CN1932037B - 一种筛查转基因小麦的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛查转基因小麦的方法。该方法，是检测待测小麦的基因组中是否含有Ubiquitin启动子，若含有Ubiquitin启动子，则该目的材料为转基因小麦。本发明的方法筛查转基因小麦更加快速，简便，精确。

Description

一种筛查转基因小麦的方法

技术领域

本发明涉及一种筛查转基因小麦的方法。

背景技术

由于小麦的遗传基因复杂，转基因小麦品种的研究比其它作物花费了更长的时间，2001年全世界第一个转基因小麦品种问世，2005年6月已经在美国FDA申请注册登记。我国的转基因小麦有改良品质和抗病抗除草剂等，几年内即将投入商品化生产。随着我国小麦进出口贸易量增加，小麦中转基因成分检测势在必行，意义重大。

目前，国内外转基因小麦品系的通用外源基因有来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因NOS终止子，玉米泛素蛋白基因Ubiquitin启动子(GENBANK号为AY572837.1GI：45862532)和bar，uidA标记基因等；内源基因小麦中有麦谷醇溶蛋白基因GAG56D和蜡质基因Wx012(日本)。

实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板分子最初的拷贝数。首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个阈值(域值)(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，域值的设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过阈值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个PCR反应的Ct值与该PCR模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要测得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。最常用的Real-time Q-PCR是Taqman探针技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛查转基因小麦的方法。

本发明所提供的筛查转基因小麦的方法，是检测待测小麦的基因组中是否含有Ubiquitin启动子，若含有Ubiquitin启动子，则该待测小麦为转基因小麦。

为了避免在实际操作中出现假阴性结果，所述方法中，还包括检测待测小麦的基因组中是否含有GAG56D基因。如果在待测小麦中未检测到GAG56D基因，则表明待测小麦中的核酸没有提取出来或PCR体系中存在物质抑制等。

所述方法中，采用实时荧光PCR检测待测小麦的基因组中是否含有GAG56D基因和Ubiquitin启动子。

所述实时荧光PCR检测GAG56D基因的一对引物，它们的核苷酸序列为序列表中序列1和序列2，所述实时定量PCR检测Ubiquitin启动子的一对引物，它们的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4。所述实时荧光PCR检测GAG56D基因的探针，其核苷酸序列为序列表中序列5；所述实时荧光PCR检测Ubiquitin启动子的探针，其核苷酸序列为序列表中序列6。

所述实时荧光PCR检测GAG56D基因或Ubiquitin启动子的反应程序为：两步法：预变性95℃10s，1个循环；95℃5s，60℃ 20s，40个循环；或三步法：预变性95℃/10min，1个循环；95℃/5s，50℃/5s，60℃/20s，40个循环。

所述转基因小麦为含有Ubiquitin启动子的小麦。所述转基因小麦中至少含有具有自GENBANK号为AY572837.1(GI：45862532)的5′端第2175-2301位核苷酸序列的玉米泛素蛋白基因Ubiquitin启动子。

本发明的方法通过检测小麦样品基因组中是否含有小麦属内源GAG56D特异参照基因和Ubiquitin启动子序列，可以准确的检测该小麦是否是转基因小麦。本发明的方法使转基因小麦的筛查更加快速(整个检测过程只需40-120分钟，不同荧光PCR仪器检测时间不同)，简便，精确。本发明的方法可广泛用于进出口贸易转基因小麦以及含有转基因小麦成分食品的检测和市场监管。

附图说明

图1为内参照基因麦谷醇溶蛋白基因GAG56D的检测结果

图2为转基因和非转基因小麦GAG56D基因的扩增曲线

图3为转基因和非转基因小麦Ubiquitin启动子的扩增曲线

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例中所用材料：

转基因小麦B73，B72，B102(B73，B72，B102含有的Ubiquitin启动子的序列为自GENBANK号为AY572837.1(GI：45862532)5′端第2175-2301位核苷酸序列。华中科技大学提供，林刚，何光源.《转基因小麦“中间试验”与农艺性状评价》，武汉植物学研究2004，22(4)：284-288)

非转基因冬小麦京冬6号，京花1号(北京农林科学院提供，张晓东，梁荣奇等.优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析，科学通报，2003，5：474-479)；

一粒麦(AA)，二粒麦(AABB)，硬粒麦(AABBDD)，斯卑尔脱小麦(AABBDD)，粗山羊草(DD)，黑麦(RR)，大麦亚族中的大麦，同时对小麦亚族以外的燕麦，荞麦，大豆，玉米，水稻，谷子，亚麻籽(均来自黑龙江省农业科学院)。

实施例1、筛查转基因小麦的方法的确定及其效果实验

1、内参照基因麦谷醇溶蛋白基因GAG56D的检测

通过GENBANK搜索和同源性分析首次找出了小麦属特有的内参照基因麦谷醇溶蛋白基因GAG56D(GENBANK号为GI：10638295)。

针对小麦中麦谷醇溶蛋白内源参照基因GAG56D设计并合成了探针和引物，引物1：5′-caacaattttctcagccccaaca-3′(序列表中序列1)，引物2：5′-ttcttgcatgggttcacctgtt-3′(序列表中序列2)  (引物1和引物2扩增的片段为自GENBANK号为10638295的5′端的第353-474位脱氧核苷酸)；探针1为5′FAM--ttcccgcagccccaacaaccgc-Tamra 3′(序列表中序列5)。

提取小麦(染色体组成AABBDD)转基因小麦B73(图1中8)，非转基因冬小麦京花1号(图1中9)；一粒麦(AA)  (图1中2)，二粒麦(AABB)  (图1中3)，硬粒麦(AABBDD)  (图1中4)，斯卑尔脱小麦(AABBDD)  (图1中5)，粗山羊草(DD)  (图1中7)，黑麦(RR)  (图1中6)，同时对小麦亚族以外的大麦(图1中10)，燕麦(图1中11)，荞麦(图1中12)，大豆(图1中13)，玉米(图1中14)，水稻(图1中15黑米，16白米)，谷子(图1中17)，亚麻籽(图1中18)样品中的基因组DNA。

以上述提取的基因组DNA为模板，分别以上述引物1和引物2，以探针1为探针，用荧光定量PCR进行了定性检测。

实时荧光两步法PCR反应程序为：预变性95℃10s，1个循环；95℃5s，60℃20s，40个循环。

反应体系为：10×PCR Buffer 1×，氯化镁(MgCl₂)2.5mmol/L，dNTP(含dUTP)0.2mmol/L，UNG酶0.075U，引物1 0.2pmol/μL，引物20.2pmol/μL，探针0.2pmol/μL，Taq酶2.5U/μL，DNA模板(20-30ng/μL)5.0μL，补水至50μL。

以引物1和引物2为引物的实时荧光PCR检测结果如图1所示，结果表明，所有小麦属中的品系(2-9号)都出现了扩增曲线，而水空白对照(图1中1)和其它作物中没有扩增曲线。说明麦谷醇溶蛋白内源参照基因GAG56D是小麦属特有的内参照基因。同时也证明了转基因小麦的DNA提取成功，同时防止了假阴性结果的出现。

2、转基因小麦的实时荧光PCR定量(性)检测方法。

选取转基因小麦B73，B72，B102(B73，B72，B102含有的Ubiquitin启动子的序列为自GENBANK号为AY572837.1(GI：45862532)的5′端第2175-2301位脱氧核苷酸)，非转基因小麦京冬6号，京花1号，提取基因组DNA。针对小麦属内源特异参照基因GAG56D，设计了特异的引物序列，引物1和引物2，以及探针1序列5′-FAMttcccgcagccccaacaaccgc-TAMRA 3′。针对目前国内外转基因小麦品系的通用外源基因Ubiquitin启动子，设计了特异的引物序列，引物3：5′-GTCCAGAGGCAGCGACAGA-3′(序列表中序列3)，引物4：5′-CGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTA-3′(序列表中序列4)(引物3和引物4扩增的片段是自GENBANK号为AY572837.1 GI：45862532的5′端第2175-2301位脱氧核苷酸)，探针2序列：5′FAM-TGCCGTGCCGTCTGCTTCGCTTG-TAMRA 3′(序列表中序列6)。以上述制备的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR进行了定性定量检测。

实时荧光PCR反应程序为：两步法为预变性95℃ 10s，1个循环；95℃5s，60℃20s，40个循环，或三步法为预变性95℃10min，1个循环；95℃5s，50℃5s，60℃20s，40个循环。

检测转基因小麦GAG56D和Ubiquitin的PCR反应体系为：10×PCR Buffer 1×，氯化镁(MgCl₂)2.5mmol/L，dNTP(含dUTP)0.2mmol/L，UNG酶0.075U，引物(上游)0.2pmol/μL，引物(下游)0.2pmol/μL，探针0.2pmol/μL，Taq酶2.5U/μL，DNA模板(20-30ng/μL)5.0μL，补水至50μL。

当外源基因和内源参照基因标记相同的荧光报告基团时，应在不同反应管中分别加入外源基因和内源参照基因的引物、探针，分别进行检测。

合适的DNA模板量是：内参照基因GAG56D检测的Ct值在15-36之间，外源基因Ubiquitin启动子检测的Ct值在27-36之间。否则应进一步增加/减少或纯化DNA。

结果如图2和图3所示，表明在转基因小麦B73，B72，B102和非转基因小麦京冬6号，京花1号的基因组中均检测到内参照基因GAG56D；在转基因小麦B73，B72，B102的基因组中均检测到Ubiquitin启动子序列，而在非转基因小麦京冬6号，京花1号基因组中均未检测到Ubiquitin启动子序列。

序列表

<160>6

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

caacaatttt ctcagcccca aca    23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ttcttgcatg ggttcacctg tt    22

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gtccagaggcagcgacaga        20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

cgagtagataatgccagcctgtta

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

ttcccgcagc cccaacaacc gc    22

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tgccgtgccgtctgcttcgcttg    20

Claims (3)

1.一种筛查转基因小麦的方法，是采用实时荧光PCR检测待测小麦的基因组中是否含有Ubiquitin启动子和GAG56D基因，含有Ubiquitin启动子和GAG56D基因，则该待测小麦为转基因小麦；

所述转基因小麦为基因组基因中含有Ubiquitin启动子和GAG56D基因的转基因小麦；

实时荧光PCR检测Ubiquitin启动子序列的一对引物，它们的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；

实时荧光PCR检测GAG56D基因的一对引物，它们的核苷酸序列为序列表中序列1和序列2；

实时荧光PCR检测GAG56D基因的探针，其核苷酸序列为序列表中序列5；实时荧光PCR检测Ubiquitin启动子的探针，其核苷酸序列为序列表中序列6。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：实时荧光PCR检测GAG56D基因和Ubiquitin启动子的反应程序为：预变性95℃10s，1个循环；95℃5s，60℃20s，40个循环；或者预变性95℃10min，1个循环；95℃5s，50℃5s，60℃20s，40个循环。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述转基因小麦中至少含有GENBANK号为AY572837.1的5′端第2175-2301位脱氧核苷酸的Ubiquitin启动子片段。