CN103555841B - 家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法 - Google Patents

家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法。该试剂盒根据靶序列上MOMP的1个区域设计2条引物和一条探针，可特异性的扩增家畜衣原体。该试剂盒包括扩增反应液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。

Description

家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法。
背景技术
动物衣原体病(Chlamydiosis)是由各类衣原体(Chlamydia)感染哺乳动物、禽类等动物所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。该病呈地方流行，常造成很大危害及经济损失。衣原体科的最新分类研究表明，衣原体科（Chlamydiaceae）分为衣原体属（Chlamydia）和嗜衣原体属（Chlamydophila），包括沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis）、猪源衣原体(Chlamydiasuis)、鼠沙眼衣原体（Chlamydiamuridarum）、流产嗜衣原体(Chlamydophilaabortus)、猫嗜衣原体(Chlamydophilafelis)、家畜嗜衣原体(Chlamydophilapecorum)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)和鹦鹉热衣原体(Chlamydophilapsittaci)。感染动物的衣原体主要有6种：猪源衣原体、猫衣原体、家畜衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体。家畜衣原体属于嗜性衣原体属。目前已经从牛、绵羊、山羊、考拉和猪分离到该菌。考拉感染家畜衣原体后引起不育症和尿道疾病；其他动物感染后会引起流产、结膜炎、脑脊髓炎、肠炎、肺炎等疾病。家畜衣原体首次从间歇性脑脊髓炎病牛分离出来。C.pecorum常发现于健康小反刍动物如绵羊肠道（ClarksonM.J.等，1997），但有些分离株与结膜炎、关节炎和睾丸炎有关（RodolakisA..等，1989；StorzJ..等，1968）。猪C.pecorum感染引发肺炎、多发性关节炎、胸膜炎、心包炎和流产。沙眼衣原体和C.pecorum混合感染可能是猪衣原体流产的主要原因。由此可见家畜衣原体对养殖业有着很大的危害，对养殖业的发展造成极大的威胁。本发明就此研究开发了家畜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，这种方法能够快速准确的检测到家畜衣原体，在最短的时间内做出相应的对策。
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团链接在探针的5，末端，淬灭基团则在3，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3，端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5，外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。
TaqMan—MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。
中国发明专利（申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等）分别公开了采用荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测家畜衣原体(C.pecorum)的试剂盒及检测方法的报道。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种家畜衣原体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的家畜衣原体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法，用于对肉食品出入境进行检测。
为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：家畜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，包括家畜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQIDNO.1；家畜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQIDNO.2；家畜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQIDNO.3。
为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案：一种家畜衣原体荧光实时定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：
DNA序列为SEQIDNO.1的10μmol/L的家畜衣原体上游引物0.2μL；
DNA序列为SEQIDNO.2的10μmmol/L的家畜衣原体下游引物0.2μL；
DNA序列为SEQIDNO.3的10μmol/L的猪家畜衣原体MGB探针0.4μL；
2×PremixExTaq缓冲液10μL；
灭菌去离子水8.2μL；
所述阳性对照管，管内为家畜衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20μL；
核苷酸序列为SEQIDNO.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQIDNO.5的PCR下游引物按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA;
所述阴性对照管，管内为无家畜衣原体感染的猪的血液基因组DNA，体积为20μL；
所述灭菌去离子水管1mL～2mL。
为了实现上述第二目的本发明提供一种家畜衣原体荧光实时定量PCR检测方法：包括如下步骤：
1）制备待检模板DNA：选用商品化的DNA提取试剂盒，提取待测样品中的DNA，获得待检模板DNA；
2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液，1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;
3）家畜衣原体荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR管反应条件：预变性95℃30s；95℃5s，58℃30s～34s（使用ABI7500建议采用34s）40个循环；在58℃30s进行荧光信号的采集。
4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
本发明的原理是：针对一段1000bp左右的靶序列上MOMP保守区域设计2条引物和一条MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5，端标记有报告基团FAM，3，端标记有非淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，可以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。
TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测。现有的家畜衣原体的检测周期较长，约1天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需50min左右。
本发明的优点是（1）、不需要特殊试剂与设备；（2）、高特异性：应用MOMP的保守区段，二条引物及一条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.8%，假阳性率小于0.1%；（3）、快速、高效扩增：检测时间50min左右；（4）、灵敏度高：最低检测极限达到2.8×10拷贝/uL；（5）、鉴定简便：通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精确的，无需电泳等其他任何分析步骤；（6）、用途：可用于畜产品及其相关产品的快速检测。
附图说明
图1特异性试验结果
图2灵敏度试验结果;
图3稳定性试验结果；
图4标准曲线的建立；
图1中：分别采用了家畜衣原体菌株VR-1575，肺炎衣原体菌株53592，流产衣原体菌株VR-656，鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体菌株VR-878，小鼠衣原体VR-123,猫衣原体，阴性对照。
具体实施方式
实施例1，引物的设计及筛选
家畜衣原体荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的家畜衣原体MOMP基因的参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探针设计软件PrimerExpress3.0，设计4套荧光定量引物，由英骏（上海）有限公司合成，利用ABI7500FASTPCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组荧光定量PCR扩增引物，分别标记为SEQIDNO.1～SEQIDNO.3。其中引物组中上游引物:SEQIDNO.1；下游引物:SEQIDNO.2；探针:SEQIDNO.3；SEQIDNO.1～SEQIDNO.3的浓度分别为10μmol/L，10μmol/L，10μmol/L，体积比为1:1:2。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为：PCR上游引物：SEQIDNO.4；PCR下游引物：SEQIDNO.5；它们的体积比为1:1。
SEQIDNO.1代表的序列为：5’-GCAGAGCCAAGTTTATTAATTG-3’
SEQIDNO.2代表的序列为：5’-TAGCGCAAGGATCACATG-3’
SEQIDNO.3代表的序列为:5’FAM-ATCTCCTGACATACCTTC-MGB3’
SEQIDNO.4代表的序列为：5’-CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’
SEQIDNO.5代表的序列为：5’-GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’
实施例2，阳性对照品的制备
用试剂盒提取家畜衣原体细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定，采用PCR上游引物SEQIDNO.4和PCR下游引物SEQIDNO.5进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1:10的比例和pMD19-T载体进行连接反应，4℃连接过夜，转化DH5α菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之间。
实施例3，阴性对照品的制备
用试剂盒提取无家畜衣原体感染的猪的血液基因组DNA，进行PCR及电泳鉴定。
实施例4，家畜衣原体荧光定量PCR扩增快速检测方法：包括如下步骤：
1）制备待检模板DNA：选用商品化的DNA提取试剂盒，提取样品中的DNA，获得待检模板DNA。
2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL。
3）家畜衣原体荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃30s；95℃5s，58℃30s（使用ABI7500建议采用34s）40个循环；在58℃30s进行荧光信号的采集。
4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
实施例5，猪衣原体荧光定量PCR扩增的特异性试验
采用实施例4中的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别是家畜衣原体菌株VR-1575，肺炎衣原体菌株53592，流产衣原体菌株VR-656，鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体菌株VR-878，小鼠衣原体VR-123,猫衣原体，阴性对照。
参见图1的结果显示：图中的两条曲线分别表示只有VR-1575株家畜衣原体菌有检测结果。
实施例6，家畜衣原体荧光定量PCR扩增的灵敏度试验
将所建立的家畜衣原体质控标准品（即阳性质粒）进行10倍倍比稀释（2.8×108拷贝/μL~2.8×10拷贝/μL），采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出，建立的该方法最低能够检测出2.8×10拷贝/μL的DNA样品。
参见图2的结果显示：图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为2.8×108拷贝/μL、2.8×107拷贝/μL、2.8×106拷贝/μL、2.8×105拷贝/μL、2.8×104拷贝/μL、2.8×103拷贝/μL、2.8×102拷贝/μL、2.8×10拷贝/μL。
实施例7，家畜衣原体荧光定量PCR扩增的重复性试验
以重组质粒标准品2.8×106拷贝/μL与2.8×105拷贝/μL为模板，采用实施例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为0.1702％~2.796％，表明该方法具有较好的重复性。
参见图3的结果显示。
实施例8，家畜衣原体荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立
把重组质粒的标准品进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数R2=0.999，扩增效率达到101.7％，Y=3.2815x+41.396。由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率较好，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。
参见图4的结果显示。
SEQUENCELISTING
<110>重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>家畜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法
<160>5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.1
gcagagccaagtttattaattg22
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.2
tagcgcaaggatcacatg18
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.3
FAM-atctcctgacataccttc-MGB18
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.4
ctccttrcaagcyytgcctgt21
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.5
gtgagcwgctctttcrtyrattaarcg27

Claims (4)

1.家畜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在于：包括家畜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQIDNO.1；
家畜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQIDNO.2；
家畜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQIDNO.3，该序列的5，端标记有报告基团FAM，3，端标记有非淬灭基团，同时还连接有MGB修饰基团。
2.家畜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：它包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：
DNA序列为SEQIDNO.1的10μmol/L的家畜衣原体上游引物0.2μL；
DNA序列为SEQIDNO.2的10μmmol/L的家畜衣原体下游引物0.2μL；
DNA序列为SEQIDNO.3的10μmol/L的家畜衣原体MGB探针0.4μL；
2×PremixExTaq缓冲液10μL；
灭菌去离子水8.2μL；
合计19μL，为单次反应的用量；
所述阳性对照管，管内为家畜衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20μL；
所述阴性对照管，管内为无家畜衣原体感染的猪的血液基因组DNA，体积为20μL；
所述灭菌去离子水管1mL～2mL。
3.根据权利要求2所述家畜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒DNA由如下反应获得：
核苷酸序列为SEQIDNO.4的PCR上游引物和序列为SEQIDNO.5的PCR下游引物按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。
4.利用权利要求2所述试剂盒进行家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤：
1）制备待检模板DNA：选用商品化的DNA提取试剂盒，提取待测样品中的DNA，获得待检模板DNA；
2）扩增反应体系为：19μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20μL;
3）家畜衣原体荧光定量PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性95℃30s；95℃5s，58℃30s～34s40个循环；在58℃30s进行荧光信号的采集；
4）结果判定：将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
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