CN107988318B - 基于电化学电势预处理技术快速检测核酸的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开基于电化学电势预处理技术快速检测核酸的方法及应用。该方法是PBS缓冲液为电解液，探针与目标核酸片段加入PBS缓冲液中，按碱基互补配对原则形成核酸杂化溶液。传感电极在大于1.8V的电势范围内，进行电化学预处理，而后运用SWV选择性检测目标核酸。该电化学预处理技术的核酸检测方法在疾病特征miRNA相关电化学生物传感检测及医学诊断及食品和环境等病原体检测领域中的应用。该检测方法应用于核酸时具有如下特点：高选择性，对核酸分子能够实现单碱基错配检出；高灵敏度，检测灵敏度达5×10‑18M；检测结果完全能够重复；操作过程经济简单，不存在链反应，无需扩增，无需荧光指示剂。

Description

基于电化学电势预处理技术快速检测核酸的方法及应用
技术领域
本发明属于微电子生物传感技术领域，涉及一种电化学预处理技术的核酸片段检测方法，特别是一种电化学电势预处理技术的miRNA直接检测方法及miRNA相关电化学传感检测的应用。
背景技术
miRNA是一类非编码的小分子单链RNA,广泛存在于动植物和原生生物中,以基因表达的方式参与调节生物体系的各种生物学过程。因此miRNA检测应用引起包括医药、食品、法医和环境等应用领域的广泛兴趣，是目前传感检测应用研究领域的热点。特别是miRNAs在炎症及癌变发生等病理过程中发挥关键作用，如miR-122、miR-21、miR-1290和miR-141等小分子RNA在癌细胞中出现异常表达。当前，miRNAs被公认最具潜力的肿瘤标志物。以miRNAs作为肿瘤标志物，比检测蛋白肿瘤标志物特异性更高，更直接，更具优势。因此，miRNA的研究对病原体检测、癌症的早期诊断和研究，药物靶点筛选，新药研发等非常重要。但是，由于RNA水解酶(Rnases)无处不在，RNA稳定性很差；并且miRNAs链很短，最多只有22个碱基，给miRNAs研究检测带来诸多困难。miRNAs研究检测一般需要复杂的预处理步骤及昂贵的光学仪器及荧光试剂等。因此，建立快速、灵敏、简便、准确的，能够满足于生命科学研究和医学及临床诊断领域等等的实际应用的miRNA检测方法是必须的，也是传感检测应用科学中的重要课题。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有核酸检测研究的不足之处，提出一种利用电化学电势预处理技术在一定电压范围内直接快速检测核酸的方法。
下面以玻碳电极为例，来进行具体说明。
本发明方法具体是：以玻碳电极为传感电极，在最大电压≥1.8V的电势范围内，进行电化学预处理；以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)作为电解液，将与目标核酸片段相匹配的探针DNA或RNA与待检测核酸片段加入2mL PBS缓冲液中，使得溶液按碱基互补配对原则(A-U，G-C，A-T)形成核酸杂化溶液(即杂化的双链DNA-RNA，DNA-DNA或RNA-RNA)；然后在小于1.8V的电势范围，运用电化学方波伏安(SWV)扫描，通过直接观察是否有肩峰出现，进而判断待检测核酸片段是否与目标核酸片段碱基序列一致。
若探针DNA或RNA与待检测核酸片段完美匹配(即待检测核酸片段与目标核酸片段碱基序列一致)时，在小于1.8V的电势范围内，进行电化学方波伏安(SWV)扫描时出现肩峰，若探针DNA或RNA与待检测核酸片段错配(即待检测核酸片段与目标核酸片段碱基序列不一致)时，电化学方波伏安(SWV)扫描时没有肩峰出现。
本发明选择1.8V为电化学处理的最低电压值。
本发明所采用的探针与待检测核酸片段体积和浓度为任意比例。
本发明提供的电化学电势预处理检测方法中使用的检测探针是DNA或RNA(miRNA)，检测的目标核酸片段是DNA，cDNA或RNA(miRNA)。
本发明提供的电化学电势预处理检测方法中检测体系为单核酸体系及多核酸混合体系或Total RNA(miRNA)或总miRNA。
本发明的另一个目的是提供上述核酸检测方法在疾病特征miRNA相关电化学生物传感检测和疾病诊断及食品和环境等领域病原体检测的应用。其中探针DNA或RNA选取与具有疾病特征或病原体的目标DNA，miRNA或cDNA相匹配。
具体是pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为电解质溶液，以玻碳电极为传感电极，在大于等于1.8V的电势范围内，进行电化学电势预处理后，使探针DNA或RNA与具有疾病特征或病原体的目标miRNA或cDNA杂化，形成杂化的双链DNA-RNA，DNA-DNA或RNA-RNA，利用电化学技术手段，实现疾病特征或病原体的miRNA电化学生物传感检测。
疾病特征或病原体miRNA是人工合成的疾病特征miRNA或其cDNA，疾病细胞中提取的miRNA，血清中提取的miRNA。
本发明提供的电化学电势预处理检测方法的应用领域为医学、食品、环境等领域，但不限于此，凡是能应用此方法检测核酸的领域，都适用本发明。
本发明利用电化学电势预处理技术在一定电压范围内直接快速检测核酸的方法及其疾病特征miRNA的核酸检测和疾病诊断及病原体检测的应用，具有如下特点：(1)高选择性，对核酸分子能够实现单碱基错配检出；(2)高灵敏度，检测灵敏度达5×10-18M；(3)检测结果完全能够重复实现；(4)操作过程经济简单，不存在链反应，无需扩增，无需荧光指示剂。
附图说明
图1为电化学电势预处理法检测核酸完美配对与错配的方波伏安比较图：(a)完美配对；(b)错配；(c)PBS空白；
图2为电化学电势预处理法检测不同浓度完美配对核酸溶液的方波伏安图：(a)PBS空白；核酸溶液浓度分别为(b)5×10-21M；(c)5×10-18M；(d)5×10-15M；(e)5×10-12M。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步说明:
下面实施例提供的电化学电势预处理检测方法的目标核酸样品来源是人工合成的DNA及cDNA或RNA(miRNA)片段，细菌DNA及RNA(miRNA)，病毒DNA及RNA(miRNA),细胞提取的DNA及RNA(miRNA)，或血清RNA(miRNA)，Total RNA等。
电化学电势预处理检测方法中核酸杂化形式为杂化的双链DNA-RNA，DNA-DNA或RNA-RNA。
实施例1.DNA-DNA杂化体系
将人工合成的目标DNA(5’-GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’)溶液分别等体积地滴入5pM正配探针(5’-GTATCATCAGGTCCTTCCCACC-3’)溶液和5pM错配探针(5’-GTATCATCAGGACCTTCCCACC-3’)溶液中，通过DNA-DNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在1.8-2.7V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果如附图1所示:正配杂交溶液方波伏安曲线在1.0-1.8V范围出现肩峰，错配杂交溶液及PBS空白溶液的方波伏安曲线在1.0-1.8V范围没有肩峰出现，并且灵敏度极高，能够检测到5×10-18M(图2)。
实施例2.DNA-cDNA杂化体系
将人工合成的前列腺癌特征标志物miR-141的cDNA(5’-TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3’)溶液分别等体积地滴入5pM正配探针(5’-CCATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’)溶液和5pM错配探针(5’-ACATCTTTACCAGACAGTGTTA-3’)溶液中，通过cDNA-DNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在1.8-2.5V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果类似附图1，图2所示。
实施例3.DNA-RNA杂化体系
将人工合成的目标RNA(5’-GGUGGGAAGGACCUGAUGAUAC-3’)溶液分别等体积地滴入5pM正配探针(5’-GTATCATCAGGTCCTTCCCACC-3’)溶液和5pM错配探针(5’-GTTTCATCAGGTCCTTCCCACC-3’)溶液中，通过DNA-RNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在0-2.7V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果类似附图1，图2所示。
实施例4.胰腺癌DNA-RNA杂化体系
将人工合成的胰腺癌特征标志物miR-1290(5'-UGGAUUUUUGGAUCAGGGA-3')溶液分别等体积地滴入5pM正配探针(5'-TCCCTGATCCAAAAATCCA-3')溶液和5pM错配探针(5'-TCGCTGATCCAAAAATCCA-3')溶液中，通过RNA-DNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在0.8-2.5V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果类似附图1，图2所示。
实施例5.登革热RNA-RNA杂化体系
将人工合成的登革热特征标志物DENV-2miRNA(5'-GGAAGCUGUACGCAUGGCGUA-3')溶液分别等体积地滴入5pM正配探针(3'-NH2–2-O-Me-(CCUUCGACAUGCG)TACCGCAT-5')溶液和5pM错配探针(3'-NH2–2-O-Me-(CCUUCGACAUGCG)TACCCCAT-5')溶液中，通过RNA-RNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在0.3-2.5V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果类似附图1，图2所示。
实施例6.肺癌细胞DNA-Total RNA(总miRNA)杂化体系
将从肺癌细胞A549中提取的总miRNA溶液分别等体积地滴入5pM正配探针(5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3')溶液和5pM错配探针(5'-TCAACATCAGTCTGATAAGATA-3')溶液中，通过RNA-DNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在0.5-2.5V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果类似附图1，图2所示。
实施例7.肝癌患者血清DNA-Total RNA(总miRNA)杂化体系
将从肝癌患者血清中提取的miRNA溶液分别等体积地滴入5pM肝损伤特征标志物Has-miR-122的正配探针(5'-CAAACACCATTGTCACACTCCA-3')溶液和5pM错配探针(5'-CAAACACCATTCTCACACTCCA-3')溶液中，通过RNA-DNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在0.1-2.4V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果类似附图1，图2所示。
实施例8.食品或环境检测应用-大肠杆菌E.Coli RNAs检测
将人工合成的目标lacZ,E.coli lacZ miRNA(nt5’-AUGUGGAUUGGCGAUAAAAAACAA-3’)溶液等体积地滴入5pM正配探针(5’-d(GTTGTTTTTT)-2’-O-Me-RNA(AUCGCCAAUCCACAU)-d(CTGTGAAAGA)-NH2-3’)溶液中，通过RNA-RNA杂化反应，形成正配杂交溶液和错配杂交溶液。玻碳电极在0-2.5V电势范围进行预处理，然后以pH＝7.4的模拟体液磷酸缓冲溶液(PBS缓冲液)为空白对比，在小于1.8V电势范围，对上述正配杂交溶液和错配杂交溶液及PBS空白溶液进行方波伏安扫描，电化学传感检测结果类似附图1，图2所示。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.非诊断目的的基于电化学电势预处理技术快速检测DNA或RNA核酸的方法，其特征在于该方法是在大于0V且小于等于2.7V的电势范围内，对玻碳电极进行电化学预处理；将与目标核酸片段相匹配的探针与待检测核酸片段加入pH 7.4的PBS缓冲液中，使得溶液按碱基互补配对原则形成核酸杂化溶液作为电解液；然后在1.0-1.8V的电势范围，运用电化学方波伏安法扫描，通过直接观察是否有肩峰出现，进而判断待检测核酸片段是否与目标核酸片段碱基序列一致；
若探针与待检测核酸片段完美匹配时，在1.0-1.8V的电势范围内，进行电化学方波伏安法扫描时出现肩峰，若探针与待检测核酸片段错配时，电化学方波伏安法扫描时没有肩峰出现。
2.如权利要求1所述的非诊断目的的基于电化学电势预处理技术快速检测DNA或RNA核酸的方法，其特征在于探针是DNA或RNA，检测的目标核酸片段是DNA或RNA。
3.如权利要求1所述的非诊断目的的基于电化学电势预处理技术快速检测DNA或RNA核酸的方法，其特征在于目标核酸片段所在的检测体系为单核酸体系及多核酸混合体系。
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CN110482566A (zh) * 2019-09-02 2019-11-22 杭州电子科技大学 一种介孔钛硅化合物及其在核酸分子检测上的应用
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