CN104630336A - 一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法 - Google Patents

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李彩风
曹功泽
杜春安
王静
宋欣
吴晓玲
段传慧
曹嫣镔
宋永亭
张守献
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
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Abstract

本发明涉及一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，属于微生物勘探技术领域，包括以下步骤：取目标区块土样，利用自动核酸提取仪进行基因组DNA提取，以该基因组为模板，用标记的引物组进行扩增，然后将得到的扩增产物与基因芯片上的探针进行杂交，根据杂交结果确定指示菌的种类及相对含量，从而区分背景区及异常区。本发明能够准确地判定背景区及异常区，并可以实现自动化操作，大大提高了检测速度，减轻了人员工作量。

Description

一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种微生物油气勘探技术领域，特别涉及一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法。
背景技术
目前，油气微生物勘探技术已成功应用于非常规油气藏和深部油气藏中。微生物油气勘探技术主要由三部分组成，分别为：（1）确定勘探区取样点并采集样品；（2）对取回的样品进行指示菌测试分析；（3）通过数据分析预测油气藏分布。指示菌数量的测定是油气微生物勘探技术的核心内容，该数据是反映测试区块是否存在油气藏的核心分析指标。目前，油气微生物勘探领域已经形成了一套较为完整的技术系统，但现有技术对指示菌的分析采用培养法，存在工作量大，自动化程度低，耗时长等不足。
本发明将为研究油藏环境微生物群落组成、结构和功能活动等提供一种快速、准确、高通量的工具。
发明内容
本发明的目的在于所提供一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，通过分析烃氧化菌种类，并针对其16S核糖体RNA设计种、属特异性探针，以待检测样品的基因组DNA为模板，用标记的引物组进行扩增，然后将得到的扩增产物与生物芯片上的探针进行杂交，根据杂交结果确定微生物勘探指示菌的种类及相对含量。本发明具有特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠及适于批量样本检测的特点。
一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，具体包括以下步骤：
（1）设计微生物勘探指示菌特异性探针
利用软件收集分析上述微生物的特异性序列，设计油藏微生物勘探指示菌属特异性探针。芯片上的条码序列探针序列结构通式为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-条码序列。即探针的5′端氨基修饰，氨基旁边连接poly-T15。
（2）制备芯片
使用点样仪将探针以设定的顺序固定到醛基化修饰的玻片上。芯片是由微生物勘探指示菌探针、QC（点样的阳性质控）、BC（点样的阴性质控）、NC（杂交的阴性质控）和PC（杂交的阳性质控）组成的阵列。所有的条码序列探针用50%DMSO溶解，终浓度为10μM，每个点重复三次点制到玻片上。封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基。
QC是一端带有Hex标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX；BC为50％的DMSO，用于质控点样过程中有无样品残留污染；NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG；PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列（c-PC）杂交，用于杂交过程的质控，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。
（3）核酸扩增
分别以油藏样品基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物PCR扩增；
扩增体系如下,包括0.1-0.3mM dNTPs,1×Qiagen PCR buffer,添加MgCl2至1-3mM,pH8.7,05.-2单位DNA Polymerase，和0.05-0.3ng模版DNA，上下游引物。25μl扩增体系中，引物的浓度为0.01-0.04μM。
扩增参数为：
先95℃15分钟；然后94℃30秒,50-65℃1分钟，72℃30-90秒，30-40个循环；
最后72℃6-15分钟；4℃保存。
（4）基因芯片杂交
取5-20μl PCR产物加到两倍体积杂交缓冲液中(6×SSC,5×Denhardt′sreagent,25％甲酰胺,0.1%SDS,5nM c-PC（与芯片PC互补的序列，5′端TAMRA标记）。95-98℃变性3-10分钟，冰浴,杂交混合物加入到点阵中反应。然后将芯片放置36-45℃水浴中杂交0.5-3小时。取出玻片分别在两种洗液中36-45℃各洗1-5min，洗液Ⅰ：0.1-0.5×SSC/0.05-02%SDS，洗液II：0.01-0.1×SSC。最后，玻片稍离心甩干。
（5）数据分析
使用芯片扫描仪扫描芯片，根据荧光信号强度及扫描图像分析目的油藏古菌群落结构。
所述的探针序列为DNA、RNA、PNA（肽核酸）或LNA（锁定核酸）序列。
所述的探针可以引入人工错配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物，所述类似物包括尿嘧啶，肽核酸和锁定核酸。
所述的引物序列带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。
所述的基因芯片是目前所知的任一种生物芯片，包括固相生物芯片、膜生物芯片、过滤器生物芯片、针生物芯片和微珠生物芯片。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）根据本发明杂交结果不仅能知道微生物勘探指示菌的种类，还知道微生物勘探指示菌相对含量；
（2）本发明具有特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠及适于批量样本的检测。

Claims (5)

1.一种用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，具体包括以下步骤：
（1）设计微生物勘探指示菌特异性探针
利用软件收集分析上述微生物的特异性序列，设计油藏微生物勘探指示菌属特异性探针，芯片上的条码序列探针序列结构通式为：NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-条码序列，即探针的5′端氨基修饰，氨基旁边连接poly-T15。
（2）制备芯片
使用点样仪将探针以设定的顺序固定到醛基化修饰的玻片上，芯片是由微生物勘探指示菌探针、QC（点样的阳性质控）、BC（点样的阴性质控）、NC（杂交的阴性质控）和PC（杂交的阳性质控）组成的阵列。所有的条码序列探针用50%DMSO溶解，终浓度为10μM，每个点重复三次点制到玻片上，封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基，QC为一端带有Hex标记，另一端氨基修饰的寡核苷酸探针，用于观察芯片点样和固定的效率，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGAGTGCTTGGTGCCATAAC-HEX；BC为50％的DMSO，用于质控点样过程中有无样品残留污染；NC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，与杂交液中的所有待检测序列不会杂交，用于观察有无非特异杂交，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGCAACCACCACCGGAGG；PC是一段氨基修饰的寡核苷酸探针，可以与杂交液中添加的荧光标记的互补序列（c-PC）杂交，用于杂交过程的质控，其序列为NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGGTATCGCGACCGCATCCCAATCT。
（3）核酸扩增
分别以油藏样品基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物PCR扩增；
扩增体系如下,包括0.1-0.3mM dNTPs,1×Qiagen PCR buffer,添加MgCl2至1-3mM,pH8.7,05.-2单位DNA Polymerase，和0.05-0.3ng模版DNA，上下游引物，25μl扩增体系中，引物的浓度为0.01-0.04μM。
扩增参数为：先95℃15分钟；然后94℃30秒,50-65℃1分钟，72℃30-90秒，30-40个循环；最后72℃6-15分钟；4℃保存。
（4）基因芯片杂交
取5-20μl PCR产物加到两倍体积杂交缓冲液中(6×SSC,5×Denhardt′s reagent,25％甲酰胺,0.1%SDS,5nM c-PC（与芯片PC互补的序列，5′端TAMRA标记），95-98℃变性3-10分钟，冰浴,杂交混合物加入到点阵中反应，然后将芯片放置36-45℃水浴中杂交0.5-3小时，取出玻片分别在两种洗液中36-45℃各洗1-5min，洗液Ⅰ：0.1-0.5×SSC/0.05-02%SDS，洗液II：0.01-0.1×SSC，最后，玻片稍离心甩干。
（5）数据分析
使用芯片扫描仪扫描芯片，根据荧光信号强度及扫描图像分析目的油藏古菌群落结构。
2.根据权利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述探针序列为DNA、RNA、PNA（肽核酸）或LNA（锁定核酸）序列。
3.根据权利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述探针可以引入人工错配碱基，所述人工错配碱基是天然的A、T、C、G四种碱基或其类似物，所述类似物包括尿嘧啶，肽核酸和锁定核酸。
4.根据权利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述引物序列带有荧光分子或可通过化学发光或固体微粒进行标记检测的分子。
5.根据权利要求1所述的用于微生物勘探的基因芯片及其使用方法，其特征在于所述的基因芯片是目前所知的任一种生物芯片，包括固相生物芯片、膜生物芯片、过滤器生物芯片、针生物芯片和微珠生物芯片。
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