CN105132546A - 一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法 - Google Patents

一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法，包括以下步骤：(1)苗期采用除草剂首次筛选；(2)喇叭口期采用叶片Bar试纸条快速检测；(3)抽雄吐丝期采用除草剂二次筛选后，进行基因组的PCR检测。本发明首次为养分高效利用转基因玉米材料鉴定提供了一套具有简便、灵活、快速、准确、经济实用、适合于全生育期检测等特点的检测体系，检测者可以根据鉴定需要灵活选择某一时期或某一种方法或整套体系进行养分高效利用转基因玉米材料鉴定。

Description

一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种转基因植物材料快速鉴定的方法，具体涉及一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法。
背景技术
随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用生物基因工程技术将能够提高玉米氮、磷肥利用效率的基因导入玉米，改良玉米自身性状已成为可能。当前，转基因玉米已经在全世界范围内广泛种植，全球种植的转基因作物面积和比例连年增加，同时随着转基因技术的快速发展，国外转基因作物大量进入我国。因此，转基因植物的检测技术成为转基因产品安全性评价的重要技术平台，如何快速有效地鉴定转基因植物、种子等，在转基因植物研制开发或对转基因产品进行筛选或安全性评价时，对于科研单位、商检、海关和农业执法部门等具有重要的实用价值。
目前，转基因植物的检测技术主要有除草剂鉴定、试纸条鉴定以及PCR鉴定技术。其中，在植物转基因研究过程中，通常采用选择性标记基因提高转化筛选效率，而草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene，bar)是玉米转基因研究中常用的筛选标记基因，草铵膦可以强烈抑制植株内的谷氨酰胺合成酶的活性，导致细胞内氨的迅速积累，随叶绿体结构解体，最后整个植株中毒死亡。因此，利用筛选标记基因的农艺性状，建立快速有效的非生物鉴定方法非常必要。待玉米生长至5～6叶期时喷洒草铵膦，8～10d之后，野生型玉米叶片逐渐变黄枯萎，有明显中毒症状，当草铵膦浓度大于2000mg/L时，野生型植株叶片褐化直至全部死亡，而含有Bar基因的玉米叶片没有黄化症状，生长正常，表现出对草铵膦的良好抗性，使用该浓度的草铵膦溶液喷洒玉米叶片，即可准确、有效地鉴定转基因与非转基因玉米植株。因此，该方法可用于鉴定含抗除草剂标记基因Bar基因的养分高效利用转基因玉米植株。然而喷洒草铵膦除草剂，筛选养分高效利用的转基因玉米材料的缺点主要是假阳性高、反应速度慢等；若草铵膦没有完全喷洒玉米植株，玉米植株会在受伤后继续恢复生长，造成假阳性；同时，喷洒除草剂后通常要一周左右才能看到植株反应效果，鉴选时间较长不利于及时获知结果。
在试纸条鉴定中，草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricinacetyltransferasegene，bar)为抗除草剂基因，编码蛋白一膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。该基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记基因。养分高效利用转基因玉米使用Bar基因作为标记基因，它使玉米抵抗以L-phosphiothricin(PPT)为活性成分的草铵膦除草剂，通过Bar试纸条分子检测法能够快速鉴定转基因材料中的Bar蛋白，检测时取Bar试纸条将标有箭头和“max”端置于玉米叶片研磨上清液中1～2cm左右，一般等待3～5min，试纸条上端出现质控线，最长反应时间为20min，表示混合液中含有来自于样品的蛋白，试验结果有效。如果样品含有Bar蛋白，则在质控线下方出现测试线；若不出现测试线，则表示样品中不含有Bar蛋白，该鉴定方法为快速有效的筛选大量转基因材料节约大量时间。然而Bar试纸条检测结果呈阳性，也还只是处于“海选”阶段，需要进一步将初步筛选出的阳性材料进行PCR定性筛选检测，才能最终确定是否真正含有转基因物质；同时Bar试纸条检测成本较贵，约为25元/样品。
在转基因玉米研究和培育时，阳性植株的筛选、插入序列分析、安全检测一般都离不开分子检测，最常用的分子检测手段是PCR(聚合酶链反应)检测。PCR检测的基础是提取满足检测需要的基因组DNA，然后以提取的待检测转基因玉米材料基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增后通过电泳系统分辨目的基因条带，有目的片段出现的样品即为转基因阳性植株，反之为阴性非转基因植株。然而PCR定性筛选检测，检测费用为每次1000元左右；在研究或者筛选群体较大(如转基因植株的大批量筛选、遗传规律分析等)时，提取基因组DNA就会成为一项繁重的工作，并成为检测和筛选速度的一个重要制约因素。因此，PCR鉴定成本较高、方法步骤繁琐，做大量鉴定，运用时有一定的局限性。
综上，现有养分高效利用转基因植物鉴定方法鉴定手段单一，要么是苗期喷施除草剂筛选鉴定，要么是简单的进行Bar试纸条检测，要么是全材料提取基因组DNA进行PCR验证，方法上太过局限和不灵活。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有简便、快速、准确、灵敏度和特异性高、经济实用、适合于全生育期检测等特点的养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)除草剂首次筛选：将种植的养分高效利用转基因玉米材料(优选转phyAO、AMT1-1、DvASN、DvGS2、GPPAT基因玉米材料)在苗期玉米5～6叶一心，喷施浓度为1200～1300mg/L(优选浓度为1250mg/L)草铵膦除草剂6～8d后筛选，玉米植株枯萎褐化直至死亡为阴性材料即非转基因植株，余下正常生长植株初步鉴定为养分高效利用转基因玉米植株；
(2)叶片Bar试纸条快速检测：将苗期筛选正常生长的转基因玉米植株叶片在喇叭口期玉米植株9～10叶一心时，进行Bar试纸条检测，仅出现控制线的试纸条检测结果为阴性，即为非转基因植株；同时出现控制线和测试线的试纸条检测结果为阳性，即为养分高效利用转基因玉米植株：
(3)除草剂二次筛选和基因组的PCR检测：将喇叭口期筛选出的转基因玉米植株待玉米植株生长到抽雄吐丝期，再次喷施浓度为1200～1300mg/L(优选浓度为1250mg/L)草铵膦除草剂6～8d筛选，玉米植株枯萎发黄直至死亡为阴性材料即非转基因植株，余下正常生长植株鉴定为养分高效利用转基因玉米植株；同时取样除草剂二次筛选后的转基因玉米叶片用于提取基因组DNA，待药效明显后再对正常生长的玉米材料提取基因组DNA进行PCR检测。
进一步，步骤(2)中，所述Bar试纸条检测是用1.5ml离心管取管盖大小叶片，加入0.5ml提取液反复研磨至匀浆，箭头端向下插入Bar试纸条，待试纸条浸入研磨液10～15min后观察结果。
进一步，步骤(3)，所述PCR引物为
phyAO正向CAGTCCCCGCCTCGAGAAAT
phyAO反向TGCCGTTGTACAGACCCAAA
AMT1-1正向TGGTCCGCTACAAGAACG
AMT1-1反向GCTCAGGTAAGCAATGAAAGT
DvASN正向CACCACGAGTTCACCTTCACAG
DvASN反向CATCAATCCAGTTGTAGCCCAC
DvGS2正向CACCCAAGCAACACTCGT
DvGS2反向CACAGGCAGAGGGATACG
PPATBamHfwCGCGGATCCGCGATGGCAGCTCCGGAAGATTC
PPATSmaIrevTCCCCCGGGGGAGAGAGTTTATATATGATGAGTT。
本发明首次为养分高效利用转基因玉米材料鉴定提供了一套具有简便、灵活、快速、准确、经济实用、适合于全生育期检测等特点的检测体系，检测者可以根据鉴定需要灵活选择某一时期或某一种方法或整套体系进行养分高效利用转基因玉米材料鉴定。实验证明，本发明提供的转养分高效利用基因phyAO、AMT1-1、DvASN、DvGS2、GPPAT玉米检测体系，通过苗期和抽雄吐丝期大田除草剂筛选、喇叭口期Bar试纸条快速检测及抽雄吐丝期基因组DNA的PCR检测，逐步筛选排查非转基因植株，缩小后期精准鉴定范围，大大降低了工作量和成本。
附图说明
图1为AMT-I基因扩增程序。
图2为PPAT基因扩增程序。
图3为ASN基因扩增程序。
图4为GS2基因扩增程序。
图5为phyAO基因扩增程序。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1
(1)除草剂首次筛选：将种植的养分高效利用转基因玉米材料在苗期玉米5～6叶一心，采用背负式喷雾器人工喷施，喷施浓度为1250mg/L草铵膦除草剂(永农生物科学有限公司生产)6～8d后筛选，玉米植株枯萎褐化直至死亡为阴性材料即非转基因植株，余下正常生长植株初步鉴定为养分高效利用转基因玉米植株；
(2)叶片Bar试纸条快速检测：将苗期筛选正常生长的转基因玉米植株叶片在喇叭口期玉米植株9～10叶一心时，进行Bar试纸条检测(检测试剂盒为QuickStixKitforLibertyLink(bar)，EnviroLogixInc.生产)，用1.5ml离心管取管盖大小叶片，加入0.5ml提取液反复研磨至匀浆。箭头端向下插入Bar试纸条，待试纸条浸入研磨液10～15min后观察结果，仅出现控制线(ControlLine)的试纸条检测结果为阴性，即为非转基因植株；同时出现控制线和测试线(TestLine)的试纸条检测结果为阳性，即为养分高效利用转基因玉米植株：
(3)除草剂二次筛选和基因组的PCR检测：将喇叭口期筛选出的转基因玉米植株待玉米植株生长到抽雄吐丝期，采用背负式喷雾器人工再次喷施，喷施浓度为1250mg/L草铵膦除草剂6～8d筛选，玉米植株枯萎发黄直至死亡为阴性材料即非转基因植株，余下正常生长植株鉴定为养分高效利用转基因玉米植株；同时取样除草剂二次筛选后的转基因玉米叶片用于提取基因组DNA，待药效明显后再对正常生长的玉米材料提取基因组DNA进行PCR检测，其中，DNA提取步骤：
①将装有待检测叶片材料的2mL离心管置于液氮中充分冷冻，在保持冷冻的状态下在离心管内加入Φ3的钢珠，之后置于研磨机中以频率25研磨1分30秒。
②每个离心管内加入1mL65℃预热的DNA提取混合液(DNA提取溶液I：Sorbitol0.35M，Tris-HCl(pH8.0)0.1M，EDTA(pH8.0)5mM；DNA提取溶液II：Tris-HCl(pH8.0)0.2M，EDTA(pH8.0)0.05M，CTAB2％；DNA提取溶液III：5％N-lauroylsarcosine)。使用时将3种溶液按5∶5∶2比例混合，现用现配)，混匀后65℃水浴1h。
③水浴后将离心管取出，待冷却到室温后加入等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，颠倒混匀10min。如需要提高DNA的纯度，重复步骤③1到2次。
④12000rpm离心10min，吸上清(约800μL)到新1.5mL离心管内，加入700μL4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀3分钟后置于-20℃冷冻20-30分钟。
⑤12000rpm离心10min，弃上清。
⑥加入1mL70％乙醇清洗沉淀，置于4℃冰箱内30min。
⑦8000rpm离心10min，弃去上清，待沉淀晾干后加入100μLTE溶解沉淀。
⑧将每个离心管内加入1μLRNA酶，37℃孵育30min(RNA酶加入量1μL酶/100μLDNA溶液)
⑨以NANO测DNA浓度，并将DNA稀释为50ng/μL备用。
引物名称及序列：
phyAO正向CAGTCCCCGCCTCGAGAAAT
phyAO反向TGCCGTTGTACAGACCCAAA
AMT1-1正向TGGTCCGCTACAAGAACG
AMT1-1反向GCTCAGGTAAGCAATGAAAGT
DvASN正向CACCACGAGTTCACCTTCACAG
DvASN反向CATCAATCCAGTTGTAGCCCAC
DvGS2正向CACCCAAGCAACACTCGT
DvGS2反向CACAGGCAGAGGGATACG
PPATBamHfwCGCGGATCCGCGATGGCAGCTCCGGAAGATTC
PPATSmaIrevTCCCCCGGGGGAGAGAGTTTATATATGATGAGTT
PCR反应体系：
PCR反应程序
①AMT-I基因扩增程序，见图1
②PPAT基因扩增程序，见图2
③ASN基因扩增程序，见图3
④GS2基因扩增程序，见图4
⑤phyAO基因扩增程序，见图5
PCR产物电泳检测：电泳检测使用2％琼脂糖凝胶，100V电压电泳1小时左右即可。

Claims (4)

1.一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)除草剂首次筛选：将种植的养分高效利用转基因玉米材料在苗期玉米5～6叶一心，喷施浓度为1200～1300mg/L草铵膦除草剂6～8d后筛选，玉米植株枯萎褐化直至死亡为阴性材料即非转基因植株，余下正常生长植株初步鉴定为养分高效利用转基因玉米植株；
(2)叶片Bar试纸条快速检测：将苗期筛选正常生长的转基因玉米植株叶片在喇叭口期玉米植株9～10叶一心时，进行Bar试纸条检测10～15min,仅出现控制线的试纸条检测结果为阴性，即为非转基因植株；同时出现控制线和测试线的试纸条检测结果为阳性，即为养分高效利用转基因玉米植株：
(3)除草剂二次筛选和基因组的PCR检测：将喇叭口期筛选出的转基因玉米植株待玉米植株生长到抽雄吐丝期，再次喷施浓度为1200～1300mg/L草铵膦除草剂6～8d筛选，玉米植株枯萎发黄直至死亡为阴性材料即非转基因植株，余下正常生长植株鉴定为养分高效利用转基因玉米植株；同时取样除草剂二次筛选后的转基因玉米叶片用于提取基因组DNA，待药效明显后再对正常生长的玉米材料提取基因组DNA进行PCR检测。
2.根据权利要求1所述的养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述养分高效利用转基因玉米材料为转phyAO、AMT1-1、DvASN、DvGS2、GPPAT基因玉米材料；所述草铵膦除草剂的浓度为1250mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Bar试纸条检测是用1.5ml离心管取管盖大小叶片，加入0.5ml提取液反复研磨至匀浆，箭头端向下插入Bar试纸条，待试纸条浸入研磨液10～15min后观察结果。
4.根据权利要求1～3之一所述的养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述草铵膦除草剂的浓度为1250mg/L；所述PCR引物为
phyAO正向CAGTCCCCGCCTCGAGAAAT
phyAO反向TGCCGTTGTACAGACCCAAA
AMT1-1正向TGGTCCGCTACAAGAACG
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