CN101921833A - 转基因玉米检测芯片 - Google Patents

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CN101921833A CN 201010148294 CN201010148294A CN101921833A CN 101921833 A CN101921833 A CN 101921833A CN 201010148294 CN201010148294 CN 201010148294 CN 201010148294 A CN201010148294 A CN 201010148294A CN 101921833 A CN101921833 A CN 101921833A
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Abstract

本发明属于生物芯片技术领域，具体涉及一种转基因玉米检测芯片，其特点是针对CaMV-P、Nos-T等13个待检靶基因检测玉米产品是否拥有相关基因，设计有55-59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相同即在70.7-82.1的范围内，并根据所述待检靶基因设计有相应的带有荧光标记的PCR扩增引物：CaMV-P、Cry9C、neo、pat、nos-T、gox、IVR、CryIAb、CryIAc、18S、hpt、bar、EPSPS，其Tm值在58-66的范围内，该芯片可与各种结构的芯片围栏、半封闭式围栏，折叠式杂交盒、转基因生物芯片检测试剂盒等配套使用，是基于寡核苷酸芯片技术的高灵敏度、高通量的转基因玉米检测芯片，其探针经过特别设计，长度适中，兼容性和特异性优异。

Description

转基因玉米检测芯片
技术领域：本发明属于生物芯片技术领域，具体是一种转基因玉米检测芯片。
背景技术：现有技术中，有关转基因产品的检测芯片报道有：中国实用新型专利ZL01214517.3公开了一种用于转基因产品鉴定的基因检测芯片，即在平面型支撑载体的平面上被覆有带正电荷材料的膜层，在该膜层的表面以微点阵方式排布有供转基因产品判断用的异源基因探针。但在其说明书中未提供任何有关检测探针序列及待检靶基因扩增引物的信息，仅有芯片说明无配套试剂盒故根本无法应用于实际工作中。
中国发明专利03150523.6公开了一种用于转基因产品检测的寡核苷酸芯片的制造方法及其应用，是根据已知转基因产品基因组中所含的异源插入基因、物种内标基因、特异性边界序列等设计特异性的寡核苷酸探针及相应引物，然后将探针固定在载玻片上构成转基因产品检测芯片。该专利利用15-35聚探针，TM值在60度左右。这种长度的探针因为较短，特异性太强，对某个位点发生突变无法检测。
发明内容：本发明的目的是为了克服现有用于转基因产品鉴定的基因检测芯片所存在的过的短探针特异性太强，对某个位点发生突变无法检测的弊端及过长的探针长度特异性不强，容易造成假阳性的技术缺陷，为人们提供一种兼容性和特异性都较好的转基因玉米检测芯片。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。
本发明的转基因玉米检测芯片，其特征在于，针对CaMV-P、Nos-T等13个待检靶基因检测玉米产品是否拥有相关基因，设计55-59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相同：
异源                                                                     长  Tm
                                 探针
插入基因                                                                 度  值
CaMV-P    ATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA    59  74.5
Nos-T     TTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG        55  70.7
Bar       TTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG    59  82.1
Neo       ATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC    59  78.7
Hpt       AAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT    59  78.7
Pat       AATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA    59  74.5
EPSPS     AATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG    59  81.4
CryIAb    ATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG    59  82.1
CryIAC    AGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT    59  74.5
Cry9C     AGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG    59  81.4
Gox       TTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC    59  77.3
玉米                                                                     长  Tm
                              探针
内源基因                                                                 度  值
IVR       TAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG    59  79.4
18S       TGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT        55  78.2
上述方案中，根据所述待检靶基因设计有相应的带有荧光标记的
PCR扩增引物，分别为：
靶基因名称             引物序列(5’-3’)                        Tm值
                 Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG                       66
CaMV-P
                 TAGCTCATTGTCGTTGGACG                           60
                 Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA                      64
Nos-T
                 CCCAAAGTTCAACTACGAGC                           60
                 Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTAC                       62
Bar
                 GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC                           62
Neo              Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT                       60
                   AATATCACGGGTAGCCAACG                60
                   Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTAT            62
Hpt
                   GATGTTGGCGACCTCGTATT                60
                   Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAG            64
Pat
                   AGGCCAATAACAGCAACCAC                60
                   Cy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCG            60
EPSPS
                   CCTTCGTATCGGAGAGTTCG                62
                   Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCT            62
CryIAb
                   AACTCAGTGCCATCCAGGAC                62
                   Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTT            60
CryIAc
                   TTCTGCGCTCTTTCCAGATT                58
                   Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACT            62
Cry9C
                   GTCCATGAAGTTGCTGCTCA                60
                   Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTA            58
Gox
                   GCACGTTTCCAGTTAGGAGC                62
                   Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG            64
IVR
                   TAGCTCATTGTCGTTGGACG                60
                   Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA           64
18S
                   CCCAAAGTTCAACTACGAGC                60
通过点样仪将上述探针转移到经化学基团修饰的玻片上，经SDS(十二烷基硫酸钠)、纯水处理制成。玻片修饰基团可选自醛基、异硫氰基或巯基之一。抽提待检玉米基因组DNA，用有荧光标记的引物对待检靶基因进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，所得产物与寡核苷酸探针阵列杂交，通过扫描仪获得待检玉米产品的相关信息。
本说明书和权力要求书中使用的下列异源插入基因名称缩写除非特别说明具有如下含义：
CaMV-P：花椰菜花叶病毒基因组的35S启动子；
Nos-T：Ti胭脂碱合成酶基因终止子；
Bar：来源于链霉菌Streptomyces viridochromogenes，其编码产物为草丁磷乙酰转移酶；
Neo：大肠杆菌E.coli新霉素-3′-磷酸转移酶基因；
Hpt：潮霉素磷酸转移酶；
Pat：来源于链霉菌Streptomyces viridochromogenes，其编码产物为草丁磷乙酰转移酶；
EPSPS：5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因；
CryIAb：苏云金芽抱杆菌Bacillus thuringiensissubsp.Kurstaki杀虫毒蛋白cryIA(b)基因；
CryIAc：苏云金芽抱杆菌Bacillus thuringiensissubsp.Kurstaki杀虫毒蛋白cryIA(c)基因；
Cry9C：苏云金芽抱杆菌Bacillus thuringiensissubsp.Kurstaki杀虫毒蛋白cryI9C基因；
Gox：细菌Ochrobactrum anthropi草甘膦氧化还原酶基因；
IVR：玉米的转化酶1基因；
18S：真核生物18S核糖体RNA基因。
本发明之转基因产品所检测目的基因PCR扩增片段及探针标记序列如下：
CaMV-P
Gaggatctaacagaactcgccgtgaagactggcgaacagttcatacagagtctt ttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccat
该核酸序列部分为CaMV 35S启动子基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
Nos-T
Aagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggttt ttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaa
该核酸序列部分为Nos终止子基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
Bar
Gcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcacgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgctctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggctg cccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggcatgacgtgggtttctggcagctggacttc
该核酸序列部分为Bar基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
Neo
Tgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcac gtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatatt
该核酸序列部分为Neo基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
Hpt
Tcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatc
该核酸序列部分为Hpt基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
Pat
Cggagaggagaccagttgagattaggccagctacagcagctgatatggccgcggtttgtgatatcgttaaccattacattgagacgtctacagtgaactttaggacagagccacaaacaccacaagagtggattgatgatctagagaggttgcaagatagatacccttggttggttgctgaggttgagggtgttgtggctggtattgcttacgctgggccctggaaggctaggaacgcttacgattggacagttgagagtactgtttacgtgtcacataggcatcaaaggt tgggcctaggatccacattgtacacacatttgcttaagtctatggaggcgcaaggttttaagtctgtggttgctgttataggcct
该核酸序列部分为Pat基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
EPSPS
Atatccgattctcgctgtcgccgccgccttcgcggaaggggcgaccgtgatgaacggtctggaagaactccgcgtcaaggaaagcgaccgcctctcggccgtcgccaatggcct caagctcaatggcgtggattgcgatgagggcgagacgtcgctcgtcgtgcgcggccgccctgacggcaaggggctcggcaacgcctcgggcgccgccgtcgccacccatctgcatcaccgcatcgccatgagcttcctcgtcatgggcctcgtgtcggaaaaccctgtcacggtggacgatgccacgatgatcgccacgatcttcccggagttcatggacctgatggccgggctgggcgcgaagatcgaactctccgatacgaagg
该核酸序列部分为EPSPS基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
CryIAb
Cctggacattgtgtccctcttcccgaactacgactcccgcacctacccgatccgcaccgtgtcccaactgacccgcgaaatctacaccaaccccgtcctggagaacttcgacggtagcttcaggggcagcgcccagggcatcgagggctccatcaggagcccacacctgatggacatcctcaacagcatcactatctacaccgatgcccaccgcggcgagtactactggtccggccaccagatcatggcctccccggtcggcttcagcggccccgagtttacctttcctctctacggcacgatgggcaacgccgctccacaacaacgcatcgtcgctcagctgggccagg gcgtctaccgcaccctgagctccaccctgtaccgcaggcccttcaacatcggtatcaacaaccagcagctgtccgtcctggatggcactgagtt
该核酸序列部分为CryIAb基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
CryIAc
Cctgcagtgaagggaaactttctttttaatggttctgtaatttcaggaccaggatttactggtggggacttagttagattaaatagtagtggaaataacattcagaatagagggtatattgaagttccaattcacttcccatcgacatctaccagatatcgagttcgtgtac ggtatgcttctgtaaccccgattcacctcaacgttaattggggtaattcatccattttttccaatacagtaccagctacagctacgtcattagataatctacaatcaagtgattttggttattttgaaagtgccaatgcttttacatcttcattaggtaatatagtaggtgttagaaattttagtgggactgcggagtgataatagacagatttgaatttattccagttactgcaacactcgaggctgaatataatctggaaagagcgcagaa
该核酸序列部分为CryIAc基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
Cry9C
Gaccgccaagtacaccaactactgcgagacctggtacaacaccggtctggaccgcctgaggggcaccaacaccgagagctggctgcgctaccaccagttccgcagggagatgaccctggtggtgctggacgtggtggccctgttcccctactacgacgtgcgcctgtaccccaccggcagcaacccccagctgacacgtgaggtgtacaccgaccccatcgtgttcaaccc accagccaacgtgggcctgtgccgcaggtggggcaccaacccctacaacaccttcagcgagctggagaacgccttcatcaggccaccccacctgttcgaccgcctgaacagcctgaccatcagcagcaatcgattccccgtgagcagcaacttcatggac
该核酸序列部分为Cry9C基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
Gox
Taacttgtctcacgcctttaccaagggaatccttatcgaagagaacggtcacaccatcaacccacaaggtctcgtgactctcttgtttcgtcgtttcatcgctaacggtggag agttcgtgtctgctcgtgttatcggattcgagactgaaggtcgtgctctcaagggtatcaccaccaccaacggtgttcttgctgttgatgcagctgttgttgcagctggtgcacactccaagtctcttgctaactcccttggtgatgacatcccattggataccgaacgtggataccacatcgtgatcgccaacccagaagctgctccacgtattccaactaccgatgcttctggaaagttcatcgctactcctatggagatgggtcttcgtgttgctggaaccgttgagttcgctggtctcactgctgctcctaactggaagcgtgc
该核酸序列部分为Gox基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
IVR
Cacacctgtacacgtccctgtacgcgccgtcgtggtctcccgtgatcctgccccgtcccctccacgcggccacgcctgctgcagcgctctgtacaagcgtgcaccacgtgaga atttccgtctactcgagcctagtagttagacgggaaaacgagaggaagcgcacggtccaagcacaacactttgcgcgggcccgtgacttgtctccggttggctgagggcgcgcgacagagatgtatggcgccgcggcgtgtcttgtgtcttgtcttgcctatacaccgtagtcagagactgtgtcaaagccgtccaacgacaatgagcta
该核酸序列部分为IVR基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
18S
Gagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcc cgacacggggaggtagtgacaataaatactgatacagggctcttttgggtcttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaattagagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctctaatagcgtatattaaatttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaacttggg
本发明整体构思是1.通过政府及国际组织网站NCBI、GENEBANK等核酸数据库、专利数据库收集多种已商品化的转基因产品的基因构建图及相应的异源插入基因，并通过克隆和测序给予补充和验证。这些异源插入基因可分为两类：外源基因序列、边界序列A.启动子、终止子和标记基因；B.性状基因(目标基因，既能改变植物形状的异源核苷酸片段)，根据这些异源插入基因设计相应的探针和引物。2.选取一段与18SrRNA产物相配对的寡核苷酸片段，作为阳性参照，用于监控杂交反应中假阴性的出现。3.选取一段与内标基因IVR产物相配对的寡核苷酸片段，作为玉米的物种特异性对照。4.将各类探针分别固定在一张玻片的不同区域内便可达到并行对转基因玉米内多种异源插入基因片段进行筛查。
本发明是发明人通过长期实践探索开发出来的科学实用的就是方案，提供了一种可以测定上述目的基因的用于转基因玉米及其加工产品检测的基于寡核苷酸芯片技术的高灵敏度、高通量的转基因玉米检测芯片，其探针经过特别设计，长度适中，并且克服了现有技术中短探针特异性太强，对某个位点发生突变无法检测的弊端及过长的探针长度特异性不强，容易造成假阳性的缺陷，为人们提供一种兼容性和特异性都较好的转基因玉米检测芯片。
下面通过实施例进一步描述本发明，本发明不仅限于所述实施例。
附图说明：
图1为与表4对应的芯片点阵排布设计示意图
图2为CaMV-P理论杂交图，图3为CaMV-P实际杂交图。
图4为cryIAb理论杂交图，图5为cryIAb实际杂交图。
图6为EPSPS理论杂交图，图7为EPSPS实际杂交图。
图8为neo理论杂交图，图9为neo实际杂交图。
图10为nos-T理论杂交图，图11为nos-T实际杂交图。
图12为pat理论杂交图，图13为pat实际杂交图。
图14为bar理论杂交图，图15为bar实际杂交图。
图16为18S理论杂交图，图17为18S实际杂交图。
具体实施方式：
实施例1
首先，要在醛基化芯片表面固定的DNA分子必须具有一个伯胺基。5’-氨基，又称为连接氨基，具有通过6-12个碳原子间隔臂连接在5’核苷酸的磷酸基团上的一个伯胺基。而为了使探阵分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交，故合成时在每个探针的5’加上了一个氨基和15个T。
探针(如表1所示)和引物(如表3所示)是人工合成的一串寡核苷酸链，均由核酸合成仪进行合成。
将合成好的探针用超纯水溶解，使其终浓度为40μM。然后将溶解的探针和点样缓冲液(晶芯基因芯片点样液)充分混匀分装到384孔板中，另外还将Hex及阳性(PC)和阴性(NC)内参装入384孔板的对应位置。之后将384孔板和醛基芯片放入芯片点样仪中进行点样，点制好的芯片阵列如表4所示基因芯片点阵排布情况。
芯片点制好后进行芯片的固定过程，探针牢固的结合到芯片上。固定的基本流程为：
湿盒过夜——清洗液清洗——milliQ水清洗——封闭液封闭——milliQ水清洗——离心甩干。
湿盒过夜：将大芯片盒的下半部分清理干净，放入一块无尘布，再在无尘布内加入15ml的milliQ水，将芯片盒放入大自封袋内，折叠好后放入37度烘箱内烘至少16小时。
清洗液洗涤：往大烧杯内加入588ml的milliQ水，同时加入10％的SDS 12ml，将湿盒中取出的芯片放在芯片架上放入清洗液中，75rpm缓慢摇动5min。
milliQ水清洗：在另外一个大烧杯内加入750-800ml的milliQ水，将清洗液中的芯片架取出，放入水中上下提拉芯片架30次(迅速)，换干净的milliQ水重复一次。
封闭液封闭：(封闭液提前配制)向烧杯中加入405ml的milliQ水，10×的PBS 45ml，硼氢化钠1.5克，待完全溶解后加入150ml的无水乙醇，玻璃棒迅速搅拌。将还在上一步milliQ水的芯片架取出，放入封闭液中75rpm缓慢摇动5min。
milliQ水清洗：在另外一个大烧杯内加入750-800ml的milliQ水，将清洗液中的芯片架取出，放入水中上下提拉芯片架30次(迅速)，换干净的milliQ水重复一次。
离心甩干，避光静置备用。
表1针对CaMV-P、Nos-T等13个待检靶基因检测玉米产品是否拥有相关基因，设计55-59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相同：
表1
异源                                                                    长  Tm
                                 探针
插入基因                                                                度  值
CaMV-P   ATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA    59  74.5
Nos-T    TTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG        55  70.7
Bar      TTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG    59  82.1
Neo      ATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC    59  78.7
Hpt      AAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT    59  78.7
Pat      AATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA    59  74.5
EPSPS    AATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG    59  81.4
CryIAb   ATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG    59  82.1
CryIAc   AGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT    59  74.5
Cry9C    AGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG    59  81.4
Gox      TTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC    59  77.3
玉米                                                                    长  Tm
                                  探针
内源基因                                                                度  值
IVR      TAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG    59  79.4
18S      TGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT        55  78.2
本发明的应用方法如下：
1.试剂准备
芯片洗液：
根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液I和II。
1)洗液I：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2％。以配制总量500ml为例，量取440ml蒸馏水倒入1000ml试剂瓶中，加入50ml20×SSC，混匀。再加入10ml 10％SDS，混匀，室温存贮。或根据需求按比例配制。
2)洗液II：SSC终浓度为0.2×。以配制总量500ml为例，量取495ml蒸馏水倒入1000ml试剂瓶中，加入5ml20×SSC，混匀，室温存贮。或根据需求按比例配制。
2.PCR扩增玉米基因组DNA
2.1 配制PCR反应体系
在PCR配液区内，在冰上融化PCR Mix及基因组DNA，按表2体系配制反应液。本发明之PCR扩增试剂(MIX)为混合试剂，有以下主要成分：①Taq酶(DNA聚合酶，0.5μl)，②PCR缓冲液(10×PCR Buffer，5μl)，③脱氧核苷酸混合液(dNTP MIX(10μM each，1μl)，④扩增引物混合液：CaMV-P(R and F：10μM，Each 0.5μl)，Cry9C(R and F：10μM，Each 0.5μl)，neo(R and F：10μM，Each 0.5μl)，pat(R and F：10μM，Each 0.5μl)，nos-T(R and F：10μM，Each 0.5μl)，gox(R and F：10μM，Each 0.5μl)，IVR(R and F：10μM，Each 0.5μl)，，CryIAb(R and F：10μM，Each 0.5μl)，CryIAc(R and F：10μM，Each0.5μl)，18S(R and F：10μM，Each 0.5μl)，hpt(R and F：10μM，Each0.5μl)，bar(R and F：10μM，Each 0.5μl)，EPSPS(R and F：10μM，Each 0.5μl)⑤去核酸水(ddH2O，28.5μl)。
表2：转基因检测PCR反应体系
Figure GSA00000066258400151
2.2 PCR扩增
将配制好的反应液置于PCR扩增仪中，按照如下PCR反应循环程序进行PCR反应。
94℃ 5min
72℃ 5min
4℃  ∞
本例所采用的带有荧光标记的PCR扩增引物，如表3所示。
3.杂交及结果判读
3.1 杂交及洗片
将杂交液在42℃溶化，按下面体系配制杂交液，杂交Buffer95℃变性3分钟，冰浴3分钟，备用。
Figure GSA00000066258400153
打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约80μl灭菌水。将芯片正面朝上(围栏面朝上，标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15μl变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入42℃恒温水浴中，静置，杂交2小时或过夜均可。
杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液I中，42℃震荡清洗4分钟，再用42℃预热好的洗液II，42℃震荡清洗4分钟(冬季洗液II可清洗两次，每次2分钟)，最后用42℃预热好清水清洗一次，清洗后的芯片1500rpm离心1分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。
3.2 芯片扫描及结果判读
洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪进行扫描，通过配套软件自动对扫描结果进行判读分析，给出检测结果，可对结果进行存储、打印和查询。本例上述时间、温度、配方等工艺条件可在适当范围内调整，不仅限于所述实施例。
表4为基因芯片点阵排布情况，图2-图17为用图1所示的基因芯片对各种转基因玉米进行实际的检测结果，理论杂交图与实际杂交图的对比情况。表5为表4和图1中各探针的名称与含义解释。
本发明所述转基因玉米检测芯片，可与各种结构的芯片围栏、半封闭式围栏，折叠式杂交盒、转基因生物芯片检测试剂盒等配套使用。
表3带有荧光标记的PCR扩增引物
靶基因名称        引物序列(5’-3’)              Tm值
            Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG             66
CaMV-P
            TAGCTCATTGTCGTTGGACG                 60
            Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA            64
Nos-T
            CCCAAAGTTCAACTACGAGC                 60
            Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTAC             62
Bar
            GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC                 62
            Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT             60
Neo
            AATATCACGGGTAGCCAACG                 60
            Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTAT             62
Hpt
            GATGTTGGCGACCTCGTATT                 60
            Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAG             64
Pat
            AGGCCAATAACAGCAACCAC                 60
            Cy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCG             60
EPSPS
            CCTTCGTATCGGAGAGTTCG                 62
            Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCT             62
CryIAb
            AACTCAGTGCCATCCAGGAC                 62
            Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTT             60
CryIAC
            TTCTGCGCTCTTTCCAGATT                 58
            Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACT             62
Cry9C
            GTCCATGAAGTTGCTGCTCA                 60
            Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTA             58
Gox
            GCACGTTTCCAGTTAGGAGC                 62
            Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG             64
IVR
            TAGCTCATTGTCGTTGGACG                 60
            Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA            64
18S
            CCCAAAGTTCAACTACGAGC                 60
表4基因芯片点阵排布情况
  HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX
  PC   PC   PC   PC   PC   NC   NC   NC   NC   NC
  bar   bar   bar   bar   bar   CaMV-P   CaMV-P   CaMV-P   CaMV-P   CaMV-P
  Cry9C   Cry9C   Cry9C   Cry9C   Cry9C   CryIAb   CryIAb   CryIAb   CryIAb   CryIAb
  CryIAc   CryIAc   CryIAc   CryIAc   CryIAc   CryIAc   CryIAc   CryIAc   CryIAc   CryIAc
  EPSPS   EPSPS   EPSPS   EPSPS   EPSPS   gox   gox   gox   gox   gox
  hpt   hpt   hpt   hpt   hpt   IVR   IVR   IVR   IVR   IVR
  neo   neo   neo   neo   neo   pat   pat   pat   pat   pat
  Nos-T   Nos-T   Nos-T   Nos-T   Nos-T   18S   18S   18S   18S   18S
  HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX   HEX
表5为表4和图1中各探针的名称与含义
  探针名称   探针含义
  HEX   芯片固定阳性对照
  PC   芯片杂交阳性对照
  NC   芯片杂交阴性对照
  bar   草丁磷乙酰转移酶
  CaMV-P   花椰菜花叶病毒基因组的35S启动子
  Cry9C   苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白cry9C基因
  CryIAb   苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白CryIAb基因
  CryIAc   苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白CryIAc基因
  EPSPS   5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因
  gox   草甘膦氧化还原酶基因
  hpt   潮霉素磷酸转移酶
  IVR   玉米的转化酶1基因
  neo   大肠杆菌新霉素-3’-磷酸转移酶基因
  pat   链霉菌草丁磷乙酰转移酶
  Nos-T   Ti胭脂碱合成酶基因终止子
  18S   真核生物18S核糖体RNA基因

Claims (2)

1.一种转基因玉米检测芯片，其特征在于，针对CaMV-P、Nos-T等13个待检靶基因检测玉米产品是否拥有相关基因，设计55-59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相同：
异源                                                                  长  Tm
                              探针
插入基因                                                              度  值
CaMV-P    ATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA 59  74.5
Nos-T     TTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG     55  70.7
Bar       TTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG 59  82.1
Neo       ATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC 59  78.7
Hpt       AAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT 59  78.7
Pat       AATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA 59  74.5
EPSPS     AATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG 59  81.4
CryIAb    ATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG 59  82.1
CryIAc    AGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT 59  74.5
Cry9C     AGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG 59  81.4
Gox       TTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC 59  77.3
玉米                                                                  长  Tm
                           探针
内源基因                                                              度  值
IVR       TAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG 59  79.4
18S       TGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT     55  78.2
2.根据权利要求1所述的转基因玉米检测芯片，其特征在于根据所述待检靶基因设计有相应的带有荧光标记的PCR扩增引物，分别为：
靶基因名称     引物序列(5’-3’)                       Tm值
               Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG                66
CaMV-P
               TAGCTCATTGTCGTTGGACG                    60
               Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA               64
Nos-T
               CCCAAAGTTCAACTACGAGC                    60
               Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTAC                62
Bar
               GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC                    62
Neo            Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT                60
               AATATCACGGGTAGCCAACG                    60
               Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTAT                62
Hpt
               GATGTTGGCGACCTCGTATT                    60
               Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAG                64
Pat
               AGGCCAATAACAGCAACCAC                    60
               Cy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCG                60
EPSPS
               CCTTCGTATCGGAGAGTTCG                    62
               Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCT                62
CryIAb
               AACTCAGTGCCATCCAGGAC                    62
               Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTT                60
CryIAc
               TTCTGCGCTCTTTCCAGATT                    58
               Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACT                62
Cry9C
               GTCCATGAAGTTGCTGCTCA                    60
               Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTA                58
Gox
               GCACGTTTCCAGTTAGGAGC                    62
               Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG                64
IVR
               TAGCTCATTGTCGTTGGACG                    60
               Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA               64
18S
               CCCAAAGTTCAACTACGAGC                    60
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