CN104164515A - 一种洪湖碘泡虫特异性pcr检测引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于洪湖碘泡虫的PCR检测引物，属于生物检测技术领域。该洪湖碘泡虫PCR检测引物包括正向和反向引物：正向引物F：5’–TCGCTCAGGGTGTAATG–3’和反向引物R：5’–ATGAGGCAGCGTAAAGG–3’。其通过洪湖碘泡虫基因组DNA的提取、洪湖碘泡虫的特异性引物设计、PCR反应和电泳检测得到结果。本发明的PCR检测引物具有特异性强、灵敏度高、耗时短的优点。该引物可以应用于普通PCR和荧光定量PCR检测中，在洪湖碘泡虫的病原种类鉴定、监测、疾病检疫方面具有一定的应用前景。

Description

一种洪湖碘泡虫特异性PCR检测引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测的引物及其检测方法，具体涉及一种用于检测洪湖碘泡虫的PCR检测引物及其检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

洪湖碘泡虫（Myxobolus honghuensis）是一种微小的，营寄生生活的后生动物，隶属于粘孢子动物门双壳目。它主要感染水体底栖的寡毛类动物和淡水鲫鱼，导致养殖及野生的鲫鱼发生“喉孢子虫病”。喉孢子虫病是鲫鱼养殖中非常重要的一种寄生虫疾病，每都造成大量的死亡，给鲫鱼养殖产业带来极大的经济损失。被感染的鲫鱼在发病初期眼球突出，咽喉部充血发炎；随着病情的发展，洪湖碘泡虫的孢子不断无性繁殖，形成无数白色孢囊，最终撑破鲫鱼喉咽腔上壁，孢子流出病灶，进入水体。巨大的孢囊阻碍病鱼摄食和鳃部的呼吸功能，导致病鱼大量死亡。从3-4cm的鲫鱼幼鱼到成鱼都有该病的发生。对该病的诊断主要根据发病鱼病灶组织显微镜镜检是否有洪湖碘泡虫的孢子。然而，当病鱼喉部出现明显病症，镜检出现孢子时已处于发病后期，此时药物完全无法治疗该疾病。在病原潜伏和发病的早期，洪湖碘泡虫的很难用常规的镜检方法检测出来。为了预防该疾病发生，出现了在不清楚是否感染有洪湖碘泡虫的情况下盲目的滥用药物。粘孢子虫的孢子通常仅有5-20μm大小，很容污染水、泥土、工具等，造成广发传播。因此，实际生产中迫切需要一种特异性强、灵敏度高、快速的检测手段。

通过对现有资料文献检索发现，尚未有与本发明的洪湖碘泡虫特异性PCR检测方法及核酸引物相关的报道。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已广发应用于各领域病原生物的快速检测。本发明根据洪湖碘泡虫检测靶点设计特异性引物并与PCR技术相结合，建立特异性强、灵敏度高、耗时短的检测方法。该方法在洪湖碘泡虫的病原种类鉴定、监测、疾病检疫方面具有一定的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种洪湖碘泡虫特异性PCR检测引物。该引物可用于洪湖碘泡虫的普通PCR检测和荧光定量PCR检测，具有检测结果特异性强、灵敏度高，实用性强。

按照本发明提供的技术方案，一种洪湖碘泡虫特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物；正向引物F：5’-TCGCTCAGGGTGTAATG-3’；反向引物R：5’-ATGAGGCAGCGTAAAGG-3’。

所述洪湖碘泡虫特异性PCR检测引物的检测方法，步骤为：以18S rDNA序列为靶基因，通过PCR方法，以待检样品DNA为模板，以权力要求1中核苷酸序列为引物扩增靶基因，检测是否存在扩增产物，有则表明检测结果为阳性；

具体步骤为：

（1）洪湖碘泡虫的DNA提取：采用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取洪湖碘泡虫的DNA，溶解在50 μL、pH7.8的TE缓冲液中，置于-20℃保存备用；

（2）PCR反应：

PCR检测体系为25 μL的总量，具体包含：

10×PCR buffer(含Mg2+)        2.5μL，

2.5mmol/L的dNTP            2.0μL，

rTaq酶 （5 U/μL）            0.2μL，

引物F(10 μmol/L)             0.5-1μL,  

引物R (10 μmol/L)            0.5-1μL,

样品DNA                     1-3 μL，

最后用灭菌双蒸水补至25 μL。

PCR检测反应程序为：94℃预变性3min；30个循环，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min，最后降温至4-12℃；

（3）电泳检测：取5-10μL PCR检测产物，以1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，电压100-140V，TAE电泳缓冲液中含Tris碱0.04mol/L，EDTA 2mM/L。

本发明的有益效果：本发明能快速、灵敏、准确的检测出洪湖碘泡虫的感染，对药物的预防以及苗种检疫有重要的意义；荧光PCR检测技术具有特异性好和灵敏度高等特点，使得粘孢子虫的快速检测成为可能。

附图说明

图1 洪湖碘泡虫PCR引物的特异性检测。

图2 洪湖碘泡虫特异引物PCR检测方法灵敏度试验。

图3 洪湖碘泡虫特异引物的荧光定量PCR检测。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明检测系统中的特异性引物均通过核酸合成设备制备。核酸合成设备可委托相关基因公司合成。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 洪湖碘泡虫特异引物获得

根据实验室获得的洪湖碘泡虫18S rDNA序列（GenBank登录号HM188545）和常见的塔形碘泡虫、瓶囊碘泡虫、吴李碘泡虫、武汉单极虫、卡特碘泡虫、楚克拉虫的基因序列比对分析，在洪湖碘泡虫的物种特异性核苷酸序列区域运用Primer5.0 中设计出一组特异性PCR引物。所述引物的核苷酸序列如下所示：

正向引物F：5’– TCGCTCAGGGTGTAATG–3’

反向引物R：5’–ATGAGGCAGCGTAAAGG–3’

实施例2 洪湖碘泡虫PCR引物的特异性检测

1、洪湖碘泡虫、塔形碘泡虫、瓶囊碘泡虫、吴李碘泡虫、武汉单极虫、卡特碘泡虫、楚克拉虫的基因组DNA提取：

粘孢子虫DNA提取参照Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）的手册指南进行（公众可从上海生工获取详细资料），溶解在50 μL TE缓冲液（pH7.8），置-20℃保存备用。

2、PCR反应体系和程序：

在200μL的反应管中加入10×PCR buffer(含Mg2+) 2.5 μL，dNTP2.5mmol/L            2.0μL，rTaq酶（5 U/μL）0.2μL，引物F(10 μmol/L) 0.5-1μL, 引物R (10 μmol/L)0.5-1μL,每个管中分别加入洪湖碘泡虫、塔形碘泡虫、瓶囊碘泡虫、吴李碘泡虫、武汉单极虫、卡特碘泡虫、楚克拉虫的基因组DNA模板1-3μL，最后用灭菌双蒸水补至25μL。

PCR检测反应程序为：94℃预变性3min；30个循环，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min，最后降温至4-12℃。

3、取10μL PCR检测产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果图1所示，图中M是标准条带DL2000，泳道1-7依次为洪湖碘泡虫、塔形碘泡虫、瓶囊碘泡虫、吴李碘泡虫、武汉单极虫、卡特碘泡虫、楚克拉虫的扩增产物样品，仅有洪湖碘泡虫样品在电泳泳道1出现80bp阳性条带。

实施例3 洪湖碘泡虫特异引物PCR检测方法灵敏度试验

通过细胞计数和梯度稀释制备10⁴，10³，10²，10¹，10⁰（个/μL）的孢子悬液。在200μL PCR反应管中直接分别加入1μL孢子液，设立2个空白对照管，再加入2μL裂解液（宝生物）, 置80℃孵育15min, 然后冰浴10min, 低速离心。按实施例1中加入除DNA模板外的其他PCR反应试剂进行，PCR扩增产物凝胶电泳后在紫外灯下观察拍照，如图2所示。泳道1-7依次为10⁴至空白样品。孢子浓度10⁴ –10¹都能检测到清晰条带。

实施例4 洪湖碘泡虫特异引物在荧光定量PCR中的检测

以实施例3中不同梯度洪湖碘泡虫DNA样品为模板，在PCR管中加入实施例1中引物F和R各0.8μL（20 pmol），SYBR Premix ExTaqII （宝生物）10μL，ROX Refrence Dye（宝生物） 0.4μL，灭菌双蒸水6μL，在荧光定量PCR仪（ABI 7500）中进行反应检测。反应程序设置为50℃ 2min；95℃ 5 min；94℃30s，60℃45s，进行40个循环；在60℃收集荧光信号。图3中，1-4依次为10⁴，10³，10²，10¹样品，都能检测到清晰扩增曲线。

Claims (2)

1.一种洪湖碘泡虫特异性PCR检测引物，其特征是：包括正向引物和反向引物；正向引物F：5’-TCGCTCAGGGTGTAATG-3’；反向引物R：5’-ATGAGGCAGCGTAAAGG-3’。

2.权利要求1所述洪湖碘泡虫特异性PCR检测引物的检测方法，其特征是步骤为：以18S rDNA序列为靶基因，通过PCR方法，以待检样品DNA为模板，以权力要求1中核苷酸序列为引物扩增靶基因，检测是否存在扩增产物，有则表明检测结果为阳性；

具体步骤为：

（1）洪湖碘泡虫的DNA提取：采用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取洪湖碘泡虫的DNA，溶解在50 μL、pH7.8的TE缓冲液中，置于-20℃保存备用；

（2）PCR反应：在200μL的反应管中加入10×PCR buffer，其中含Mg²⁺ 2.5 μL，2.5mmol/L的dNTP 2.0 μL，5 U/μL的rTaq酶0.2μL，10μmol/L的正向引物F 0.5-1μL, 10 μmol/L的引物R 0.5-1μL；

PCR检测反应程序为：94℃预变性3min；30个循环，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸45s；72℃延伸7min，最后降温至4-12℃；

（3）电泳检测：取5-10μL PCR检测产物，以1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，电压100-140V，TAE电泳缓冲液中含Tris碱0.04mol/L，EDTA 2mM/L。