CN106755504A - 一种快速检测转基因玉米pat的引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明具体公开了一种快速检测转基因玉米PAT的引物对及试剂盒，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中反应体系组分包括：HRM反应预混液，内参引物对，外源基因引物对，反应模板，去离子水；本发明的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因高粱的Zein基因和PAT基因；表明本发明检测的灵敏度更高，达到0.1％的水平，稳定性较高，模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.96，本发明的检测结果的准确度高达98％左右，由于本发明的简化了操作步骤，缩短检测周期，而且可以实现定量分析，因此具有较高的应用价值。

Description

一种快速检测转基因玉米PAT的引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及转基因植物快速检测技术领域，具体地，涉及一种快速检测转基因玉米PAT的引物及试剂盒。
背景技术
玉米是我国重要的粮食作物之一，在我国的农业生产中占有重要地位，也是保证我国粮食安全的一大功臣。转基因玉米虽然在我国还没有批准生产，但是相关的科研人员已在玉米转基因育种中取得的许多成果，当然，不能避免有转基因玉米通过不法渠道流入市场中。
目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR检测方法》中规定了对玉米MON810、Bt11、Evebt176、T14/T25、CBH351、GA21品系中转基因成分的定性检测，这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法，但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的荧光染料，毒性较大的荧光染料威胁科研人员的身体健康。
发明内容
针对现有技术上的不足，本发明的目的在于提供一种快速检测转基因玉米PAT的引物对；本发明的另一个目的是提供一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案得以实现：
一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；
内参引物对：
上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；
下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；
外源基因引物对：
上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；
下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。
一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR 0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；
所述内参上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；
所述内参下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；
所述外源基因上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；
所述外源基因下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。
相对于现有技术，本发明的有益效果：
1、本发明的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因高粱的Zein基因和PAT基因；
2、采用本发明的方法可以在同一反应体系同时检测高粱的Zein基因和外源基因PAT本发明的设计的引物对Tm值均在60℃以上，引物的长度均为25个碱基以上，引物特异性更高，检测结果更客观。
3、综合实验例1和2的结果，表明本发明的检测引物，试剂盒及方法；其检测的灵敏度更高，达到0.1％的水平，稳定性较高，模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.96，本发明的检测结果的准确度高达98％左右，由于本发明的PCR结束后，不用再转入其他分析装置分析，实现闭管操作，简化的操作步骤，避免由于操作过程复杂引起的交叉污染，缩短检测周期，而且可以实现定量分析，因此具有较高的应用价值。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
图1是本发明的结构示意图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。图1是本发明的快速鉴定抗除草剂的转基因高粱纯合植株的方法的流程示意图。
一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；
内参引物对：
上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；
下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；
外源基因引物对：
上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；
下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。
一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR 0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；
所述内参上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；
所述内参下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；
所述外源基因上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；
所述外源基因下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。
优选地，以上所述的快速检测转基因玉米PAT的试剂盒；
其中，试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR 1ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR 1ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul。
一种用以上所述的试剂盒的快速检测转基因玉米PAT方法，包括以下步骤：
S1.提取样品DNA；
S2.利用权利要求2或3所述的试剂盒，对步骤S1中的样品DNA进行PCR扩增；
S3.扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
本发明的组分和配比合理，检测快捷，准确率高，合适用于荧光PCR检测转基因高粱的Zein基因和PAT基因；采用本发明的方法可以在同一反应体系同时检测高粱的Zein基因和外源基因PAT本发明的设计的引物对Tm值均在60℃以上，引物的长度均为25个碱基以上，引物特异性更高，检测结果更客观。
在合适的实施例中，本部分对以上的快速检测转基因玉米PAT方法中步骤S1做出详细说明，
优选地，所述提取样品DNA过程包括以下步骤：
S1.取适量经石英砂和干冰研磨后的样品中加入2mL的离心管，随后快速加入1.5mL DNA提取缓冲液并上下颠倒混匀，混匀3分钟；
S2.将所有混合液转移到注射器中，轻轻推动注射器，混合液经过海绵和微孔滤膜的过滤后，滤液流到吸附柱的硅胶膜上，室温下静置5分钟；
S3.取新的注射器连接至吸附柱上，推动注射器，硅胶膜上的清液会缓慢的经过硅胶膜而流到柱子下面连接的离心管中，此时DNA分子会吸附在硅胶膜上；
S4.换新的2mL的离心管，加入500uL的洗液A后在室温下静置3分钟，推动注射器让洗液A洗脱硅胶膜上的蛋白质以及RNA；
S5.换新的2mL的离心管，加入700uL的洗液B后在室温下静置1分钟，推动注射器让洗液B洗脱硅胶膜上残留的蛋白质以及RNA；
S6.换新的2mL的离心管，加入500uL的洗脱液Ⅰ后在室温下静置3分钟，推动注射器让洗脱液Ⅰ对硅胶膜进行洗脱，去除残留的有机溶剂；
S7.换新的2mL的离心管，加入700uL的洗脱液Ⅱ后在室温下静置1分钟，推动注射器让洗脱液Ⅱ对硅胶膜进行洗脱，进一步除残留的有机溶剂；
S8.换新的注射器，推动注射器对空管的硅胶柱进行推气干燥3次，然后室温干燥3分钟；
S9.换新的2mL的离心管，加入50uL贮存液，后在室温下静置5分钟，轻轻推动注射器，离心管中便能收集得到高质量的DNA。
更优选地，所述DNA提取缓冲液成分为5M异硫氰酸胍，10mM 2-巯基乙醇，50mMTris，20mM EDTA，21.3mM聚乙二醇辛基苯基醚，pH 6.8；
更优选地，所述吸附柱的硅胶膜为特殊硅基质吸附材料，可以特异性吸附DNA，排斥RNA和蛋白质；
更优选地，所述过滤层为大孔径的海绵过滤层和超小孔径的微孔滤膜层；所述过滤层海绵为耐酸耐碱的材料；所述过滤层微孔滤膜为耐酸耐碱的陶瓷膜，孔径为0.8nm～1μm。
使用本方法与两种不同品牌的商业试剂盒，所提取的基因组DNA的OD260/280值和OD260/230值，显示大体一致的良好范围，表明本试剂盒大体上能达到一般商业试剂盒的水平，本发明的试剂盒提取产量稍微低于两种商业试剂盒，但对于监测部门的现场快速检测，DNA的量完全满足检测需要。
实验例1
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源；将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，采用0.1％标准品对其进行灵敏性实验。
结果显示，本发明的检测阈值达到0.1％，重复实验显示检测样品具有很好的重复性，稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.96。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
实验例2
为了验证采用本发明的方法及试剂盒，检测转基因玉米的准确度及效率；我们使用传统PCR和本发明的方法，对同一批次的转基因玉米进行检测，每个处理检测100待测样品，每个处理重复3次，结果取平均值；最后两种的检测结果分别与二代测序的结果对比，比较每一种方法的准确率，检测结果如表1所示；
表1
玉米品种 本发明检测方法 传统PCR
华农866 97.9％ 84.8％
申玉17号 98.1％ 83.9％
从实验例2结果表明，本发明的检测方法，其检测结果准确度更高，高达98％，传统PCR检测结果准确度在84％左右。
综合实验例1和2的结果，表明本发明的检测引物，试剂盒及方法；其检测的灵敏度更高，达到0.1％的水平，稳定性较高，模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.96，本发明的检测结果的准确度高达98％左右，由于本发明的PCR结束后，不用再转入其他分析装置分析，实现闭管操作，简化的操作步骤，避免由于操作过程复杂引起的交叉污染，缩短检测周期，而且可以实现定量分析，因此具有较高的应用价值。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种快速检测转基因玉米PAT的引物对，其特征在于，所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；
内参引物对：
上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；
下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；
外源基因引物对：
上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；
下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。
2.一种快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的引物对包括所述引物对包括内参引物对和外源基因引物对；试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR 0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF0.7-1.2ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR 0.7-1.2ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul；
所述内参上游引物ZeinF：ACTATGCCTTGGTCTGTACTATGCCGAG；
所述内参下游引物ZeinR：CGTAAGGGCTGATGATTGGCATACCGTC；
所述外源基因上游引物PATF：GGAGGCCAATACTGCATGGCAGAATC；
所述外源基因下游引物PATR：GCTCATCGAAGGCCTAATGGCATTCGG。
3.根据权利要求2所述的快速检测转基因玉米PAT的试剂盒，其特征在于，试剂盒中25ul反应体系包括以下组分：终浓度为1倍的HRM反应预混液15ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物ZeinF 1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物ZeinR 1ul，终浓度为0.5pmol/L的上游引物PATF1ul，终浓度为0.5pmol/L的下游引物PATR 1ul，DNA模板1ul，去离子水补齐至25ul。
4.一种用权利要求3所述的试剂盒的快速检测转基因玉米PAT方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取样品DNA；
S2.利用权利要求2或3所述的试剂盒，对步骤S1中的样品DNA进行PCR扩增；
S3.扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
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