CN108384869A

CN108384869A - 同时检测四种致病弧菌的多重pcr引物组及检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN108384869A
Application number: CN201810483097.4A
Authority: CN
Inventors: 陈鲤群; 黄蓝青; 林峻; 蔡伟文; 赵依依
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2018-08-10

Abstract

本发明公开了一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒，其检测引物组包含检测霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的引物对。本发明建立一种多重PCR检测方法及试剂盒，利用设计得到的所述引物组，对待测样品中提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行多重PCR反应，通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有上述致病弧菌，具有快速准确、成本低、特异性和灵敏度高的优点。

Description

同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及同时检测四种致病弧菌的多重PCR检测引物组、检测方法及试剂盒。

背景技术

弧菌(Vibrio)是海洋环境中常见的优势细菌菌群之一，菌体短小，兼性厌氧，嗜碱生长，因弯曲如弧而得名，是一类尾部带单鞭毛或者周身鞭毛的革兰氏阴性菌，广泛分布在海湾、河口、半咸水、沉积物以及海洋生物体表和肠道。

世界卫生组织根据细菌的DNA同源性、抗原性、生化特性和致病性等将弧菌分为四类： O1群霍乱弧菌、非O1群霍乱弧菌、不典型O1群霍乱弧菌和其他弧菌。弧菌种类繁多，自1854年Filippo Pacini首次将从霍乱病人中分离出的微生物命名为弧菌以来，海水养殖强度的不断增大、细菌分类学的日益完善使得该属不断扩编。根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)》的叙述，现已有37种弧菌被收录在册，其中有12种被认定为对人类具有致病性的同时也是海洋生物的重要致病菌，包括霍乱弧菌(V.cholera)，溶藻弧菌(V.alginolyticus)，鲨鱼弧菌(V.carchariae)，辛辛那提弧菌(V.cincinnatiensis)，美人鱼弧菌(V.damsel)，河流弧菌(V.fluvialis)，弗氏弧菌(V.furnissii)，霍利斯弧菌(V.hollisae)，麦氏弧菌(V. metschnikovii)，拟态弧菌(V.mimicus)，副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)以及创伤弧菌(V.vulnificus)。

霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食物经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，可能藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血流，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌。

溶藻弧菌是一种常见的海洋致病菌，在世界各地海水及河口处广泛分部，并且其数量居海水类弧菌之首，因其生物学性状有许多与副溶血性弧菌相似，在Bergey氏细菌学鉴定手册第八版中将其列为副溶血性弧菌的一个生物型，第八版以后溶藻弧菌又单独立种。溶藻弧菌可对人引起伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病，同时，它也是鱼、虾、贝等海水养殖动物的一种条件致病菌，当环境恶化时机体免疫机能下降，溶藻弧菌病容易爆发，特别当水温在25-32℃下容易流行，因此养殖动物的溶藻弧菌病多发生在夏季，爆发时往往会造成水产养殖业巨大经济损失。

河流弧菌是生活在海洋里的一种条件致病菌。由于该病原菌的适应能力比较强，海水的温度、盐度、pH等都较适于河流弧菌的生长，所以广泛分布在海洋环境中。近几年，该菌已引起多种水产动物的败血症、脓疱病等疾病，造成了非常严重的经济损失。河流弧菌不仅是多种水产动物的致病菌，而且也是人类的致病菌，是因食用不洁海产品而导致流行性腹泻的主要致病菌。

鳗弧菌被认为是造成波罗的海鳗鱼红瘟的罪魁祸首，成为较早发现的海洋细菌病原菌之一，鳗弧菌会导致多种具有经济价值的鱼类包括太平洋和大西洋鲑鱼、虹鳟鱼、大比目鱼、石斑鱼、海狸、条纹鲈、鳕鱼、香鱼和日本、欧洲鳗鱼等患上出血性败血症，并伴有鳍片出血、眼球突出、角膜混浊和真皮水肿等症状，在O1到O23二十多种不同血清型的鳗弧菌中，O1和O2最为常见且毒力最大，由鳗弧菌造成的弧菌病曾给鲈形目和鲑科鱼的海水养殖带来毁灭性的打击。

目前，弧菌的检测与鉴定主要有以下几种方法：

1、传统的生理生化鉴定

迄今为止，国内仍以传统的微生物学生理生化鉴定方法作为致病性弧菌的国家与行业标准检测方法。传统的表型鉴定技术需要针对病原菌的形态、生理、生化特点进行一系列鉴定工作包括选择平板分离、生化试验、神奈川试验等，周期较长，工作量大，操作繁琐，耗时耗力，不利于致病菌的快速检测鉴定。近年来问世的VITEK系列全自动快速微生物鉴定智能分析系统和API20E生化鉴定试剂条因其快速简便准确等优点受到越来越多的青睐和认可，缺陷是检测成本较高，可能会出现因对部分细菌缺码而导致的鉴定结果错误。

2、免疫学技术

作为海洋鱼虾贝类细菌性疾病常用检测诊断方法之一的免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应捕捉致病菌，涉及ELISA技术、免疫荧光法和蛋白质印迹法(Westernblot)，准确性高，检测速度快，缺点是成本稍高，对实验技能要求高。

3、核酸检测技术

随着分子生物学发展和基因工程技术的兴起，以核酸为基础的检测技术被成功用于弧菌的快速检测，包括PCR、核酸探针和16S rRNA技术，灵敏度高，特异性强，难点在于特异性引物的设计能否对亲缘关系相近，分化程度不够的物种进行区分。多重聚合酶链式反应 (multiplex polymerase chain reaction，M-PCR)是利用精心设计的多对引物在同一个PCR体系中同时扩增多个目的基因，以弥补单一引物扩增易漏检的不足，降低实验材料损耗，缩短检测时间，自Chamberlian J S于1988年首次提出这一概念以来，M-PCR技术已逐步被用于细菌病的诊断和病原体的鉴定等，应用前景相当广阔。实际应用过程中，靶标序列的选择、引物设计以及实验条件的控制皆为该项技术的难点。此外，微量外源性DNA的污染导致的假阳性结果和增菌培养基选择不当造成的假阴性结果也是其容易产生的问题。

鉴于M-PCR技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。二重和三重PCR 检测屡有相关报道，但由于多重PCR影响因素复杂，不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg²⁺浓度、dNTP浓度及其比例等会产生复杂的综合效应，因此同时检测的目标微生物种类越多，PCR体系建立的难度越大。经国内外文献查询，尚未见有多重PCR应用于霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌快速检测的相关报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组、检测方法和试剂盒，可实现对霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的快速检测。

为了实现本发明目的，本发明首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案及一种多重 PCR检测致病弧菌的引物组：

1、构建阳性内对照(IAC)扩增引物和模板

以弧菌的16S rDNA序列为模板设计一对引物，扩增其中的663bp大小的片段，作为检测的IAC。IAC上游引物序列为5’-CGGTGA AAT GCG TAG AGA T-3’，IAC下游引物的序列为5’-TTA CTA GCG ATT CCG AGT TC-3’。

2、筛选不同弧菌的特异靶基因用于引物设计

在以PCR为基础的弧菌鉴定方法中，靶基因的选择是首要的难点和要点，这类靶基因主要包括毒力基因和看家基因，既要保证该靶基因在属内相对保守，使其具有通用性，又要求其在种间的同源性较低以实现特异性。通过文献分析和检测需求分析，获得了每一种致病弧菌候选扩增的基因或者DNA片段：在不同生物型或血清型霍乱弧菌菌株之间高度保守的外膜蛋白基因OmpW的序列；溶藻弧菌toxR基因高变区；河流弧菌的基因间隔区(intergenic spacers，IGSs)，即16S-23S rRNA genes的保守区域；鳗弧菌的金属蛋白酶基因empA。

3、引物备用方案的设计

多重PCR的难点首先在于引物的设计，尽量保证多对引物解链温度相似、避免互补序列，扩增的目的片段大小不能太接近，否则扩增产物在电泳的时候分不开。

在设计引物时，应该注意以下事项：

(1)引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。

(2)引物长度一般为15-30bp，因为过长会导致其延长温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。

(3)引物不应形成二级结构，引物二聚体及发夹结构的数值过高(超过4.5kcal/mol) 易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

(4)引物的Tm值不能太低也不能太高，引物所对应模板位置序列的Tm值在45-60℃左右可使复兴条件最佳；两条引物的Tm值应尽可能相等或接近，最好相差不超过5度。Tm 值得多种计算方法，如按公式Tm＝4(G+C)+2(A+T)进行计算。

(5)引物3’端不可修饰，引物3’端的末位碱基对Taq聚合酶的DNA合成效率有较大的影响。3’端应选用A、T，少选用G、C，这种引物能有效地避免假引发，有更高的引发效率。引物序列本身或者之前不能出现3个以上的连续碱基，因此应当避免在引物3’端使用错误引发几率增加。

本发明根据GenBank上已公布的各种弧菌的毒力基因和看家基因序列，结合相关文献报道，利用Oligo7和Primer Primier5.0软件设计引物，按照搜寻结果显示，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，逐条分析，依次筛选，对所有扩增目标候选基因或者片段进行设计1-2套备用方案。

当上下引物全选好后，需要对引物进行评价。可以用“Analyse”菜单分析引物：比如有无引物二聚体、发卡结构等等。首先检查引物二聚体，尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或者下游引物自己生成，也可能是上下游引物之间形成(cross dinner)。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测(非克隆)性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而尽可能选取不形成二聚体或其他能值较低的引物。第二项检查是发卡结构(hairpin)，与二聚体相同，发卡结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发卡结构，而且能能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发卡结构的检测不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45％-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或者偏高，导致引物的GC含量不能被控制。在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。

4、对扩增目标基因的引物候选方案进行Blast分析

在Genbank中对所有引物候选方案进行Blast分析，获得特异性较高的引物方案作为实验验证用方案，每一种致病弧菌可能会选择多个扩增目标，每个扩增目标会有1-2个实验验证方案。

5、对每个可用实验验证方案进行单重PCR验证，确定引物的可用性，包括特异性评估和敏感性评估。

6、将所有扩增目标的引物混合进行多重PCR，验证引物共同扩增时的可用性，从中选择引物之间干扰程度最小的组合，对不能工作的引物需要按照步骤2-4重复设计新的引物进行替换。最终获得本发明提供的一套特异的引物序列(详见表1)。

表1.同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组

基于上述技术方案，本发明提供了一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组，其包含检测霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的引物对；

所述检测霍乱弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQID NO.2所示；

所述检测溶藻弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示；

所述检测河流弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQID NO.6所示；

所述检测鳗弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQID NO.8所示。

进一步地，所述同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组还包含阳性内对照引物对，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了一种使用引物组对霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌进行多重 PCR检测的方法，将霍乱弧菌的检测引物对、溶藻弧菌的检测引物对、河流弧菌的检测引物对和鳗弧菌的检测引物对与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析以确定样品中是否含有霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌或鳗弧菌；其中所述霍乱弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述溶藻弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列，所述河流弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述鳗弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

进一步地，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对和相应的模板。

进一步地，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示。

所述方法能全面快速筛检霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌，其技术方案具体如下：

1、引物合成

按照表1中的引物序列，在基因合成公司合成所有引物的寡聚核苷酸序列。

2、DNA模板提取

选择霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌作为建立检测方法的目标微生物，分别按照国标或者行业标准方法对上述四种微生物进行增菌培养，采用细菌基因组提取试剂盒提取 DNA模板。

3、构建多重PCR检测体系

在确定多重PCR反应体系中引物序列后，按照下列20μl的M-PCR反应体系(表2)加入试剂，混匀，分别参照经多次摸索优化的PCR反应条件(表3)进行PCR反应。

表2.多重PCR反应体系

表3.多重PCR反应条件

4、多重PCR扩增产物的序列分析和结果判定

将4ul多重PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，多重PCR扩增产物经电泳在凝胶成像仪下观察结果后，将阳性扩增的PCR产物送去基因检测公司进行测序，序列拼接结果用ChromasPro校正后，通过NCBI的Blast进行序列比较，Blast中出现比对分值，即具有的MaxIdent值最高的细菌种类的比对结果，并结合16SrDNA PCR的测序结果推测为相应属种。

5、检测体系的验证

以标准菌株为模板验证已经建立的同时检测四种致病弧菌的多重PCR检测方法的特异性和有效性。

特异性验证：选用创伤弧菌、哈氏弧菌、拟态弧菌作为特异性评估用菌株，进行核酸提取，采用前期建立和优化的反应条件，应用本发明检测试剂进行检测。结果表明IAC(阳性内对照)均为阳性。除IAC外，阴性对照和特异性验证菌株无非特异性条带扩增，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有较好的特异性，能够将非目标菌有效区分开。

敏感性验证：对初始浓度为10⁹CFU/mL的四种目标菌DNA分别稀释到10⁸CFU/mL，10⁷CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL。采用前期建立和优化的反应条件进行检测，每种目标菌的检测限均可达到10⁵CFU/mL，重复检测结果全部一致，表明该检测方法具有高度的敏感性和良好的重复性。

本发明还提供了一种同时检测四种致病弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括前述引物组、阳性内对照引物对、阳性内对照模板、Taq DNA聚合酶、反应体系缓冲液、dNTP 和双蒸水。

本发明的有益效果在于：

1、快速鉴定多种弧菌

本发明建立的多重PCR方法可以一步鉴定霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、鳗弧菌四种致病弧菌，并引入扩增内标指示PCR反应的假阴性，相对于现有技术所建立的方法来说既增加了检测的通量，也保证了结果的准确性，同时具有节省人力成本和时间成本的优势。

2、特异性和灵敏度高

本发明的多重PCR检测引物组具备高度特异性，所有引物都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性验证，能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非目标细菌准确分辨出来。本发明所建立的检测方法能够实现四种目标菌的同时筛检，在反应体系中每个目标菌的检测灵敏度可达到10⁵CFU/mL。

附图说明

图1为本发明实施例3中四种致病弧菌多重PCR检测琼脂糖凝胶电泳结果。

其中，1：鳗弧菌；2：河流弧菌；3：霍乱弧菌；M：250bp DNA ladder Marker；4：溶藻弧菌；5：其他弧菌；6：阴性对照。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1引物的设计与筛选(以霍乱弧菌为代表)

根据GenBank上已公布的霍乱弧菌的毒力基因和看家基因序列，结合相关文献报道，获得了霍乱弧菌的候选扩增的DNA片段，即在不同生物型或血清型霍乱弧菌菌株之间高度保守的外膜蛋白基因OmpW的序列，利用Oligo7和Primer Primier5.0软件设计引物，在评分高的引物中进行筛选，通过适当手动调整和修改，然后将获得的引物设计方案在NCBI网站上进行Blast分析，如果其中任何引物对与非目标菌存在交叉反应，需要重新调整引物的位置和序列长度，直至获得高特异性的OmpW基因引物序列。最终获得如表4的两种引物备选方案。

在设计筛选引物时，需要注意一下几点：

(1)引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。

表4.霍乱弧菌的引物备选方案

然后对上述备选方案进行单重PCR验证，确定引物的可用性，包括特异性评估和敏感性评估：

特异性评估的细菌组：包括溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌三种试剂盒内的检测目标菌，还包括与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，如创伤弧菌、哈氏弧菌、拟态弧菌。

对上述细菌采用细菌基因组提取试剂盒获得DNA模板备用。将提取的模板各取1μl混匀，作为特异性验证的模板。

霍乱弧菌的特异性分析试验：使用上述设计完成的引物对，按照如下项目配置PCR反应体系：10×PCR buffer(100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、15mM Mg2+、500mM KCl)2μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，每对引物(10μM)2μl，特异性验证DNA模板1μl，双蒸水补至20μl。按照如下反应条件进行PCR扩增：93℃预变性5min； 92℃变性40s，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

PCR扩增产物4μl使用2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，在阳性对照(加入霍乱弧菌的引物和模板)成立的前提下，设计的两条霍乱弧菌引物OmpW-1和OmpW-2与溶藻弧菌、河流弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、哈氏弧菌、拟态弧菌等生境相似、高频并存的菌均无交叉反应。因此可认为，两条引物OmpW-1和OmpW-2均具有较好的特异性。

敏感性评估：选择1株霍乱弧菌的模板，其初始浓度大约为10⁹CFU/mL，梯度稀释到10⁴CFU/mL，作为OmpW基因扩增引物敏感性评估的模板。体系配置如下：10×PCR buffer(100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、15mM Mg2+、500mM KCl)2μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.5μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，每对引物(10μM)2μl，霍乱弧菌模板1μl，双蒸水补至20μl。PCR反应条件同特异性实验。

PCR扩增产物4μl使用2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，两个引物对均可以达到10⁵CFU/mL，其中引物对OmpW-1的条带亮度比OmpW-2亮很多。

综合敏感性和特异性的评估结果，选择OmpW-1作为OmpW基因扩增的引物。

其他弧菌的引物的设计筛选方法与霍乱弧菌相同。引物均由Invitrogen公司合成。

实施例2同时检测四种致病弧菌的多重PCR检测试剂盒的组建

试剂盒由PCR反应体系缓冲液(100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、15mM Mg²⁺、 500mMKCl)、Taq DNA聚合酶(5U/μl)、dNTP、引物混合液(四种致病弧菌引物和IAC 引物混合液)、阳性对照模板(四种致病弧菌的混合模板，每种10⁶CFU/ml)、双蒸水构成，试剂盒的反应体系为20ul，具体配置如下：

表5多重PCR检测试剂盒的配置

实施例3在普通琼脂糖凝胶电泳对试剂盒多重PCR检测试验

检测样本：选择霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的病原体基因组DNA作为试验的模板，每种模板的浓度大约为10⁵CFU/ml。

试剂盒组建：采用实施例2中的试剂盒。

试剂盒操作：2mL细菌悬浊液，按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取模板DNA。将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：93℃预变性5min；92℃变性40s，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

多重PCR检测试验结果如图1所示。

由图1可知：多重PCR体系反应产物的对应目的条带清晰，且无杂带产生，表明经过多次优化后确立的反应条件和反应成分比例合适，相互之间不产生干扰，五对引物组合参与的多重PCR反应体系具有很好的特异性。根据电泳后的目的片段大小(第1泳道出现248bp扩增条带，第2泳道出现278bp扩增条带，第3泳道出现588bp扩增条带，第4泳道出现340bp扩增条带)，再结合扩增产物的测序结果，登录基因数据库进行比对，可知第1泳道是鳗弧菌，第2泳道是河流弧菌，第3泳道是霍乱弧菌，第4泳道是溶藻弧菌。

实施例4试剂盒的特异性试验

选择创伤弧菌、哈氏弧菌、拟态弧菌等与检测目标菌种属相近、存在环境相似的细菌作为待检细菌，经检测均只有一条IAC条带扩增，无杂带产生，且对目标菌检测时，除特异性条带外，无杂带产生。表明本发明试剂盒能够有效区分非目标细菌，具有较好的特异性。

实施例5试剂盒的敏感性试验

评估用检测样本：将霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的浓度调整至10⁹CFU/mL 数量级，采用细菌基因组提取试剂盒提取四种检测目标菌DNA。每个模板梯度稀释成 10⁸CFU/mL，10⁷CFU/mL，10⁶CFU/mL，10⁵CFU/mL，10⁴CFU/mL的检测样品。

使用本发明试剂盒分别检测四个目标菌不同稀释度的模板。根据实施例3结果判断方法，试剂盒检测四种目标菌的敏感性试验结果如表6所示：

表6试剂盒检测四种目标菌敏感性试验结果

从表6看出，试剂盒检测四种致病弧菌的敏感性均为10⁵CFU/mL。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

<110> 福州大学

<120> 同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒

<130> SC-ZL20188336

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Vc-F

<400> 1

caccaagaag gtgactttat tgt 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Vc-R

<400> 2

gaacttataa ccacccgcg 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Val-F

<400> 3

attgagaacc cgacagaagc gaa 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Val-R

<400> 4

cctaatgcgg tgatcagtgt tact 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Vf-F

<400> 5

ataaagtgaa gagattcgta c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Vf-R

<400> 6

gtattcctga atggaataca c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Van-F

<400> 7

cctttaacca agtgggcgta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Van-R

<400> 8

cgatttgtaa gggcgacaat 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> V16s-F

<400> 9

cggtgaaatg cgtagagat 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> V16s-R

<400> 10

ttactagcga ttccgagttc 20

Claims

1.一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组，其特征在于，其包含检测霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的引物对；

所述检测霍乱弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示；

所述检测溶藻弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示；

所述检测河流弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示；

所述检测鳗弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8所示。

2.根据权利要求1所述的同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组，其特征在于，还包含阳性内对照引物对，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示。

3.一种使用引物组对霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌进行多重PCR检测的方法，其特征在于，将霍乱弧菌的检测引物对、溶藻弧菌的检测引物对、河流弧菌的检测引物对和鳗弧菌的检测引物对与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析以确定样品中是否含有霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌或鳗弧菌；其中所述霍乱弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述溶藻弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述河流弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述鳗弧菌的检测引物对中的上下游引物分别具有如SEQID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在进行多重PCR反应时，反应体系中还加入阳性内对照引物对。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。

6.根据权利要求3-5任一项所述的方法，其特征在于，所述多重PCR反应按以下步骤进行：

(1)93℃预变性5min；

(2)92℃变性40s，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35次；

(3)72℃延伸7min。

7.一种同时检测四种致病弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、阳性内对照引物对、阳性内对照模板、Taq DNA聚合酶、反应体系缓冲液、dNTP和双蒸水。