CN105331734A - 食品致病性细菌检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品检测用品领域内的一种食品致病性细菌检测试剂盒，主要由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为10重聚合酶链式反应引物组合，其中，反向引物的5’端接上Tag序列，引物组合中还含有一条5’端带生物素标志的Tag引物，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的10组探针序列、1组阳性对照探针序列和1组阴性对照探针序列。本发明克服了现有食品检测技术费时、费力、成本高、单次反应检测指标少的缺陷，提供的食品致病性细菌检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。

Description

食品致病性细菌检测试剂盒
所属技术领域
本发明涉及食品检测用品领域，具体为食品致病性细菌检测试剂盒。
背景技术
食品安全问题是关系到人民健康和国计民生的重大问题，检测是保证食品安全最为基础的手段。目前用于检测食品中致病性细菌的方法主要以传统的分离鉴定方法为主，传统检测方法要求对每个检验项目进行前增菌、选择性增菌、分离、筛选和鉴定等步骤，一般需要5天才能出具检测报告，阳性结果需要长达10～15天的时间才能出具报告，检验滞后于消费，造成食源性疾病的频繁发生。
近年来，食品微生物检测和研究在快速自动化采样和检测方面取得了较快的进展，生物传感器、基因分析及酶联免疫分析等技术在食品微生物检测中被广泛应用。然而，上述生物学技术一般每次仅能检测一种食品微生物，无法全面分析检测食品中所存在的致病性细菌的种类、分布及数量，这是食品微生物学亟待解决的一个重要问题。
除此之外，基于核酸水平的基因芯片技术也被广泛应用于致病性细菌的检测。但是基因芯片技术目前绝大多数还处于实验室阶段，更多的用于基础性研究而不能平民化应用。目前基因芯片法一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，成本较高。
发明内容
本发明的目的是克服现有食品检测技术费时、费力、成本高、单次反应检测指标少的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉的食品致病性细菌检测试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的食品致病性细菌检测试剂盒，主要由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为10重聚合酶链式反应（PCR）引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
细菌通用内参基因：正向引物：TGCGGTTGGATCACCTCCT
反向引物：TCCCCACCTTCCAGTT；
大肠杆菌O157：正向引物：TCAGAGTTTACCGCAACCTATCCA
反向引物：GCCAACGAGCTTCAATGTATTCCA；
志贺氏菌：正向引物：GTGGAGAGGCGTAATACAATACCC
反向引物：TAATCCATGCCGCAAACACC；
金黄色葡萄球菌：正向引物：TCGCTAAGTATGTTTATGCCTT
反向引物：TTGGGATAAATGATAGCCATCG；
空肠弯曲杆菌：正向引物：TCTTGAAAAGCGTTTTAATGTGA
反向引物：TAACTCGCTTCTTCATATAGTGG；
单核细胞增生李斯特菌：正向引物：TATAGCATTATATCAAACCG
GAAG
反向引物：AACTTGGCTCTACTATTCTCA；
沙门氏菌：正向引物：ATTAACAGCATCCCGACGGAG
反向引物：GGTATTCCGCATACGCTGCAAC；
阪崎肠杆菌：正向引物：TCGTTCGCATATTTAAAGGGGAT
反向引物：TTTTACCAGCGTCTGAAAACTGTC；
霍乱弧菌O1群及O139群：正向引物：CAATATTTAGCCGTCAATAAA
CCC
反向引物：AATTGACCACCAAGTATTACCTGA；
副溶血性弧菌：正向引物：GGTAAAATGGCGTTAATTCCC
反向引物：CCACATAGTAATTAAGTCACGTC。
其中，反向引物的5’端接上Tag序列，该Tag序列为
5’-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’，
引物组合中还含有一条5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTAT
GGCT-3’；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的10组探针序列、1组阳性对照（Positive）探针序列和1组阴性对照（Negative）探针序列，10组探针序列、阳性对照探针序列及阴性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
细菌通用内参基因探针:CGGTCGTGTAGGTTCGCCAGCCACTTA；
大肠杆菌O157探针:CAAGCCTGCCGTCATCCGAAC；
志贺氏菌探针:CAGTTGACACCCGACCAACCAG；
金黄色葡萄球菌探针:CAATTGCCTGATGTCGTGGT；
空肠弯曲杆菌探针:TTGAGTTTGAACGAAAGCTCGAA；
单核细胞增生李斯特菌探针:AATTCCAATCATCGTGCCACC；
沙门氏菌探针:ACGATAAACACCCAGCCGAGCA；
阪崎肠杆菌探针:CCCTGAACAAGGCGCTCGTG；
霍乱弧菌O1群及O139群探针:AATCACCAAAACCTTCACGAGCA；
副溶血性弧菌探针:AATAGCTTGATTAAGGCTCGGAT；
Positive探针:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGA
GAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG；
Negative探针：GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCC
ATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。
上述方案中，所述试剂盒主要由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为dNTPs、EX-Taq聚合酶（Polymerase）和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，该单链碱基序列为：biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCT
CGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
上述方案中，所述试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液。
上述方案中，所述预杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠（SDS）和10×Denhardt’s液，其中，SSC为0.75M氯化钠和0.075M柠檬酸钠，Denhardt’s液为1%Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone），1%牛血清白蛋白（BSA）；杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比SDS，5×Denhardt’s，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA；洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1：2×SSC和0.1%重量百分比SDS，洗液2：0.5×SSC和0.1%重量百分比SDS，洗液3：100mM（毫摩尔/升）Tris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，洗液4：100mMTris-HCl，pH9.5，100mMNaCl和100mMMgCl2；封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白（BSA），100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液：pH5.4的200mM柠檬酸钠和0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液：3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液。
上述方案中，所述支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他有三维孔径结构的支持物。
本发明采用多重PCR扩增的方法扩增目标序列。多重PCR扩增技术原理是将多对引物放到同一个反应管中进行PCR扩增，达到同时扩增2种或2种以上目标DNA序列的目的。本发明采用了10重PCR扩增体系扩增目标序列，包括9种常见、常检的致病性细菌，如大肠杆菌O157、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、霍乱弧菌O1群及O139群及副溶血性弧菌的特异性序列和细菌通用内参基因。
本发明采用单引物扩增技术用以提高检测灵敏度。单引物扩增技术原理是在PCR扩增过程中采用的反向引物的5’端接上Tag序列，同时引入一条5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物（二者TAG序列相同），使得PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的探针杂交，从而提高检测灵敏度。
本发明在多重PCR扩增同时进行单引物扩增，采用的技术方案是在多重PCR反向引物的5’端添加Tag序列，同时在PCR反应体系中添加5’端带生物素标志的Tag引物，带生物素标志的Tag引物的碱基顺序与多重PCR反向引物Tag序列的碱基顺序相同，带生物素标志的Tag引物Tm值（解链温度）比多重PCR正向引物Tm值高10~15℃，带生物素标志的Tag引物和反向引物上的Tag接头的互补序列配对后，通过调节退火温度进行单引物扩增制备出单链DNA。在整个PCR扩增过程中，首先采用低退火温度（55~60℃）进行多重PCR反应，其扩增产物主要是双链DNA，之后提高退火温度（65~68℃），使正向引物不能结合到模板上，只有Tag引物可以结合到模板上并延伸扩增，从而产生大量5’端带生物素标志的单链DNA，该单链DNA用于接下来的膜芯片杂交检测。
本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行多种致病性细菌的杂交检测，其工作原理是首先将针对各种致病性细菌特异性序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域，再将待测的多重PCR产物与其杂交，这样PCR产物中的致病性细菌特异性序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有生物素标志，结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标志物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号，这样一张膜芯片上就可以同时检测多种病原微生物。本发明的食品致病性细菌检测可视化膜芯片检测方法及其试剂盒的检测探针顺序排列于支持膜表面的特殊区域，形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形成肉眼可视化的检测结果。
本发明的有益效果是：
1）操作简单，经过一次样本前处理，单管PCR扩增，单芯片杂交就可以同步检测样本中多种致病性细菌，具有平行分析和多重判断的特点；
2）检验对象完备，包含了当前市面上常见、常检的致病性细菌指标，并且可以很方便的加入新的检测指标；
3）系统在多重PCR扩增过程同时进行了单链扩增获得大量单链DNA，提高了系统的灵敏度和准确性；
4）试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式，提高了系统的检测通量，并且检测结果可以直接用肉眼判断，方便，快捷；
5）试剂盒操作简单，经济，无需特殊的昂贵仪器，适用于食品中致病性细菌的检测和大规模筛查。
因此，本发明克服了现有食品检测技术费时、费力、成本高、单次反应检测指标少的缺陷，提供的食品致病性细菌检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
附图说明
图1为本发明用于检测凉面样品的杂交结果图，其中图1A为芯片结果模式图，图1B为凉面样品的检测结果图。
图2为本发明用于检测方便面样品的杂交结果图，其中图2A为芯片结果模式图，图2B为方便面样品的检测结果图。
图3为本发明用于检测皮蛋样品的杂交结果图，其中图3A为芯片结果模式图，图3B为皮蛋样品的检测结果图。
图4为本发明用于检测水样品的杂交结果图，其中图4A为芯片结果模式图，图4B为水样品的检测结果图。
附图中，细菌通用内参基因为细菌16srRNA；Positive为阳性对照；Negative为阴性对照。
具体实施例
下面结合附图及实施例进一步详述本发明，但本发明不仅限于所述实施例。
实施例一
本例的食品致病性细菌检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，引物组合为10重PCR引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
大肠杆菌O157：正向引物：TCAGAGTTTACCGCAACCTATCCA
反向引物：GCCAACGAGCTTCAATGTATTCCA；
志贺氏菌：正向引物：GTGGAGAGGCGTAATACAATACCC
反向引物：TAATCCATGCCGCAAACACC；
金黄色葡萄球菌：正向引物：TCGCTAAGTATGTTTATGCCTT
反向引物：TTGGGATAAATGATAGCCATCG；
空肠弯曲杆菌：正向引物：TCTTGAAAAGCGTTTTAATGTGA
反向引物：TAACTCGCTTCTTCATATAGTGG；
单核细胞增生李斯特菌：正向引物：TATAGCATTATATCAAACCG
GAAG
反向引物：AACTTGGCTCTACTATTCTCA；
沙门氏菌：正向引物：ATTAACAGCATCCCGACGGAG
反向引物：GGTATTCCGCATACGCTGCAAC；
阪崎肠杆菌：正向引物：TCGTTCGCATATTTAAAGGGGAT
反向引物：TTTTACCAGCGTCTGAAAACTGTC；
霍乱弧菌O1群及O139群：正向引物：CAATATTTAGCCGTCAATAAA
CCC
反向引物：AATTGACCACCAAGTATTACCTGA；
副溶血性弧菌：正向引物：GGTAAAATGGCGTTAATTCCC
反向引物：CCACATAGTAATTAAGTCACGTC；
细菌通用内参基因：正向引物：TGCGGTTGGATCACCTCCT
反向引物：TCCCCACCTTCCAGTT。
其中，反向引物的5’端接上Tag序列，该Tag序列为
5’-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’，
引物组合中同时包含单引物扩增引物，为5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTAT
GGCT-3’。
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的10组探针序列、1组阳性对照（Positive）探针序列和1组阴性对照（Negative）探针序列，10组探针序列、阳性对照探针序列及阴性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
大肠杆菌O157探针:CAAGCCTGCCGTCATCCGAAC；
志贺氏菌探针:CAGTTGACACCCGACCAACCAG；
金黄色葡萄球菌探针:CAATTGCCTGATGTCGTGGT；
空肠弯曲杆菌探针:TTGAGTTTGAACGAAAGCTCGAA；
单核细胞增生李斯特菌探针:AATTCCAATCATCGTGCCACC；
沙门氏菌探针:ACGATAAACACCCAGCCGAGCA；
阪崎肠杆菌探针:CCCTGAACAAGGCGCTCGTG；
霍乱弧菌O1群及O139群探针:AATCACCAAAACCTTCACGAGCA；
副溶血性弧菌探针:AATAGCTTGATTAAGGCTCGGAT；
细菌通用内参基因探针:CGGTCGTGTAGGTTCGCCAGCCACTTA；
Positive探针:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGA
GAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG；
Negative探针：GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCA
TGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。
支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他有三位孔径结构的支持物。
通过相应的多重PCR引物设计，采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述10重PCR组合引物和Tag引物。根据多重PCR扩增产物设计检测探针，采用固相亚磷酰胺三酯法合成探针，探针合成时同时合成阴性探针（negativeprobe）、阳性探针(positiveprobe)和与阳性探针对应的5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸(positiveoligo)单链DNA，该单链DNA的碱基序列如下：biotin-5'-CTGGTACTTTGGAC
ACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
将支持膜裁成1.2cm×1.8cm的膜条，裁好的膜于双蒸水中浸泡15min，再用15×SSC浸泡15min，取出，置于滤纸上，60℃烘1.5hour，待膜条降温到室温后，将探针(5uM)顺序点在膜上，点样样式见附图，膜条晾干后80℃烘2小时以固定探针，处理好的膜芯片室温保存。
按照北京康为世纪生物科技有限公司细菌基因组提取试剂盒（BacteriaGenDNAKitPurificationKit，CW0552）的说明提取基因组DNA，每25g（ml）待检初始样本经匀浆、增菌培养、提取总核酸后用50ulddH2O（双蒸水）溶解细菌基因组DNA，并用紫外分光光度计将DNA溶液稀释至同一质量浓度(50ng/ul)。
PCR扩增的反应体系如下所示：
ddH2O:加至总体积50ul
10×PCRBuffer:5ul
dNTP(2.5mMeach):5ul
PCR引物(20μM):0.5uleach
Tagprimer(20μM):3.5ul
EX-TaqPolymerase(Takara,5U/ul):0.5ul
待测样本中致病性细菌基因组DNA(约50ng/ul):2ul
对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由预变性、多重PCR循环1和单链PCR循环2组成，条件分别为：
预变性：温度95℃，时间10分钟。
多重PCR循环1：30个循环组成：
变性：温度95℃，时间45秒。
退火：温度55℃，时间30秒。
延伸：温度72℃，时间30秒。
单链PCR循环2：25个循环组成：
变性：温度95℃，时间45秒。
退火：温度65℃，时间30秒。
延伸：温度72℃，时间30秒。
最后延伸：温度72℃，时间10分钟。
然后进行膜芯片斑点杂交检测，膜条于42℃预杂交液（5×SSC，0.1%SDS，10×Denhardt’s）中预杂交1小时，之后将膜条放于2ml杂交液(5×SSC，0.1%SDS，5×Denhardt’s，50%去离子甲酰胺，100ug/ml酵母tRNA)中42℃，1小时。取40ul多重PCR产物加入1ul阳性寡核苷酸单链DNA(10uM)，100℃水浴变性5分钟后置于冰上，之后加入2ml杂交液中，42℃杂交16小时。洗液1（2×SSC，0.1%SDS）、洗液2（0.5×SSC，0.1%SDS）42℃各洗膜条两次，每次10分钟。将膜条置于封闭液（3%BSA，100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）中37℃封闭30分钟，之后将膜条放到酶联液（用封闭液1:5000稀释链酶亲和素标记辣根过氧化物酶）中37℃，30分钟。用洗液3（100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）、洗液4（100mMTris-HCl，pH9.5，100mMNaCl，100mMMgCl2）各漂洗膜条3次，每次5分钟，之后将膜条放入TMB显色液（100mM柠檬酸钠pH5.4，0.1mg/ml四甲基联苯胺TMB，1:1600体积比的H2O2(3%)）中，避光显色10~15分钟，依照杂交点的显色情况判定结果。
本例中所用辅料和配液为外购或自配，百分比为重量百分比。
本例中待测样本经检测含大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及霍乱弧菌，检测结果如图1B所示。
实施例二
本例的食品致病性细菌检测试剂盒，由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为dNTPs、EX-Taq聚合酶（Polymerase）和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA该单链的碱基序列为biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCG
CACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
本例中待测样本经检测含志贺氏菌、空肠弯曲杆菌及单核细胞增生李斯特菌，检测结果如图2B所示。
其余同实施例一。
实施例三
本例的食品致病性细菌检测试剂盒，由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺（TMB）显色液，其中，预杂交液为5×SSC，0.1%SDS和10×Denhardt’s；杂交液为5×SSC，0.1%SDS，5×Denhardt’s，50%去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA；洗液分别为洗液1：2×SSC和0.1%SDS，洗液2：0.5×SSC和0.1%SDS，洗液3：100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，洗液4：100mMTris-HCl，pH9.5，100mMNaCl和100mMMgCl2；封闭液为3%BSA，100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl；四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液：200mM柠檬酸钠pH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液：3%H2O2用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液。
本例待测样本经检测含致病菌志贺氏菌、阪崎杆菌及副溶血性弧菌，检测结果如图3B所示。
其余同实施例二。
实施例四
本例的食品致病性细菌检测试剂盒，由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，其中，多重PCR扩增试剂一管600ul，每48ul试剂可检测一个DNA样本，每48ul扩增体系构成如下：10×PCRBuffer(Takara)5ul，dNTP(2.5mMeach)5ul，11对多重PCR引物(20μM)0.5uleach，Tagprimer(20μM)3.5ul，EX-TaqPolymerase(Takara，5U/ul)0.5ul，ddH2O加至48ul。每一样本检测需要吸取48ul扩增试剂，加入2ul待测致病菌基因组DNA(约50ng/ul)。
阳性寡核苷酸单链DNA(10uM)一管15ul。
预杂交液（5×SSC，0.1%SDS，10×Denhardt’s）一瓶30ml。杂交液(5×SSC，0.1%SDS，5×Denhardt’s，50%去离子甲酰胺，100ug/ml酵母tRNA)一瓶30ml。
洗液1（2×SSC，0.1%SDS）10倍浓缩液一瓶12ml，使用前加108mlddH2O。洗液2（0.5×SSC,0.1%SDS）10倍浓缩液一瓶12ml，使用前加108mlddH2O。
封闭液/酶联液（3%BSA，100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）一瓶60ml。链酶亲和素标记辣根过氧化物酶（1mg/ml）一管5ul，使用前用封闭液1:5000稀释成酶联液。
洗液3（100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）10倍浓缩液一瓶18ml，使用前加162mlddH2O。洗液4（100mMTris-HCl，pH9.5，100mMNaCl，100mMMgCl2）10倍浓缩液一瓶18ml，使用前加162mlddH2O。
TMB显色液A液（200mM柠檬酸钠pH5.4，0.2mg/ml四甲基联苯胺TMB）一瓶15ml。TMB显色液B液（1:800体积比的H2O2(3%)）一瓶15ml。使用前A液B液等量混合配成TMB显色液。
本例中待测样本经检测不含上述9种致病病原体，检测结果呈阴性，如图4B所示。
其余同实施例三。

Claims (5)

1.一种食品致病性细菌检测试剂盒，主要由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为10重聚合酶链式反应引物组合，各对引物的碱基序列5’-3’如下：
细菌通用内参基因：正向引物：TGCGGTTGGATCACCTCCT
反向引物：TCCCCACCTTCCAGTT；
大肠杆菌O157：正向引物：TCAGAGTTTACCGCAACCTATCCA
反向引物：GCCAACGAGCTTCAATGTATTCCA；
志贺氏菌：正向引物：GTGGAGAGGCGTAATACAATACCC
反向引物：TAATCCATGCCGCAAACACC；
金黄色葡萄球菌：正向引物：TCGCTAAGTATGTTTATGCCTT
反向引物：TTGGGATAAATGATAGCCATCG；
空肠弯曲杆菌：正向引物：TCTTGAAAAGCGTTTTAATGTGA
反向引物：TAACTCGCTTCTTCATATAGTGG；
单核细胞增生李斯特菌：正向引物：TATAGCATTATATCAAACCG
GAAG
反向引物：AACTTGGCTCTACTATTCTCA；
沙门氏菌：正向引物：ATTAACAGCATCCCGACGGAG
反向引物：GGTATTCCGCATACGCTGCAAC；
阪崎肠杆菌：正向引物：TCGTTCGCATATTTAAAGGGGAT
反向引物：TTTTACCAGCGTCTGAAAACTGTC；
霍乱弧菌O1群及O139群：
正向引物：CAATATTTAGCCGTCAATAAACCC
反向引物：AATTGACCACCAAGTATTACCTGA；
副溶血性弧菌：正向引物：GGTAAAATGGCGTTAATTCCC
反向引物：CCACATAGTAATTAAGTCACGTC；
其中，反向引物的5’端接上Tag序列，该Tag序列为
5’-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’，
引物组合中还含有一条5’端带生物素标志（biotin）的Tag引物，其碱基顺序如下所示：
Tag引物：biotin-5’-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的10组探针序列、1组阳性对照探针序列和1组阴性对照探针序列，10组探针序列、阳性对照探针序列及阴性对照探针序列的碱基序列5’-3’如下：
细菌通用内参基因探针:CGGTCGTGTAGGTTCGCCAGCCACTTA；
大肠杆菌O157探针:CAAGCCTGCCGTCATCCGAAC；
志贺氏菌探针:CAGTTGACACCCGACCAACCAG；
金黄色葡萄球菌探针:CAATTGCCTGATGTCGTGGT；
空肠弯曲杆菌探针:TTGAGTTTGAACGAAAGCTCGAA；
单核细胞增生李斯特菌探针:AATTCCAATCATCGTGCCACC；
沙门氏菌探针:ACGATAAACACCCAGCCGAGCA；
阪崎肠杆菌探针:CCCTGAACAAGGCGCTCGTG；
霍乱弧菌O1群及O139群探针:
AATCACCAAAACCTTCACGAGCA；
副溶血性弧菌探针:AATAGCTTGATTAAGGCTCGGAT；
Positive探针:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGA
GAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG；
Negative探针：GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCC
ATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。
2.根据权利要求1所述的食品致病性细菌检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒主要由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为dNTPs、EX-Taq聚合酶和5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，该单链碱基序列为：
biotin-5'-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCT
CGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
3.根据权利要求2所述的食品致病性细菌检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10×PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺显色液。
4.根据权利要求3所述的食品致病性细菌检测试剂盒，其特征在于所述预杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和10×Denhardt’s液，其中，SSC为0.75M氯化钠和0.075M柠檬酸钠，Denhardt’s液为1%Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；杂交液为5×SSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，5×Denhardt’s，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA；洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1：2×SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液2：0.5×SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液3：100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，洗液4：100mMTris-HCl，pH9.5，100mMNaCl和100mMMgCl2；封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白，100mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl；四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液：pH5.4的200mM柠檬酸钠和0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液：3%重量百分比的H2O2用800体积的双蒸水稀释液。
5.根据权利要求1所述的食品致病性细菌检测试剂盒，其特征在于所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
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