CN102559878B

CN102559878B - 小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒

Info

Publication number: CN102559878B
Application number: CN 201110433623
Authority: CN
Inventors: 陈初光; 周仲春; 吕悦心
Original assignee: BEIJING MICROREAD GENE TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: SUZHOU MICROREAD GENETICS CO., LTD.
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: CN102559878A

Abstract

本发明涉及小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒，属于生物技术领域。本发明涉及在一个PCR体系中同时扩增多个小鼠的短串联重复序列(D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1)及1个性别决定位点(Jarid1)，对小鼠DNA进行复合扩增、毛细管电泳检测。该体系可以用于小鼠细胞的基因分型，由于各个位点采用荧光标记的引物，得到的产物带有荧光标记，可以在遗传分析仪等仪器上进行检测，得到的片段长度更精确，可重复性更高。本体系操作简单、便于大规模推广，全部过程都有自动化设备，整个检测时间只需6小时左右。

Description

小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及鉴定小鼠多个短串联重复序列的复合扩增体系及其试剂盒，可以快速准确进行小鼠细胞STR分型进而鉴定小鼠细胞系类型。

背景技术

2009年，Nature上的一篇社论指出：在数以千计的使用细胞系的生物实验室中，许多实验室并不知道介于1/5-1/3之间的常用细胞系可能已不是原先认为的那样了。过去的25年里，大量的研究，加上美国、英国、德国和日本细胞库的经验发现：18-36％的培养物含有错误鉴定的物种或其它细胞类型。就连管理严格的美国国家癌症研究所的细胞库都出现了细胞系遭污染的现象。现在实验室研究人员唯一的办法是给细胞验明正身，使用DNA指纹图谱(STR分型技术)验证所使用的细胞是否与数据库的数据一致以鉴定身份。Nature杂志社希望这一身份鉴定工作能持续下去，将主要的无限制增殖的细胞系(癌细胞)鉴定完毕。Nature杂志将会要求投稿人为文章中的所有细胞系提供身份验证。

2010年5月ATCC SDO(Standards Development Organization)工作组在Nature review cancer杂志上发表了题为《Cell line misidentification：the beginning of the end》前瞻性报道。报道指出：细胞系作为正常或肿瘤组织的模式细胞被广泛应用于科学研究和药物开发，然而很大一部分的细胞系被错误标记或被其它个体、组织、种系来源的细胞所替代，由于科学界无法解决此类问题以致大量因使用错误鉴定的细胞系而导致误导或存在潜在错误的学术论文发表。通过近年来的努力而开发出的STR分型方法已成为对人源细胞进行鉴定的标准方法，STR分型的应用成为根除细胞错误鉴定这一问题的重要一步。

STR位点是由不同数目重复单元组成的重复DNA序列。STR分型的原理为在一单管中同时扩增多个多态性DNA片段。每一个STR位点均能被扩增且扩增产物标记上不同颜色的荧光，使得扩增产物很容易通过片段大小和颜色来区分。STR分型最先应用于亲缘鉴定、法医鉴定、以及鉴定在20年之前的大灾难中遇难的受害者。随后，STR分型用于细胞鉴定中。用STR分型来做细胞鉴定具有其它方法所不具备的优势：

1.高度丰富信息：同时分析多个STR位点，可以建立每个细胞的标准分型图谱，便于不同来源细胞进行比对。

2.灵敏度高，能够检测1ng或更低的DNA量，能够检测早期细胞污染。

3.分型快速、且结果稳定可靠，易于操作及自动化。

许多方法已被用来检测细胞系交叉污染，包括同工酶分析、核型分析、人类白细胞抗原(HLA)分型，免疫分型和DNA指纹识别。这些方法都可以鉴别出某一种细胞系，但是分辨能力各不一样。然而，这些方法在不同实验室所得到的数据却不尽相同，以致没有任何一种方法可以用来建立一个标准参考数据库。由于STR分型具有快速、鉴定的细胞系结果明确等无以伦比的优点，故STR分型的应用价值最大。

目前STR分型技术已被广泛应用于人源细胞系的鉴定，并已建立起标准的STRMarker组合，用于鉴定1000多种细胞。但对于小鼠细胞系的鉴定，由于没有成型的多重STR扩增体系和相关的产品，STR分型并未得到广泛应用。

在过去一个世纪的研究中，小鼠已经成为建立人类遗传性疾病的动物模型的最佳实验材料，小鼠细胞系已广泛应用于生命科学研究的各个领域。如在疾病研究和疫苗生产方面常用的小鼠细胞系有A9、3T3、NS-1、J774A.1、CTLL-2、SC-1等多种，是除了人类细胞外被应用数量最多的动物细胞，数量有几百种。建立小鼠细胞系的STR分型方法，对于每一位使用小鼠细胞系的研究者来说无疑是一个福音，也必将极大地促进人类健康事业的发展。

发明内容

针对上述领域中的不足和需求，本发明提供一种鉴定小鼠细胞系的复合扩增体系，其扩增的位点是一些可以用来鉴定小鼠细胞系的STR位点，在鉴定小鼠细胞系时，其分型快速、结果准确、操作简单、便于大规模推广，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化，所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。

小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述扩增体系中同时扩增STR位点D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16和D17Mit51.1。

所述扩增体系中还包括性别决定位点Jarid1。

所述扩增体系中的被扩增位点，分别由三种不同颜色的荧光素标记，三组组合分别为：第一组：D15Mit16、D11Mit4、D2Mit395.1；第二组：D4Mit170.1、D7Mit40、D5Mit201.1；第三组：D17Mit51.1、Jarid1。

所述三组中可以分别标记为FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC。

所述第一组的标记为FAM或荧光素；所述第二组标记为HEX或JOE；所述第三组标记为TMR或VIC。

所述STR位点由一对引物扩增，其中一条引物的5’末端带有标记。

所述引物分别为：

D2Mit395.1引物：

引物1：GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA，

引物2：TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT；

D4Mit170.1引物：

引物1：TTCCATCGAGTGACTTGATC，

引物2：CAGAGTGGCTGTCATCTGG；

D5Mit201.1引物：

引物1：TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT，

引物2：ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT；

D7Mit40引物：

引物1：GTCAACAGTCAGGAAAGCTG，

引物2：CAGATGCTTGTATTTGCAAAG；

D11Mit4引物：

引物1：CAGTGGGTCATCAGTACAGC，

引物2：AAGCCAGCCCAGTCTTCATA；

D15Mit16引物：

引物1：AGACTCAGAGGGCAAAAT，

引物2：TCGGCTTTTGTCTGTCTG；

D17Mit51.1引物：

引物1：TCTGCCCTGTAACAGGAG，

引物2：CTTCTGGAATCAGAGGAT；

Jarid1引物：

引物1：GCTGACTACTTCAACATGC，

引物2：CCGCTGCCAAATTCTTTGG；

一种试剂盒，包括一扩增体系，其特征在于包括STR位点D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1的特异性引物对的混合物。

用于扩增D2Mit395.1的引物对是由位于SEQ ID NO1中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO1中400～450位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D4Mit170.1的引物对是由位于SEQ ID NO2中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO2中170～220位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D5Mit201.1的引物对是由位于SEQ ID NO3中90～140位18～27个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO3中370～420位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D7Mit40的引物对是由位于SEQ ID NO4中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO4中270～320位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D11Mit4的引物对是由位于SEQ ID NO5中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO5中320～370位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D15Mit16的引物对是由位于SEQ ID NO6中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO6中200～250位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增D17Mit51.1的引物对是由位于SEQ ID NO7中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO7中220～270位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增Jarid1的引物对是由位于SEQ ID NO8中70～120位18～25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NO8中290～340位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

优选引物对分别为上述8对引物。

所述扩增体系的总体积为20μl，其中10×缓冲液2μl，2.5mM each dNTP 1.6μl，引物对混合物4.0μl，2.5U Taq酶0.4μl，去离子水10μl，加入模板DNA为2μl。

所述引物对混合物中的引物对浓度分别为0.3μM的D15Mit16引物对、0.2μM的D11Mit4引物对、1.0μM的D2Mit395.1引物对、1.0μM的D4Mit170.1引物对、0.7μM的D7Mit40引物对、0.5μM的D5Mit201.1引物对、0.7μM的D17Mit51.1引物对和0.3μM的Jarid1引物对。

所述扩增体系的扩增条件为：94℃变性，5-10min；59-61℃退火，30-60sec；70-72℃延伸，30-60sec；60℃最后延伸，30-60min。

经过多年的不断努力，我们目前已筛选出一些可以用来鉴定小鼠细胞系的STR位点，如D1Mit159.1、D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1等。本发明选取其中7个具有高度灵敏性及特异性的STR位点(D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1)对小鼠细胞系进行分型检测。同时，我们加入1个性别决定位点(Jarid1)，建立8个位点的多重复合扩增体系。本发明的整个方法过程：

1、引物组合的设计

首先，我们选择了具有高度灵敏性及扩增特异性的STR位点，选择的位点包括D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1，以及性别决定位点Jarid1。我们从小鼠的基因组数据中筛选了这些STR位点，具有高度多态性，和很强的种属特异性，跟人、豚鼠、大鼠、仓鼠等物种均没有高度同源序列。根据候选的位点所在基因的GeneBank序列号从NCBI核酸数据库下载基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表。

用于扩增D2Mit395.1的引物对是由位于序列1中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列1中400～450位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D4Mit170.1的引物对是由位于序列2中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列2中170～220位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D5Mit2011的引物对是由位于序列3中90～140位18～27个连续碱基构成的引物，和与序列3中370～420位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D7Mit40位点的引物对是由位于序列4中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列4中270～320位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D11Mit4的引物对是由位于序列5中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列5中320～370位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D15Mit16的引物对是由位于序列6中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列6中200～250位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增D17Mit51.1的引物对是由位于序列7中90～140位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列7中220～270位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增Jarid1的引物对是由位于序列8中70～120位18～25个连续碱基构成的引物，和与序列8中290～340位的互补序列的18～25个连续碱基构成的引物的组合。

以上引物由Primer3、Primer Premier 5和NCBIBlast等软件设计而成。设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(60±2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差100bp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。

选用任一小鼠DNA模板，分别用8对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5～2.0％的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到8对引物共同的扩增条件。最终要达成的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。

然后，将满足要求的8对引物，分为三组进行荧光标记。每组采用一种荧光素，分别可以是FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC。获得荧光标记引物后，用与之相配对的非荧光引物组合后分别进行单重扩增，将扩增产物置于3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。

其后，将同一荧光素标记的2对或3对引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率以及此2对或3对引物的混合扩增是否引起非特异扩增。

最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将8对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致为准。最终确定的8对引物序列分别见序列表。

2.扩增体系及条件的建立

2.1Taq酶的选择

Taq酶是扩增体系的重要组分，多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara公司的rTaq酶和HS Taq酶、KAPA Biosystems公司的Taq酶、Roche公司的AmpliTaq Gold酶等均能得到较好的扩增效率和特异性，采用热启动Taq酶比非热启动酶的扩增特异性要好。

2.2Mg²⁺浓度的选择

我们摸索了在不同Mg²⁺浓度梯度下复合扩增，其中在1.0-2.0mM的浓度范围内均能得到较好的扩增。

2.3反应体积的选择

我们分别采用了50μl、20μl和10μl体系进行了复合扩增，结果显示：20μl与50μl的体系效果基本相当。

2.4反应程序的优化

退火及延伸温度：我们摸索了退火温度从55℃到62℃之间各温度下的扩增情况，结果显示在59-61℃范围内均能得到较好结果。扩增循环数在28-32个有较好的效果。

我们摸索了在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内(见表1)的扩增可以得到较好的结果：表1温度与时间

本发明的优势在于：

1.一次性扩增7个小鼠STR位点和性别位点，能得到的信息量大，这是首次将8个小鼠基因位点进行复合扩增成功。

2.各个位点采用荧光标记的引物，得到的产物带有荧光标记，可以在遗传分析仪等仪器上进行检测，得到的片段长度更精确，可重复性更高。

3.能得到可重复的数据，且数据格式适合建立一个标准参考数据库。

4.操作简单、便于大规模推广，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化。

5.所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。

附图说明

图1小鼠CTLL-2细胞STR图谱，

图2小鼠3T6Swiss细胞STR图谱，

图3小鼠NS-1细胞STR图谱，

图4小鼠P3X63Ag8.65细胞STR图谱，

图5小鼠J774A.1细胞STR图谱，

图6小鼠L-M(TK-)细胞STR图谱，

图7小鼠WEHI-13VAR细胞STR图谱，

图8小鼠P388细胞STR图谱，

图9小鼠SP2/0细胞STR图谱，

图10小鼠SC-1细胞STR图谱，

图11小鼠BALB/C 3T3CloneA31细胞STR图谱，

图12小鼠M.dunni细胞STR图谱，

图13小鼠NIH/3T3细胞STR图谱，

图14小鼠A9细胞STR图谱，

图15小鼠3T3Swiss细胞STR图谱。

具体实施方式

实施例1

以下是我们采用本发明对15例小鼠细胞CTLL-2、3T6 Swiss、NS-1、P3X63Ag8.65、J774A.1、L-M(TK-)、WEHI-13VAR、P388、SP2/0、SC-1、BALB/C 3T3Clone A31、M.dunni、NIH/3T3、A9和3T3 Swiss的DNA样本进行检测的具体实施情况。该样本均为常见细胞，市售得到，本公司也有保存，可以对外公开发放。

1.DNA提取

采用组织DNA提取试剂盒(天根生化)对培养的CTLL-2、3T6 Swiss、NS-1、P3X63Ag8.65、J774A.1、L-M(TK-)、WEHI-13VAR、P388、SP2/0、SC-1、BALB/C 3T3Clone A31、M.dunni、NIH/3T3、A9和3T3 Swiss细胞进行DNA提取，操作步骤依照说明书，DNA提取完毕用紫外分光光度计定量，并稀释成2ng/μl。

2.PCR

2.1反应体系：

将Jarid1位点和7个STR位点的共8对引物分别溶解并配成浓度为10μM的工作液，然后后按表2体积比配成引物混合液(Primer mix)：

D2Mit395.1引物：

引物1：GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA，

引物2：TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT；

D4Mit170.1引物：

引物1：TTCCATCGAGTGACTTGATC，

引物2：CAGAGTGGCTGTCATCTGG；

D5Mit201.1引物：

引物1：TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT，

引物2：ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT；

D7Mit40引物：

引物1：GTCAACAGTCAGGAAAGCTG，

引物2：CAGATGCTTGTATTTGCAAAG；

D11Mit4引物：

引物1：CAGTGGGTCATCAGTACAGC，

引物2：AAGCCAGCCCAGTCTTCATA；

D15Mit16引物：

引物1：AGACTCAGAGGGCAAAAT，

引物2：TCGGCTTTTGTCTGTCTG；

D17Mit51.1引物：

引物1：TCTGCCCTGTAACAGGAG，

引物2：CTTCTGGAATCAGAGGAT；

Jarid1引物：

引物1：GCTGACTACTTCAACATGC，

引物2：CCGCTGCCAAATTCTTTGG；

表2各引物体积比

引物名称	体积(μl)
		D2Mit395.1	6
D4Mit170.1	5
		D5Mit201.1	3
D7Mit40	4
		D11Mit4	1
D15Mit16	1.5
		D17Mit51.1	4
Jarid1	2

将各反应试剂(Buffer、Primer Mix、dNTP等)振荡混合后按表3体积比(模板除外)配成PCR反应混合液，分装19μl于PCR反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后进入下一步。表3标准扩增反应体系

2.2PCR反应程序：

将PCR反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火50秒，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸60分钟。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。

3.毛细管电泳检测

3.1取上一步得到的PCR扩增产物，点样于1.5-2.0％琼脂糖凝胶上，电泳20min后观察结果，若在100-400bp处出现明亮的阶梯条带则可上机检测。

3.2根据电泳胶图上的样品的条带亮度，确定样品稀释倍数，按稀释倍数将扩增产物稀释待用。将ROX500内标和甲酰胺按比例1∶8混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入稀释过的样品1μl，混合静置数分钟，写上板号，离心后放入ABI 3130xl测序仪上，准备检测。

3.3打开ABI 3130xl测序仪数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序。

3.4点击运行，即开始检测。

3.5检测完毕后，将数据拷贝至光盘。

4.数据分析

4.1导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add，样品文件即显示在Project窗口；

4.2选择分析参数。定义analysis method、panel和size standard。浏览样本电泳的原始数据，任性一样本文件名，在“sample”菜单下选择“raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个红色的内标峰之前)，以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysismethod分析参数中的起始点；

4.3点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。

4.4采用Gene Mapper v32软件分析得到的数据并生成图谱，见图1-15。

5.结果分析

通过分型图(见图1-15)可知，15种小鼠细胞在D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1和Jarid1等8个位点分型没有完全相同的分型结果，因此可以用这种方法为这15个小鼠细胞系建立特征性的STR图谱，对这些小鼠细胞进行鉴定。

Claims

1.小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述扩增体系中同时扩增小鼠STR位点D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16和D17Mit51.1；所述扩增体系中的引物对分别为：

D2Mit395.1引物对：

引物1：GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA，

引物2：TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT；

D4Mit170.1引物对：

引物1：TTCCATCGAGTGACTTGATC，

引物2：CAGAGTGGCTGTCATCTGG；

D5Mit201.1引物对：

引物1：TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT，

引物2：ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT；

D7Mit40引物对：

引物1：GTCAACAGTCAGGAAAGCTG，

引物2：CAGATGCTTGTATTTGCAAAG；

D11Mit4引物对：

引物1：CAGTGGGTCATCAGTACAGC，

引物2：AAGCCAGCCCAGTCTTCATA；

D15Mit16引物对：

引物1：AGACTCAGAGGGCAAAAT，

引物2：TCGGCTTTTGTCTGTCTG；

D17Mit51.1引物对：

引物1：TCTGCCCTGTAACAGGAG，

引物2：CTTCTGGAATCAGAGGAT。

2.根括权利要求1所述的复合扩增体系，所述扩增体系中还扩增小鼠性别决定位点Jarid1，所述扩增体系中引物对还包括：

Jarid1引物：

引物1：GCTGACTACTTCAACATGC，

引物2：CCGCTGCCAAATTCTTTGG。

3.根括权利要求2所述的复合扩增体系，所述扩增体系中的被扩增位点分别由三种不同颜色的荧光素标记，三组组合分别为：第一组：D15Mit16、D11Mit4、D2Mit395.1；第二组：D4Mit170.1、D7Mit40、D5Mit201.1；第三组：D17Mit51.1、Jarid1。

4.根括权利要求3所述的复合扩增体系，所述三组中可以分别标记为FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC。

5.根括权利要求4所述的复合扩增体系，所述第一组的标记为FAM或荧光素；所述第二组标记为HEX或JOE；所述第三组标记为TMR或VIC。

6.一种试剂盒，包括一扩增体系，其特征在于扩增体系中包括STR位点D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16和D17Mit51.1的特异性引物对的混合物，所述特异性引物对分别为：

D2Mit395.1引物对：

引物1：GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA，

引物2：TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT；

D4Mit170.1引物对：

引物1：TTCCATCGAGTGACTTGATC，

引物2：CAGAGTGGCTGTCATCTGG；

D5Mit201.1引物对：

引物1：TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT，

引物2：ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT；

D7Mit40引物对：

引物1：GTCAACAGTCAGGAAAGCTG，

引物2：CAGATGCTTGTATTTGCAAAG；

D11Mit4引物对：

引物1：CAGTGGGTCATCAGTACAGC，

引物2：AAGCCAGCCCAGTCTTCATA；

D15Mit16引物对：

引物1：AGACTCAGAGGGCAAAAT，

引物2：TCGGCTTTTGTCTGTCTG；

D17Mit51.1引物对：

引物1：TCTGCCCTGTAACAGGAG，

引物2：CTTCTGGAATCAGAGGAT。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，所述引物的混合物中还包括性别决定位点Jarid1的引物对，

Jarid1引物对：

引物1：GCTGACTACTTCAACATGC，

引物2：CCGCTGCCAAATTCTTTGG。