CN101613751A - 快速检测弓形虫的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒,涉及一种人兽共患传染病病原体的基因检测技术,适用于弓形虫定性定量检测。本发明由DNA提取液、标准阳性模板、荧光定量PCR反应液、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品组成。本发明定量准确,检测速度快,特异性好,灵敏度高,使用步骤简单,可重复性高,可替代传统的病原学检测方法。
Description
技术领域
本发明属于人兽共患传染病病原体的检测技术领域,尤其涉及一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒,适用于弓形虫定性定量检测。
背景技术
弓形虫是一种广泛寄生于人和动物有核细胞中的寄生性原虫,猫科动物为其终末宿主,人和许多脊椎动物为其中间宿主。该虫呈世界性分布,人和许多动物均能感染,引起人兽共患的弓形虫病。由于其对人类健康及农牧业生产存在很大的潜在危害,快速、准确地诊断弓形虫病显得十分重要。
临床检测上,传统的病原学检查方法具有检出率不高、培养时间长等不足,传统的血清学方法由于简便、快速、敏感性尚佳,仍然是各实验室的常用方法,但血清学只是感染的间接标志,当机体免疫力低下时,则很难获得可供诊断的血清学结果。由于人群感染弓形虫的普遍性,血清学检测对现症感染的诊断价值受到一定限制。常规的PCR在操作中容易造成污染,假阳性较高,使其在临床诊断上受到一些限制,因此急需一种精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
发明内容
本发明提供一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒,其目的在于克服现有技术存在检出率不高、培养时间长等缺点和不足,用于弓形虫的快速检测。
本发明提供的快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒,包括DNA提取液、荧光定量PCR反应液、标准阳性模板弓形虫pMD-B1、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品等组成;其中,
标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫高度保守B1基因的223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体,该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖;
荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I,正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl2、dNTPs及无菌双蒸水组成;
弓形虫标准阳性模板所包含的B1基因的核苷酸序列为:
5′-tccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactgcaagagaagtatttgaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgtacgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagaggtccgcccccacaagacggctgaagaa-3′。
本发明所述的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1、DNA提取液:配制裂解缓冲液,包括如下组分:0.1M Tris-HCl(pH8.0),0.1~0.15M NaCl,0.1~0.5M EDTA(pH8.0)和1%~4%SDS。配制蛋白酶K的贮存液,浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体,终浓度为4μg/μl,即为DNA提取液。
2、定量PCR反应液包括SYBR-Green I,正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl2、dNTPs及无菌双蒸水组成。
3、标准阳性模板弓形虫pMD-B1:标准阳性模板pMD-B1是含有弓形虫高度保守基因B1基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒,该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取,用分光光度计测A260定量并稀释至1010拷贝/μl,使用前进行10倍梯度的系列稀释。
4、弓形虫B1基因特异性引物:正向引物Toxo-BF:5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′;反向引物Toxo-BR:5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′。
5、阴性质控标准品:阴性质控标准品为无菌双蒸水。
本试剂盒的工作原理
SYBR-Green I是一种常用的实时定量PCR技术,它巧妙地利用了PCR技术高效扩增、光谱技术的敏感性及定量分析的优点,通过实时检测扩增过程中荧光物质强度的变化来进行PCR产物的分析。SYBR-GreenI具有以下特点:1)它能结合到双链DNA的小沟部位;2)它只有和双链DNA结合后才发出荧光;3)PCR反应中的高温变性时,DNA双链分开,无荧光:4)PCR反应中的低温复性和延伸时,形成双链DNA,SYBR-Green I发荧光,此阶段采集信号,荧光量的增加与PCR产物的累积量呈比例关系。对弓形虫的定量可通过与标准品的循环域值(Ct,Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中,荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数,Ct值与起始模板数呈一定比例关系,Ct值越小,起始模板数越多,相反,Ct值越大,起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线,再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
本发明的使用方法包括以下步骤:
1、对贮存液浓度为1010拷贝/μl标准阳性模板pMD-B1进行10倍的系列稀释,制备阳性标准品;
2、从待测标本中提取DNA;
3、分别取步骤2中的DNA和同样量的系列稀释的步骤1中的两种阳性标准品加入到荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测;
4、通过比较待测样品和相应标准品的循环域值Ct值,对待测样品的起始拷贝数进行定量。
以下实验表明试剂盒可以快速检测弓形虫:
(1)取新鲜或冰冻动物组织块100mg(0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml离心管中,加入蛋白酶K(500μg/ml)20μl,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12~24h,用酚-氯仿-异戊醇(酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1)抽提2次,无水乙醇沉淀后用30μl TE(0.1M Tris-HCl,0.001M EDTA pH8.0)溶解,取1μl做PCR反应。
(2)将阳性标准模板系列稀释为109拷贝/μl、108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl。
(3)分别取荧光定量PCR反应液各24μl,取第①步所得弓形虫DNA和第②步稀释的弓形虫阳性标准模板各1μl,并设阴性对照,分别加入不同的PCR反应管,在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为:95℃预变性60s;95℃ 15s,58℃15s,72℃ 45s,扩增40个循环。
循环结束后,运用仪器自带软件,读取待测样品拷贝数。结果为:弓形虫标准阳性模板109拷贝/μl、108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl的Ct值分别为19.15,22.80,25.48,28.86,32.28;阴性对照为0。
反复重复试验3次,得到Ct值进行统计学分析P>0.05,数据差异无显著意义,说明不同批次之间的检测结果具有可比性和良好的重复性。
从上述实例可以说明,荧光定量PCR方法定量重复性好,定量准确,而且,荧光定量PCR检测试剂盒对样品(DNA)的检测仅需2个小时就能完成。
本发明与现有技术相比其积极效果在于:具有定量准确、检测速度快,仅2小时、特异性好,灵敏度高、使用步骤简单,可重复性好,可以弓形虫样品进行定性定量检测,可以替代传统的病原学和血清学方法。
附图说明
图1:弓形虫标准阳性模板109拷贝/μl、108拷贝/μl、107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl不同稀释度PCR扩增结果。1为DL2000 Marker;2~9分别为弓形虫标准阳性模板107拷贝/μl、106拷贝/μl、105拷贝/μl、104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、10拷贝/μl、1拷贝/μl稀释度的PCR扩增产物。
图2:质粒pMD-B1的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施实例,进一步阐述本发明:
下列实例中未注明具体实验条件和方法的,通常按照常规条件如:J.萨姆布鲁克等主编,科学出版社,2002,分子克隆实验指南(第三版);D.L.斯佩克特等,科学出版社,2001,细胞实验指南,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:试剂盒组成与配制
(1)DNA提取液:配制裂解缓冲液,包括如下组分:0.1M Tris-HCl(pH8.0),0.1~0.15M NaCl,0.1~0.5M EDTA(pH8.0)和1%~4%SDS。配制蛋白酶K的贮存液,浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体,终浓度为4ug/ul,即为DNA提取液。
(2)荧光定量PCR反应液:配制反应液SYBR-Green I(10×)0.5μl,10×buffer2.5μl,dNTP(2.5mmol/L)2μl,Taq酶(5U/μl)0.2μl,MgCl2(2.5mmol/L)3.5μl,正向引物和反向引物各1μl(10μmol/L),无菌双蒸水14.3μl。
(3)标准阳性模板贮存液:浓度为1010拷贝/μl标准阳性模板pMD-B1。
(4)阴性指控标准品:为无菌双蒸水。
实施例2:试剂盒的特异性试验
用经过DNA有效性验证毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、利什曼原虫、柔嫩艾美尔球虫等5种对照阳性样品各1μl为模板进行荧光定量PCR反应,同时设空白对照组和阳性对照组。
PCR扩增条件为循环条件为:95℃预变性60s;95℃ 15s,58℃ 15s,72℃45s,扩增40个循环。
结果只有弓形虫检测有扩增曲线,而毛滴虫、贾第虫、微小隐孢子虫、利什曼原虫、柔嫩艾美尔球虫均无扩增曲线。将弓形虫经三次重复,溶解曲线的溶解温度稳定,说明目的基因PCR扩增产物特异性较好;获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,均与目的条带大小(223bp)相近。上述结果说明试剂盒具有较好的特异性。
实施例3试剂盒的敏感性试验
首先将计数后的弓形虫速殖子DNA进行稀释,检测其总DNA含量,采用倍比法作10×,100×,1000×,2000×,4000×,8000×稀释弓形虫DNA,各1μl为模板进行荧光定量PCR反应,同时设空白对照组。
PCR扩增条件为循环条件为:95℃预变性60s;95℃ 15s,58℃ 15s,72℃45s,扩增40个循环。
通过实验结果确定试剂盒的敏感性,通过6个稀释度的扩增曲线,表明该荧光定量PCR试剂盒最多能检测到0.5个弓形虫。
Claims (4)
1、一种快速检测弓形虫的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于:
由DNA提取液,荧光定量PCR反应液,标准阳性模板pMD-B1、弓形虫B1基因特异性引物、阴性质控标准品组成。
正向引物Toxo-BF:5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′;
反向引物Toxo-BR:5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′;
标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫保守基因的223个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T载体,该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。
2、根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是:
荧光定量PCR反应液由SYBR-Green I,正、反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl2、dNTPs及无菌双蒸水组成。
3、根据权利要求1所述的试剂盒,其特征是弓形虫标准阳性模板所包含的B1基因的核苷酸序列为:
5′-tccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactgcaagagaagtatttgaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgtacgacatcgcattcaagggaagagatccagcagatctcgttcgtgtattcgagacaagagaggtccgcccccacaagacggctgaagaa-3′。
4、权利要求1所述的试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)DNA提取液:配制裂解缓冲液,包括如下组分:0.1M Tris-HCl(pH 8.0),0.1~0.15M NaCl,0.1~0.5M EDTA(pH 8.0)和1%~4%SDS。配制蛋白酶K的贮存液,浓度为20mg/ml。提取组织或细胞基因组时现加蛋白酶K入裂解缓冲液体,终浓度为4μg/μl,即为DNA提取液。
2)定量PCR反应液包括:由SYBR-Green I,正反向引物Toxo-BF和Toxo-BR、MgCl2、dNTPs及无菌双蒸水组成;
3)标准阳性模板pMD-B1:标准阳性模板pMD-B1含有弓形虫高度保守基因B1基因223个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒,该重组质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取,用分光光度计测A260定量并稀释至1010拷贝/μl,使用前进行10倍梯度的系列稀释;
4)弓形虫B1基因特异性引物:
正向引物Toxo-BF:5′-TCCTTCGTCCGTCGTAAT-3′;
反向引物Toxo-BR:5′-TTCTTCAGCCGTCTTGTG-3′;
5)阴性质控标准品:阴性质控标准品为无菌双蒸水。
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