CN103589781B - 玉米转基因检测试剂盒 - Google Patents

玉米转基因检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明是检测用品领域内的一种玉米转基因检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重PCR引物组合，各对引物为Pat、Bar、Cry1Ab、Cry105、EPSPS、P35S和玉米内源基因序列Zein，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列和一组阳性对照探针序列，分别为Pat探针、Bar探针、Cry1Ab探针、Cry105探针、EPSPS探针、P35S探针、Zein探针和Positive探针，引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物。本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的玉米转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。

Description

玉米转基因检测试剂盒
所属技术领域
本发明涉及检测用品领域，具体为一种玉米转基因检测试剂盒。
背景技术
转基因玉米和转基因大豆是目前全球最主要的转基因粮食作物。从1996年开始，抗虫和耐除草剂玉米开始在美国商业化种植，根据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）资料显示，到2011年已有16个国家种植转基因玉米，其中5个国家种植面积超过100万公顷。2011年全球转基因玉米总种植面积已达到5100万公顷，占玉米总种植面积的32%。由于转基因产品在全球市场中的大量涌现，其环境和食品安全问题也引起国际性的高度关注。各国相继制定并出台了相应的法律法规，对转基因作物的环境释放和产品销售采取严格的管理措施。目前已有超过40个国家要求对转基因生物及其产品实施标识管理。我国于2001年5月23日发布了国务院第304号令《农业转基因生物安全管理条例》，实现了对转基因生物的规范管理，并于2002 年3 月20 日起施行《农业转基因生物标识管理办法》，要求对包括转基因玉米和转基因大豆在内的5 类转基因生物及其产品进行标识。因此，快速、准确、灵敏、廉价和相应通量的转基因产品检测技术是非常关键的。转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫试纸条和Western杂交等方法是目前主要的基于蛋白的检测方法，其共同特点是需要通过一定的处理步骤从样品中释放出目标蛋白（抗原），然后利用抗体特异性的结合抗原蛋白，最后通过酶标或金属标偶联抗体与抗原抗体复合物结合，从而产生可检测的信号，该类方法的缺点是检测灵敏度相对较低，并且需要制备高特异性抗体，同时检测容易受到多种因素的影响，出现假阳性。而基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，检测方法主要包括PCR（聚合酶链式反应）技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以PCR技术应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。普通定性PCR方法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式PCR虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率的问题；多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但常规的电泳检测结果很难判断，容易出现假阳性和假阴性结果；荧光定量PCR方法灵敏度高，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。基因芯片也是常用的转基因产品检测技术，目前一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，同样成本较高。因此研发一种快速、方便、灵敏、廉价、可视化和高通量的检测方法将具有非常好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术费时费力成本高的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉的玉米转基因检测试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的玉米转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重PCR引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
Pat：正向引物： TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT
反向引物： GGCCCAGCGTAAGCAATACC
Bar：正向引物： GGGGATCTACCATGAGCCCA
反向引物：GGCTCGGTACGGAAGTTGAC
Cry1Ab：正向引物：CGACATCTCCTTGTCCTTGAC
反向引物：CTCAATTTGCACCAGGAATGC
Cry105：正向引物： ACTCGATCAGGTACAATGCCA
反向引物：GCATCTGTTAGGCTCTCCAC
EPSPS：正向引物： GCGCGATCATACGGAAAAGAT
反向引物：TCGATGACTTGGCCGGTGAG
P35S：正向引物：AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA
反向引物：GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG
Zein：正向引物： ACTAGTGCGACCCATATTCCAG
反向引物：AAGCGGTAAGGCCAACAGTT；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列和一组阳性对照（Positive）探针序列，7组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
Pat探针: GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT
GTGGCTGGTATTGCTT
Bar探针: ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC
TACATCGAGACAAGCAC
Cry1Ab探针: GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT
TTGGTCCATCTCAATG
Cry105探针: GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC
TGCCCAATCTCCCATTG
EPSPS探针: ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC
GCCTGGAAGGCCGCGGC
P35S探针: CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT
GACGCACAATCCCAC
Zein探针:  ACTGCATGATGCAACAGGGGCTTGCCAGCTTGATGGCGTGTC
CGTCCCTGATGCTGCAG
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG。
上述方案中，所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3’。
上述方案中，所述玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、EX-Taq聚合酶（Polymerase）和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTC
TGATCTGGATGC-3’。
上述方案中，所述玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液。
上述方案中，所述预杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠（SDS）和10×Denhardt’s液，其中，SSC为0.75M 氯化钠，0.075M 柠檬酸钠，Denhardt’s液为1% Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，l% 牛血清白蛋白（BSA）；杂交液为5×SSC，0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠（SDS），5×Denhardt’s液，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml 酵母tRNA；洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1为2×SSC和0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠（SDS），洗液2为0.5×SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠（SDS），洗液3为100 mM（毫摩尔/升）Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl，洗液4为100 mMTris-HCl，PH9.5，100 mMNaCl和100 mM MgCl2；封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白（BSA），100 mMTris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液为200mM柠檬酸钠，PH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液为 3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液。
上述方案中，所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
本发明的玉米转基因检测试剂盒采用多重PCR扩增的方法扩增目标序列。多重PCR扩增技术原理是将多对引物放到同一个反应管中进行PCR扩增，达到同时扩增2种或两种以上目标DNA序列的目的。试剂盒采用了7重PCR扩增体系扩增目标序列，包括五种常见转基因序列Pat、Bar、Cry1Ab、Cry105、EPSPS，一个外源启动子序列P35S和玉米内源基因序列Zein。
本发明采用非对称PCR扩增技术（asymmetric PCR）用以提高检测灵敏度。非对称PCR扩增技术原理是在PCR扩增过程中采用不等量的正向引物和反向引物（或是扩增延伸条件不同的正向引物和反向引物），PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的探针杂交，从而提高检测灵敏度。
本发明在多重PCR扩增同时进行非对称PCR扩增，采用的技术方案是在多重PCR反向引物的5’端添加5’端带生物素标志的Tag序列，同时在PCR反应体系中添加过量的5’端带生物素标志的Tag引物，Tag引物的碱基顺序与上述Tag序列的碱基顺序相同，该Tag引物Tm值（解链温度）比多重PCR正向引物Tm值高10~15℃，用于非对称PCR阶段扩增单链DNA。在整个PCR扩增过程中，首先采用低退火温度（55~60℃）进行多重PCR反应，其扩增产物主要是双链DNA，之后提高退火温度（65~68℃），使正向引物不能结合到模板上，只有Tag引物和反向引物可以结合到模板上并延伸扩增，从而产生大量5’端带生物素标志的单链DNA，该单链DNA用于接下来的膜芯片杂交检测。
本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行转基因的分子杂交检测，其工作原理是首先将针对各个转基因序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域，再将待测的多重PCR产物与其杂交，这样PCR产物中的转基因序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有生物素标志，结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标志物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号，这样一张膜芯片上就可以同时检测多个转基因目标序列。本发明的玉米转基因检测试剂盒的检测探针为59碱基的寡核苷酸探针，其顺序排列于支持膜表面的特殊区域，形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形成肉眼可视化的检测结果。
本发明提供一种多指标检测玉米转基因的可视化膜芯片试剂盒，其中待检测的目标序列包括常见的玉米转基因序列Pat、Bar、Cry1Ab、Cry105、EPSPS、外源启动子序列P35S和玉米内源基因Zein。通过该试剂盒的检测，可以快速准确的判断待检玉米产品中是否含有上述转基因序列，适合于转基因玉米产品的大规模筛查。
本发明的有益效果是：1）操作简单，经过一次样本前处理，单管PCR扩增，单芯片杂交就可以同步检测样本中多种转基因序列，具有平行分析和多重判断的特点；2）检验对象完备，包含了当前常见的转基因序列，并且可以很方便的加入新的检测序列；3）系统在多重PCR扩增过程同时进行了非对称PCR扩增，提高了系统的灵敏度和准确性；4）试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式，提高了系统的检测通量，并且检测结果可以直接用肉眼判断，方便，快捷；5）试剂盒操作简单，经济，无需特殊的昂贵仪器，适用于转基因玉米的大规模检测。
因此，本发明克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，提供的玉米转基因检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
附图说明
图1为本发明用于检测转基因玉米品系BT11的杂交结果图，其中图1A为芯片结果模式图，图1B为转基因玉米BT11的检测结果图。
图2为本发明用于检测转基因玉米品系BT176的杂交结果图，其中图2A为芯片结果模式图，图2B为转基因玉米BT176的检测结果图。
图3为本发明用于检测转基因玉米品系MON88017的杂交结果图，其中图3A为芯片结果模式图，图3B为转基因玉米MON88017的检测结果图。
图4为本发明用于检测转基因玉米品系MON89034的杂交结果图，其中图4A为芯片结果模式图，图4B为转基因玉米MON89034的检测结果图。
图5为本发明用于检测非转基因玉米品系郑单958的杂交结果图，其中图5A为芯片结果模式图，图5B为非转基因玉米郑单958的检测结果图。
附图中，Pat：草丁膦乙酰CoA转移酶，Bar：草丁膦乙酰转移酶基因，Cry1Ab：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA(b)基因，Cry105：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cry105基因，EPSPS：莽草酸羟基乙酰转移酶，P35S：花椰菜花叶病毒35S启动子，Zein：玉米醇溶蛋白基因，Positive：阳性对照，Barcode：膜芯片条码。
具体实施例
下面结合附图及实施例进一步详述本发明，但本发明不仅限于所述实施例。
实施例一
本例的玉米转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，引物组合为7重PCR引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
Pat：正向引物： TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT
反向引物： GGCCCAGCGTAAGCAATACC
Bar：正向引物： GGGGATCTACCATGAGCCCA
反向引物：GGCTCGGTACGGAAGTTGAC
Cry1Ab：正向引物：CGACATCTCCTTGTCCTTGAC
反向引物：CTCAATTTGCACCAGGAATGC
Cry105：正向引物： ACTCGATCAGGTACAATGCCA
反向引物：GCATCTGTTAGGCTCTCCAC
EPSPS：正向引物： GCGCGATCATACGGAAAAGAT
反向引物：TCGATGACTTGGCCGGTGAG
P35S：正向引物：AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA
反向引物：GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG
Zein：正向引物： ACTAGTGCGACCCATATTCCAG
反向引物：AAGCGGTAAGGCCAACAGTT；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列和一组阳性对照（Positive）探针序列，7组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
Pat探针: GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT
GTGGCTGGTATTGCTT
Bar探针: ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC
TACATCGAGACAAGCAC
Cry1Ab探针: GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT
TTGGTCCATCTCAATG
Cry105探针: GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC
TGCCCAATCTCCCATTG
EPSPS探针: ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC
GCCTGGAAGGCCGCGGC
P35S探针: CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT
GACGCACAATCCCAC
Zein探针:  ACTGCATGATGCAACAGGGGCTTGCCAGCTTGATGGCGTGTC
CGTCCCTGATGCTGCAG
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG。
支持膜为硝酸纤维素膜。
通过相应的多重PCR引物设计，采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述7重PCR组合引物。根据多重PCR扩增产物设计检测探针，采用固相亚磷酰胺三酯法合成探针，探针合成时同时合成阳性探针(positive probe)和对应的5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸(positive oligo)单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCAC
TGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
将支持膜裁成1.2cm×1.8cm的膜条，裁好的膜于双蒸水中浸泡15min，再用15×SSC浸泡15min，取出，置于滤纸上，60℃烘1.5 hour，膜条降温到室温后，将探针(5uM)顺序点在膜上，每个探针重复点样两次，以验证检测结果的可重复性，点样样式见图1A，膜条晾干后80℃烘2小时以固定探针，处理好的膜芯片室温保存。
按照北京康为世纪生物科技有限公司新型植物基因组DNA提取试剂盒（NuCleanPlantGen DNA Kit，CW0531）的说明提取转基因玉米品系BT11的玉米基因组DNA，每30mg初始样本经抽提后用50ul ddH2O（双蒸水）溶解基因组DNA，并用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(50ng/ul)。
PCR扩增的反应体系如下所示：
ddH2O:  50ul
10×PCR Buffer:  5ul
dNTP (2.5mM each):  5ul
PCR引物(20μM):  0.5ul each
EX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul):  0.5ul
提取的玉米基因组DNA (约50ng/ul):  2ul
对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由预变性、多重PCR循环组成，条件分别为：
预变性：温度95℃，时间10分钟。
多重PCR循环：30个循环组成：
变性：温度95℃，时间45秒。
退火：温度55℃，时间30秒。
延伸：温度72℃，时间30秒。
最后延伸：温度72℃，时间10分钟。
然后进行膜芯片斑点杂交检测，膜条于42℃预杂交液（5×SSC，0.1% SDS，10×Denhardt’s）中预杂交1小时，之后将膜条放于2ml杂交液(5×SSC，0.1% SDS，5×Denhardt’s，50%去离子甲酰胺，100ug/ml 酵母tRNA)中42℃，1小时。取40ul多重PCR产物加入1ul阳性寡核苷酸单链DNA(10uM)，100℃水浴变性5分钟后置于冰上，之后加入2ml杂交液中，42℃杂交16小时。洗液1（2×SSC，0.1% SDS）、洗液2（0.5×SSC，0.1% SDS）42℃各洗膜条两次，每次10分钟。将膜条置于封闭液（3%BSA，100 mMTris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl）中37℃封闭30分钟，之后将膜条放到酶联液（用封闭液1:5000稀释链酶亲和素标记辣根过氧化物酶）中37℃，30分钟。用洗液3（100 mM Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl）、洗液4（100 mM Tris-HCl，PH9.5，100 mMNaCl，100 mMMgCl2）各漂洗膜条3次，每次5分钟，之后将膜条放入 TMB显色液（100mM柠檬酸钠PH5.4，0.1mg/ml四甲基联苯胺TMB，1:1600体积比的H2O2(3%)）中，避光显色10~15分钟，依照杂交点的显色情况判定结果。
本例中所用辅料和配液为外购或自配，百分比为重量百分比。
实施例二
本例的玉米转基因检测试剂盒由引物组合和膜芯片组成，引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3’。
支持膜为尼龙膜。
PCR扩增的反应体系如下所示：
ddH2O:  50ul
10×PCR Buffer:  5ul
dNTP (2.5mM each):  5ul
PCR引物(20μM):  0.5ul each
Tag primer (20μM):  3.5ul
EX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul):  0.5ul
提取的玉米基因组DNA (约50ng/ul):  2ul
对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由预变性、多重PCR循环1和非对称PCR循环2组成，条件分别为：
预变性：温度95℃，时间10分钟。
多重PCR循环1：30个循环组成：
变性：温度95℃，时间45秒。
退火：温度55℃，时间30秒。
延伸：温度72℃，时间30秒。
非对称PCR循环2：25个循环组成：
变性：温度95℃，时间45秒。
退火：温度65℃，时间30秒。
延伸：温度72℃，时间30秒。
最后延伸：温度72℃，时间10分钟。
检测结果如图1B所示。
其余同实施例一。
实施例三
本例的玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、EX-Taq聚合酶（Polymerase）和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5'-CTGGTACTTTGGA
CACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
提取的玉米基因组DNA为转基因玉米品系BT176，检测结果如图2B所示。
其余同实施例二。
实施例四
本例的玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液。
提取的玉米基因组DNA为转基因玉米品系MON88017，检测结果如图3B所示。
其余同实施例二。
实施例五
本例的玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液，其中，预杂交液为5×SSC，0.1% SDS和10×Denhardt’s；杂交液为5×SSC，0.1% SDS，5×Denhardt’s，50%去离子甲酰胺和100ug/ml 酵母tRNA；洗液分别为洗液1：2×SSC和0.1% SDS，洗液2：0.5×SSC和0.1% SDS，洗液3：100 mM Tris-HCl，PH7.5，150 mM NaCl，洗液4：100 mM Tris-HCl，PH9.5，100 mM NaCl和100 mM MgCl2；封闭液为3% BSA，100 mM Tris-HCl，PH7.5，150 mM NaCl；四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液：200mM柠檬酸钠PH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液： 3% H2O2用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液。
支持膜为硝酸纤维素膜。
提取的玉米基因组DNA为转基因玉米品系MON89034，检测结果如图4B所示。
其余同实施例二。
实施例六
本例的玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，其中，多重PCR扩增试剂一管600ul，每48ul试剂可检测一个DNA样本，每48ul扩增体系构成如下：10×PCR Buffer(Takara) 5ul，dNTP (2.5mM each) 5ul，7对多重PCR引物(20μM) 0.5ul each， Tag primer(20μM) 3.5ul， EX-Taq Polymerase(Takara， 5U/ul) 0.5ul，ddH2O加至48ul。每一样本检测需要吸取48ul扩增试剂，加入2ul待检测基因组DNA (约50ng/ul)。
阳性寡核苷酸单链DNA(10uM)一管15ul。
预杂交液（5×SSC，0.1% SDS，10×Denhardt’s）一瓶30ml。杂交液(5×SSC，0.1% SDS，5×Denhardt’s，50%去离子甲酰胺，100ug/ml 酵母tRNA)一瓶30ml。
洗液1（2×SSC，0.1% SDS）10倍浓缩液一瓶12ml，使用前加108ml ddH2O。洗液2（0.5×SSC,0.1% SDS）10倍浓缩液一瓶12ml，使用前加108ml ddH2O。
封闭液/酶联液（3%BSA，100 mM Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl）一瓶60ml。链酶亲和素标记辣根过氧化物酶（1mg/ml）一管5ul，使用前用封闭液1:5000稀释成酶联液。
洗液3（100 mM Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl）10倍浓缩液一瓶18ml，使用前加162ml ddH2O。洗液4（100 mM Tris-HCl，PH9.5，100 mMNaCl，100 mM MgCl2）10倍浓缩液一瓶18ml，使用前加162ml ddH2O。
TMB显色液A液（200mM柠檬酸钠PH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺TMB）一瓶15ml。TMB显色液B液（1:800体积比的H2O2(3%)）一瓶15ml。使用前A液B液等量混合配成TMB显色液。
提取的玉米基因组DNA为非转基因玉米品系郑单958，检测结果如图5B所示。
其余同实施例五。
IIndividual Applicant
--------------------
      Street : 雁江区晨风路6号周祠坝49栋703号
      City : 资阳市
      State : 四川
      Country : 中国
      PostalCode :
      PhoneNumber : 18980016131
      FaxNumber :
      EmailAddress : xaoxuy0516sina.com
<110> LastName : 黄
<110> FirstName : 广平
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Application Project
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<120> Title : 玉米转基因检测试剂盒
<130> AppFileReference : 1
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<141> CurrentFilingDate : 2013-07-02
 
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<223> Pat，PCR引物
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tgatatggcc gcggtttgtg at                                                 22
 
 
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<223>  Bar，PCR引物
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ggggatctac catgagccca                                                    20
 
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<223> Cry1Ab，PCR引物
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cgacatctcc ttgtccttga c                                                  21
 
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<223> Cry105，PCR引物
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<223> EPSPS，PCR引物
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<223> P35S，PCR引物
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<223> Zein，PCR引物
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actagtgcga cccatattcc ag                                                 22
 
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<223> Pat探针
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gcaagataga tacccttggt tggttgctga ggttgagggt gttgtggctg gtattgctt         59
 
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<223> Bar探针
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accgaggcgg acatgccggc ggtctgcacc atcgtcaacc actacatcga gacaagcac         59
 
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<223> Cry1Ab探针
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gctgggttcg ttctcggact agttgacatc atctggggta tctttggtcc atctcaatg         59
 
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<223> Cry105探针
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gaccgtgaat gtcccaggta ctggttccct ctggccactt tctgcccaat ctcccattg         59
 
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<223> EPSPS探针
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accttaccgt cgagacggat gcggacggcg tgcgcaccat ccgcctggaa ggccgcggc         59
 
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<223> P35S探针
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caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccac         59
 
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<223> Zein探针
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actgcatgat gcaacagggg cttgccagct tgatggcgtg tccgtccctg atgctgcag         59
 
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<223> Positive探针
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gcatccagat cagaagcaat aatgagcagt gcgagaagaa cgagtgtcca aagtaccag         59
 
 
 
 
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<212> Type : DNA
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<220>
<223> 5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物
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agacgccacc gccagcgtat tatccgagcc                                         30
 
 
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<210> 17
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<212> Type : DNA
<213> OrganismName : 人工序列
<220>
<223> 5’端带生物素标志（biotin）的阳性寡核苷酸单链DNA
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ctggtacttt ggacactcgt tcttctcgca ctgctcatta ttgcttctga tctggatgc         59
 
 
 

Claims (1)

1.一种玉米转基因检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重聚合酶链式反应（PCR）引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
Pat：正向引物： TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT
反向引物： GGCCCAGCGTAAGCAATACC
Bar：正向引物： GGGGATCTACCATGAGCCCA
反向引物：GGCTCGGTACGGAAGTTGAC
Cry1Ab：正向引物：CGACATCTCCTTGTCCTTGAC
反向引物：CTCAATTTGCACCAGGAATGC
Cry105：正向引物： ACTCGATCAGGTACAATGCCA
反向引物：GCATCTGTTAGGCTCTCCAC
EPSPS：正向引物： GCGCGATCATACGGAAAAGAT
反向引物：TCGATGACTTGGCCGGTGAG
P35S：正向引物：AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA
反向引物：GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG
Zein：正向引物： ACTAGTGCGACCCATATTCCAG
反向引物：AAGCGGTAAGGCCAACAGTT；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列和一组阳性对照（Positive）探针序列，7组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
Pat探针: GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT
GTGGCTGGTATTGCTT
Bar探针: ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC
TACATCGAGACAAGCAC
Cry1Ab探针: GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT
TTGGTCCATCTCAATG
Cry105探针: GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC
TGCCCAATCTCCCATTG
EPSPS探针: ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC
GCCTGGAAGGCCGCGGC
P35S探针: CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT
GACGCACAATCCCAC
Zein探针:  ACTGCATGATGCAACAGGGGCTTGCCAGCTTGATGGCGTGTC
CGTCCCTGATGCTGCAG
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG；
所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3’。
2.一种玉米转基因检测试剂盒，其特征在于玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片和辅料组成，引物组合为7重聚合酶链式反应（PCR）引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
Pat：正向引物： TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT
反向引物： GGCCCAGCGTAAGCAATACC
Bar：正向引物： GGGGATCTACCATGAGCCCA
反向引物：GGCTCGGTACGGAAGTTGAC
Cry1Ab：正向引物：CGACATCTCCTTGTCCTTGAC
反向引物：CTCAATTTGCACCAGGAATGC
Cry105：正向引物： ACTCGATCAGGTACAATGCCA
反向引物：GCATCTGTTAGGCTCTCCAC
EPSPS：正向引物： GCGCGATCATACGGAAAAGAT
反向引物：TCGATGACTTGGCCGGTGAG
P35S：正向引物：AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA
反向引物：GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG
Zein：正向引物： ACTAGTGCGACCCATATTCCAG
反向引物：AAGCGGTAAGGCCAACAGTT；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列和一组阳性对照（Positive）探针序列，7组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
Pat探针: GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT
GTGGCTGGTATTGCTT
Bar探针: ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC
TACATCGAGACAAGCAC
Cry1Ab探针: GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT
TTGGTCCATCTCAATG
Cry105探针: GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC
TGCCCAATCTCCCATTG
EPSPS探针: ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC
GCCTGGAAGGCCGCGGC
P35S探针: CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT
GACGCACAATCCCAC
Zein探针:  ACTGCATGATGCAACAGGGGCTTGCCAGCTTGATGGCGTGTC
CGTCCCTGATGCTGCAG
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG；
所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3’；辅料为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、EX-Taq聚合酶（Polymerase）和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
3.一种玉米转基因检测试剂盒，其特征在于玉米转基因检测试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，引物组合为7重聚合酶链式反应（PCR）引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
Pat：正向引物： TGATATGGCCGCGGTTTGTGAT
反向引物： GGCCCAGCGTAAGCAATACC
Bar：正向引物： GGGGATCTACCATGAGCCCA
反向引物：GGCTCGGTACGGAAGTTGAC
Cry1Ab：正向引物：CGACATCTCCTTGTCCTTGAC
反向引物：CTCAATTTGCACCAGGAATGC
Cry105：正向引物： ACTCGATCAGGTACAATGCCA
反向引物：GCATCTGTTAGGCTCTCCAC
EPSPS：正向引物： GCGCGATCATACGGAAAAGAT
反向引物：TCGATGACTTGGCCGGTGAG
P35S：正向引物：AAGACGTTCCAACCACGTCTTCAA
反向引物：GAGGAAGGGTCTTGCGAAGG
Zein：正向引物： ACTAGTGCGACCCATATTCCAG
反向引物：AAGCGGTAAGGCCAACAGTT；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列和一组阳性对照（Positive）探针序列，7组探针序列和阳性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
Pat探针: GCAAGATAGATACCCTTGGTTGGTTGCTGAGGTTGAGGGTGTT
GTGGCTGGTATTGCTT
Bar探针: ACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCAC
TACATCGAGACAAGCAC
Cry1Ab探针: GCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCT
TTGGTCCATCTCAATG
Cry105探针: GACCGTGAATGTCCCAGGTACTGGTTCCCTCTGGCCACTTTC
TGCCCAATCTCCCATTG
EPSPS探针: ACCTTACCGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCC
GCCTGGAAGGCCGCGGC
P35S探针: CAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGAT
GACGCACAATCCCAC
Zein探针:  ACTGCATGATGCAACAGGGGCTTGCCAGCTTGATGGCGTGTC
CGTCCCTGATGCTGCAG
Positive探针：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAAC
GAGTGTCCAAAGTACCAG；
所述引物组合中有非对称PCR扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3’；辅料为脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、EX-Taq聚合酶（Polymerase）和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA的碱基顺序为biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’；配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液。
4.根据权利要求3所述的玉米转基因检测试剂盒，其特征在于所述预杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和10×Denhardt’s液，其中，SSC为0.75M 氯化钠, 0.075M 柠檬酸钠， Denhardt’s液为1% Ficoll聚蔗糖， 1%聚乙烯吡咯烷酮，1% 牛血清白蛋白；杂交液为5×SSC，0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠，5×Denhardt’s液，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml 酵母tRNA；洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1为2×SSC和0.1% 重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液2为0.5×SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液3为100 mM（毫摩尔/升）Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl，洗液4为100 mMTris-HCl，PH9.5，100 mMNaCl和100 mM MgCl2；封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白，100 mMTris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液为200mM柠檬酸钠，PH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液为 3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液。
5.根据权利要求1所述的玉米转基因检测试剂盒，其特征在于所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
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