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，更够快速、准确且灵敏地检测出加林疏螺旋体；特异性强，对其他螺旋体和常见病毒、细菌和真菌都没有非特异性扩增；灵敏度高，高达5拷贝/ml。
2、本申请经过大量的创新性试验得出本申请的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用一对引物对和一个探针就检测出加林疏螺旋体，且使其特异性强，灵敏度高的问题，这也是本申请最大的技术难点。本发明采用单管双荧光通道同时检测加林疏螺旋体和内参基因β球蛋白的存在，能检测脑脊液、咽拭子等标本中加林疏螺旋体DNA的存在。当脑脊液、全血、血浆或鼻咽拭子中的存在PCR抑制时，容易造成病原体核酸定量结果不准备甚至出现“假阴性”，针对这个难点与技术问题，本发明设计了内参基因，可对标本提取和扩增这整个过程进行质量监控，能监控DNA是否成功提取以及后续的逆转录和PCR是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误。
3、本发明提供了加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，将检测时间缩短到了1小时内，而一般检测方法的时间是2～4小时；本发明采用了UNG酶， UNG酶能显著的降解前一次扩增的PCR产物，能极大程度的减少污染发生的概率，同时由于样本提取和扩增时间缩短，减少了暴露在潜在污染源的可能性，进一步减少了污染的发生概率；本发明所涉及的材料和试剂价格低廉，容易获取，UNG酶、taq酶和引物和探针的价格明显低于免疫法的单克隆抗体，使得本发明的样品诊断成本低，具有潜在的应用价值。本发明检测时间周期短、检测效率高；本发生所涉及的引物和探针序列均只特异性的靶向加林疏螺旋体，探针序列长达33bp，使得与其他生物产生非特异性扩增的概率为(1/4)33，几乎为零，这也保证了本发明的特异性和准确率高；在进行病原体定性分析的同时还能进行病原体定量分析，定量线性范围好；检测灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。
附图说明
图1是加林疏螺旋体标准品扩增曲线；
图2是加林疏螺旋体标准品浓度标准曲线；
图3是20例血清标本加林疏螺旋体荧光定量PCR扩增曲线；
图4是20例血清标本内参基因β球蛋白扩增曲线；
图5是本发明试剂盒检测线性范围分析；
图6是19例皮肤活检标本加林疏螺旋体荧光定量PCR扩增曲线；
图7是19例皮肤活检标本内参基因β球蛋白扩增曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1试剂盒的开发
本发明在对加林疏螺旋体核酸序列分析的基础上，选取加林疏螺旋体特异性的保守基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，同时，选取β球蛋白做内标基因，设计特异性引物和荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术可对加林疏螺旋体进行检测。引物及探针序列见表1。
表1
Figure BDA0002324670360000041
试剂盒中还包括阳性对照：加林疏螺旋体标准品；阴性对照：RNase Free H2O；内标溶液：含β球蛋白序列的质粒溶液；5×PCR Buffer和Enzyme Mix。其中5×PCR Buffer和Enzyme Mix的配制如下：
5×PCR Buffer配制：
Figure BDA0002324670360000042
配置混合后于冰箱-20℃保存；
Enzyme Mix配制：
Figure BDA0002324670360000043
配置混合后于冰箱-20℃保存。
本实施例中还提供了加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测方法，如下：
(1)加林疏螺旋体核酸的提取
①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；
②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；
③将标本(如脑脊液、鼻咽拭子等)取200μl加入此管中，加入5μl内标溶液，充分混匀；
④再在每管分别加入200μl漂洗液，混匀振荡30s，70℃温育10min；
⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；
⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；
⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；
⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl 缓冲液2，12000rpm，离心1min。重复步骤⑧一次；
⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min 以干燥滤膜；
⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50μl RNase-free H2O，室温静置2min； 12 000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸；
按上述方法提取15份疑似加林疏螺旋体感染病人疱疹液标本的核酸，当然，其他实施例中也可以采用其他方法实现核酸的提取。
(2)实时荧光定量PCR扩增(每份25μl体系)
取5μl DNA作为模板，同时加入20μl PCR反应液(荧光定量PCR反应液的配制体系如表2所示)至八联管中进行荧光定量PCR扩增。
表2 PCR反应液的配制体系
Figure BDA0002324670360000051
Figure BDA0002324670360000061
(3)实时荧光定量PCR反应程序为：25℃2min；95℃1min；95℃3sec、57℃10sec， 45个循环。从57℃步骤开始收集荧光信号。本实施例使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。
(4)得到实时荧光定量PCR扩增结果，对扩增曲线进行分析，并作出判断。判断规则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，判断样品为加林疏螺旋体阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于40 就判断样品为加林疏螺旋体阳性，否则判断样品为加林疏螺旋体阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道中Ct≤45时，判断样品为加林疏螺旋体阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本DNA和重新扩增。
其中，加林疏螺旋体标准品扩增曲线如图1所示；加林疏螺旋体标准品浓度标准曲线如图2所示，标准浓度曲线方程为：y＝-3.37x+48.41，其中x是浓度的log值，y是Ct值。
用上述方法检测疑似螺旋体感染病人血清标本20份，检测出加林疏螺旋体阳性3例。图 3是这3例加林疏螺旋体阳性标本及17份阴性标本的荧光定量PCR扩增曲线，根据这3例阳性结果的Ct值结合标准曲线方程，由Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这3例加林疏螺旋体阳性标本的浓度，具体结果见表3。同时，20份标本的内参基因β球蛋白扩增曲线正常，如图4所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。
表3 3例加林疏螺旋体阳性标本浓度
样品编号 Ct值 加林疏螺旋体浓度(拷贝/mL)
样品4 32.35 2.14×10<sup>3</sup>
样品13 33.89 7.37×10<sup>2</sup>
样品14 34.43 5.09×10<sup>2</sup>
实施例2加林疏螺旋体的实时荧光PCR试剂盒的性能测定
1.准确性验证
细菌核酸检测的金标准是培养后基因组测序，将此试剂盒的检测结果与细菌培养后基因组测序做比较，分析其准确性。本实施例选取了基因组测序确定为加林疏螺旋体的25例标本，用本发明提供的试剂盒检测后结果如下表4。由结果可见，25份阳性标本全部被检出，表明本发明提供的加林疏螺旋体的实时荧光PCR的准确性为100％。
表4本发明的准确性分析
螺旋体型别 例数 测序阳性 此方法阳性 准确率
加林疏螺旋体 25 25 25 100％
2.特异性验证
试剂盒的特异性是通过检测其他病原体来评估，本实施例选择了20种常见病原体阳性标本，包括与加林疏螺旋体亲缘关系较近的其他10种螺旋体和另外10种常见病毒、细菌和真菌，结果如下表5。经检测，此发明对20种常见病原体阳性标本无扩增，表明本发明提供的加林疏螺旋体的实时荧光PCR的特异性为100％。
表5本发明的特异性分析
阳性病原体 是否有扩增 是否有扩增
回归热疏螺旋体 无 新布尼亚病毒 无
达顿疏螺旋体 无 人疱疹病毒1型 无
日本疏螺旋体 无 人疱疹病毒2型 无
扁虱疏螺旋体 无 EB病毒 无
伯氏疏螺旋体 无 人疱疹病毒6型 无
阿氏疏螺旋体 无 大肠杆菌 无
中国疏螺旋体 无 金黄色葡萄球菌 无
瓦莱疏螺旋体 无 鲍曼不动杆菌 无
革氏疏螺旋体 无 铜绿假单胞菌 无
比氏疏螺旋体 无 白色念珠菌 无
3.灵敏度检测
灵敏度也即最低检测限，是指将阳性标本经过梯度稀释后，在最低稀释梯度的同一个标本上中测到靶核酸的可能性在统计学上概率>95％。用于灵敏度评估的样本在每个需评估的浓度水平检测次数应不少于20次，以至少19次出现阳性扩增信号为合格。在此，本实施例将加林疏螺旋体的阳性标准品质粒按一定拷贝数倍比稀释后，每一个稀释度平均分为20个样本，用此发明的方法进行检测，出现19次及以上阳性的该拷贝数即为最低检测限，结果见表6。经验证，在5拷贝/ml浓度时，检出率为100％，低于此浓度时，检出率不足95％。由此可见，表明本发明提供的加林疏螺旋体的实时荧光PCR的灵敏度为5拷贝/mL。
表6本发明的灵敏度分析
加林疏螺旋体阳性质粒拷贝数(拷贝/mL) 重复检测数 阳性检出数 阳性检出率
1×10<sup>4</sup> 20 20 100％
1×10<sup>3</sup> 20 20 100％
1×10<sup>2</sup> 20 20 100％
50 20 20 100％
40 20 20 100％
30 20 20 100％
20 20 20 100％
10 20 20 100％
5 20 20 100％
1 20 14 70％
4.精确性检测
精确性是指相同阳性样本多次检测，结果判读的一致性，以变异系数(CV)小于5判定为精确性良好。本实施例在每个浓度梯度分3次检测了30份阳性标本，结果如下表7所示。经验证，在5～1×107拷贝范围内，此发明的批内和批间CV<5％，精密度良好。
表7本发明的精确性分析
Figure BDA0002324670360000081
Figure BDA0002324670360000091
5.线性范围分析
本实施例分析了在1、5、10、20、50、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107和 1×108拷贝/ml范围内，此发明的线性范围，结果如图5所示，此发明提供的加林疏螺旋体的实时荧光定量PCR的线性范围为5～1×108拷贝/ml，在此范围内呈良好的线性关系。
实施例3临床检测
皮肤活检标本是螺旋体检测分离的最佳标本，为了进一步验证此发明性能，用此发明所述方法对另外疑似螺旋体感染病人皮肤活检标本19份进行检测，其中加林疏螺旋体检测结果阳性6例，荧光定量PCR扩增曲线见图6，根据这6例阳性结果的Ct值结合扩增曲线，由 Roche LightCycler 480分析软件自动分析得到这5例加林疏螺旋体阳性标本浓度，具体结果见表8。同时，这18份咽拭子标本的内参基因β球蛋白扩增曲线正常，如图7所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常，阳性和阴性结果准确。
表8 6例加林疏螺旋体阳性标本浓度
样品编号 Ct值 加林疏螺旋体浓度(拷贝数/mL)
样品1 34.63 4.44×10<sup>2</sup>
样品3 36.63 1.12×10<sup>2</sup>
样品4 32.35 2.14×10<sup>3</sup>
样品14 34.43 5.09×10<sup>2</sup>
样品17 35.63 2.22×10<sup>2</sup>
样品19 27.60 5.70×10<sup>4</sup>
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东龙帆生物科技有限公司
<120> 一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(加林螺旋体-F)
<400> 1
aaccacattt gaaattttca aagaag 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(加林螺旋体-R)
<400> 2
gtatgtctgt gtattcaagt ctggt 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(加林螺旋体-FAM)
<400> 3
aagacaagtc atcaacagaa ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(β球蛋白-F)
<400> 4
gtgcacctga ctcctgagga ga 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(β球蛋白-R)
<400> 5
ccttgatacc aacctgccca g 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(β球蛋白- HEX)
<400> 6
aaggtgaacg tggatgaagt tggtgg 26

Claims (7)

1.一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括加林疏螺旋体特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因β球蛋白特异性引物及探针序列，见SEQ IDNO.4-6。
2.一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。
3.根据权利要求2所述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：
阳性对照品：加林疏螺旋体标准品；
内标溶液：含β球蛋白序列的质粒溶液；
阴性对照品：RNase Free H2O。
4.一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：以样品DNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对和探针。
5.根据权利要求4所述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；扩增程序为：25℃2min；95℃1min；95℃3sec、57℃10sec，45个循环；从57℃步骤开始收集荧光信号。
6.根据权利要求4所述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM荧光通道中Ct≤40时，HEX荧光通道有或无扩增曲线时，判断样品为加林疏螺旋体阳性；
当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，HEX荧光通道有或无扩增曲线时，重复一次实验，如果FAM荧光通道Ct还是在此范围之内或小于等于40就判断样品为加林疏螺旋体阳性，否则判断样品为加林疏螺旋体阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX荧光通道中Ct≤45时，判断样品为加林疏螺旋体阴性；
当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需重新提取标本DNA和重新扩增检测。
7.如权利要求1所述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测加林疏螺旋体的试剂盒中的应用。
CN201911311600.9A 2019-12-18 2019-12-18 一种加林疏螺旋体实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用 Pending CN110904254A (zh)

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