CN107177687A - 转基因棉花mon88701品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 - Google Patents

转基因棉花mon88701品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒 Download PDF

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开了转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本发明针对转基因棉花MON88701品系转入的基因盒5’端与棉花基因组邻接区序列设计检测引物和探针，建立转基因棉花MON88701品系实时荧光PCR检测方法，具有特异性良好，灵敏度高，可重复性良好等优点，扩增效率为94％，最低定量检测下限为34copies。有效的解决了现有技术中无转基因棉花MON88701品系特异性定量检测技术的问题，该方法可应用于进出境口岸检验检疫、农产品监管中转基因棉花MON88701及其产品的检测。

Description

转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探 针、方法和试剂盒
技术领域：
本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光 PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。
背景技术：
转基因棉花MON88701是孟山都公司开发的耐受两种广谱除草剂麦草畏和草铵膦的转基因品系。MON88701经由农杆菌介导PV-GHHT6997质粒转入Coker 130棉花而成，其T-DNA 含有dmo(dicamba mono-oxygenase)基因盒和bar(phosphinothricin N-acetyltransferase，PAT) 基因盒，分别编码麦草畏单加氧酶和膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT)，它们在转基因植株内均为1个拷贝。
目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，品系特异性PCR(转化事件特异性)(Event-specific PCR)检测的目标序列是外源插入序列与植物基因组间连接区，相较于筛选PCR(Screening PCR)、基因特异性PCR(Gene-specific PCR)、构建特异性PCR (Construct-specific PCR)具有更加高的具有高特异性，能用于检测鉴定相同质粒转化的转基因具体品系，是目前转基因品系鉴定检测技术研究和实际检测工作中的重要方法。
为打破其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，完善和我国转基因产品定量检测技术体系，保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，为进出境口岸监管部门提供转基因不同品系标识检测鉴定的方法，建立转基因棉花MON88701品系特异性定量PCR精准检测方法十分必要。
发明内容：
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因棉花 MON88701品系的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
所述的荧光报告基团优选为FAM，所述的荧光淬灭基团优选为BHQ1。
本发明的第三个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；
所述的检测探针如下所示：
MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
本发明的第四个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因棉花MON88701品系。
优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L检测引物MON88701-F和MON88701-R各0.4μL，10 μmol/L检测探针MON88701-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.7μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环，于58℃收集荧光信号。
优选，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因棉花MON88701品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因棉花MON88701品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因棉花MON88701品系。
本发明的第五个目的是提供一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取转基因棉花MON88701品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应；
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数(lg) 呈线性关系，据此得到该线性范围内转基因棉花MON88701品系的标准曲线；
(3)提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因棉花MON88701品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因棉花MON88701品系基因组DNA的含量(拷贝数或质量)。
本发明具有以下优点及有益效果：
1.本发明打破国外其他国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；
2.本发明弥补和完善了我国转基因产品定量检测技术体系。提供的技术用于转基因产品的检测可更加好的保护消费者的知情权和选择权，满足国家监管部门对转基因产品的鉴定和标识需求。
3.本发明针对转基因棉花MON88701品系特异性序列设计引物和TaqMan探针，建立转基因棉花MON88701实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法。利用该检测引物和检测探针及建立的实时荧光PCR体系，按照本发明的方法定量检测下限为 34copies，建立的转基因棉花MON88701品系的标准曲线方程为：y＝-3.48x+39.91，R2为 0.99，扩增效率：94％(介于90％～110％)，表明本发明的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法在模板量34-680000copies重复性实验显示本发明的方法的标准偏差 (SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强。
附图说明：
图1是退火温度为58℃时扩增图。
图2是退火温度为60℃时扩增图。
图3是转基因棉花MON88701品系特异性检测方法特异性实验结果；1为Adhc -MON88701质粒；2～14分别为转基因油菜MON88302、转基因油菜DP-073496-4、转基因棉花MON88913、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、转基因甜菜H7-1、非转基因棉花、阴性对照和空白对照。
图4是转基因棉花MON88701品系特异性检测灵敏度试验扩增图；1～9依次分别为340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μL质粒DNA，10和11分别为阴性对照和空白对照。
图5是实时荧光PCR检测转基因棉花MON88701品系的标准曲线，LOG(copies)即为Log10(copies)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
主要材料：转基因油菜MON88302、转基因油菜DP-073496-4、转基因棉花MON88913、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、转基因甜菜H7-1和非转基因棉花为本实验室购置及保存，棉花内源基因棉花乙醇脱氢酶C基因(alcohol dehydrogenase C gene,AdhC,GenBank:AF036569.1)和转基因棉花MON88701品系特异性片段双基因阳性质粒(双基因阳性质粒为将内源基因AdhC基因片段140bp序列(如SEQ ID NO.4所示)和转基因棉花MON88701品系特异性片段211bp序列(如SEQ ID NO.5所示)的共351bp序列(如SEQ ID NO.6所示)克隆到AmpR抗性的PUC57载体上构建得到的重组质粒，将重组质粒转入受体菌DH5a后-70℃保存。以下称AdhC-MON88701质粒，含酶切位点Kpnl)为本实验室构建。
棉花内源基因选用棉花乙醇脱氢酶C基因(alcohol dehydrogenase C gene,AdhC，GenBank: AF036569.1)(参考文献：Mazzara M,Grazioli E.,Savini C,Van DenEede G.event-specific method for the quantification of cotton line LLcotton25using real-time PCR-Validation report and protocol-cotton seeds sampling andDNA extraction,DOI 10.2788/32755)引物AdhC-F/R和探针 AdhC-P用于检测棉花样品基因组DNA是否成功提取以及是否适于进行实时荧光PCR扩增；其序列信息详见表1。
主要试剂：Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大连宝生物；DNA提取试剂盒，北京天根公司；引物和探针由闪晶生物公司合成，稀释为终浓度为10μM的工作液使用。
主要仪器与设备：
ABI7500，ABI7500FAST实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；QX 200微滴式数字PCR系统，美国伯乐公司；nanodrop2000c微量分光光度计，美国Thermo公司；研磨机，德国IKA。
农作物材料样品基因组DNA采用常规方法提取与纯化。
实施例1：实时荧光PCR检测方法的建立与优化
根据转基因棉花MON88701品系转入的基因盒5’端与棉花基因组邻接区序列(转基因棉花MON88701品系特异性片段，如SEQ ID NO.5所示)，应用Primer Primer 5.0软件设计引物和探针。将设计的引物、探针经NCBI网站上使用BLAST数据库比对确定引物和探针的理论特异性；棉花内源基因AdhC用于棉花来源样品DNA的检测及转基因成分的相对定量。具体引物探针信息见表1。
表1实时荧光PCR的引物、探针
对退火温度及引物探针配比进行优化：
A组的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference DyeII 0.2 μL，10μmol/L检测引物MON88701-F和MON88701-R各0.5μL，10μmol/L检测探针MON88701-P 1μL，34000copies/μLDNA模板(转基因棉花MON88701品系基因组DNA)2 μL和ddH2O 8.3μL；
B组的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference DyeII 0.2 μL，10μmol/L检测引物MON88701-F和MON88701-R各0.4μL，10μmol/L检测探针MON88701-P 0.8μL，34000copies/μL DNA模板(转基因棉花MON88701品系基因组DNA) 2μL和ddH2O 8.7μL；
C组的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference DyeII 0.2 μL，10μmol/L检测引物MON88701-F和MON88701-R各0.2μL，10μmol/L检测探针MON88701-P 4μL，34000copies/μL DNA模板(转基因棉花MON88701品系基因组DNA)2 μL和ddH2O 5.9μL。
退火温度为58℃时的反应程序为95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环，于58℃收集荧光信号；
退火温度为60℃时的反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
结果显示：在退火温度为58℃时的扩增图如图1所示，图中从左到右分别为B、A和C组的扩增曲线，B组Ct值最小；
在退火温度为60℃时的扩增图如图2所示，图中从左到右分别为A、B和C组的扩增曲线，A组扩增效率稍高，B和C组Ct值接近，但三组的Ct值均较退火温度为58℃时Ct值高。
综合以上考虑，基于经济性和扩增效率，考虑选择58℃作为退火温度、B组引物探针配比为本实验的扩增反应体系。
实施例2：实时荧光PCR方法特异性测试
提取转基因油菜MON88302、转基因油菜DP-073496-4、转基因棉花MON88913、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因玉米MON810、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、转基因玉米NK603、转基因甜菜H7-1、非转基因棉花的基因组DNA为模板，阳性对照为Adhc-MON88701质粒，阴性对照为非转基因大米DNA。对建立的实时荧光 PCR检测方法的特异性进行测试。
扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II0.2μL， 10μmol/L检测引物MON88701-F和MON88701-R各0.4μL，10μmol/L检测探针MON88701-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.7μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、58℃ 34s，40个循环，于58℃收集荧光信号。
结果显示(图3)，采用转基因棉花MON88701品系特异性引物MON88701-F/R和探针MON88701-P进行实时荧光PCR时，只有阳性样品Adhc-MON88701质粒的DNA模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料DNA为模板的反应均无典型荧光扩增曲线。表明本发明的检测方法特异性良好。
实施例3：灵敏度测试、可重复性测试及标准曲线建立
将提取的Adhc-MON88701质粒DNA溶液加TE缓冲液分别稀释至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μL作为DNA模板进行转基因棉花MON88701 实时荧光PCR检测，实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例2，进行灵敏度测试：
测试结果显示(图4)，340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μL 范围内9个浓度梯度均能有典型扩增曲线，其最低检测浓度为17copies/μL。扩增图从左至右分别为TE缓冲液稀释至340000、34000、17000、3400、1700、340、170、34和17copies/μL扩增曲线。
将提取的Adhc-MON88701质粒DNA溶液加TE缓冲液分别稀释至340000、34000、17000、 3400、1700、340、170、34和17copies/μL作为DNA模板，进行转基因棉花MON88701品系实时荧光PCR检测，进行线性范围测试及可重复性测试，每个样品进行3次重复实验，水为空白对照，实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例2：
测试结果的Ct值如表2所示；根据表2中Ct值数据与在34-680000copies范围内9个浓度的对数值与所得Ct值建立标准曲线(图5)，线性回归方程为：y＝-3.48x+39.91，R2＝0.99，扩增效率：94％(介于90％～110％)，表明本发明的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法在模板量34-680000copies范围内线性相关性良好，扩增效率高，符合ENGL 相关要求[Definition of Minimum Performance Requirements for AnalyticalMethods of GMO Testing]；且在模板量为34-680000copies的线性范围内，其Ct值的SD介于0.22-0.62，RSD 介于0.78％-2.90％，表明在线性范围内最低模板量34copies时，其SD和RSD均小于25％，所以本发明的定量检测下限为34copies。
表2实时荧光PCR方法的灵敏度及可重复性测试
本发明针对转基因棉花MON88701品系转入的基因盒5’端与棉花基因组邻接区序列设计引物和探针，建立的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，可对转基因棉花MON88701进行品系特异性快速、高通量的定性及精准定量检测，满足检测、监管部门对其进行标识的需求。
序列表
<110> 中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局
<120> 转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒
<160> 6
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaatgcaga gttacaagaa catcc 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgacgaattc tgcagaagct tg 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaaagcccg ggcttaatta aggc 24
<210> 4
<211> 140
<212> DNA
<213> 棉花
<400> 4
aaactttact tttttctcca ttttggatat atataaacac atgacttagc ccatctttgc 60
ttgcaggttt tggtgccact gtgaatgttg ctaaaccaaa aaagggtggg tttgttgcag 120
tttttggact tggtgctgta 140
<210> 5
<211> 211
<212> DNA
<213> 转基因棉花MON88701
<400> 5
taatgaggtc cataactagt ttgagtgaaa tgcagagtta caagaacatc cttgataacc 60
ttatttatat aaaaattagg acatattctc ttaaggtagc caaagcccgg gcttaattaa 120
ggcgcgcccg gccaagtcgg ccgcggccgc gttaacaagc ttctgcagaa ttcgtcaacg 180
agatcttgag ccaatcaaag aggagtgatg t 211
<210> 6
<211> 351
<212> DNA
<213> AdhC-MON88701质粒
<400> 6
aaactttact tttttctcca ttttggatat atataaacac atgacttagc ccatctttgc 60
ttgcaggttt tggtgccact gtgaatgttg ctaaaccaaa aaagggtggg tttgttgcag 120
tttttggact tggtgctgta taatgaggtc cataactagt ttgagtgaaa tgcagagtta 180
caagaacatc cttgataacc ttatttatat aaaaattagg acatattctc ttaaggtagc 240
caaagcccgg gcttaattaa ggcgcgcccg gccaagtcgg ccgcggccgc gttaacaagc 300
ttctgcagaa ttcgtcaacg agatcttgag ccaatcaaag aggagtgatg t 351

Claims (8)

1.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’；
MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’。
2.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
MON88701-F：5’-GAAATGCAGAGTTACAAGAACATCC-3’；
MON88701-R：5’-TGACGAATTCTGCAGAAGCTTG-3’；
所述的检测探针如下所示：
MON88701-P：5’-CCAAAGCCCGGGCTTAATTAAGGC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
5.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为转基因棉花MON88701品系。
6.根据权利要求5所述的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROXReference Dye II 0.2μL，10μmol/L检测引物MON88701-F和MON88701-R各0.4μL，10μmol/L检测探针MON88701-P 0.8μL，DNA模板2μL和ddH2O 8.7μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、58℃34s，40个循环，于58℃收集荧光信号。
7.根据权利要求5所述的转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因棉花MON88701品系的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因棉花MON88701品系；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是转基因棉花MON88701品系。
8.一种转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取转基因棉花MON88701品系的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应；
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到该线性范围内转基因棉花MON88701品系的标准曲线；
(3)提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤(1)中相同体系的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因棉花MON88701品系的标准曲线，计算得到待检样品中转基因棉花MON88701品系基因组DNA的含量。
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