CN105603104A

CN105603104A - 一种检测血清中循环microRNA的方法

Info

Publication number: CN105603104A
Application number: CN201610148876.XA
Authority: CN
Inventors: 李娟�; 杨黄浩; 洪诚毅; 吴淑贤; 许小平
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2016-03-16
Filing date: 2016-03-16
Publication date: 2016-05-25

Abstract

本发明是基于p19蛋白修饰的磁性微球的特异性富集作用和滚环扩增放大技术，开发了一种简单的方法用于血清中循环microRNA的检测。首先，将双功能探针与目标miRNA杂交形成dsRNA结构，并通过与p19蛋白的特异性结合作用富集到PFMBs表面。然后将加热释放出的JP探针/miRNA复合物作为引物进行RCA反应，从而产生长单链DNA产物。加入检测探针与RCA产物杂交形成长dsDNA，并嵌入大量荧光染料SYBR？Green获得增强的荧光信号。通过利用PFMBs特异性富集目标物及降低背景信号，并结合RCA进行信号放大，所建立的方法具有很高的灵敏度。在最优实验条件下，得到该方法的线性范围为10？fM~100？pM，miRNA的检测限低至1？fM。

Description

一种检测血清中循环microRNA的方法

技术领域

本发明属于核酸杂交检测领域，具体涉及一种检测血清中循环microRNA的方法。

背景技术

microRNA（miRNA）是长度为21~25个核糖核苷酸的内源性非编码小单链RNA分子，在众多细胞基因表达途径的调节中扮演着重要的角色。它们通过结合到mRNAs的3'端非翻译区，来调节mRNA的断裂或者阻止蛋白的合成。据报道，3'端非翻译区受到优先保护，miRNAs调控人类60%的基因。Calin小组首次发现miRNAs与人类癌症的关系，并在许多类型的肿瘤中发现miRNAs表达的改变。一些miRNAs是肿瘤的抑制基因，另一些则是直接或间接的致癌基因。此外，迄今已发现，miRNA能够抵抗RNA酶的降解、极端pH和温度条件的破坏，且能够在提取后或直接在血清或血浆中检测。这些发现表明用血清中的循环miRNAs作为一种标志物，对促进基础生物医学研究的进步和帮助癌症的诊断具有重要意义。因此，我们急需构建一种能够快速、灵敏检测miRNAs的方法。

目前，已有许多miRNA的检测分析方法被报道，包括RNA印记法、微阵列芯片检测法、毛细管电泳法、电化学生物传感器法和荧光技术检测法（实时定量PCR）等。其中，荧光检测技术由于具有灵敏度高、选择性好、分析快速和整体成本效益好等优点，是最常使用的miRNA检测技术。同时，该检测技术提供了包括波长、荧光寿命和强度的多个荧光检测参数，增加了检测的灵活性。

实时定量PCR（qRT-PCR）作为一个强大的荧光技术检测工具被用于miRNA的高灵敏和准确的定量分析。然而，qRT-PCR通常需要对实际样本中的miRNA进行分离和纯化。此外，miRNA的长度比较短，给PCR引物的设计增加了困难。为了在不降低检测能力的前提下取代PCR，研究人员开发了许多基于荧光的信号放大检测方法，如基于发卡结构的放大方法、等温链置换聚合酶反应法（ISDPR）和滚环扩增放大法（RCA）。然而这些方法大都需要在检测前从实际样品中提取总RNA，使得这些方法变得复杂而且需要耗费大量劳力。因此，开发一种可用于实际样品中循环miRNA直接检测的简单方法具有重要意义。

p19RNA结合蛋白，来自康乃馨意大利环斑病毒，是一个RNA沉默的抑制因子。它能够以很高的亲和力（纳摩尔水平）结合特定大小和序列的双链RNA（dsRNA），而不会与ssRNA、rRNA、mRNA、ssDNA或者dsDNA结合。p19RNA结合蛋白结合力的大小取决于dsRNA双链区域的长度，它能与含21-23对碱基的dsRNA牢固结合，而与具有24-26对碱基的dsRNA的结合力逐渐减弱，其与19个碱基对或者更短的dsRNA结合力较差。基于上述奇特的结合性质，研究人员开发了与p19蛋白相关的亲和力毛细管电泳检测方法和电化学检测方法。这些方法对miRNA的检测具有很高的灵敏度和选择性。然而在实际样品检测中，电泳分离的条件很难优化。另一方面，血清中高含量的蛋白质和其它成分通过非特异性吸附可干扰电极并产生错误的信号。本发明利用p19蛋白的特性，开发了一种简单的基于p19蛋白修饰的磁性微球（PFMBs）特异性富集和滚环扩增技术（RCA）的循环miRNAs检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种简单的方法用于血清中循环microRNA（miRNA）的检测，通过利用PFMBs特异性富集目标物及降低背景信号，并结合RCA进行信号放大，所建立的方法具有很高的灵敏度，且本发明可直接用于实际样品中循环miRNA的定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案；

一种检测血清中循环microRNA的方法，包括以下步骤：通过杂交形成双功能探针/miRNA的复合物，用p19蛋白修饰的磁性微球对目标miRNA进行富集以及利用滚环扩增技术进行信号放大；具体步骤如下：

（1）双功能探针与目标miRNA杂交形成双链的dsRNA，dsRNA通过与p19蛋白修饰的磁性微球特异性结合被捕获，通过加热可将dsRNA从蛋白修饰的磁性微球上释放收集起来得到双功能探针/miRNA复合物；

（2）将步骤（2）释放出的双功能探针/miRNA复合物中的双功能探针作为引物进行RCA反应，得到含有几千个重复序列的长线形单链DNA，加入检测探针，与RCA产物进行杂交形成dsDNA；

（3）将荧光染料嵌入剂嵌入步骤（2）所述的dsDNA溶液中可获得强荧光，从而实现目标miRNA的灵敏检测。

步骤（1）所述的双功能探针由两部分构成，一部分与目标miRNA的核酸序列互补，另一部分是DNA核酸序列，可用做RCA反应的引物。

步骤（1）所述的双功能探针和miRNA分散在结合缓冲液中，所述的结合缓冲液含有20mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMEDTA，1mMTCEP和0.02%Tween-20。

步骤（1）所述的dsRNA，具体合成步骤为：取10μL双功能探针与500μLmiRNA加入到490μL结合缓冲液中在30℃下孵育2小时得到dsRNA。

步骤（1）所述p19蛋白修饰的磁性微球的制备通过以下步骤实现：磁性微球在使用前先分散在结合缓冲液中，并简单的进行震荡；然后将p19蛋白加入到磁性微球分散液中，室温震荡30分钟后，用磁石进行磁性分离，移除上清液并用结合缓冲液洗两次得到p19蛋白修饰的磁性微球。

步骤（1）所述JP探针/miRNA复合物的捕获与收集通过以下步骤实现：将15μLp19蛋白修饰的磁性微球加入到所述的1mLdsRNA溶液中，在室温下震荡反应2小时，用洗涤缓冲液洗涤5次；用磁性分离架将磁性微球吸到管子侧壁，移除溶液，剩余物质分散在DEPC处理过的去离子水中，加热到90℃并维持15分钟，得到双功能探针/miRNA复合物。

所用的洗涤缓冲液中含有20mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMEDTA，100μg/mlBSA。

步骤（2）所述的RCA反应具体通过以下步骤实现：取步骤（1）中收集的JP探针/miRNA复合物溶液，加入到含有2mMMgCl₂，2mM(NH₄)₂SO₄，0.4mMDTT，1mMdNTP和环形DNA模板的Tris-HCl缓冲液中；往上述溶液中加入DNA聚合酶于30℃RCA聚合反应3小时；随后将溶液加热到65℃并维持15分钟以停止RCA反应；溶液冷却至室温后，往溶液中加入检测探针进行杂交反应，30℃反应1小时。

步骤（3）所述的荧光染料嵌入剂加入的体积为3μL；用pH7.5的PBS将有荧光染料嵌入剂嵌入的dsDNA溶液稀释到600μL；在室温下反应15分钟后测定荧光光谱。，所述的荧光光谱是用F4600荧光分光光度计，激发波长为480nm，发射波长为500-650nm，最大发射峰为530nm。

一种基于磁性微球特异富集和滚环放大技术检测血清中循环microRNA的方法具体步骤为：

（1）p19蛋白修饰的磁性微球的制备：将p19蛋白加入到磁性微球分散液中，室温震荡30分钟后，用磁石进行磁性分离，移除上清液并用结合缓冲液洗两次得到p19蛋白修饰的磁性微球。

（2）JP探针/miRNA复合物的捕获与收集：取10μLJP探针和500μLmiRNA加入到490μL结合缓冲液中并在30℃下孵育2小时得到dsRNA。将15μL步骤（1）中制备的PFMBs加入到1mLdsRNA溶液中，在室温下震荡反应2小时，用洗涤缓冲液洗涤5次。最后，用磁性分离架将磁性微球吸到管子侧壁，移除溶液，剩余物质分散在DEPC处理的去离子水中，加热到90℃并维持15分钟，得到JP探针/miRNA复合物。

（3）JP探针/miRNA复合物的RCA反应：取步骤（2）中收集的JP探针/miRNA复合物溶液，加入到含有2mMMgCl₂，2mM(NH₄)₂SO₄，0.4mMDTT，1mMdNTP和环形DNA模板的Tris-HCl（10mM，pH7.5）缓冲液中。往上述溶液中加入DNA聚合酶进行RCA聚合反应（30℃，3小时）。随后将溶液加热到65℃并维持15分钟以停止RCA反应。溶液冷却至室温后，往溶液中加入检测探针进行杂交反应（30℃，1小时）。

（4）取3μL荧光染料嵌入剂SYBRGreen（SG）嵌入步骤（3）所述的dsDNA溶液中，用pH7.5的PBS将有SG嵌入的dsDNA溶液稀释。在室温下反应15分钟后测定荧光光谱，所述的荧光光谱是用日本日立公司购买的F4600荧光分光光度计，激发波长为480nm，发射波长为500-650nm，最大发射峰为530nm。

本发明的显著优点在于：

1.本发明制备的p19蛋白修饰的磁性微球，对目标miRNA具有特异性富集的作用，且可以降低背景信号，有利于目标miRNA的特异性检测。

2.结合滚环放大技术的应用来检测血清中循环microRNA，所建立的方法具有很高的灵敏度，在最优实验条件下，得到该方法的线性范围为10fM~100pM，miRNA的检测限低至1fM。

3.本发明无需对循环miRNA进行分离提取，可直接用于实际样品中循环microRNA的检测。

4.本发明可以定量的检测血清中循环microRNA，定量误差小。

附图说明

图1为本发明方法所述的原理图。

图2为不同miRNA-21浓度下的荧光发射光谱图，其中内插图为miRNA-21的工作曲线。

图3为不同miRNA-16浓度下的荧光发射光谱图。

图4为不同浓度、不同miRNA分子荧光强度响应的比较。

图5为5个健康的捐赠者（样品1-5）和5个新诊断乳腺癌患者（样品1'-5'）血清中miRNA-21的荧光响应变化值（△F）的比较。

图6为稀释的血清样品中标准添加miRNA-21的浓度与荧光强度的关系。

图7为荧光定量PCR（绿色）与本发明方法（红色）测得血清中miRNA-21表达水平的比较。

具体实施方式

为了验证设计的可行性，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明应用不仅限于此。

表1为本发明所用到的所有核酸序列表。其中，JP探针的粗体部分序列与miRNA-21互补，斜体部分序列与环形DNA的下划线部分序列互补。JP-2探针的粗体部分序列与miRNA-16互补，斜体部分序列与环形DNA的下划线部分序列互补。

表1

实施例1

为了测试该方法的实用性，选用miRNA-21作为一个模型来进行验证。miRNA-21是一个在乳腺癌细胞中过表达的miRNA。在最佳条件下，考察了所构建的方法对一系列浓度miRNA-21的荧光响应。

取10μLJP探针（20nM）和500μL不同浓度（0M，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM）的miRNA-21加入到490μL结合缓冲液中并在30℃下孵育2小时得到dsRNA。将15μLPFMBs加入到1mLdsRNA溶液中，在室温下震荡反应2小时，用洗涤缓冲液洗5次以除去未结合的JP探针及miRNA。最后，用磁性分离架将磁性微球吸到管子侧壁，并用移液枪小心移除溶液，剩余物质分散在20μLDEPC处理的去离子水中，加热到90℃并维持15分钟，以释放JP探针/miRNA复合物。

取10μLJP探针/miRNA复合物溶液，加入到含有2mMMgCl₂、2mM(NH₄)₂SO₄、0.4mMDTT、1mMdNTP和25nM环形DNA模板的8μLTris-HCl（10mM，pH7.5）缓冲液中。往上述溶液中加入2μLDNA聚合酶进行RCA聚合反应（30℃，3小时）。随后将溶液加热到65℃并维持15分钟以停止RCA反应。待溶液冷却至室温后，往溶液中加入3μL，1μM的检测探针。杂交反应在30℃下进行1小时。

取3μL荧光染料嵌入剂SYBRGreen（SG）嵌入步骤（3）所述的dsDNA溶液中，用pH7.5的PBS将有SG嵌入的dsDNA溶液稀释到600μL。在室温下反应15分钟后测定荧光光谱，激发波长为480nm，发射波长为500-650nm，最大发射峰为530nm。

检测结果如图2所示。从图中可知，荧光强度随着miRNA-21浓度（10fM-100pM）的增加而增大（曲线a到g浓度分别为0M，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM）。在miRNA-21浓度为100pM时可以观察到约19倍的荧光增强。荧光比值（F-F₀）/F₀与miRNA-21浓度的对数在一定范围内（10fM-100pM）呈良好的对数关系，线性方程为(F-F₀)/F₀=4.03lg(C_miRNA)+58.15(R²=0.9935)。此处，F₀和F分别是在不含和含有miRNA-21时530nm处的荧光强度。检测限为1fM（S/N=3）。在10fM的miRNA-21存在的条件下进行五组重复试验来验证方法的精确度。获得的相对标准偏差为3.42%，说明该方法重现性较好。

实施例2

选用了另外一条探针（JP-2）用于检测另外一个目标miRNA-16，以验证该方法在miRNA检测方面的普遍适用性。JP-2探针的RNA序列与miRNA-16的序列互补。

取10μLJP-2探针（20nM）和500μL不同浓度（0M，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM）的miRNA-16加入到490μL结合缓冲液中并在30℃下孵育2小时得到dsRNA。将15μLPFMBs加入到1mLdsRNA溶液中，在室温下震荡反应2小时，用洗涤缓冲液洗5次以除去未结合的JP探针及miRNA。最后，用磁性分离架将磁性微球吸到管子侧壁，并用移液枪小心移除溶液，剩余物质分散在20μLDEPC处理的去离子水中，加热到90℃并维持15分钟，以释放JP探针/miRNA复合物。

取10μLJP探针/miRNA复合物溶液，加入到含有2mMMgCl₂，2mM(NH₄)₂SO₄，0.4mMDTT，1mMdNTP和25nM环形DNA模板的8μLTris-HCl（10mM，pH7.5）缓冲液中。往上述溶液中加入2μLDNA聚合酶进行RCA聚合反应（30℃，3小时）。随后将溶液加热到65℃并维持15分钟以停止RCA反应。待溶液冷却至室温后，往溶液中加入3μL，1μM的检测探针。杂交反应在30℃下进行1小时。

本发明方法检测miRNA-16结果如图3，荧光强度随着目标miRNA-16浓度的增加而增大（曲线a到g浓度分别为0M，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM），说明该方法对不同miRNA的检测具有普遍适用性。

实施例3

为了评估本发明方法的特异性，用相同的实验步骤对3个不同浓度的目标miRNA-21和另外两条miRNA（miRNA-155和miRNA-16）进行检测。

检测结果如图4所示，miRNA-155、miRNA-16比miRNA-21产生的荧光信号变化值小得多。由10fM的miRNA-21产生的荧光比值(F-F₀)/F₀约为1pM的miRNA-155和miRNA-16的3.25倍。这些结果表明，该方法具有很高的序列特异性，有望用于识别不同的miRNA序列。

实施例4

为了验证本发明方法在实际样品检测中的适用性，对来自5个健康的捐赠者和5个新诊断乳腺癌患者的血清样本进行了测试。

检测结果如图5所示，荧光强度的变化值（△F）根据下列方程进行计算：△F=F-F₀（F₀和F分别是在不含和含有miRNA-21时530nm处的荧光强度）。检测发现，乳腺癌患者的血清比健康人血清产生的荧光强度高，表明乳腺癌患者血清中miRNA表达的上调。这一结果与有关文献报道相一致。

实施例5

本发明方法可定量检测血清中miRNA浓度。用标准添加法对实施例4中乳腺癌患者血清中miRNA-21浓度进行估算。

选用病人的血清样品1'作为检测样。分别往样品1'中添加相同体积不同浓度（0、10、20、40、60、80、100fM）的标准miRNA-21，建立一个校准曲线（图6）。通过计算，得到稀释样中miRNA的浓度为30.01fM。因此，样品中的miRNA-21初始浓度为60.02fM。运用相同的方法进行检测和计算，得到其它四个病人血清样品中的miRNA-21的浓度分别为73.22fM、84.54fM、89.32fM和115.28fM。

为了验证本发明方法定量的准确性，运用qPCR分析方法对癌症病人血清样品中miRNA-21进行分析，并将获得的结果与本发明所建立的荧光检测结果进行比较。结果表明，这两种方法测得的结果基本一致，通过该荧光传感器测得的miRNA-21浓度值在误差允许的范围内（图7）。说明本发明方法有望用于实际样品中miRNA的准确和可靠检测。

SEQUENCELISTING

<110>福州大学

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Claims

1.一种检测血清中循环microRNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：通过杂交形成双功能探针/miRNA的复合物，用p19蛋白修饰的磁性微球对目标miRNA进行富集以及利用滚环扩增技术进行信号放大；具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的双功能探针由两部分构成，一部分与目标miRNA的核酸序列互补，另一部分是DNA核酸序列，用做RCA反应的引物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的双功能探针和miRNA分散在结合缓冲液中，所述的结合缓冲液含有20mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMEDTA，1mMTCEP和0.02%Tween-20。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的dsRNA，具体合成步骤为：取10μL双功能探针与500μLmiRNA加入到490μL结合缓冲液中在30℃下孵育2小时得到dsRNA。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述p19蛋白修饰的磁性微球的制备通过以下步骤实现：磁性微球在使用前先分散在结合缓冲液中，并简单的进行震荡；然后将p19蛋白加入到磁性微球分散液中，室温震荡30分钟后，用磁石进行磁性分离，移除上清液并用结合缓冲液洗两次得到p19蛋白修饰的磁性微球。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述JP探针/miRNA复合物的捕获与收集通过以下步骤实现：将15μLp19蛋白修饰的磁性微球加入到所述的1mLdsRNA溶液中，在室温下震荡反应2小时，用洗涤缓冲液洗涤5次；用磁性分离架将磁性微球吸到管子侧壁，移除溶液，剩余物质分散在DEPC处理过的去离子水中，加热到90℃并维持15分钟，得到双功能探针/miRNA复合物。

7.根据权利要求6中所述的方法，其特征在于：所用的洗涤缓冲液中含有20mMTris-HCl，100mMNaCl，1mMEDTA，100μg/mlBSA。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的RCA反应具体通过以下步骤实现：取步骤（1）中收集的JP探针/miRNA复合物溶液，加入到含有2mMMgCl₂，2mM(NH₄)₂SO₄，0.4mMDTT，1mMdNTP和环形DNA模板的Tris-HCl缓冲液中；往上述溶液中加入DNA聚合酶于30℃RCA聚合反应3小时；随后将溶液加热到65℃并维持15分钟以停止RCA反应；溶液冷却至室温后，往溶液中加入检测探针进行杂交反应，30℃反应1小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述的荧光染料嵌入剂加入的体积为3μL；用pH7.5的PBS将有荧光染料嵌入剂嵌入的dsDNA溶液稀释到600μL；在室温下反应15分钟后测定荧光光谱。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的荧光光谱是用F4600荧光分光光度计，激发波长为480nm，发射波长为500-650nm，最大发射峰为530nm。