CN100532572C - 一种转基因大豆的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因大豆的定量检测方法，它包括以下步骤：(1)提取大豆中的DNA；(2)将提取的DNA作为模板，用外源基因特异性引物对进行PCR扩增，与此同时加入Taqman型荧光探针，进行杂交，设定荧光阈值，测定杂交所产生的可检测信号达到荧光阈值的循环次数；所述的Taqman型荧光探针是：5’-acgttccaaccacgtct--3’；(3)分析测定数据，从而定量地检测出转基因大豆中转基因成分。该方法高效、准确、简便，减少了定量检测中探针的种类，降低检测成本，可以较便捷对转基因成分实施定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测方法，尤其涉及一种转基因大豆的定量检测方法。
背景技术
随着基因工程技术的迅速发展，全球转基因作物的种植面积成倍增长，其中抗除草剂转基因大豆占全球转基因作物种植面积的66％，达到3600万hm2。据国际农业生物技术应用购买组织(ZSAAA)预测，2005年基因工程作物的市场份额将达50亿美元，显著的经济效益世人瞩目，但转基因作物潜在的生态风险，可能带来的环境问题、伦理问题和国际贸易问题等，促使国际上许多国家如欧盟、日本、韩国等都制订了相应的法规对转基因食品实行标签制度。中国加入世贸组织以后，国外的农产品必将以其优良的品质和低廉的价格大量涌入，大部分来自转基因技术发达的美国、加拿大等国家，因此，建立准确的转基因检测方法保证消费者的知情权和选择权非常必要。
国内外已有多篇关于转基因食品含量检测的文献报道，但多为针对原料产品进行品系检测，还没有针对转基因产品品系的鉴定检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、准确、简便的检测转基因大豆中转基因成分的方法。
本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：一种转基因大豆的定量检测方法，它包括以下步骤：
(1)提取大豆中的DNA；
(2)将提取的DNA作为模板，用外源基因特异性引物对进行PCR扩增，并同时加入探针，进行杂交；设定荧光阈值，测定杂交所产生的可检测信号达到荧光阈值的循环次数；
(3)分析测定数据，从而定量地检测出转基因大豆中转基因成分。
所述的步骤(2)中，测定的可检测信号是探针和扩增产物杂交反应中产生的荧光信号。
所述的探针是：5’—acgttccaaccacgtct--3’，是Taqman型荧光探针。这个探针与PCR两个引物之间的靶序列互补配对，其5’端标记了一个荧光报告基团，3’端标记了一个荧光淬灭基团。两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基团所发出的荧光可被荧光抑制基团吸收或抑制。当二者距离较远时，抑制作用消失。进行PCR反应时，Taq聚合酶利用其5’→3’外切酶活性从探针上切下荧光报告基团，荧光淬灭基团抑制作用消失，报告基团荧光信号增强。伴随PCR产物的增加，荧光信号随之增强。
所述的外源基因特异性引物对是：
5’—GAGGAGCATCGTGGAAAAAGAA--3’
5’—GGATATCACATCAATCCACTTGCTT--3’
所述的荧光阈值是以PCR反应的第3～15个循环的荧光值作为荧光本底信号，再以3～15个循环的荧光值增加量ΔRn的标准偏差的10倍来设定。
在步骤(2)中还包括将标准参照物作为模板，用外源基因特异性引物对进行PCR扩增，同时加入探针进行杂交，设定荧光阈值，测定杂交所产生的可检测信号达到荧光阈值的循环次数，从而制得标准曲线。其中所述的标准参照物是转基因大豆与非转基因大豆的DNA混合物，其中在各种混合物中转基因DNA的含量为0％、1.0％、2.0％或5.0％。
所述步骤(2)中是以荧光信号达到所设定的荧光阈值时的循环次数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间建立线性关系得到标准曲线的。
在步骤(3)中将测定的数据与标准曲线进行比较，从而定量检测转基因大豆中转基因成分。
所述外源基因是指特异性地扩增出转入植物的外源基因或其片段的引物，应理解，外源基因特异性引物随外源基因的不同而变化。本发明方法检测的外源基因优选35S启动子。
(1)本发明提供的转基因大豆的定量检测方法中，PCR扩增反应和与探针杂交反应一步完成，并以荧光信号达到该荧光阈值时的循环次数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间建立线性关系，方法简便，减少了定量检测中探针的种类，降低检测成本，可以较便捷对转基因成分实施定量检测。
(2)由于70％转基因产品都是使用35S启动子，因此该方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品，检测转基因成分的含量，并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。
附图说明
图1是转基因大豆35S启动子的定量扩增曲线；
图2是Ct值与不同转基因大豆含量之间的Taq Man检测标准曲线；
图3是1％转基因大豆标准品作为未知样的35S启动子定量扩增曲线；
图4是2％转基因大豆标准品作为未知样的35S启动子定量扩增曲线；
图5是5％转基因大豆标准品作为未知样的35S启动子定量扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的内容。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1 材料方法
1.1 材料
转基因大豆(Roundup ready)抗除草剂大豆参照样品从Fluka公司购买，其中转基因成分含量分别占0％、1.0％、2.0％、5.0％四个样品。
1.2 仪器
美国ABI公司生产的ABI PRISM 7000定量PCR仪；
离心机：德国Eppendorf 5415D型；
核酸蛋白分析仪：美国LABCONCO公司产品。
1.3 试剂
Taq ManTM PCR检测试剂盒购自美国ABI PRISM公司产品(ABI-Roche MolecularSystems Inc.，Branch-burg，NJ，USA)。
1.4 DNA提取
大豆粉末DNA的提取采用CTAB法。
1.5 引物及探针
上游引物：5’—GAGGAGCATCGTGGAAAAAGAA--3’；
下游引物：5’—GGATATCACATCAATCCACTTGCTT--3’；
探针：5’—acgttccaaccacgtct--3’5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团TAMRA标记。
1.6 PCR反应
使用美国ABI PRISM公司Taq ManTM PCR检测试剂盒，50μl反应体系中含引物100nmol/L，探针200nmol/L，dNTP 0.25nmol/L，AmpliTaq Gold DNA聚合酶2.5U，UNG0.5U，MgCl2 3.25mmol/L，1×PCR缓冲液，4ng模板DNA，检测外源基因的PCR反应小管中进行。循环条件：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30S，60℃，1min，50个循环。
1.7 转基因大豆的定量检测标准曲线的制作
使用Beckman紫外分光光度计精确测定DNA浓度，保证加入PCR反应管中模板量一致。对每个参照样品的DNA作为模板，用35S启动子设定的特异性引物对进行PCR扩增反应，同时与Taq Man探针进行杂交反应，测定杂交所产生的可检测信号。可检测信号达到荧光阈值时的循环次数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。根据所测得的转基因作物阳性梯度标准品Ct值，制成标准曲线。
2 结果
用35S启动子的引物和探针对参照样品进行定量PCR测试的扩增曲线如图1所示；各参照样品外源基因35S启动子的Ct值见表1。其中Roundup ReadyTM转基因大豆含量分别为1％、2％和5％的标准品。
表1 不同含量转基因大豆样品检测的Ct值
| 转基因大豆含量 | 1％ | 2％ | 5％ |
| Ct | 32.79 | 32.18 | 30.48 |
而各PCR管中模板总量一致，PCR反应管内总DNA为2000个拷贝，由此1％、2％和5％的标准品f拘拷贝数分别为20、40和100，在此基础上，绘制外源基因35S启动子的Ct值与Roundup readyTM转基因大豆量之间的标准曲线(见图2)，该标准曲线的回归方程为：
Ct＝-3.053345logX+36.794895 R2：0.994245
实施例2 转基因大豆的定量检测
运用以上建立起来的方法，对待测的转基因大豆样品进行检测，分别将转基因成分含量为1％、2％、5％的标准品作为未知样品进行测试，定量扩增曲线见图3、图4、图5。测试结果分析见表2。
表2 转基因大豆转基因成分含量检测分析结果
| 转基因成分理论含量 | 1％ | 2％ | 5％ |
| Ct | 32.58 | 32.14 | 30.52 |
| 实测值 | 1.2％ | 1.67％ | 5.68％ |
Claims (6)
1、一种转基因大豆的定量检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)提取大豆中的DNA；
(2)将提取的DNA作为模板，用外源基因特异性引物对进行PCR扩增，与此同时加入Taqman型荧光探针，进行杂交，设定荧光阈值，测定杂交所产生的可检测信号达到荧光阈值的循环次数；所述的Taqman型荧光探针是：5’—acgttccaaccacgtct--3’；所述的外源基因特异性引物对是：
5’—GAGGAGCATCGTGGAAAAAGAA--3’
5’—GGATATCACATCAATCCACTTGCTT--3’；
(3)分析测定数据，从而定量地检测出转基因大豆中转基因成分。
2、根据权利要求1所述的转基因大豆的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，测定的可检测信号是Taqman型荧光探针和扩增产物杂交反应中产生的荧光信号。
3、根据权利要求1或2所述的转基因大豆的定量检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中还包括将标准参照物作为模板，用外源基因特异性引物对进行PCR扩增，与此同时加入探针，进行杂交，设定荧光阈值，测定杂交所产生的可检测信号达到荧光阈值的循环次数，从而制得标准曲线，其中所述的标准参照物是转基因大豆与非转基因大豆的DNA混合物，其中在各种混合物中转基因DNA的含量为0％、1.0％、2.0％或5.0％。
4、根据权利要求3所述的转基因大豆的定量检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中是以可测荧光信号达到所设定的荧光阈值时的循环次数(Ct值)和PCR体系中起始DNA量的对数值之间建立线性关系得到标准曲线的。
5、根据权利要求4所述的转基因大豆的定量检测方法，其特征在于：所述的外源基因优选35S启动子。
6、根据权利要求5所述的转基因大豆的定量检测方法，其特征在于：在步骤(3)中将测定的数据与标准曲线进行比较，从而定量检测转基因大豆中转基因成分。
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