CN101586149B

CN101586149B - 寡核苷酸芯片及其应用

Info

Publication number: CN101586149B
Application number: CN2008100168882A
Authority: CN
Inventors: 韩金祥; 庞靖祥; 高雪芹
Original assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Current assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Priority date: 2008-06-24
Filing date: 2008-06-24
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2028-06-24
Also published as: CN101586149A

Abstract

本发明公开了一种基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片，由基片和阵列涂布于其上的CMV、HSVI、RV、EBV或TB病原体探针以及阴性对照、阳性对照、空白对照制成，其中所述基片是表面醛基化修饰的载玻片；所述病原体探针是10条70mer的OMV-1、OMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2探针；所述阴性对照为JEV探针；所述阳性对照为合成标记探针；所述空白对照为双蒸水；本发明用随机引物同时对多种病原体靶序列进行biotin-11-dUTP扩增标记，并采用biotin-avidin-cy3信号放达系统增加标记效率的方法进行病原体的检测，检测灵敏度高，检测成本和时间明显缩短。本发明的技术体系能适用于临床检测，卫生监督，海关检疫及科研等领域。

Description

寡核苷酸芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸芯片及其应用，尤其涉及一种基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片及其在中枢神经系统病原体检测中的应用，属生物芯片和诊断试剂等技术领域。

背景技术

中枢神经系统感染性疾病是一种由多种病原体引起的严重威胁人类生命健康的病症，该种类型的疾病发病急，诊断困难，致死率高，这就要求对脑脊液中病原体进行快速准确的检测鉴定，以期早期采取有效的针对性治疗措施。由于不同的病原体感染，病变范围、程度相差悬殊，临床表现十分复杂，给诊断带来困难，确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断，长期以来病原体诊断主要依靠形态学检查、脑脊液细菌培养及组织学的方法，但脑脊液中病毒含量甚低，其病毒培养检测不但费时、费力，且敏感性和特异性很差，远远不能满足临床要求。

生物芯片/微阵列技术是上个世纪末期产生的高通量平行检测技术，它一经产生就显示了极大的优势，寡核苷酸微阵列已经在基因表达和人类疾病的研究中取得了广泛的成果。

在芯片杂交检测过程中，样品的荧光标记是极其关键的一个步骤，特别是对于RNA样品由于其易于降解造成的引物区的缺失也会增加检测的假阴性率，探索更快速和有效的标记技术将对基因芯片技术的应用和推广具有重要的实用价值。生物素-亲和素系统是七十年代后期发展起来的一种生物反应放大系统，具有很多优越性，通过随机引物掺入标记将生物素插入到靶序列，然后与avidin-cy3反应，可以明显地提高信号强度。然而，在检索的寡核苷酸芯片中，还未见用随机引物的方法对多种引起中枢神经系统疾病的病原体靶序列进行biotin-11-dUTP的同时标记，采用biotin-avidin-cy3信号放大系统提高杂交信号强度，来检测多种中枢神经系统感染的常见病原体的寡核苷酸芯片。

发明内容

针对现有技术的不足和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种能同时扩增多种能引起中枢神经系统疾病的病原体靶序列并提高标记效率的寡核苷酸芯片及其在中枢神经系统病原体检测中的应用。

本发明的技术构思是用随机引物的方法对能引起中枢神经系统疾病的多种病原体靶序列进行biotin-11-dUTP的同时标记，并与本发明的70mer长片段寡核苷酸探针制备检测芯片杂交，采用biotin-avidin-cy3信号放大系统提高杂交信号强度，增加标记效率来提高病原体检测的敏感性，实现检测多种引起中枢神经系统疾病的病原体的目的。

本发明的基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片，由基片和阵列涂布于其上的CMV(巨细胞病毒)、HSVI(单纯疱疹病毒I型)、RV(风疹病毒)、EBV(EB病毒)或TB(结核分枝杆菌)病原体探针以及阴性对照、阳性对照、空白对照制成，其特征在于：所述基片是表面醛基化修饰的载玻片；所述病原体探针是 10条70mer的、点样浓度均为10μM的CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2探针(每种病原体的探针为两条；探针的5’端合成有一个氨基，6碳臂，15个T)；所述阴性对照为点样浓度为10μM的JEV(乙脑病毒)探针；所述阳性对照为点样浓度为10μM的合成标记探针，探针的序列为NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-Tamra；所述空白对照为双蒸水；所述芯片的阵列布局如图1所示；其中：上述CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、TB1、TB2、EBV1和EBV2探针具体序列为：

CMV-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CGTCTCACGGTCTCGGGACTGGCCTGGACGCGGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACA；

CMV-2：(NH2-CH2)6-Poly(dT)15

GAGCGGCAGAAACGGGTGGACGACGAGGTGGTGCAGCGTGAGAAACAGCAGCTGAAGGCTTGGGAGGAGA；

HSVI-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCCCGAGACCAGTC；

HSVI-2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCCCGCTGTTCTCGTTCCTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCCGTCAGCACCGTCATCCA；

RV1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTTGCCCTCGCCAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGTCCG；

RV2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCCCGACTGGGCCTCCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTCGTGGG；

TB1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GCCAACATACCCGCCGAGTTCTTGAAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGTACA；

TB2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

附图说明

CTGCCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCTTGACCAGCGAGCTGCCGCAATGGTTGTCCGCCAACAG；

EBV1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CGTCCCGTAGTCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTCGCCCGAAGACAC；

EBV2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCACGACACACTGATGAACACCCACCACGATGACTCCCTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTA。

所述阴性对照探针具体序列为：

NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GTGCAAACAAGGTTTCACTGATCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGACTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGAC。

本发明所述基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片在检测中枢神经系统感染性病原体中的应用。

其中：所述芯片应用方法是基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记靶序列实现对待检中枢神经系统感染性病原体特异基因同时扩增标记，然后与经37℃水合、3600mJ条件下紫外交联、2.6g/L的NaBH₄还原过程处理后的寡核苷酸芯片杂交反应，再于杂交盒中与Avidin-cy3反应，之后将芯片洗脱甩干用扫描仪扫描，进行病原体检测。

更进一步的是：所述芯片应用方法是先将biotin-11-dUTP通过随机引物PCR扩增掺入到靶序列，然后与阵列涂布有病原体探针的寡核苷酸芯片在杂交盒中65℃杂交6～8h，洗脱甩干后、在杂交盒中与Avidin-cy3在37℃下反应30min～40min，将芯片洗脱甩干用Scanarray 4000扫描仪扫描，用Quantarray 3.0定量分析软件分析扫描图像的荧光强度值。

其中：所述将biotin-11-dUTP通过随机引物PCR扩增掺入到靶序列的方法是将选择的CMV、HSVI、RV、EBV或TB病原体靶序列基因{CMV的UL8基因和UL32(BK000394)，HSV I的UL4基因(NP_044666)，RV的RVE1基因(AB080733)，EBV的LMP1基因(AY60133)，TB的AG85b基因(AY207396)}扩增标记，使biotin-11-dUTP掺入到靶序列中去；其中反应体系中的引物为random primer(6mer)(随机引物)，dNTP为TTP∶Biotin-11-dUTP＝4∶1混合，解链温度为42℃。

所述杂交中使用的杂交液成分优选是：50％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS、0.1％鲑鱼精DNA。

所述洗脱中使用的洗脱液成分优选是：2×SSC、0.2％SDS。

所述avidin-cy3的浓度为0.05mM(1mM的avidin-cy3用PBS按1∶20稀释)。

具体实施方式

所述扫描仪扫描的参数优选为：激光强度100％，PMT100％。

本发明的长片断寡核苷酸芯片能同时检测多种引起中枢神经系统疾病的病原体，极适用于基层的临床检测应用。应用本发明所述的biotin-avidin-cy3系统随机引物PCR扩增标记寡核苷酸芯片技术体系能进一步研究开发包括检测其他病原体的寡核苷酸芯片及相应的应用。

试验结果显示：本发明的寡核苷酸芯片检测结果与临床检测结果无显著性差异，两者具有较高的符合率；说明采用作为终点信号的检测是可行的。

本发明建立的基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的长片段寡核苷酸芯片技术体系与现有的寡核苷酸芯片技术相比，具有灵敏度、特异性高的特点，是一种具有广泛应用前景的技术体系，能广泛适用于临床检测，卫生监督，海关检疫及科研等领域。

图1为本发明的寡核苷酸芯片阵列分布图；

其中

：阳性对照；

：阴性对照

：空白对照；①，⑥：为CMV探针；②，⑦：HSVI探针；③，⑧：RV探针；④，⑩：TB探针；⑤，

EBV探针。

图2不同浓度的荧光标记产物的杂交结果；

其中A～F依次为核酸浓度依次为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μl、0.01pg/μ；左上角四个点为阳性对照。

图3不同探针浓度的对荧光强度的影响；

其中1-5为五个平行样，从上往下顺序为：50μM、25μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM、0.01μM七个浓度。

图4随机引物标记与PCR插入标记的杂交结果；

其中A为随机引物扩增结果；B为PCR扩增标记杂交结果：C为随机引物标记结果；

1：DL2000；2：随机引物扩增结果；3，7：阳性对照；4，5，8，9：探针杂交结果；6，10：阴性对照。

图5五种病原体探针特异性检验结果；

其中A为CMV两条探针杂交结果；B为HSVI两条探针杂交结果；C为RV两条探针杂交结果；D为TB两条探针杂交结果；E为EBV两条探针杂交结果，左上角四个点位阳性对照。

图6为以CMV探针为对象同批次寡核苷酸芯片重复性检测结果。

其中A、B、C为标记产物在同一批次的杂交结果；右上角四个点为阳性对照，中间四个点和下面四个点分别为巨细胞病毒的两条探针。

图7为以CMV探针为对象不同批次寡合苷酸芯片重复性检测结果。

其中A为标记产物第一次的杂交结果；B第二次的标记产物与芯片的杂交结果；C第三次的标记产物与芯片的杂交结果。阵列分布同图6。

实施例1 biotin-avidin-cy3系统随机引物PCR扩增标记寡核苷酸芯片

1.探针的设计合成

利用探针设计软件ArrayDesigner4.2，按照探针设计原则G+C含量为50％-70％；Tm值在(78±5)℃；连续重复的碱基≤6个；探针分子内部互补碱基≤6个；每一个探针与非靶基因的相似性必须＜70％，探针连续同源的碱基数≤18个，发夹结构、二聚体及错配尽可能少、解链温度(TM值)值尽可能接近的探针；按每种病原体各设计两条探针(CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2)，同时设计阳性对照探针(PC)、阴性对照探针(NC)各一条；探针序列如下所示：

CMV-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CGTCTCACGGTCTCGGGACTGGCCTGGACGCGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACA；

CMV-2：(NH2-CH2)6-Poly(dT)15

GAGCGGCAGAAACGGGTGGACGACGAGGTGGTGCAGCGTGAGAAACAGCAGCTGAAGGCTTGGGAGGAGA；

HSVI-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTC；

HSVI-2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCCCGCTGTTCTCGTTCCTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCGTCAGCACCGTCATCCA；

RV1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTTGCCCTCGCCAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGTCCG；

RV2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCCCGACTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTCGTGGG；

TB1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GCCAACATACCCCGCCGAGTTCTTGAAGAACTTGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGTACA；

TB2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CTGCCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGCAATGGTTGTCCGCCAACAG；

EBV1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCCGCGCCGCCCCCGAGACCCAGTCGCCCCGAAGACAC；

EBV2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCCCTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTA；

PC：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-Tamra。

NC：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GTGCAAACAAGGTTTCACTGATCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGACTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGAC。

2.芯片的制备

选择上述设计的10条CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2探针用3×SSC分别稀释成20mM，采用Cartisan5500点样仪将探针点至到醛基化修饰的玻片表面上，每个探针点四个重复，以Tamara修饰的探针(PC)为阳性对照，以乙脑探针(NC)为阴性对照，双蒸水为空白对照。每个对照也点四个重复，阵列上探针的分布如图1所示.在湿盒中进行水合温育，水和温度为37℃。过夜干燥。UV交联，紫外能量为3600mJ，将芯片放于2.6g/L的NaBH4还原10min，洗脱后4℃避光保存备用。

3.靶基因的标记

DNA随机引物生物素间接标记：随机引物PCR将选择CMV的UL8基因和UL32(BK000394)，HSV I的UL4基因(NP_044666)，RV的RVE1基因(AB080733)，EBV的LMP1基因(AY60133)，TB的AG85b基因(AY207396)扩增标记。扩增体系：10×buffer5μl，25mmol/L MgCl₂3μl，0.25mmol/L dNTP(TTP∶Biotin-11-dUTP＝4∶1比例混合)混合物1μl，random primer(6mer){随机引物，购于宝生物公司}2μl，DNA模板5μl.rTaq DNA聚合酶0.5μl，ddH₂035μl，短暂离心。扩增程序：94℃5min，94℃45s，42℃45s，72℃延伸1min。扩增35个循环，72℃延伸10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果，余下进行芯片杂交。

4.样品检测

将荧光标记的靶DNA序列溶于杂交液中(5×SSC、0.5％SDS、50％甲酰胺、0.1％鲑鱼精DNA)，取标记的DNA溶液加到芯片的表面，加盖玻片(小心不要有气泡)：放入杂交盒中，杂交温度65℃，杂交时间为8h；取出后，先用2×SSC(0.2％SDS)冲洗，再离心。将avidin-cy3与芯片阵列杂交半小时，然后洗涤离心甩干。将芯片用Scanarray 4000扫描仪扫描，扫描参数为：激光强度100％，PMT100％。用Quantarray 3.0定量分析软件分析扫描图像的荧光强度值。计算出每个阵列中阴性对照点4个重复点的平均值(mean)和标准差(s)，得出95％的参考范围(mean±2s)然后统计出每种探针的4个重复点荧光值的平均值，若此平均值高于

为阳性，低于

则为阴性，对结果进行判读。

实施例2芯片制备条件的优化

1.1水合温度的优化选用CMV标准株DNA扩增标记，采用醛基化玻片为基片，水合的温度选用了37℃、55℃和65℃3个温度紫外交联的能量强度。选择杂交效果最好的温度为水合温度。

经过3次重复试验表明：水合的温度用37℃杂交效果最好。

1.2紫外交联的优化选用CMV标准株DNA扩增标记，采用醛基化玻片为基片，紫外交联的能量分别选择600mJ、1200mJ和3600mJ，选择杂交效果最好的能量结果。

经过3次重复试验表明：紫外交联的能量选择3600mJ杂交效果最好。

1.3杂交液的优化实验中通过对如表1所示的12种杂交液在不同温度(温度分别为42℃、55℃、65℃)、不同杂交时间(杂交时间分别为2h、8h、16h)的条件下杂交信号的比较，来选择长片段探针最优化的杂交条件。

其中杂交液成分如表1所示：

表1不同杂交液的成分

经过3次重复试验表明杂交液选择为：50％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS、0.1％鲑鱼精DNA，杂交时间为8h，杂交温度为65℃可以获得最高的荧光强度。

结果确定：

1.探针浓度的确定

芯片杂交洗脱后，经过扫描得到不同浓度的探针杂交后的扫描荧光强度。扫描结果如图3所示，可以看出探针浓度在10μmol/L时就可以得到满意的效果，因此实验中采用10μmol/L作为最终探针点样浓度。

2.寡核苷酸微阵列对靶基因检测敏感性优化

以EBV B95-8为实验菌株，提取其基因组DNA，各取2μl作为模版进行荧光标记扩增，标记产物用核酸定量仪进行DNA定量，然后用双蒸水1∶10定量稀释为浓度为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、0.1pg/μ、0.01pg/μl六个浓度，与芯片杂交，结果显示在浓度为1pg/μl时，荧光强度值高于阳性点荧光值的

显示其敏感性为1pg。

3.芯片的杂交条件

综合优化条件试验的结果，采用70mer寡核苷酸探针，探针点样后37℃水合，然后在3600mJ条件下进行紫外交联固定效果最好。优化出的杂交液成分为：50％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS、0.1％鲑鱼精DNA，杂交时间为6-8h，杂交温度为65℃。

4.芯片对血清标本的检测应用结果

应用本发明的以biotin-avidin-cy3标记系统随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片进行临床中枢神经系统感染性病原体标本检测，结果见表2。

表2：中枢神经系统感染性病原体标本检测结果

·a)Kappa＞0.75，consistency is satisiactory；b)p＞0.05，no significance

结果显示：本发明的寡合苷酸芯片检测结果与临床检测结果无显著性差异，两者具有较高的符合率。

综上所述，本发明的以biotin-avidin-cy3系统随机引物PCR扩增标记寡核苷酸芯片与临床常规检测方法相比符合率较高，说明采用biotin-avidin-cy3系统随机引物PCR扩增标记方法作为终点信号的检测是可行的。建立的70mer长片段寡核苷酸芯片技术体系与现有的芯片技术相比，具有敏感性、特异性高的特点，是一种具有广泛应用前景的技术体系。

序列表

<110>山东省医药生物技术研究中心

<120>基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片及其应用

<141>2008-6-16

<160>11

<210>1

<211>70

<212>DNA

<213>CMV-1(探针)

<221>CMV-1DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>1

cgtctcacgg tctcgggact ggcctggacg cgtcagcaga accagtggaa agagcccgac 60

gtctactaca 70

<210>2

<211>70

<212>DNA

<213>CMV-2(探针)

<221>CMV-2DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>2

gagcggcaga aacgggtgga cgacgaggtg gtgcagcgtg agaaacagca gctgaaggct 60

tgggaggaga 70

<210>3

<211>70

<212>DNA

<213>HSV1-1(探针)

<221>HSV1-1DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>3

gacaaaccca accgtcccgt agtcccatcc cccgatccca acaactcccc cgcgcgcccc 60

gagaccagtc 70

<210>4

<211>70

<212>DNA

<213>HSV1-2(探针)

<221>HSV1-2DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>4

ccccgctgtt ctcgttcctc actgcctccc ccgccctgga caccctcttc gtcgtcagca 60

ccgtcatcca 70

<210>5

<211>67

<212>DNA

<213>RV-1(探针)

<221>RV-1DNA序列

<222>(1)…(67)

<400>5

ccaccgacac cgtgatgagc gtgtttgccc tcgccagcta cgtccagcac cctcacaaga 60

ccgtccg 67

<210>6

<211>60

<212>DNA

<213>RV-2(探针)

<221>RV-2DNA序列

<222>(1)…(60)

<400>6

ccccgactgg gcctccccgg tttgccaacg ccattcccct gactgctcgc ggctcgtggg 60

<210>7

<211>70

<212>DNA

<213>TB-1(探针)

<221>TB-1DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>7

gccaacatac ccgccgagtt cttgaagaac ttcgttcgta gcagcaacct gaagttccag 60

gatgcgtaca 70

<210>8

<211>66

<212>DNA

<213>TB-2(探针)

<221>TB-2DNA序列

<222>(1)…(66)

<400>8

ctgccagact tacaagtggg aaaccttcct gaccagcgag ctgccgcaat ggttgtccgc 60

caacag 66

<210>9

<211>70

<212>DNA

<213>EBV-1(探针)

<221>EBV-1DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>9

cgtcccgtag tcccatcccc cgatcccaac aactcccccg cgcgccccga gaccagtcgc 60

ccgaagacac 70

<210>10

<211>70

<212>DNA

<213>EBV-2(探针)

<221>EBV-2DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>10

ccacgacaca ctgatgaaca ccaccacgat gactccctcc cgcaccctca acaagctacc 60

gacgattcta 70

<210>11

<211>70

<212>DNA

<213>JEV(阴性对照探针)

<221>JEV DNA序列

<222>(1)…(70)

<400>11

gtgcaaacaa ggtttcactg atcgtgggtg gggcaacgga tgtggacttt tcgggaaggg 60

aagcattgac 70

Claims

1.一种基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片，由基片和阵列涂布于其上的CMV、HSVI、RV、EBV或TB病原体探针以及阴性对照、阳性对照、空白对照制成，其特征在于：所述基片是表面醛基化修饰的载玻片；所述病原体探针是10条5’端合成有一个氨基、6个CH₂碳臂和15个T的寡核苷酸序列的、点样浓度均为10μM的CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2探针；所述阴性对照为5’端合成有一个氨基、6个CH₂碳臂和15个T的寡核苷酸序列的、点样浓度为10μM的JEV探针；所述阳性对照为5’端合成有一个氨基、6个CH₂碳臂和15个T的寡核苷酸序列的、点样浓度为10μM的合成标记探针，探针的序列为NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-Tamra；所述空白对照为双蒸水；所述芯片的阵列布局如图1所示；其中：上述CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、TB1、TB2、EBV1和EBV2探针具体序列为：

CMV-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CGTCTCACGGTCTCGGGACTGGCCTGGACGCGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACA；

CMV-2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GAGCGGCAGAAACGGGTGGACGACGAGGTGGTGCAGCGTGAGAAACAGCAGCTGAAGGCTTGGGAGGAGA；

HSVI-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCGGAGACCAGTC；

HSVI-2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCCCGCTGTTCTCGTTCCTCACTGCCTCCCCCGCCCTGGACACCCTCTTCGTCGTCAGCACCGTCATCCA；

RV1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTTGCCCTCGCCAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGTCCG；

RV2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCCCGACTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTCGTGGG；

TB1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GCCAACATACCCGCCGAGTTCTTGAAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGTACA；

TB2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CTGCCAGACTTACAAGTGGGAACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGCAATGGTTGTCCGCCAACAG；

EBV1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCGAGACCAGTCGCCCGAAGACAC；

EBV2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

CCACGACACACTGATGAACACCACCACGATGACTCCCTCCCGCACCCTCAACAAGCTACCGACGATTCTA；

所述阴性对照探针具体序列为：

NH2-(CH2)6-Poly(dT)15

GTGCAAACAAGGTTTCACTGATCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGACTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGAC。