CN102851356A - 一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因芯片及方法，本发明针对十四种常见致病菌的特异性鉴别靶基因设计相应的引物和探针，构建复合基因芯片；使用生物素标记引物，再将引物以PCR方法来扩增被检测物质的靶基因片段，扩增产物与复合基因芯片上的探针杂交，通过引物和探针双重特异性检测，复合物在复合基因表面沉积，使特定的分子杂交转变成可视信号，从而检测不同产毒微生物。本发明能检测14种常见致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。
Description
【技术领域】
本发明涉及基因芯片，尤其涉及一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及使用该复合基因芯片进行检测的方法。
【背景技术】
生物毒素(biotoxin)亦称天然毒素(natural toxin)，是指生物来源不可自主复制的有毒化学物质，包括动物毒素、植物毒素和微生物毒素等。其中微生物毒素主要由产毒微生物生长过程中分泌以及死亡后体内的物质释放而产生的，可以分为细菌毒素(bacterial toxin)和真菌毒素(mycotoxin)。常见的细菌毒素有金黄色葡萄球菌毒素、产肠毒素大肠杆菌肠毒素、志贺样毒素、志贺菌毒素、霍乱毒素、溶血毒素等。常见真菌毒素有黄曲霉毒素、伏马菌素等。对于上述诸多微生物毒素快速、准确的检测是有效预防中毒事件发生的前提和关键。但目前由于天然食物生产的全球化、新食品生产工艺的应用、人们饮食习惯的改变等各种因素在一定程度上增加了产毒微生物感染的途径，造成各种产毒微生物引起大规模中毒事件屡屡发生，以产毒微生物为根源的中毒占食物中毒事件之首位，其毒性之高仍是化学合成毒物都难以达到的。因此发展产毒微生物的快速检测、鉴定方法一直为国际上研究的热点。
目前国内外对细菌毒素和真菌毒素的直接检测存在一定的难度。主要的方法有：①生物法：有很大局限性，只能测出其毒性大小，无法确知其组成；所测得的毒性和小鼠的品系、状态、体重等有关，不确定因素很多很复杂；毒性测定结果重复性差；测试所需时间长，需专门人员，费用高。②基于免疫技术的免疫层析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫印迹等。随着单克隆抗体和多克隆抗体制备技术的发展，免疫学检测地敏感性及特异性均有提高，但仍存在一定的问题。免疫学检测不可避免地可能发生交叉反应，使用的化学试剂也可能掩盖毒素的存在，实验受试剂纯度的影响很大，引起假阳性或假阴性。此外，与仪器测定相比免疫方法的检测灵敏度不高，只能作为快速筛选，常常需要检测限较低的仪器作结果确证。③基于仪器测定的薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)、免疫亲和柱-荧光检测(IAC-FLD)。仪器测定有灵敏度高、检测限低、自动化程度高的优点。然而此方法所需仪器昂贵，人员技术要求高，标准品毒性大，一些毒素标准品难以获得。另外，现时的仪器和技术尚未能实现同步检测多种毒素及其衍生物。④基于核酸和基因探针技术的PCR反应(Polymerase ChainReaction，)和实时荧光PCR法(Real-Time PCR)等。基因芯片(gene chip)又称DNA芯片，是20世纪90年代发展起来的一项专门用于核酸检测的前沿生物技术，是在分子杂交技术和微晶技术(microfabrication technology)的基础上发展起来的生物高技术，具有传统的检测方法不可比拟的优点：微型化、高通量、并行处理、快速分析、高准确性、高灵敏度、定量分析等。能够对污染食品的产毒细菌、真菌的毒力基因实现快速的在线检测，及时反映食品中存在的潜在毒素污染问题。基因芯片技术是将待测样品DNA或RNA通过PCR扩增、RT-PCR扩增、体外转录等技术渗入探针分子后，与位于芯片上的探针分子杂交。通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度。计算机软件进行数据的比较和综合分析后，即获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。由于微生物毒素种类众多，且存在许多结构相似的衍生化合物，因此现有方法分别在特异性、灵敏度、适用范围、检测成本等方面有较大局限性。基因芯片具备高通量的优点，通过反向杂交技术，可同时高通量、并行分析处理多基因、多序列，从而对多种产毒微生物进行同步检测鉴定。
【发明内容】
本发明要解决的一个技术问题是提供一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片，同时检测14种常见致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。
上述技术问题通过以下技术方案解决：
一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片，其特征在于，所述复合基因芯片上整合了如下探针：
用于检测金黄色葡萄球菌的靶基因FemA的探针：
金黄色葡萄球菌1探针，其序列为GCT CAC TAT TTG CTT GGC TTT G，
金黄色葡萄球菌2探针，其序列为TTT GAC TCT CAT TCAAAT GTT G；
用于检测沙门氏菌的靶基因invA的探针：
沙门氏菌探针，其序列为AAT AAG ACC GGC CTT CTA GG；
用于检测空肠弯曲菌的靶基因VS1的探针：
空肠弯曲菌1探针，其序列为TGAAAG TGA TAG CGC TAGACA G，
空肠弯曲菌2探针，其序列为AAC TAT TAG GCT CTT GGA GGC T；
用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因ail的探针：
小肠结肠炎耶尔森氏菌1探针，其序列为AGC AAT TGC CAG TTA TCC AT，
小肠结肠炎耶尔森氏菌2探针，其序列为TGG AGC AAC ATT GAT GAACA；
用于检测副溶血性弧菌的靶基因tlh的探针：
副溶血性弧菌1探针，其序列为ATC TGC ACAAGC ACT AAG CG，
副溶血性弧菌2探针，其序列为GAT GGC ACG CAA CAT TCC AC；
用于检测霍乱弧菌的靶基因ompW的探针：
霍乱弧菌1探针，其序列为GTG TAC TAATTG TCC GCA CC，
霍乱弧菌2探针，其序列为TAC CAC TAC TTG GAA GCA AG；
用于检测肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的靶基因rfbE的探针：
O157:H7探针，其序列为GTGAAC TGAACG GCA CCA TC；
用于检测腊样芽孢杆菌的靶基因16s rRNA-b的探针：
腊样芽孢杆探针，其序列为TGC TAC GCA TTG GCA CTG GCA CCT；
用于检测产气荚膜梭菌的靶基因CPα的探针：
产气荚膜梭菌探针，其序列为TAC TAG TTG TAT TAG GCT CC；
用于检测志贺氏菌的靶基因ipaH的探针：
志贺氏菌1探针，其序列为CAT TTC TGC CGA CGC AGT CA，
志贺氏菌2探针，其序列为CAC ATC TTG CAA TCT GCA GA；
用于检测单核增生李斯特氏菌的靶基因prfA的探针：
单核增生李斯特氏菌探针，其序列为GAT TAC TAA GCA CCATGG CT；
用于检测肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c的探针：
肉毒梭菌探针，其序列为TATACC TAGACAATC TCATT；
用于检测黄曲霉、寄生曲霉的靶基因Nor的探针：
黄曲霉/寄生曲霉Nor1探针，其序列为ATC ATA CTG TCT GCAAGC TG，
黄曲霉/寄生曲霉Nor2探针，其序列为GGT TTC TGC CCAATA CAG GA；
用于检测黄曲霉、寄生曲霉的靶基因omt的探针：
黄曲霉/寄生曲霉omt1探针，其序列为GAG AAC CCA TCC AAG GCA TG，
黄曲霉/寄生曲霉omt2探针，其序列为CCT TAC TTC CTC GCAAAG AA。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种检测十四种常见致病菌的方法，能检测14种常见致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。
上述技术问题通过以下技术方案解决：
一种检测十四种常见致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取被检测物质的模版DNA；
2)使用生物标记素标记引物；
3)使用上述被标记的引物对所述模版DNA进行聚合酶链反应扩增；
4)将所得扩增产物与权利要求1所述的复合基因芯片进行杂交；
5)检测复合基因芯片的杂交信号。
进一步的方案：
步骤2)中所述的引物为下列引物中一种：
与金黄色葡萄球菌的靶基因FemA对应的引物，其序列为：
FemA-F：aaa aaa gca cat aac aag cg，FemA-R：gat aaa gaa gaa acc agc ag；
与沙门氏菌的靶基因invA对应的引物，其序列为：
invA-F：gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa，invA-R：tca tcg cac cgt caa agg aac c：
与空肠弯曲菌的靶基因VS1对应的引物，其序列为：
VS1-F：gat atg tat gat ttt atc ttg c；VS1-R：gaa tga aat ttt aga atg ggg；
与小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因ail对应的引物，其序列为：
ail-F：tta atg tgtacg ctg gga gtg，ail-R：gga gta ttc ata tga agc gtc；
与副溶血性弧菌的靶基因tlh对应的引物，其序列为：
tlh-F：aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg，tlh-R：gct act ttc tag cat ttt ctc tgc；
与霍乱弧菌的靶基因ompW对应的引物，其序列为：
ompW-F：cac caa gaa ggt gac ttt att gtg，ompW-R：gaa ctt ata acc acc cgc g；
与肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的靶基因rfbE对应的引物，其序列为：
rfbE-F：att gcg ctg aag cct ttg；rfbE-R：cga gta cat tgg cat cgt g；
与腊样芽孢杆菌的靶基因16s rRNA-b对应的引物，其序列为：
16s-F：cgc tgg cgg cag gcc taa cac atgc，16s-R：cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c；
与产气荚膜梭菌的靶基因CPα对应的引物，其序列为：
CPα-F：aga tat gaa tgg caa aga gga aac，CPα-R：gct atc aac ggc agt aac att ag；
与志贺氏菌的靶基因ipaH对应的引物，其序列为：
ipaH-F：gtt cct tga ccg cct ttc cga tac cgt c；ipaH-R：gcc ggt cag cca ccc tct gagagt ac；
与单核增生李斯特氏菌的靶基因prfA对应的引物，其序列为：
prfA-F：gat aca gaa aca tcg gtt ggc，prfA-R：gtg taa tct tga tgc cat cag；
与肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c对应的引物，其序列为：
16s-F：cgc tgg cgg cag gcc taa cac atg c；16s-R：cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c；
与黄曲霉和寄生曲霉的靶基因Nor对应的引物，其序列为：
Nor-F：acc gct acg ccg gca ctc tcg gca c；Nor-R：gtt ggc cgc cag ctt cga cac tcc g；
与黄曲霉和寄生曲霉的靶基因omt对应的引物，其序列为：
omt-F：ggc ccg gtt cct tgg ctc cta agc；omt-R：cgc ccc agt gag acc ctt cct cg。
进一步的方案：
步骤2)中的聚合酶链反应的反应体系为：
| 组分 | 体积(μL) |
| 模板DNA | 2.0或4.0 |
| 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) | 5.0 |
| dNTP Mixture(各2.5mmol/L) | 4.0 |
| 25pmol/μL上游引物 | 1.0 |
| 25pmol/μL下游引物 | 1.0 |
| TaKaRa Ex Taq(5U/μL) | 0.5 |
| 灭菌三蒸水加至 | 50.0 |
用PCR扩增仪按以下程序扩增：95℃，5min；然后按94℃ 30s，退火温度30s，72℃ 50s做35个循环；最后72℃ 10min；
所述退火温度根据扩增不同靶基因设置不同温度，具体按下述对应关系表设置：
对应关系表为：
| 菌种 | 靶基因 | 退火温度 |
| 金黄色葡萄球菌 | FemA | 57℃ |
| 沙门氏菌 | invA | 64℃ |
| 空肠弯曲菌 | VS1 | 56℃ |
| 小肠结肠炎耶尔森氏菌 | ail | 62℃ |
| 副溶血性弧菌 | tlh | 60℃ |
| 霍乱弧菌 | ompW | 64℃ |
| 肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7 | rfbE | 55℃ |
| 腊样芽孢杆菌 | 16s RNA-b | 62℃ |
| 产气荚膜梭菌 | CPα | 55℃ |
| 志贺氏菌 | ipaH | 65℃ |
| 单核增生李斯特氏菌 | prfA | 55℃ |
| 肉毒梭菌 | 16s RNA-c | 55℃ |
| 黄曲霉/寄生曲霉 | Nor | 55℃ |
| 寄生曲霉/寄生曲霉 | omt | 65℃ |
本发明针对十四种常见致病菌的特异性鉴别靶基因设计相应的引物和探针，构建复合基因芯片；本发明使用生物素标记引物，再将引物以PCR方法来扩增被检测物质的靶基因片段，扩增产物与复合基因芯片上的探针杂交，通过引物和探针双重特异性检测，复合物在复合基因表面沉积，使特定的分子杂交转变成可视信号，从而检测不同产毒微生物。
本发明能检测14种常见致病菌，检测通量高、特异性强、灵敏度好、快速有效。
【附图说明】
图1为本发明的基因芯片阵列示意图；
图2为本发明的十四种常见致病菌的靶基因PCR扩增电泳图；(M：DL2000Ladder Marker(分子量从上到下分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1：黄曲霉菌的靶基因nor；2：黄曲霉菌的靶基因OMT；3：寄生霉菌的靶基因OMT；4：寄生霉菌的靶基因nor；5：单核增生李斯特氏菌的靶基因prfA；6：肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c；7：肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的靶基因Rfbe；8：空肠弯曲菌的靶基因Vs；9：腊样芽孢杆菌的靶基因16s rRNA-b；10：小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因ail；11：金黄色葡萄球菌的靶基因femA；12：志贺氏菌的靶基因ipaH；13：沙门氏菌的靶基因invA；14：霍乱弧菌的靶基因OMpw 15：副溶血性弧菌的靶基因tlh；16：产气荚膜梭菌的靶基因cpa)；
图3为金黄色葡萄球菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图4为肉毒梭菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图5为志贺氏菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图6为肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图7为副溶血性弧菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图8为霍乱弧菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图9为沙门氏菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图10为空肠弯曲球菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图11为产气荚膜梭菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图12为黄曲霉菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图13为寄生曲霉菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图14为单核增生李斯特氏菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图15为小肠结肠炎耶尔森氏菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图16为腊样芽孢杆菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图；
图17a-图17c为福氏志贺氏菌稀释第7梯度-福氏志贺氏菌稀释第9梯度的福氏志贺氏菌平板图；
图18-图22为福氏志贺氏菌稀释第5梯度-福氏志贺氏菌稀释第9梯度的福氏志贺氏菌的PCR扩增产物与复合基因芯片杂交的示意图。
【具体实施方式】
本发明是针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7、腊样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、志贺氏菌、单核增生李斯特氏菌、肉毒梭菌、黄曲霉、寄生曲霉这十四种常见致病菌而设计复合基因芯片及提供使用该复合基因芯片进行检测的方法。
一、靶基因探针和引物的设计
经过对上述十四种常见致病菌的基因分析，得出上述十四种常见致病菌的特异性鉴别靶基因，并针对这些靶基因设计出相应的引物和探针，其中，探针的相关信息详见表1，引物及靶基因的相关信息见表2。
表1 检测十四种常见致病菌的寡核苷酸探针的相关信息
表2 检测十四种常见致病菌的引物的相关信息
二、检测十四种常见致病菌的复合基因芯片的构建
1、阵列设计
芯片设计为8×8阵列(如图1和表3)，列阵包括28个探针点、2个芯片质控点、1个阴阳对照点和1个空白对照点。
表3 基因芯片点样列阵示意表
2、芯片点样
将合成的探针稀释至30pmol/μL，加入等体积的2×点样缓冲液，按照预先设计好的列阵加入探针溶液盘中，每孔加入约15μL；按操作说明使用DR.FastSpot点样仪点制芯片，点样完毕后目测点样区，检测是否漏点，形状是否规则；点制好的芯片室温静置5-10min，在紫外交联仪中254nm交联700s，加500uL超纯水冲洗5min两次；加100μL 95％乙醇20s后，放入50℃干燥箱中干燥10min，4℃保存备用。
三、使用基因芯片进行样品检测
1、靶基因的PCR(PCR，聚合酶链反应)扩增
PCR反应体系见表4，PCR仪运行参数设置按常规进行。
表4 PCR反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| 模板DNA | 2.0或4.0 |
| 10×Ex Taq Buffer(Mg2+Plus) | 5.0 |
| dNTP Mixture(各2.5mmol/L) | 4.0 |
| 25pmol/μL上游引物 | 1.0 |
| 25pmol/μL下游引物 | 1.0 |
| TaKaRa Ex Taq(5U/μL) | 0.5 |
| 灭菌三蒸水加至 | 50.0 |
反应参数：用PCR扩增仪按以下程序扩增：95℃，5min；然后按94℃ 30s，退火温度(检测不同常见致病菌使用不同退火温度，具体见表2)30s，72℃ 50s做35个循环；最后72℃ 10min。
反应结束后，扩增产物经3％的琼脂糖凝胶(含0.05μL/ml的EB)电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，100V恒压电泳30min，紫外灯下检测电泳结果并拍照分析。
PCR扩增前，先使用生物素对引物进行标记；模版DNA的提取方法采用细菌DNA提取的通用方法，一般的实验参考书上就可以查到。
2、复合基因芯片的检测
2.1 PCR扩增产物与基因芯片杂交
吸取1-25μL PCR扩增产物和200μL DR.HybTMBuffer(杂交液)混合于离心管中，100℃变性5min，迅速冰浴5min；把所有的杂交混合液转移到芯片凹槽中，避免产生气泡；置于45℃杂交箱中杂交45min。
2.2 芯片洗涤
去除芯片内所有的杂交混合液；用移液器加250μL Wash Buffer洗液到芯片凹槽中，约30秒，去除Wash Buffer洗液，重复两次。
2.3 芯片封闭
加封闭液(0.2μL Strep-AP与200μL Blocking Reagent混合液)到芯片凹槽中，室温(25-35℃)反应30min；去除封闭液，用移液器加250μL Wash Buffer洗液到杂交室，约30秒，去除Wash Buffer洗液，重复两次；将芯片在吸水纸上拍打，以吸出残留的洗液。
2.4 芯片显色
加显色液(4μL NBT/BCIP与196μL Detection Buffer混合液)到芯片凹槽中，避光室温反应5-10min；去除显色液，用超纯水冲洗芯片，并读取结果；
2.5 芯片扫描分析
用芯片扫描仪进行扫描分析，也可直接肉眼观察结果并用数码相机拍照，阳性结果有灰色清晰的杂交圆点，阴性则没有。
四、复合基因芯片的检验
1、靶基因特异性杂交试验
以菌种为单位，将黄曲霉、寄生霉、单核增生李斯特氏菌、肉毒梭菌、O157:H7、空肠弯曲杆菌、腊样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌14种菌的检测靶基因分别与芯片进行杂交。
2、灵敏性试验
选取福氏志贺氏菌作为芯片检测灵敏度试验靶细菌，具体实验步骤如下：
2.1 细菌增菌：将福氏志贺氏菌标准菌株接种到GN增菌液中37℃培养24h；
2.2 细菌稀释：取10管装有9ml生理盐水的试管，取1ml增菌液接种到第一个试管的9ml生理盐水中，然后在第一个试管中取1ml生理盐水(含有增菌液)加入到第二个试管的9ml生理盐水中，按照如此，依次将上一个梯度的生理盐水取1ml加入到后一个梯度生理盐水中，稀释成10个梯度。
2.3 细菌计数：将上述取得的不同稀释梯度的增菌液(共10个)，每个用移液器取出1ml；分别与先融化好、冷却到50℃左右的营养琼脂(约15ml)混和均匀，倒入平板中，设两个平行重复(两次重复实验)；将混有菌的平板放于37℃培养箱中，过夜培养；将过夜培养后的菌体取出后，进行平板计数；
2.4 DNA提取：将不同稀释梯度的增菌液(共10个)，每个用移液器取出1ml提取基因组DNA；革兰氏阴性细菌直接采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取；革兰氏阳性细菌利用溶菌酶破壁后采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取；真菌取适量菌体经液氮研磨破碎后采用CTAB法提取。
2.5 芯片杂交：将提取好的菌体DNA进行PCR扩增及芯片杂交；根据杂交结果判断基因芯片检测灵敏度。
3、重复性和稳定性试验
随即抽取不同点样批次和同一点样批次的不同芯片各5张，在相同的条件下对腊样芽胞杆菌进行检测，验证芯片的重复性和稳定性。
五、试验结果
1.1、靶基因的PCR扩增
从14种标准菌株中扩增出相应的靶基因，各个靶基因未见非特异性条带，结果见图2。
1.2、14种标准菌株的复合基因芯片杂交试验
各标准菌株的特异性扩增产物能与芯片探针进行良好的杂交试验，获得清晰的杂交图像，结果见图3-图16；从结果可知，杂交出现预期的特异性探针信号，杂交信号明显；非目的探针与背景完全一致，未见非特异性杂交信号，靶基因之间不存在交叉杂交现象；试验结果表明，本研究设计的基因芯片具有良好的特异性。
2、基因芯片检测福氏志贺氏菌的灵敏度
用平板计数法对10种不同浓度的培养液中福氏志贺氏菌进行菌落计数，结果见表5；芯片杂交的扫描图见18-22，实验结果表明，基因芯片杂交检测灵敏度约为710cfu/ml。
表5 福氏志贺氏菌灵敏度实验的平板计数结果(平均计数结果，单位cfu/ml)
| 梯度 | 福氏志贺氏菌的平板计数结果 |
| 第1梯度 | ∞ |
| 第2梯度 | ∞ |
| 第3梯度 | ∞ |
| 第4梯度 | ∞ |
| 第5梯度 | ∞ |
| 第6梯度 | 7212 |
| 第7梯度 | 710 |
| 第8梯度 | 73 |
| 第9梯度 | 8 |
| 第10梯度 | 0 |
3、重复性和稳定性试验
在相同条件下，将腊样芽胞杆菌的扩增产物与随机抽取不同批次、同一批次的各5张复合基因芯片进行杂交试验。结果表明，所有芯片杂交信号一致，未见非特异性杂交信号。不同批次、同一批次的复合基因芯片杂交结果之间不存在明显差异。
Claims (4)
1.一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片，其特征在于，所述复合基因芯片上整合了如下探针：
用于检测金黄色葡萄球菌的靶基因FemA的探针：
金黄色葡萄球菌1探针，其序列为GCT CAC TAT TTG CTT GGC TTT G，
金黄色葡萄球菌2探针，其序列为TTT GAC TCT CAT TCAAAT GTT G；
用于检测沙门氏菌的靶基因invA的探针：
沙门氏菌探针，其序列为AAT AAG ACC GGC CTT CTA GG；
用于检测空肠弯曲菌的靶基因VS1的探针：
空肠弯曲菌1探针，其序列为TGAAAG TGA TAG CGC TAGACA G，
空肠弯曲菌2探针，其序列为AAC TAT TAG GCT CTT GGA GGC T；
用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因ail的探针：
小肠结肠炎耶尔森氏菌1探针，其序列为AGC AAT TGC CAG TTA TCC AT，
小肠结肠炎耶尔森氏菌2探针，其序列为TGG AGC AAC ATT GAT GAACA；
用于检测副溶血性弧菌的靶基因tlh的探针：
副溶血性弧菌1探针，其序列为ATC TGC ACAAGC ACT AAG CG，
副溶血性弧菌2探针，其序列为GAT GGC ACG CAA CAT TCC AC；
用于检测霍乱弧菌的靶基因ompW的探针：
霍乱弧菌1探针，其序列为GTG TAC TAATTG TCC GCA CC，
霍乱弧菌2探针，其序列为TAC CAC TAC TTG GAA GCA AG；
用于检测肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的靶基因rfbE的探针：
O157:H7探针，其序列为GTGAAC TGAACG GCA CCA TC；
用于检测腊样芽孢杆菌的靶基因16s rRNA-b的探针：
腊样芽孢杆探针，其序列为TGC TAC GCA TTG GCA CTG GCA CCT；
用于检测产气荚膜梭菌的靶基因CPα的探针：
产气荚膜梭菌探针，其序列为TAC TAG TTG TAT TAG GCT CC；
用于检测志贺氏菌的靶基因ipaH的探针：
志贺氏菌1探针，其序列为CAT TTC TGC CGA CGC AGT CA，
志贺氏菌2探针，其序列为CAC ATC TTG CAA TCT GCA GA；
用于检测单核增生李斯特氏菌的靶基因prfA的探针：
单核增生李斯特氏菌探针，其序列为GAT TAC TAA GCA CCA TGG CT；
用于检测肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c的探针：
肉毒梭菌探针，其序列为TATACC TAGACAATC TCATT；
用于检测黄曲霉、寄生曲霉的靶基因Nor的探针：
黄曲霉/寄生曲霉Nor1探针，其序列为ATC ATA CTG TCT GCA AGC TG，
黄曲霉/寄生曲霉Nor2探针，其序列为GGT TTC TGC CCAATA CAG GA；
用于检测黄曲霉、寄生曲霉的靶基因omt的探针：
黄曲霉/寄生曲霉omt1探针，其序列为GAG AAC CCA TCC AAG GCA TG，
黄曲霉/寄生曲霉omt2探针，其序列为CCT TAC TTC CTC GCA AAG AA。
2.一种检测十四种常见致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取被检测物质的模版DNA；
2)使用生物标记素标记引物；
3)使用上述被标记的引物对所述模版DNA进行聚合酶链反应扩增；
4)将所得扩增产物与权利要求1所述的复合基因芯片进行杂交；
5)检测复合基因芯片的杂交信号。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的引物为下列引物中一种：
与金黄色葡萄球菌的靶基因FemA对应的引物，其序列为：
FemA F：aaa aaa gca cat aac aag cg，FemA-R：gat aaa gaa gaa acc agc ag；
与沙门氏菌的靶基因invA对应的引物，其序列为：
invA-F：gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa，invA-R：tca tcg cac cgt caa agg aac c；
与空肠弯曲菌的靶基因VS1对应的引物，其序列为：
VS1-F：gat atg tat gat ttt atc ttg c；VS1-R：gaa tga aat ttt aga atg ggg；
与小肠结肠炎耶尔森氏菌的靶基因ail对应的引物，其序列为：
ail-F：tta atg tgt acg ctg gga gtg，ail-R：gga gta ttc ata tga agc gtc；
与副溶血性弧菌的靶基因tlh对应的引物，其序列为：
tlh-F：aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg，tlh-R：gct act ttc tag cat ttt ctc tgc；
与霍乱弧菌的靶基因ompW对应的引物，其序列为：
ompW-F：cac caa gaa ggt gac ttt att gtg，ompW-R：gaa ctt ata acc acc cgc g；
与肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7的靶基因rfbE对应的引物，其序列为：
rfbE-F：att gcg ctg aag cct ttg，rfbE-R：cga gta cat tgg cat cgt g；
与腊样芽孢杆菌的靶基因16s对应的引物，其序列为：
16s-F：cgc tgg cgg cag gcc taa cac atg c，16s-R：cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c；
与产气荚膜梭菌的靶基因CPα对应的引物，其序列为：
CPα-F：aga tat gaa tgg caa aga gga aac，CPα-R：gct atc aac ggc agt aac att ag；
与志贺氏菌的靶基因ipaH对应的引物，其序列为：
ipaH-F：gtt cct tga ccg cct ttc cga tac cgt c；ipaH-R：gcc ggt cag cca ccc tct gagagt ac；
与单核增生李斯特氏菌的靶基因prfA对应的引物，其序列为：
prfA-F：gat aca gaa aca tcg gtt ggc，prfA-R：gtg taa tct tga tgc cat cag；
与肉毒梭菌的靶基因16s对应的引物，其序列为：
16s-F：cgc tgg cgg cag gcc taa cac atg c；16s-R：cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c；
与黄曲霉和寄生曲霉的靶基因Nor对应的引物，其序列为：
Nor-F：acc gct acg ccg gca ctc tcg gca c；Nor-R：gtt ggc cgc cag ctt cga cac tcc g；
与黄曲霉和寄生曲霉的靶基因omt对应的引物，其序列为：
omt-F：ggc ccg gtt cct tgg ctc cta agc；omt-R：cgc ccc agt gag acc ctt cct cg。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤2)中的聚合酶链反应的反应体系为：
用PCR扩增仪按以下程序扩增：95℃，5min；然后按94℃ 30s，退火温度30s，72℃ 50s做35个循环；最后72℃ 10min；
所述退火温度根据扩增不同靶基因设置不同温度，具体按下述对应关系表设置：
对应关系表为：
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