CN111424074B - 一种定量小鼠源组织痕量残留的核酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量小鼠源组织痕量残留的核酸检测试剂盒，本发明可以检测出小鼠源组织或细胞的DNA残留，最低浓度为0.1fg/μl，在具有非常好的灵敏度同时还具有很好的特异性，可以用于检测食品污染、环境监测，以及精确定量单抗等生物药品中小鼠源细胞残留DNA；可为单抗等生物药品半成品、成品等生产环节提供等提供可靠的质控证据，为安全生产与使用提供重要保障为疫苗安全生产与使用提供重要保障。

Description

一种定量小鼠源组织痕量残留的核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种定量小鼠源组织痕量残留的核酸检测试剂盒。

背景技术

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

与分子杂交方法相比，TaqMan PCR技术应用于定量检测中具有如下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃分子杂交法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对待测样品进行准确定量分析，从而有效监测疫苗纯化的效果；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了分子杂交后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，有效结合了PCR和探针杂交的双重特异性，进一步提高了检测目标靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的分子杂交方法，在病原体的定量或定性检测中得到十分广泛的应用。

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。虽然已经有用染料法实时荧光PCR检测CHO细胞DNA残留的报道，但在食品污染、环境监测，以及精确定量单抗等生物药品中小鼠源细胞残留DNA的检测中，目前还没有针对小鼠源组织或细胞DNA残留的精确定量、特异性强的探针法实时荧光定量PCR检测试剂盒。

哺乳动物源组织的核酸鉴别不同于病原体，哺乳动物基因组大小都在Giga（十亿）个碱基对水平之上，以模式生物小鼠（Mus musculus）为例，其共有20对染色体，基因组大小约为6x10^9 bp，单拷贝小鼠基因组的质量约6.6 pg，即6600 fg。如果针对单拷贝的靶多核苷酸序列进行检测，平均每个反应中必须存在6.6pg核酸分子才能保证检出，按30ul的反应体系计算，检出限不可能低于220 fg/ul。理论上要达到1 fg/ul的检出限，扩增检测的靶多核苷酸序列在基因组上的拷贝数不应低于220个。目前还没有小鼠源组织的核酸鉴别产品针对这个检测参数要求，从研发伊始就量化寻找并设计可精准确定痕量小鼠源组织核酸量的方法和产品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种定量小鼠源组织痕量残留的核酸检测试剂盒，本试剂盒可用于检测食品污染、环境监测，以及精确定量单抗等生物药品中小鼠源细胞残留DNA，从而对单抗等生物药品生产过程中进行质量监测。

本试剂盒的基本原理是利用在线数据库和重头测序方法对多个小鼠源组织和细胞系基因组分析研究，发现并筛选在小鼠基因组的多条染色体上存在种属的特异性的非编码中度重复序列，针对该序列设计一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在含有耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺的PCR反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测靶多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测食品污染、环境监测，以及单抗等生物药样品中小鼠源细胞残留DNA的试剂盒包括：(1)分别装有PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量标准品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中，所述PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向引物MM-F和反向引物MM-R的序列分别是：

5’-ACAGGDTTTCTCTRTRTAB-3’(SEQ ID NO：1)

5’-NGGATNTCTGVGTTYGAG-3’(SEQ ID NO：2)

根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针MM-P的序列是：

5’-CCTGGCTRTCCTGGARCTCA-3’(SEQID NO：3)。

扩增片段为：

ACAGGDTTTCTCTRTRTABNCCTGGCTRTCCTGGARCTCA(9-24N)CTCRAACBCAGANATCCN

根据本发明的另一个优选实施方案，

正向引物MM10-F： 5’-ACAGGDTTTCTCTGTRTAG-3’(SEQID NO：4)

反向引物MM10-R： 5’-CGGATYTCTGAGTTTGAG-3’(SEQID NO：5)

探针MM10-P： 5’-CCTGGCTGTCCTGGAACTCA-3’ (SEQID NO：6)

扩增片段：

ACAGGDTTTCTCTGTRTAGNCCTGGCTGTCCTGGAACTCA(9-24N)CTCAAACTCAGARATCCG

根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶、(b)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(c)含镁离子的缓冲液、(d)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(e)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物，和(f)能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中寡核苷酸探针5’端标记有荧光报告基团，其荧光报告基团为FAM，3’端标记有淬灭基团，其淬灭基团为MGB。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：50 ^oC 2min，95 ^oC预变性10min；然后95 ^oC 10s，55 ^oC 1min，40个循环。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为HEK293基因组DNA、CHO细胞基因组DNA、Vero细胞基因组DNA。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为strain C57BL/6J、NS0、SP2细胞基因组DNA。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中定量标准品为strain C57BL/6J、NS0、SP2细胞基因组DNA，原液浓度为30ng/ul，经稀释的使用浓度，分别为300pg/ul，30pg/ul，3pg/ul，0.3pg/ul，0.03pg/ul，0.003pg/ul，0.0003pg/ul。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可定量小鼠源组织痕量残留DNA的最低浓度为1fg/ul，可检出限最低出浓度为0.1fg/ul，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

2、本发明针对小鼠源组织基因组的种属特异性的非编码中度重复DNA序列的保守区设计特异引物和探针，利用重复序列提高痕量核酸检测的检出率，可检测出痕量小鼠源组织基因组DNA，但不能检测出非小鼠源组织基因组DNA，说明本试剂盒具有很好的特异性。

3、本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测食品污染、环境监测，以及精确定量单抗等生物药品中小鼠源细胞残留DNA；可为单抗等生物药品半成品、成品等生产环节提供等提供可靠的质控证据，为安全生产与使用提供重要保障。

附图说明

图1 为本发明的NS0细胞DNA定量标准品的检测结果图；Ct值为10～40，扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。

图2 为定量标准品扩增结果的标准曲线；针对模板数为300pg/ul、30pg/ul、3pg/ul、0.3pg/ul、0.03pg/ul，0.003pg/ul的反应体系进行TaqMan PCR分析。NS0细胞基因组DNA为0.003pg/ul时，检测样品的Ct值在30左右，为明显阳性，即检测下限灵敏度可达到0.003pg/ul。绘制得到的标准曲线相关系数(R2)＝0.997。

图3 定量标准品与其他3种阴性参考品对照的标准曲线，阴性参考品基本呈平直，可明确判定为阴性。3种阴性参考品包括Vero细胞、E.coli细胞和HEK293细胞。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：

试剂盒的制备

试剂盒的制备包括以下组成成分：

Strain C57BL/6J基因组DNA（30ng/ul) (40ul/管) 1管、 NS0细胞基因组DNA（30ng/ul) (40ul/管) 1管、SP2细胞基因组DNA（30ng/ul) (40ul/管) 1管、DNA稀释液（7ml/瓶）1瓶、2×qPCR预混液 （750ul/管）1管、10×引物探针混合物（150ul/管）1管、超纯水（1.5ml/管）1管。

其中，2×qPCR预混液为商业化试剂（天根），DNA稀释液由实验室采用分子生物级试剂自行配置，10×引物探针混合物：将正向引物：反向引物：Taqman探针按照1:1:0.2的比例进行混合，得到10×引物探针混合物。引物和探针由上海生工进行合成纯化，序列如下：

正向引物序列: ACAGGDTTTCTCTGTRTAG （Seq ID No:4）

反向引物序列：CGGATYTCTGAGTTTGAG（Seq ID No:5）

Taqman探针：CCTGGCTGTCCTGGAACTCA（Seq ID No:6）

Taqman探针5’端的荧光报告基团为FAM；3’端的淬灭基团为MGB。

扩增片段：

ACAGGDTTTCTCTGTRTAGNCCTGGCTGTCCTGGAACTCA(9-24N)CTCAAACTCAGARATCCG

实施例2

strain C57BL/6J、NS0、SP2细胞基因组DNA的qPCR测试方法

DNA的提取标定： 按照基因组DNA提取试剂盒（天根）说明书提取strain C57BL/6J组织、NS0和SP2细胞的基因组DNA，然后利用Qubit（Invitrogen）将基因组DNA的浓度标定至30ng/ul。

将PCR反应所需试剂取出：2×qPCR预混液，引物探针混合物，定量标准品，超纯水。

根据样品的数量确定最终的反应管数从而准备qPCRmix，如下表1.

加样完成后，在ABI7500实时荧光定量PCR仪（ABI）上进行PCR扩增。反应条件为：50 ^oC 2min，95 ^oC预变性10min；95 ^oC 10sec，55^oC 1min，40个循环。

实施例3

NS0细胞基因组DNA标准曲线的绘制

根据实际检测的小鼠源组织痕量残留的需求选择对应的小鼠源组织或细胞系的标准参考基因组，本实施例目的为定量NS0细胞的残留DNA，将抽提标定好的NS0细胞基因组DNA（30ng/ul)利用DNA稀释液进行梯度稀释，得到ST1（300pg/ul），ST2（30pg/ul），ST3（3pg/ul），ST4（0.3pg/ul），ST5（0.03pg/ul），ST6（0.003pg/ul）。按照表1的加样体系进行加样，然后上机并按照反应程序进行反应。图1为本发明的NS0细胞DNA定量标准品的检测结果图；Ct值为10～40，扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。用NS0基因组DNA各稀释度浓度的log值对每个稀释度的Ct（初始循环数）值作图，二者呈线性递减的关系，该线性曲线即是NS0 gDNA定量标准曲线，如图2所示，曲线的R2为0.997，反映扩增反应的扩增效率在90-110%之间。

实施例4

NS0细胞DNA残留检测方法灵敏度测试

将NS0基因组DNA稀释至6fg/μl，4.5fg/μl，3fg/μl，1fg/μl，然后利用反应体系进行测定以确定其检测灵敏度，每个浓度做10个重复。实验结果显示：浓度低至1fg/μl时，其CV至仍<15% （表2），因此，检测反应的灵敏度可低至1fg/μl。

实施例5

NS0细胞DNA残留检测方法的重复性和紧密度测试

对于重复性实验，针对3pg/ul的样本进行检定，做10个重复。如下表所示，实验结果显示：CV值均<15%，表明实验重复性好。

对于中间精密度实验，针对30pg/ul，3pg/ul，0.3pg/ul和0.03 pg/ul的四个不同浓度的样本，由三个不同的人员进行定量检测。每个人每组样本独立重复3次。实验结果显示：各组的CV值均<10% ，结果如下表4所示。

实施例6

NS0细胞DNA残留检测方法的特异性测试

将单独抽提好的NS0细胞基因组DNA、Vero细胞基因组DNA、E.coli基因组DNA和HEK293细胞基因组DNA进行梯度稀释，然后按照反应体系进行加样检测并绘制曲线。图3为定量标准品与其他3种阴性参考品对照的标准曲线，实验结果显示：该方法只针对NS0细胞，具有很高的检测特异性。

实施例7

模式动物小鼠生物信息研究

在利用在线数据库对模式动物小鼠（Mus musculus，strain C57BL/6J）进行生物信息研究中我们发现在小鼠基因组的多条染色体上存在种属特异性的非编码中度重复序列，并对常见小鼠细胞系NS0、SP2等进行重头测序，确认了该非编码中度重复序列的普遍存在于小鼠细胞内。通过ClustalW对重复序列进行多序列对比排列（multiple alignment）找出保守区域和扩增子，并设计扩增的上下游引物和检测用探针，重复序列位置与拷贝数以及扩增片段大小参见下表。该扩增片段分布于小鼠基因组的9对染色体上，达到717个拷贝，扩增片段大小为67-80bp。

模式动物分类名称Mus musculus strain C57BL/6J, 数据库基因组版本号GRCm38.p6

实施例8

NS0细胞DNA残留检测方法的检出限的实验说明

实施例3中标准曲线的最低值ST6为本试剂盒作为精确定量的最低值，也就是定量限，对应反应体系内样本浓度为1fg/ul。下表对应图1绘制标准曲线的Ct值，标准曲线至ST6仍保持良好的线性。ST7点虽然不能维持良好的线性，但仍可有效地检出，区别于作为阴性对照的NTC。ST6点对应的浓度为0.001pg/ul，即1fg/ul，ST7点对应的浓度为0.0001pg/ul，即0.1fg/ul，本试剂盒的检出限为0.1fg/ul。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津欧德莱生物医药科技有限公司

<120> 一种定量小鼠源组织痕量残留的核酸检测试剂盒

<130> 1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

acaggdtttc tctrtrtab 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

nggatntctg vgttygag 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

cctggctrtc ctggarctca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

acaggdtttc tctgtrtag 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

cggatytctg agtttgag 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

cctggctgtc ctggaactca 20

Claims (4)

1.一种定量小鼠源组织痕量残留的核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液由耐热DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、含镁离子的缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针组成，其特征在于：所述正向引物和反向引物的序列分别为5’-ACAGGDTTTCTCTGTRTAG-3’和5’-CGGATYTCTGAGTTTGAG-3’，所述寡核苷酸探针的序列为5’-CCTGGCTGTCCTGGAACTCA-3’，其5’端的荧光报告基团为FAM；3’端的淬灭基团为MGB。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的条件为：50℃2min，95℃预变性10min；然后95℃10s，55℃1min，40个循环。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于待检样品为可能接触小鼠源组织的污染食品、环境监测的样品，以及以小鼠源组织或细胞为生产制备工具的生物药。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于待检样品中残留DNA来自小鼠源组织或细胞系。

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