CN109750105A - 牛源性成分检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明是检测用品领域内的牛源性成分检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为4重PCR引物组合，各对引物为黄牛D‑loop、水牛D‑loop、牦牛D‑loop和内源基因序列16S rRNA，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的4组探针序列和一组阳性对照探针序列，分别为黄牛D‑loop探针、水牛D‑loop探针、牦牛D‑loop、16S rRNA探针和Positive探针，引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的引物。本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的牛源性成分检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及检测用品领域，具体为一种牛源性成分检测试剂盒。
背景技术
随着中国城乡居民收入的增加、生活水平的提高，牛肉已经成为我国主要肉类食品之一。2000年至2016年，国内牛肉消费量从510.2万吨增长至759万吨左右，中国也成为了世界第三大牛肉消费国。我国产的牛主要有黄牛、水牛和牦牛等三种，黄牛产于全国各地，主要是平原地区；水牛产于我国南方，主要是江南地区；牦牛产于西北高原地区，主要是青藏高原地区。其中牦牛以其生长于高寒、无任何污染环境，属于独特的半野生半原始动物，营养价值和市场价值也相对较高。近年来，食品及加工产品经常出现掺假现象，尤其是牦牛肉制品中，经常被曝光用猪肉或者黄牛肉冒充，涉嫌虚假宣传欺诈消费者和侵犯消费者的合法权益。所以，建立一套鉴定三种牛源性成分的方法是非常有必要的。
基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的动物源性成分检测技术，检测方法主要包括PCR(聚合酶链式反应)技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以PCR技术应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。普通定性PCR方法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式PCR虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率的问题；多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但常规的电泳检测结果很难判断，容易出现假阳性和假阴性结果；荧光定量PCR方法灵敏度高，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。基因芯片也是常用的肉类产品检测技术，目前一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，同样成本较高。因此研发一种快速、方便、灵敏、廉价、可视化和高通量的检测方法将具有非常好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术费时费力成本高的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉的牛源性成分检测试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的牛源性成分检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为4重聚合酶链式反应(PCR)引物组合，在与探针互补的一条链的PCR引物的5’端进行生物素修饰，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
16S rRNA：正向引物：GACCTCGATGTTGGATCAGGAC
反向引物：GATAGAAACCGACCTGGATTG
黄牛D-loop：正向引物：AACACAGAATTTGCACCCT
反向引物：ATTAAGCTCGTGATCTAATGGT
水牛D-loop：正向引物：CTGACTTTACACTCTAGCCTA
反向引物：GGATTTGACTTGAATGCACT
牦牛D-loop：正向引物：CTAACAACACACATCCCCAA
反向引物：TTAAGCTCGTGATCTAGTGGA
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的4组探针序列和一组阳性对照(Positive)探针序列，探针5’末端需进行Amino linker C12修饰，4组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
16S rRNA探针:GATTAATAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGC
黄牛D-loop探针:GACCACAGAATGAATTACCTACGCAAGGGGTAATG
水牛D-loop探针:CAACATATGACCCTACTACTCCGAATGGGGG
牦牛D-loop探针:GCATTGTCCAAACGGGGGATACGTACA
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG。
上述方案中，所述引物组合中每对引物中修饰的引物与非修饰引物含量比值为3:2。
上述方案中，所述牛源性成分检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为
biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
上述方案中，所述牛源性成分检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)显色液。
上述方案中，所述预杂交液为5×SSC，0.1％重量百分比十二烷基磺酸钠和10×Denhardt’s液，其中，SSC为0.75M氯化钠,0.075M柠檬酸钠，Denhardt’s液为1％Ficoll聚蔗糖，1％聚乙烯吡咯烷酮，1％牛血清白蛋白；杂交液为5×SSC，0.1％重量百分比十二烷基磺酸钠，5×Denhardt’s液，50％重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA；洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1为2×SSC和0.1％重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液2为0.5×SSC和0.1％重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液3为100mM(毫摩尔/升)Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl，洗液4为100mM Tris-HCl，PH9.5，100mM NaCl和100mM MgCl2；封闭液为3％重量百分比牛血清白蛋白，100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液为200mM柠檬酸钠，PH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液为3％重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液。
上述方案中，所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
本发明的牛源性成分检测试剂盒采用多重PCR扩增的方法扩增目标序列。多重PCR扩增技术原理是将多对引物放到同一个反应管中进行PCR扩增，达到同时扩增2种或两种以上目标DNA序列的目的。试剂盒采用了4重PCR扩增体系扩增目标序列，包括三种牛基因序列黄牛D-loop、水牛D-loop、牦牛D-loop和内源基因序列16S rRNA。
本发明采用非对称PCR扩增技术(asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。非对称PCR扩增技术原理是在PCR扩增过程中采用不等量的正向引物和反向引物(或是扩增延伸条件不同的正向引物和反向引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的探针杂交，从而提高检测灵敏度。
本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行动物源性成分的分子杂交检测，其工作原理是首先将针对各个基因序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域，再将待测的多重PCR产物与其杂交，这样PCR产物中的基因序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有生物素标志，结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标志物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号，这样一张膜芯片上就可以同时检测多个动物源性成分目标序列。本发明的牛源性成分检测试剂盒的检测探针为27-38个碱基的寡核苷酸探针，其顺序排列于支持膜表面的特殊区域，形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形成肉眼可视化的检测结果。
本发明提供一种多指标检测牛源性成分的可视化膜芯片试剂盒，其中待检测的目标序列包括三种牛基因序列黄牛D-loop、水牛D-loop、牦牛D-loop和内源基因序列16SrRNA。通过该试剂盒的检测，可以快速准确的判断待检肉制品中是否含有上述基因序列，适合于牛源性成分产品的大规模筛查。
本发明的有益效果是：1)操作简单，经过一次样本前处理，单管PCR扩增，单芯片杂交就可以同步检测样本中多种牛源性成分基因序列，具有平行分析和多重判断的特点；2)检验对象完备，包含了当前常见的牛种基因，并且可以很方便的加入新的检测序列；3)系统在多重PCR扩增过程同时进行了非对称PCR扩增，提高了系统的灵敏度和准确性；4)试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式，提高了系统的检测通量，并且检测结果可以直接用肉眼判断，方便，快捷；5)试剂盒操作简单，经济，无需特殊的昂贵仪器，适用于牛源性成分的大规模检测。
因此，本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的牛源性成分检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
附图说明
图1为本发明用于检测牦牛肉的杂交结果图，其中图1A为芯片结果模式图，图1B为牦牛肉的检测结果图。
图2为本发明用于检测黄牛肉的杂交结果图，其中图2A为芯片结果模式图，图2B为黄牛肉的检测结果图。
图3为本发明用于检测水牛肉的杂交结果图，其中图3A为芯片结果模式图，图3B为水牛肉的检测结果图。
图4A和图4B为本发明用于检测15个非牛源性成分样品(包括猪、鸡、鸭、绵羊、山羊、兔、马、驴、狗、鱼、猫、鼠、狐狸、貂和貉等15种动物样品)的杂交结果图，其中图4A为芯片结果模式图，图4B为15个非牛源性成分样品(包括猪、鸡、鸭、绵羊、山羊、兔、马、驴、狗、鱼、猫、鼠、狐狸、貂和貉等15种动物样品)的检测结果图。
图5为本发明用于检测牦牛肉掺入黄牛样品的杂交结果图，其中图5A为芯片结果模式图，图5B为牦牛肉不同比例掺入黄牛样品的检测结果图。
附图中，内参：16S rRNA；黄牛：黄牛D-loop；水牛：水牛D-loop；牦牛：牦牛D-loop；Blank：空白；PC：阳性对照；NC：阴性对照。
具体实施例
下面结合附图及实施例进一步详述本发明，但本发明不仅限于所述实施例。
实施例一
本例的牛源性成分检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为4重聚合酶链式反应(PCR)引物组合，在与探针互补的一条链的PCR引物的5’端进行生物素修饰，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
16S rRNA：正向引物：GACCTCGATGTTGGATCAGGAC
反向引物：GATAGAAACCGACCTGGATTG
黄牛D-loop：正向引物：AACACAGAATTTGCACCCT
反向引物：ATTAAGCTCGTGATCTAATGGT
水牛D-loop：正向引物：CTGACTTTACACTCTAGCCTA
反向引物：GGATTTGACTTGAATGCACT
牦牛D-loop：正向引物：CTAACAACACACATCCCCAA
反向引物：TTAAGCTCGTGATCTAGTGGA
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的4组探针序列和一组阳性对照(Positive)探针序列，探针5’末端需进行Amino linker C12修饰，4组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
16S rRNA探针:GATTAATAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGC
黄牛D-loop探针:GACCACAGAATGAATTACCTACGCAAGGGGTAATG
水牛D-loop探针:CAACATATGACCCTACTACTCCGAATGGGGG
牦牛D-loop探针:GCATTGTCCAAACGGGGGATACGTACA
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG。
支持膜为硝酸纤维素膜。
通过相应的多重PCR引物设计，采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述4重PCR组合引物。根据多重PCR扩增产物设计检测探针，采用固相亚磷酰胺三酯法合成探针，探针合成时同时合成阳性探针(positive probe)和对应的5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸(positive oligo)单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为：
biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
将支持膜裁成1cm×1cm的膜条，裁好的膜于双蒸水中浸泡15min，再用15×SSC浸泡15min，取出，置于滤纸上，60℃烘1.5h，膜条降温到室温后，将探针(10pM)顺序点在膜上，点样样式见图1A，膜条晾干后80℃烘2小时以固定探针，处理好的膜芯片室温保存。
按照北京康为世纪生物科技有限公司组织基因组DNA提取试剂盒(TIANampGenomic DNA Kit，DP304-03)的说明提取牦牛肉基因组DNA，每30mg初始样本经抽提后用50μL ddH2O(双蒸水)溶解基因组DNA，并用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(50ng/μL)。
PCR扩增的反应体系如下所示：
ddH2O:33.5μL
10×PCR Buffer:5μL
dNTP(2.5mM each):5μL
PCR引物(20μM):不带biotin的引物0.4μL；带biotin的引物0.6μL。
EX-Taq Polymerase(Takara,5U/μL):0.5uL
提取的玉米基因组DNA(约50ng/μL):2uL
对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示：
预变性：温度95℃，时间10分钟。
多重PCR循环：30个循环组成：
变性：温度95℃，时间30秒。
退火：温度55℃，时间30秒。
延伸：温度72℃，时间15秒。
最后延伸：温度72℃，时间5分钟。
然后进行膜芯片斑点杂交检测，膜条于42℃预杂交液(5×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt’s)中预杂交1小时，之后将膜条放于2mL杂交液(5×SSC，0.1％SDS，5×Denhardt’s，50％去离子甲酰胺，100ug/ml酵母tRNA)中42℃，1小时。取50μL多重PCR产物加入1μL阳性寡核苷酸单链DNA(10μM)，100℃水浴变性5分钟后置于冰上，之后加入2mL杂交液中，42℃杂交1小时。洗液1(2×SSC，0.1％SDS)、洗液2(0.5×SSC，0.1％SDS)42℃各洗膜条两次，每次5分钟。将膜条置于封闭液(3％BSA，100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl)中37℃封闭10分钟，之后将膜条放到酶联液(用封闭液1:5000稀释链酶亲和素标记辣根过氧化物酶)中37℃，30分钟。用洗液3(100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl)、洗液4(100mM Tris-HCl，PH9.5，100mM NaCl，100mM MgCl2)各漂洗膜条3次，每次5分钟，之后将膜条放入TMB显色液(100mM柠檬酸钠PH5.4，0.1mg/ml四甲基联苯胺TMB，1:1600体积比的H2O2(3％))中，避光显色10～15分钟，依照杂交点的显色情况判定结果。
本例中所用辅料和配液为外购或自配，百分比为重量百分比。
检测结果如图1B所示。
实施例二
本例的牛源性成分检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5'-CTGGTACTTTGGA
CACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
提取的牛源性成分DNA为黄牛，检测结果如图2B所示。
其余同实施例一。
实施例三
本例的提取的牛源性成分DNA为水牛，检测结果如图3B所示。
其余同实施例二。
实施例四
本例的提取的牛源性成分DNA为15个非牛源性成分样品(包括猪、鸡、鸭、绵羊、山羊、兔、马、驴、狗、鱼、猫、鼠、狐狸、貂和貉等15种动物样品)，检测结果如图4B所示。
其余同实施例三。
实施例五
本例的提取的牛源性成分DNA为牦牛肉不同比例掺入黄牛样品(包括50％牦牛+50％黄牛；10％牦牛+90％黄牛；1％牦牛+99％黄牛等3种比例的掺杂样品)，检测结果如图5B所示。
其余同实施例四。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。
序列表
<110> 兰天恩
仝伟建
<120> 牛源性成分检测试剂盒
<141> 2017-11-03
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 黄牛(Bos taurus)
<400> 1
aacacagaat ttgcaccct 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 黄牛(Bos taurus)
<400> 2
attaagctcg tgatctaatg gt 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 水牛(Bubalus arnee)
<400> 3
ctgactttac actctagcct a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 水牛(Bubalus arnee)
<400> 4
ggatttgact tgaatgcact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 牦牛(Bos grunniens)
<400> 5
ctaacaacac acatccccaa 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 牦牛(Bos grunniens)
<400> 6
ttaagctcgt gatctagtgg a 21
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
gattaatagt cctacgtgat ctgagttcag accggagc 38
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
gaccacagaa tgaattacct acgcaagggg taatg 35
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
caacatatga ccctactact ccgaatgggg g 31
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
gcattgtcca aacgggggat acgtaca 27
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
gcatccagat cagaagcaat aatgagcagt gcgagaagaa cgagtgtcca agtaccag 58
Claims (9)
1.牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，包含引物组合和膜芯片，引物组合为4重聚合酶链式反应（PCR）引物组合，在与探针互补的一条链的PCR引物的5’端进行生物素修饰，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
16S rRNA：正向引物：GACCTCGATGTTGGATCAGGAC
反向引物：GATAGAAACCGACCTGGATTG
黄牛 D-loop：正向引物：AACACAGAATTTGCACCCT
反向引物：ATTAAGCTCGTGATCTAATGGT
水牛 D-loop：正向引物：CTGACTTTACACTCTAGCCTA
反向引物：GGATTTGACTTGAATGCACT
牦牛 D-loop：正向引物：CTAACAACACACATCCCCAA
反向引物：TTAAGCTCGTGATCTAGTGGA
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的4组探针序列和一组阳性对照（Positive）探针序列，探针5’末端需进行Amino linker C12修饰，4组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
16S rRNA探针: GATTAATAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGC
黄牛 D-loop探针: GACCACAGAATGAATTACCTACGCAAGGGGTAATG
水牛 D-loop探针: CAACATATGACCCTACTACTCCGAATGGGGG
牦牛 D-loop探针: GCATTGTCCAAACGGGGGATACGTACA
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG。
2.如权利要求1所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，所述引物组合中每对引物中修饰的引物与非修饰引物含量比值为3:2。
3.如权利要求1或2所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，所述牛源性成分检测试剂盒包含引物组合、膜芯片和辅料，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、EX-Taq聚合酶（Polymerase）和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为：
biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
4.如权利要求3所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于，所述牛源性成分检测试剂盒包含引物组合、膜芯片、辅料和配液，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液。
5.如权利要求4所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于所，述预杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和10×Denhardt’s液；其中，SSC为0.75M 氯化钠, 0.075M柠檬酸钠，Denhardt’s液为1% Ficoll聚蔗糖， 1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；杂交液为5×SSC，0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠，5×Denhardt’s液，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml 酵母tRNA；洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4；其中，洗液1为2×SSC和0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液2为0.5×SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液3为100 mM（毫摩尔/升）Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl，洗液4为100 mMTris-HCl，PH9.5，100 mMNaCl和100 mM MgCl2；封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白，100 mMTris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液为200mM柠檬酸钠，PH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液为 3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液。
6.如权利要求1所述的牛源性成分检测试剂盒，其特征在于；所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
7.16S rRNA正向引物：GACCTCGATGTTGGATCAGGAC；
16S rRNA反向引物：GATAGAAACCGACCTGGATTG；
黄牛 D-loop正向引物：AACACAGAATTTGCACCCT；
黄牛 D-loop反向引物：ATTAAGCTCGTGATCTAATGGT；
水牛 D-loop正向引物：CTGACTTTACACTCTAGCCTA；
水牛 D-loop反向引物：GGATTTGACTTGAATGCACT；
牦牛 D-loop正向引物：CTAACAACACACATCCCCAA；
牦牛 D-loop反向引物：TTAAGCTCGTGATCTAGTGGA；
以上任意序列表及其组合在检测牛肉中的用途。
8.16S rRNA探针: GATTAATAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGC；
黄牛 D-loop探针: GACCACAGAATGAATTACCTACGCAAGGGGTAATG；
水牛 D-loop探针: CAACATATGACCCTACTACTCCGAATGGGGG；
牦牛 D-loop探针: GCATTGTCCAAACGGGGGATACGTACA；
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG；
以上任意序列表及其组合在检测牛肉中的用途。
9.一种检测牛肉真伪的方法，其特征在于，利用权利要求1-6任意所述的检测试剂盒进行检测。
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109750105B (zh) | 2022-02-15 |
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Granted publication date: 20220215 |