CN109628632A - 一种用于转基因玉米mon87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法，属于转基因产品检测技术领域。本发明针对转基因玉米MON87419品系特异性序列设计得到引物组合MON87419‑F、MON87419‑R和TaqMan探针MON87419‑P，同时还建立了实时荧光聚合酶链式反应检测方法。利用该检测引物和检测探针及建立的实时荧光PCR体系，按照本发明的方法定量下限为30拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为104％，重复性实验显示本发明的方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强，可应用于转基因玉米MON87419的特异性检测。

Description

一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、 探针、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于转基因产品检测技术领域，具体涉及一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法。
背景技术
转基因玉米MON 87419为孟山都公司开发的耐麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸钠)和草铵膦(2-氨基-4-(羟基甲基磷酰)氨基丁酸)除草剂品系。MON 87419含嗜麦芽窄食单胞菌的demethylase gene去甲基化酶基因，表达麦草畏单加氧酶基因(DMO)蛋白，具有抗麦草畏除草剂能力；含产绿色链霉菌N-乙酰基转移酶(PAT)基因，表达草丁膦乙酰基转移酶(PAT)蛋白，具有抗草铵膦除草剂能力。2016年上市，目前获得批准的国家有澳大利(食品)、新西兰(食品)、加拿大(食品和饲料及种植)、日本(食品)、韩国(食品)和美国(食品、饲料及种植)6个国家。
MON 87419由农杆菌介导含2个T-DNA的质粒PV-ZMHT507801入玉米基因组研发而成。T-DNA I含dmo基因表达盒和pat基因表达盒，T-DNA II含cp4epsps表达盒用于筛选。两个T-DNA均插入玉米基因组中，随后进行传统的育种、分离、筛选含有dmo基因表达盒和pat基因表达盒而无cp4epsps表达盒的植株作为MON87419品系。
目前对转基因产品，多数国家均采用相应的标识管理制度，品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event-specific PCR)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(Screening PCR)、基因特异性PCR(Gene-specific PCR)、构建特异性PCR(Construct-specific PCR)具有更加高的具有高特异性，能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。
为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因不同品系标识检测鉴定的方法，建立转基因玉米MON87419品系特异性定量PCR精准检测方法十分必要。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法。
本发明提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合，所述引物组合包括上游引物MON87419-F和下游引物MON87419-R；
所述上游引物MON87419-F的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
所述下游引物MON87419-R的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
本发明提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的探针，所述探针为探针MON87419-P；
所述探针MON87419-P的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
本发明提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合。
优选的，所述试剂盒还包括上述探针。
优选的，所述试剂盒还包括Premix Ex TaqTM，ROX Reference DyeⅡ和双蒸水。
本发明提供了一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取样品DNA，得到扩增模板；
(2)将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、Premix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系；
(3)用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到扩增曲线；根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系。
优选的，所述步骤(2)扩增反应体系为25μL体系：Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROXReference DyeⅡ0.2μL，10μmol/L上游引物MON87419-F 0.4μL，10μmol/L下游引物MON87419-R 0.4μL，10μmol/L探针MON87419-P 0.8μL，DNA模板2μL和双蒸水8.7μL。
优选的，所述步骤(3)实时荧光PCR反应的反应程序为：95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环；于58℃收集荧光信号。
优选的，所述步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系的标准为：40个循环内，如果有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因玉米MON87419品系；40个循环内，如果无典型荧光扩增曲线，则说明样品非转基因玉米MON87419品系。
本发明还提供了一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，包括以下步骤：
①提取转基因玉米MON87419的DNA，梯度稀释，得到不同起始浓度的扩增模板；
②将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、Premix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系；用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到不同起始浓度扩增模板对应的Ct值。
③所述Ct值与起始浓度的对数呈线性关系，根据步骤②得到的数据，构建转基因玉米MON87419品系的标准曲线公式；
④提取待测样品的DNA为扩增模板，按步骤②所述方法进行反应，得到待测样品Ct值，将所述待测样品Ct值代入步骤③所述标准曲线公式，计算得到待检样品中转基因玉米MON87419品系的含量。
有益效果：本发明针对转基因玉米MON87419品系特异性序列设计得到引物组合MON87419-F、MON87419-R和TaqMan探针MON87419-P，建立了转基因玉米MON87419实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法。利用该检测引物和检测探针及建立的实时荧光PCR体系，按照本发明的方法定量下限为30拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为104％，重复性实验显示本发明的方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强。
本发明提供的引物组合、探针、试剂盒及方法打破了国外其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；有助于弥补和完善我国转基因产品定量检测技术体系。本发明提供的技术用于转基因产品的检测，可更好的保护消费者的知情权和选择权，满足国家监管部门对转基因产品的鉴定和标识需求。
附图说明
图1为体系退火温度为58℃时扩增图，从左到右依次代表引物探针配比A(MON87419-F/R/P：0.5μL/0.5μL/1μL)、B(MON87419-F/R/P：0.4μL/0.4μL/0.8μL)和C(MON87419-F/R/P：0.2μL/0.2μL/4μL)；
图2为体系退火温度为60℃时扩增图，从左到右依次代表引物探针配比A(MON87419-F/R/P：0.5μL/0.5μL/1μL)、B(MON87419-F/R/P：0.4μL/0.4μL/0.8μL)和C(MON87419-F/R/P：0.2μL/0.2μL/4μL)；
图3为转基因玉米MON87419品系特异性检测方法特异性实验结果，阳性扩增曲线为MON87419质粒；阴性信号分别为：转基因油菜MON88302、转基因油菜DP-073496-4、转基因棉花MON88913、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS40-30-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、转基因甜菜H7-1、非转基因玉米、阴性对照和空白对照；
图4为MON87419灵敏度试验扩增图：阳性信号从左到右1-9分别为：300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30和15copies/μL质粒DNA，阴性信号为阴性对照和空白对照；
图5是实时荧光PCR检测MON87419品系的标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合。在本发明中，所述引物组合针对转基因玉米MON87419品系的特异性序列(SEQ ID No.5)设计得到。所述引物组合包括上游引物MON87419-F和下游引物MON87419-R；所述上游引物MON87419-F的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述下游引物MON87419-R的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。本发明所述引物组合以转基因玉米MON87419品系基因组为模板，进行PCR扩增，特异性良好。
本发明提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的探针，所述探针为探针MON87419-P；所述探针MON87419-P的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。在本发明中，所述探针的核苷酸序列5’端优选标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团优选为FAM；所述探针的核苷酸序列3’端优选标记有荧光猝灭基团，所述荧光猝灭基团优选为BHQ1。本发明所述探针能与上述引物组合的扩增产物特异性结合，实现对扩增产物的检测。
本发明提供了一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合，优选还包括上所述的探针，更优选还包括Premix Ex TaqTM，ROXReference DyeⅡ和双蒸水。本发明对上述各组分的来源不作特别限定，本领域常规获取方法比如交由基因公司合成基因序列，或者从市场采购等方法均可。在本发明中，所述试剂盒以引物组合为基础，能实现对转基因玉米MON87419品系的特异性检测。
本发明提供了一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
(1)提取样品DNA，得到扩增模板；
(2)将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、Premix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系；
(3)用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到扩增曲线；根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系。
本发明先提取样品DNA，得到扩增模板。在本发明中，所述样品为待测样品。本发明对具体的DNA提取方法不作特别限定，本领域常规方法均可。
得到扩增模板后，本发明将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、Premix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系。在本发明中，所述扩增反应体系优选为25μL体系：Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference DyeⅡ0.2μL，10μmol/L上游引物MON87419-F 0.4μL，10μmol/L下游引物MON87419-R0.4μL，10μmol/L探针MON87419-P 0.8μL，DNA模板2μL和双蒸水8.7μL。
本发明用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到扩增曲线。然后根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系。在本发明中，所述PCR反应的反应程序优选为：95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环；于58℃收集荧光信号。所述根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系的优选标准为：40个循环内，如果有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因玉米MON87419品系；40个循环内，如果无典型荧光扩增曲线，则说明样品非转基因玉米MON87419品系。
本发明还提供了一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，包括以下步骤：
①提取转基因玉米MON87419的DNA，梯度稀释，得到不同起始浓度的扩增模板；
②将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、Premix Ex TaqTM、ROX Reference DyeⅡ和双蒸水配制成扩增反应体系；用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到不同起始浓度扩增模板对应的Ct值。
③所述Ct值与起始浓度的对数呈线性关系，根据步骤②得到的数据，构建转基因玉米MON87419品系的标准曲线公式；
④提取待测样品的DNA为扩增模板，按步骤②所述方法进行反应，得到待测样品Ct值，将所述待测样品Ct值代入步骤③所述标准曲线公式，计算得到待检样品中转基因玉米MON87419品系的含量。
在本发明中，步骤①所述转基因玉米MON87419的DNA可以是转基因玉米MON87419的基因组DNA，也可以是人工合成的含有HMG基因和MON87419品系特异性片段的阳性质粒DNA。
在本发明中，步骤③所述标准曲线公式优选为：y＝-3.23x+39.35，R2:0.99。本领域技术人员可直接按照步骤④所述方法得到待测样品Ct值，然后代如上述标准曲线公式中，计算得到待检样品中转基因玉米MON87419品系的含量。本领域技术人员亦可以根据本发明所述步骤①、②和③的方法，自行实验获得数据，构建得到新的标准曲线公式。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明各项实施例所用到的材料、试剂及仪器设备具体如下：
主要材料：转基因油菜MON88302、转基因油菜DP-073496-4、转基因棉花MON88913、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS40-30-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、转基因甜菜H7-1、非转基因玉米和玉米内源基因。其中，非转基因玉米为本实验室购置及保存；玉米内源基因选用玉米高速泳动蛋白基因(highmobility group proteins,HMG,玉米中国单拷贝，GenBank:AJ131373.1)和转基因玉米MON87419品系特异性双基因阳性质粒(将内源基因HMG基因片段150bp序列和MON87419品系特异性片段240bp序列构建到AmpR抗性的PUC57载体上，构建得到的质粒转入受体菌DH5a后-70℃保存，以下称HMG-MON87419质粒)，均为本实验室构建得到。
HMG基因片段序列为：cctgagcgag tcggtaagct ccatcttctg tactaaagtagtagttgatt ggactagaaa tctcgtgctg attaattgtt ttacgcgtgc gtttgtgtgg attgtaggacaaggctccct atgtagccaa ggctaacaag ctcaagctcg(SEQ ID No.4)。
MON87419品系特异性片段序列：ataaagattt ccgaattaga ataatttgtttattgctttc gcctataaat acgacggatc gtaatttgtc gttttatcaa aatgtacttt cattttataataacgctgcg gacatctaca tttttgaatt gaaaaaaaat tggtaattac tctttctttt tctccatagcattcgcaata cagttagatg cgagtgaagc acgataagtc acaaccataatacatactat tagaatccgg(SEQ ID No.5)。
引物和探针HMG-F/R/P用于检测玉米样品基因组DNA是否成功提取以及是否适于进行实时荧光PCR扩增；其序列信息详见表1。
主要试剂：Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大连宝生物；DNA提取试剂盒，北京天根公司；引物和探针由闪晶生物公司合成，稀释为终浓度为10uM的工作液使用。
主要仪器与设备：
ABI7500，ABI7500FAST实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；QX 200微滴式数字PCR系统，美国伯乐公司；nanodrop2000c微量分光光度计，美国Thermo公司；研磨机，德国IKA。
农作物材料样品基因组DNA采用常规方法提取与纯化。
实施例1
实时荧光PCR检测方法的建立与优化
根据MON87419品系转入的基因盒3’端与玉米基因组邻接区序列(品系特异性片段)，应用Primer Primer 5.0软件设计引物和探针。将设计的引物、探针经NCBI网站上使用BLAST数据库比对确定引物和探针的理论特异性；玉米内源基因HMG用于玉米来源样品DNA的检测及转基因成分的相对定量。具体引物探针信息见表1：
表1实时荧光PCR的引物、探针
扩增反应25μL体系为：Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/LMON87419-F和MON87419-R各0.4μL，10μmol/L探针MON87419-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.7μL。
反应程序为：95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环；于58℃收集荧光信号。
在扩增体系的退火温度为58℃时，不同引物探针配比A(MON87419-F/R/P：0.5μL/0.5μL/1μL)、B(MON87419-F/R/P：0.4μL/0.4μL/0.8μL)和C(MON87419-F/R/P：0.2μL/0.2μL/4μL)的扩增结果见图1。图1中，从左到右依次代表A、B和C。其中，A和B组Ct值接近，基于经济性考虑，选择B组为本实验的引物探针配比。
在扩增体系的退火温度为60℃时，不同引物探针配比A(MON87419-F/R/P：0.5μL/0.5μL/1μL)、B(MON87419-F/R/P：0.4μL/0.4μL/0.8μL)和C(MON87419-F/R/P：0.2μL/0.2μL/4μL)的扩增结果见图2。图2中，从左到右依次代表A、B和C。其中，B和C组Ct值接近，但三组Ct值均比退火温度为58℃时高。
综合以上考虑，基于经济性和扩增效率考虑，选择58℃作为退火温度、B组(MON87419-F/R/P：0.4μL/0.4μL/0.8μL)为本实验的引物探针配比。
实施例2
实时荧光PCR方法特异性测试
提取转基因油菜MON88302、转基因油菜DP-073496-4、转基因棉花MON88913、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、转基因甜菜H7-1、非转基因玉米的DNA为模板，阳性对照为HMG-MON87419质粒，阴性对照为非转基因大米DNA。以实时例1中确定的反应体系和条件对建立的实时荧光PCR检测方法的特异性进行测试。实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。
扩增结果见图3。图3结果表明：采用MON87419品系特异性MON87419-F/R/P引物和探针进行实时荧光PCR时，只有阳性样品HMG-MON87419的DNA模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料DNA为模板的反应均无典型荧光扩增曲线。表明本发明的检测方法特异性良好。
实施例3
灵敏度测试、可重复性测试及标准曲线建立
将提取的HMG-MON87419DNA溶液加TE缓冲液稀释至300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30和15copies/μL，进行转基因玉米MON87419实时荧光PCR检测。以实时例1中确定的反应体系和条件，对建立的实时荧光PCR检测方法的灵敏度进行测试。实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。
扩增结果见图4。图4中，从左到右依次代表300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30和15copies/μL扩增曲线。图4结果表明：300000～15copies/μL范围内均能有典型扩增曲线，其最低检测浓度为15copies/μL。
将提取的HMG-MON87419质粒DNA溶液加TE缓冲液稀释至300000、30000、15000、3000、1500、300、150、30和15copies/μL，进行转基因玉米MON87419品系实时荧光PCR检测。以实时例1中确定的反应体系和条件对建立的实时荧光PCR检测方法的线性范围及可重复性进行测试，每个样品进行3次重复实验，水为空白对照，实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。测试结果的Ct值如表2所示：
表2实时荧光PCR方法的灵敏度及可重复性测试
根据表2中Ct值数据与在30～600000copies范围内浓度的对数值建立标准曲线(图5)，线性回归方程为：y＝-3.23x+39.35，R2:0.99，扩增效率为104％(介于90％～110％)。表明本发明的MON87419检测方法在模板量30～600000copies范围内线性相关性良好，扩增效率高，符合ENGL相关要求[Definition ofMinimum Performance RequirementsforAnalytical Methods of GMO Testing]；且在模板量为30～600000copies的线性范围内，其Ct值的SD介于0.02-0.61，RSD(％)介于0.05％-1.64，表明在线性范围内最低模板量30copies时，其SD和RSD均小于25％，所以本发明的定量限为30copies。
本发明针对转基因玉米MON87419品系转入的基因盒3’端与玉米基因组邻接区序列建立的转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR方法，可对转基因玉米MON87419进行品系特异性快速、高通量的定性及精准定量检测，满足检测、监管部门对其进行标识的需求。
序列表
<110> 黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心
<120> 一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcgcctat aaatacgacg g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtgcttcac tcgcatctaa c 21
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgctgcggac atctacattt ttgaattg 28
<210> 4
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgagcgag tcggtaagct ccatcttctg tactaaagta gtagttgatt ggactagaaa 60
tctcgtgctg attaattgtt ttacgcgtgc gtttgtgtgg attgtaggac aaggctccct 120
atgtagccaa ggctaacaag ctcaagctcg 150
<210> 5
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ataaagattt ccgaattaga ataatttgtt tattgctttc gcctataaat acgacggatc 60
gtaatttgtc gttttatcaa aatgtacttt cattttataa taacgctgcg gacatctaca 120
tttttgaatt gaaaaaaaat tggtaattac tctttctttt tctccatagc attcgcaata 180
cagttagatg cgagtgaagc acgataagtc acaaccataa tacatactat tagaatccgg 240
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttggactaga aatctcgtgc tga 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctacatagg gagccttgtc ct 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caatccacac aaacgcacgc gta 23

Claims (10)

1.一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括上游引物MON87419-F和下游引物MON87419-R；
所述上游引物MON87419-F的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
所述下游引物MON87419-R的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的探针，其特征在于，所述探针为探针MON87419-P；
所述探针MON87419-P的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
3.一种用于转基因玉米MON87419品系特异性检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括权利要求2或3所述的探针。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括Premix Ex TaqTM，ROX ReferenceDye Ⅱ和双蒸水。
6.一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样品DNA，得到扩增模板；
(2)将所述扩增模板、权利要求1所述的上游引物MON87419-F和下游引物MON87419-R、权利要求2所述的探针MON87419-P、Premix Ex TaqTM、ROX Reference Dye Ⅱ和双蒸水配制成扩增反应体系；
(3)用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到扩增曲线；根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)扩增反应体系为25μL体系：Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2μL，10μmol/L上游引物MON87419-F 0.4μL，10μmol/L下游引物MON87419-R 0.4μL，10μmol/L探针MON87419-P 0.8μL，DNA模板2μL和双蒸水8.7μL。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)实时荧光PCR反应的反应程序为：95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环；于58℃收集荧光信号。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因玉米MON87419品系的标准为：40个循环内，如果有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因玉米MON87419品系；40个循环内，如果无典型荧光扩增曲线，则说明样品非转基因玉米MON87419品系。
10.一种转基因玉米MON87419品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
①提取转基因玉米MON87419的DNA，梯度稀释，得到不同起始浓度的扩增模板；
②将所述扩增模板、上游引物MON87419-F、下游引物MON87419-R、探针MON87419-P、Premix Ex TaqTM、ROX Reference Dye Ⅱ和双蒸水配制成扩增反应体系；用所述扩增反应体系进行实时荧光PCR反应，得到不同起始浓度扩增模板对应的Ct值。
③所述Ct值与起始浓度的对数呈线性关系，根据步骤②得到的数据，构建转基因玉米MON87419品系的标准曲线公式；
④提取待测样品的DNA为扩增模板，按步骤②所述方法进行反应，得到待测样品Ct值，将所述待测样品Ct值代入步骤③所述标准曲线公式，计算得到待检样品中转基因玉米MON87419品系的含量。
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